Cristalografía de proteínas na universidade de Santiago de Compostela.

Mark J. van Raaij Departamento de Bioquímica e Bioloxía Molecular, facultade de Farmacia

Unidade de Diffracción de Raios X, RIAIDTUniversidade de Santiago de Compostela

vanraaij@usc.es

- por que determinar estructuras de proteínas?

- cristalización y cristalografía de macromoléculas

- proteómica / genómica estructural

- biología estructural de proteínas virales

por que determinar estructuras de proteínas?

todavía no es posible predecir estructuras de proteínas

la estructura de una proteína / macromolécula da pistas sobre su función, efecto de mutantes, etc.

amino ácidos lejos en la secuencia primaria pueden estar muy cerca en 3D

para descubrir nuevos plegamientos, mejorar la predicción de estructuras

como determinar estructuras de proteínas?

crio-microscopía electrónica .cristales 2D: in membrano, proteínas de membrana.partículas simples- a resolución relativamente baja, apto para complejos grandes

espectroscopía NMR- en solución- alta resolución- proteínas no muy grandes (< 30 kD)

difracción de fibras- p. ej. proteínas del músculo

cristalografía de rayos X (neutrones)

cristalografía de rayos X- alta resolución, con datos (y fases) a ~ 3 Å de resolución o mejor se pueden construir modelos atómicos- apto desde moléculas pequeñas (NaCl) hasta muy grandes (ribosomas)- proporcionan una imagen estática de la estructura, aunque reaccionesenzimáticas han sido estudiadas en cristales

pasos en la determinación de una estructura de una macromolécula

• obtención de la macromolécula en escala de mg- expresión y purificación• cristalización- difusión de vapor, “micro-batch” • recogida de datos- ánodo rotante con detector, sincrotrón• determinación de fases- MR, MIR, SIRAS, MAD, SAD• análisis de la estructura• (verificación bioquímica de las conclusiones)

cristalización

muestra- múltiples preparaciones de varios mg cada una a alta concentración (al menos 5 mg/ml, mejor 10-20 mg/ml o más)- alta pureza, tanto “química” como “conformacional”

estrategias de cristalización- en primera instancia probar ~100 condiciones muy diferentes- barrido de precipitantes vs pH (4-10) y temperatura (5 ºC y 20 ºC) - optimización de las condiciones más prometedoras (ajuste fino, aditivos)

métodos de cristalización- difusión de vapor, “micro-batch”, otros

métodos de cristalizacióndifusión de vapor: gotas colgantes, sentadas o “sandwich”

métodos de cristalización“micro-batch”: placas Terazaki, “gotas flotantes”

métodos de cristalizaciónmicro-diálise: “botones”

cristalografía de macromoléculas

datos “nativos”: hasta varios cientos de imágenes como esta

si se conoce una estructura relacionada (> 30% de identidad en secuencia), resolución de la estructura por “Molecular Replacement” (reemplazamiento molecular) puede ser posible (MR)

si no se conoce una estructura homóloga:MIR: Multiple Isomorphous Replacement, utilizando varios

“derivados” de átomos pesados - importancia del isomorfismo, encontrar derivados útiles puede ser complicado

SIR: MIR pero con un solo derivado, normalmente aprovechando la señal anómala (Anomalous Signal, SIRAS)

MAD: Multi-wavelength Anomalous Dispersion, utilizando un derivado o una proteína modificada con Se-Met (ácido nucleíco con Br)

SAD: Single-wavelength Anomalous Dispersion

cuellos de botella típicos

- la proteína no expresa- la proteína se expresa de forma insoluble- la proteína es difícil de purificar- la proteína no cristaliza- los cristales obtenidos no difractan rayos X- no se encuentran derivados útiles

duración típica de un proyecto: 3 meses - 3 años (o infinito)

proteómica / genómica estructural

determinación de todas las estructuras 3D de todas las proteínas de un determinado organismo (Homo sapiens, Mycobacterium tuberculosis)

a diferencia de la biología estructural “tradicional”, determinación deestructuras de proteínas antes de saber su función

clonaje, expresión, purificación y cristalización en paralela - economía de escala

- tasa de éxito individual limitado: 10-20%

proteómica / genómica estructural

determinación de todas las estructuras 3D de todas las proteínas de un determinado organismo (Homo sapiens, Mycobacterium tuberculosis)

a diferencia de la biología estructural “tradicional”, determinación deestructuras de proteínas antes de saber su función

clonaje, expresión, purificación y cristalización en paralela - economía de escala

- tasa de éxito individual limitado: 10-20%

spin-off: tecnología como vectores de expresión, automatización,etc.

expresión, purificación

cristalización recogida de datos

resolución estructura

año

fibra corta del bacteriofago T4

EMBL Grenoble, FR

Leiden University, NL

Leiden University, NL

USC 2003

proteína de fusión fibritin / “foldon”

IBS, Grenoble, FR

IBS, Grenoble, FR

USC USC 2004

“tailspike” del

bacteriofago Det7

Profos, Regensburg, DE

USC USC USC 2004

proteína sigmaC del reovirus aviar

USC USC USC USC 2005

cabeza fibra larga adenovirus aviar

USC USC USC USC 2006

adenovirus reovirus aviar

estructuras de fibras virales

morfología

- dominio central proporciona “alcance”- en general triméricas:

- coiled coil - estructura beta

proteínas estables (SDS, urea, temperatura, proteasas)

dominio de unión al receptor

dominio de unión al virus

adenovirus

- icosaédrico- caras : hexon, proteína trimérica- vertices: penton, base pentamérica, en el cual una fibra trimérica estáinsertada- cabeza de la fibra une receptor, en humanos CAR (Coxsackievirus and Adenovirus Receptor)

adenovirus aviar (CELO, FAV1) - no es un patógeno importante, pero uso potencial como vacuna- dos fibras en cada base del penton:. fibra larga, no-esencial, receptor CAR?. fibra corta, esencial para infección in vitro, receptor desconocido

estructura de la cabeza de la fibra largaresuelta por SIRAS con derivado de cloruro de metilmercurio y refinadocon datos nativos a 1.6 Å de resolución

en colaboración con Patrick Langlois, Ploufragan, Francia

cabeza de la fibra larga

.......---A---.......................----B-----..----C----..AD2 ITIGNKNDDKLTLWT.TPDP.SPNCR.....IHSDNDCKFTLVLTKCGSQVLATVAALAV 441 ...........|.........|.....................|...|..|..|......LFH .......PEVATYHCGDNLLESYDIFASLPNTNAAK.VAAYCRLAAAGGVVSGTIQVTS. 633 ..................d..sp............k.........K.............v

..................---D----.....................-E--..F-.....AD2 SGDLSSM......TGTVASVSIFLRFDQNGVLM....ENSSLKKHYWNFRNGNSTNANPY 491 .....................|................|.|...................LFH ..YAGRWPKVGNSVTDGIKFAIVVS....PPMDKDPRSNLSQWLG.ATVF.......PAG 679 k..........................................k.y....n..st.....

......................................---G---..........---H-AD2 TNAVGFMPNLLAY..PKTQ.............SQTAKNNIVSQVYLH...GDKTKPMILT 533 .....|.||........|........................................|.LFH ATTALFSPNPYGSLNTITTLPSIASDWYVPESNLVT..YTKIHFKPTGSQQLQLASGELV 737 ...............P.p..........................................

---..............---I----.........................--J----...AD2 ITLNGTSESTETSEVSTYSMSFTWSW....ESGKYT......TETFATNSYTFSYIAQE. 582 ........|....................................|.|....|.|.....LFH VAAA...KSPV.QTTKYELIYLGFTLKQNSSGTNFFDPNASSDLSFLTPPIPFTYLGYYQ 793 ............................................................

alineamiento de las secuencias de las cabezas de la fibra del adenovirus humano tipo 2 (AD2) y la fibra larga del adenovirus aviar basados en la estructura identifica pocos aminoácidos implicados en unión a CAR conservados

rojo: cabeza de la fibra larga del adenovirus aviaramarillo: cabeza de la fibra del adenovirus humano tipo 12azul: dominio 1 de CAR

la fibra larga del adenovirus aviar probablemente no une CARo lo hace de manera diferente que adenovirus humano

reovirus aviar- patógeno importante- genoma: 10 dsRNAs- 8 proteínas estructurales y 4 no-estructurales- cubierta interna: A, A, C- cubierta externa: C (fibra) - receptor desconocido

en colaboración con Javier Benavente, USC

A

C

C A

estructura del dominio C-terminal de sigmaC, el dominio de unión al receptor de la fibra del reovirus aviar

- resuelto por MAD con derivado de cloruro de metilmercurio y refinadocon datos nativos a 2.1 Å de resolución

- lamina beta circular DABC-HEFG con bucle DE largo

- dos repeticiones de espiral beta triple

aminoácidos conservados en todas las cepas del reovirus aviar en la superficie del trímero

futuroinvestigación• cristalografía de proteínas

(no solo virales)• proyecto EU Artizymes

“desarrollo de metalo-enzimas artificiales que contienen metales de transición”

• proyecto EU BeNatural “nano-materiales biotecnológicos para investigación y aplicaciones”

recursos• cristalización de

macromoléculas

- robot de cristalización• plataforma de expresión y

purificación de proteínas para estudios estructurales

- bacterias- (baculovirus, levadura,

células de mamífero)• clonaje en vectores de

expresión paralelo

agradécese a colaboración de:• Lois Hermo, Pablo Guardado, Patricia Ferraces, Antonio

Llamas • grupo de Javier Benavente e José Martinez-Costas• Gavin Fox, ESRF Spanish beamline BM16• unidade de difracción de raios X (RIAIDT)• financiamento:

EU: proxectos Artizymes e BeNatural

MEC: BFU2005-02974, BFU2005-24982-E (ESF: proxecto FolProCom, EuroSCOPE), HG2005-0012 (acción integrada Grecia)

Xunta de Galicia: incentivo Artizymes, infraestructura (FPLC)