Desarrollo de Productos Desarrollo de Productos Naturales Fitoterapéuticos y Naturales Fitoterapéuticos y Cosmecéuticos a partir de Cosmecéuticos a partir de Plantas nativas de BoliviaPlantas nativas de Bolivia

Dra. Giovanna AlmanzaDra. Giovanna AlmanzaLaboratorio de Bio-orgánicaLaboratorio de Bio-orgánica

Instituto de Investigaciones QuímicasInstituto de Investigaciones QuímicasUMSAUMSA

Definición de Productos Fitoterapéuticos y Cosmecéuticos

Los productos fitoterapéuticos son aquellos productos con propiedades terapéuticas que tienen como principio activo un extracto o “fitocomplejo” de una planta medicinal

También son llamados: Productos Naturales (Perú), Medicamentos Naturales (Bolivia) o Productos Fitofármacos, entre otros.

Los productos naturales Cosmecéuticos son aquellos cosméticos de origen natural que además tienen alguna propiedad terapéutica

BOLIVIA UN PAIS MEGADIVERSO

Importancia de Productos NaturalesLas plantas medicinales representan cerca del 25% del total de las prescripciones médicas en los países industrializados. En los países en desarrollo representa el 80% del arsenal terapéutico.

El 25% de los fármacos para la salud está constituido por moléculas de origen vegetal

Plantas como Biofábricas Escasez de nuevos descubrimientos por los procesos

tradicionales de síntesis química.

biological

Natural Product

Derived from NP

synthetic

Syntheticfrom N

NP mimic

NP mimic

Drug Dicovery Today, 10, 2005

LOS COSTOS DE UN PRODUCTO FARMOQUIMICOLOS COSTOS DE UN PRODUCTO FARMOQUIMICO

Importancia de Productos Naturales Fitoterapéuticos y Cosmecéuticos

Los productos naturales tienen una aceptación cada vez mayor en el mercado farmacéutico y cosmético, particularmente aquellos que cuentan con el debido respaldo científico que asegura su eficacia e inocuidad.

…el “producto natural” es más seguro más manejable y menos tóxico que un producto sintético (no se han observado efectos colaterales – prevención de enfermedades no cura de enfermedades)

Los extractos o los fitocomplejos están constituidos por varias moléculas bioactivas algunas potencialmente tóxicas, la concentración podría ser crucial!!!

Las pruebas científico-clínicas se constituyen en la parte más importante y más requerida en países como Bolivia, para la industrialización de estos productos con fines de comercialización interna y externa

El mercado de “Productos Naturales” está creciendo a nivel internacional, particularmente en países como Canada, Japón, Dinamarca, Paises Bajos y Alemania.

Ciclo de Producción primariaActores: Productores, Proveedores,Agrónomos, biólogos, ONG, Programa de Biocomercio

Cultivo orgánico

Almacenamiento, secado y molienda

Ciclo de Transformación y Mercadeo

Actores: Industria Farmacéutica

Transformación a forma farmacéutica

Control de calidad

Investigación de mercado

Marketing y comercialización

Ciclo de Investigación, Desarrollo e InnovaciónActores: InvestigadoresIdentificación de potencialesProductos FitoterapéuticosRespaldo científico-clínico deProductos fitoterapéuticosObtención, control y estandarización del principio activo (Extracto)

Socios estratégicos:

Gobierno

ONGs

Médicos Tradicionales

Naturistas

COMPLEJO PRODUCTIVO

UMSA-LAFAR-FHI

Bolivia cuenta hoy con una ley de Medicamentos No 1737, sancionada el 17 de diciembre de 1996 y su decreto supremo reglamentario No 24672 del 21 de junio de 1997. Complementando esta ley y considerando que Bolivia cuenta con un importante potencial fármaco-botánico y una tradición milenaria en el uso de las plantas medicinales, en 1999 se dicta en La Paz las Normas para Medicamentos Naturales Tradicionales y Homeopáticos

Acción terapéutica Patología tratada Ensayo microbiológico Ensayo pre- clínico /farmacológico / experimentales Ensayo toxicológico Eficacia / Efectos clínicos (si corresponde) Características fisicoquímicas Características macroscópìcas Características microscópicas: Histiología, morfología. Ensayo Fitoquímico (identificación de principios activos, si corresponde) Estudios de estabilidad Propiedades organolépticas Almacenamiento/Conservación Características botánicas Evaluación de riesgos Toxicología / Inocuidad Uso tradicional / Etnobotánica

NORMATIVA EN BOLIVIA

Metodología para la investigación química de fitofármacos (OMS) (Napralert- Illinois- 1999)

Etapa I:

Confección del informe de revisión bibliográfica sobre la composición química de la especie Preparación de extractos alcoholicos o hidroalcohólicos (30-80 % v/v) Realización del screening Fitoquímico para determinar tipos deMetabolitos secundarios presentes en la planta. Realización de un screening toxicológico y farmacológico: Extractos secos (Liofilización o rotaevaporación a sequedad)

Caracterización fitoquímica preliminar

Etapa II:Determinación de componentes bioactivos

Estudio fitoquímico (bioguiado)Aislamiento y elucidación estructural del principio (s) activo (s)Evaluación farmacológica in vitro e in vivo

Se analizará por el Comité de Expertos.Métodos de fraccionamiento para obtener fracciones de mayor acciónfarmacológica.

Crear procedimiento de extracción en mayor escala para obtener más cantidad de sustancia activa para estudios de Farmacología yToxicología.

Una vez conocido el compuesto o los compuestos que poseen actividad (fitocomplejo)

Marcadores químicos de Control de Calidad de los extractos a utilizarse en los productos fitoterapéuticos

Etapa III:Establecimiento de técnicas de análisis de marcadores químicos de actividad .

Desarrollar técnicas analíticas para determinar la concentración de loscompuestos relacionados con la acción farmacológica ( GC/MS- HPLC-TLC).

¿Qué parte de la planta posee mayor principio activo?.¿Cuál es la mejor etapa de recolección?

Desarrollar métodos físicos, químicos y físicoquímicos que permitan caracterizar farmacognosticamente la planta o parte de la planta con fines de normalización y diferenciación quimiotaxonómicade especies.Desarrollar métodos físicos, químicos y físicoquímicos que permitanobtener especificaciones de calidad del extracto activo por su normalización después de desarrollado su proceso tecnológico.

Etapa IV: Establecimiento de las especificacionesde calidad del producto fitoterapéutico

Responsabilidad del Comité de Expertos determinar la formafarmacéutica más aconsejable según su uso y destino.

Se validarán los métodos químicos, físicos y físico químicos paraestablecer especificaciones de calidad, para su normalización y registro

Selección de plantas

En el campo científico, hasta ahora se han realizado los estudios químicos y biológicos preliminares de 26 especies vegetales reconocidas en el Ministerio de Salud por su uso tradicional, dando varias publicaciones en revistas científicas del área.

Entre estas especies estudiadas resultaron muy interesantes las Chillkhas

Etapa IEstudio

Preliminar

B. latifolia (Chillkha negra) B. pentlandii (Chillkha clara) B. papillosa antes B.

obtusifolia (Chillkha redonda, jathun thola)

Tienen un reconocido uso tradicional en Bolivia y otros países latinoamericanos, en el tratamiento de enfermedades como el reumatismo, problemas del hígado y principalmente se usan en cataplasmas para aliviar inflamaciones externas causadas por fracturas y dislocaciones

Baccharis latifolia

Chillkhas

B. papillosasubsp. papillosa

Etapa IEstudio

Preliminar

Antecedentes químicos del género Baccharis

La familia americana del género Baccharis abarca cerca de 400 especies, de las cuales más de 60 especies han sido investigadas químicamente, aislándose principalmente flavonoides y diterpenos tipo clerodano, labdano y kaurano CHO

O

O

OR''

R'O

OR

O

B. alaternoides

B. oxydonta

OH

CHO

B. munitiflora

Etapa IEstudio

Preliminar

Actividad antioxidante de flavonoides

Los compuestos flavonoidicos han sido estudiados por su actividad biológica en diversos campos. Particularmente son bien conocidos como antioxidantes a través de diferentes mecanismos, como:

Scavengers de radicales libres Inhibidores de procesos de

lipoperoxidación Acomplejantes de metales de

transición

Etapa IEstudio

Preliminar

Relación de Ac. Antioxidante con otras actividades (Antiinflamatoria)

ActividadAntioxidante

Inhiben la formación de ROS

Inhiben la reactividadde ROS(Scavengers of free radicals)

.

Búsqueda basada en datos etnofarmacológicos:Plantas usadas para inflamaciones,Asma, problemas hepáticos, entre otros

Actividad Antinflamatoria

Actividad Anticancerígena

Actividad Antimiutagénica

Enfermedades de piel

Enfermedades neurodegenerativas

Pancreatitis y Hepatitis

Etapa IEstudio

Preliminar

Estudio fitoquímico y farmacológico preliminar

Etapa IEstudio

Preliminar

Especie Esteroles Triterpen

os

Taninos Flavonoides

Saponinas Alcaloides

ABTS(%I)

B. boliviensis ++ + +++ - - 52.8

B. Incarum +++ - ++ +++ +/- 42.2

B. latifolia ++ - ++ + +/- 85.9

B. santelices + - ++ + - 96.8

B. papillosa ++ - ++ + - 89.3

B. pentlandii ++ - ++ + - 57.8

B. leptophylla +++ - +++ + - 40.3

B. genistilloides

+ - ++ + - 79.8

Baccharis sp + ++ +++ +/- +/- 48.3

Treatmente Extract Dose PGE2 (ng/ml)a LTC4 (ng/ml)a

Control – – 0.1±0.5 0.4±0.1

Cells alone – – 0.0±0.3 0.0±0.2

Indomethacin – 100 µM 0.0±0.1** –

NDGA – 25 µM – 0.0±0.2**

Baccharis obtusifolia Hexanic 12.5 µg/ml – –

Dichloromethanic 25 µg/ml – 0.0±0.3**

Ethanolic 200µg/ml – 0.0±0.2**

Aqueous 200µg/ml – 0.0±0.9**

Baccharis latifolia Hexanic 25 µg/ml 0.0±0.2** 0.0±0.2**

Dichloromethanic 25 µg/ml 0.0±0.1** –

Ethanolic 200µg/ml 0.0±0.5** 0.0±0.1**

Aqueous 200µg/ml 0.0±0.2* 0.0±0.7**

Baccharis pentlandii Hexanic 12.5 µg/ml 0.0±0.2** –

Dichloromethanic 50 µg/ml 0.0±0.5** 0.0±0.2**

Ethanolic 200µg/ml 0.0±0.1** 0.0±0.2**

Aqueous 200µg/ml – –

a All values are mean±S.E.* Significant (Student’s t-test P < 0.05).** Significant (Student’s t-test P < 0.01).

Journal of Ethnopharmacology 103 (2006) 338–344

Chillkhas – Ac. Antiinflamatoria in vitroEtapa I

Estudio Preliminar

Chillkhas- Ac. Antiinflamatoria in vivo

Eduardo Gonzales et.al. Revista Boliviana de Química 2007

Etapa IEstudio

Preliminar

Especies seleccionadas para estudios más profundos

Baccharis latifolia Baccharis papillosa subsp.

papillosa

Etapa IIComp. Ac.

Met. Ex.

Compuestos aislados anteriormente en B. obtusifolia

24

Zdero, C. 1987

Vivanco, O. 2004

extracto metanólico

extracto etanólico

extracto diclorometánico

extracto hexánico

Estudio fitoquímico preliminar sobre extractos en B. obtusifolia

Obtención de extractos enriquecidos en componentes activos

Metodología UV de optimización de Extracto EtanólicoColecta 1 (Julio 2006) : 20,68% Colecta 2 (Enero 2007) : 16,46%

Etapa IIComp. Ac.

Met. Ex.

Metodología ácido base de obtención de Extracto fenólico de polaridad media Colecta 1 (Julio 2006) : 5.34 % Colecta 2 (Enero 2007): 5.52%

Univ. Oscar Mamani

Univ. Rodrigo Villagomez

Aislamiento de comp. fenólicosde B. papillosa antes B. obtusifolia

O

O

O

OH

HO

OH

Zil-2 and Zil-4

O

O

O

OH

HO

O

Zil-1

OH

HOOC

Zil-7 and Zil-8

O

O

O

OH

HO

OH

Zil-12

OH

Planta % Ex. ETOH(planta seca)

% Ex. Fenólico(ex. EtOH)

B. latifolia 15,2 % 37,4 %

B. pentlandii 10,2 % 23,5 %

B. obtusifolia 18,3 % 25,8 %

Se obtuvo un extracto menos complejo y rico en compuestos de interés

Tesis Zilma Escobar

Etapa IIComp. Ac.

Met. Ex.

Se estudio sobre la región UVB (290-320) Y UVA (320-400) , por ser causantes de enfermedades tales como el cáncer de piel, daño a los ojos, envejecimiento prematuro de la piel, debilitamiento

del sistema inmunologico.

27

Determinación de Determinación de absorbancia UVabsorbancia UV

Etapa IIComp. Ac.

Met. Ex.

28UVB (290-320) UVA (320-400)

72 Hrs 0.2 g/L15 min 0.2 g/L

Extractos etanólicos

Etapa IIComp. Ac.

Met. Ex.Estudio de Absorbancia UV de extractos etanòlicos

29

344 / 1.49

312 / 1.88

347 / 1.08

356 / 2.12

UVB (290-320) UVA (320-400)

Etapa IIComp. Ac.

Met. Ex.

Estudio de Absorbancia UV de Compuestos aislados

30

Cuantificación y Cuantificación y rendimientos rendimientos

Julio

Enero

BP-1 BP-2 BP-3 BP-4

Etapa IIComp. Ac.

Met. Ex.

Compuesto

Primera

mediciónTAC µmol/l

Segunda

mediciónTAC µmol/l

Tercera

mediciónTAC µmol/l

PromedioTAC final

µmol/l

Desviación

estándar

BP-1 0.231 0.231 0.238 0.23 0.002

BP-2 0.087 0.087 0.071 0.08 0.005

BP-3 0.705 0.705 0.707 0.70 0.001

BP-4 1.744 1.723 1.656 1.71 0.003

CompuestoPrimera

mediciónTAC µmol/l

Segunda

mediciónTAC µmol/l

Tercera

mediciónTAC µmol/l

PromedioTAC final

µmol/l

Desviación

estándar

BP-1 0.120 0.120 0.124 0.12 0.001

BP-2 0.088 0.088 0.086 0.08 0.002

BP-3 0.385 0.385 0.398 0.39 0.002

BP-4 1.042 1.042 1.073 1.05 0.003

METODO FRAP TROLOX (TAC =1)

METODO ABTS TROLOX (TAC =1)

REALIZADO POR LIC. LESLIE TEJEDA 31

Estudio de la actividad Estudio de la actividad antioxidante FRAP y ABTSantioxidante FRAP y ABTS

Etapa IIComp. Ac.

Met. Ex.

32

BP-1-mayor actividad antiinflamatoria que la indometacina-antineoplasica, contra Adenocarcinoma, Leucemia, Sarcoma.-contra virus de Herpes.-hepatoprotector

BP-2-Antiinflamatorio (patentado)-Inhibe células tumorales-combate el chagas (epimastigotes de Trypanosoma cruzi)-hepatoprotector

BP-3-combate el cáncer: colon, próstata, estomacal y de sangre.-dermatofitosis.-afecciones pulmonares.

BP-4-antiinflamatoria-Alzhaimer.-Antioxidante.-Diabetes.-Asma.

Revisión de actividades biológicas

Etapa IIComp. Ac.

Met. Ex.

Potencial producto fitoterapéutico “CREMA ANTIINFLAMATORIA NATURAL”

Potencial producto cosmecéuticos“CREMA FOTOPROTECTORA NATURAL”

Estudios de Productos Fitoterapéuticos

Extractos bioactivos con Compuestos de reconocido interés biológico

Estudios biológicos complementarios para probar su seguridad y eficacia

Ensayos pre-clínicos y clínicos

Producción de fitofármacos

Control de calidad (técnicas analíticas para los marcadores químicos

Producción y Registro

Empresa Farmacéutica LAFAR S.A.

Mercado

Cultivos

Producción de materia prima

Identificacion compuestos activos (Marcadores químicos)

Financiamiento

ASDI 2004-2010

FEMCIDI-OEA 2008-2010

Otros financiamientos:

LAFAR S.A. (100.000 Bs), IDH (520.000 Bs 2007-2009)

B. latifoliaB. papillosa

IIQ, IBMB, IIFB, Medicina, IE, Agronomia

Envasado de cremas

Medición del índice de acidez y del PH

Potencial producto fitoterapeutico – Preparación de cremas LAFAR S.A.

36

Análisis cromatográfico: Análisis cromatográfico: TLC y HPLC-MSTLC y HPLC-MS

Diclorometano – Metanol 5%

1 2 3 4 5 6 7 8

BP-1 BP-2 BP-3 BP-4

1 2 3 4 5 6 7 8

BP-1 BP-2 BP-3 BP-4

1 2 3 4 5 6 7 8

ACIDO SULFURICO CLORURO FERRICO

Etapa IIITécnicasAnalíticas

BP-1 BP-2 BP-3

BP-4

37

B. papillosa subsp. papillosaExt. ETOH 15 min0.156 g/L

B. papillosa subsp. papillosacompuestos puros0.6 g/L

Metodología HPLC para el control de extractos

Etapa IIITécnicasAnalíticas

3838

317.1114

C16H12O7

316.3 g/mol

301.1212

C16H12O6

300.3 g/mol

233.1600

C14H16O3

232.3 g/mol

315.1448

C17H14O6

314.2 g/mol

Etapa IIITécnicasAnalíticas

Absorbancia UV de diferentes extractos de Baccharis. Potencial fotoprotector B. papillosa

Evaluación fotoprotectora en bacterias Echerichia coli

En correlación con los datos de absorbancia UV. La B. papillosa es la que mejores resultados muestra

Toxicidad en Drosophila melanogasterB. latifolia

Alta bioactivacion

0102030405060708090

100

0mg/

ml

1mg/

ml

2mg/

ml

4mg/

ml

6mg/

ml

8mg/

ml

concentración

sob

revi

vien

tes

UVAT- IBMB

Genotoxicidad SMARTSomatic Mutation and Recombination Test

CN URE MMC 1 2 4 6 8

109876543210Fr

ec. M

anch

as/ I

ndivi

duo

UVAT- IBMB

A. Pillco y G. Rodrigo, “Estudio genotoxicológico de Baccharis latifolia”, Biofarbo, Vol XII, Nº12, p. 21, 2005

Para este estudio se utilizaron 25 ratones de 25 a 20 gramos de peso, separados en grupos de 5, donde se probaron la fórmula 1 y la fórmula 3 de la pomada de chillkha, además del extracto puro de chillkha y de otras pomadas antiinflamatorias como la hidrocortisona y el diclofenaco sódico. Primeramente se les colocó al nivel de las orejas Croton una sustancia irritante que provoca inflamación. Luego se les colocó las pomadas mencionadas anteriormente. Posteriormente se espera por un lapso de 4 horas y se procede a eliminar a los ratones mediante una tracción cervical y se les corta las orejas, seguido a esto se procede a medir el peso de las orejas. Se supone que la crema más eficaz es aquella donde se obtuvo el menor peso.

Actividad Antiinflamatoria in vivo -IIFB

Estudios pre-clínicos de cremas anti-inflamatorias

Peso Promedio

DS ES % Reducción inflamación

Grupo Control 0,00975 0,002861 0,00143

Grupo Diclofenaco

0,00725 0,004437 0,00222 25,6%

Grupo Hidrocortisona

0,005 0,001247 0,00061 48,7%

Grupo Indometacina

0,004 0,001414 0,00071 58,9%

Grupo Formula 0,1%

0,0064 0,001496 0,00066 34,3%

Grupo Formula 1%

0,0048 0,0016 0,00071 50,7%

Grupo Extracto 0,002135 0,0038 0,0009 78,1%

Estudios pre-clínicos preliminares de Actividad Antiinflamatoria - IIFB

Toxicidad aguda del Extracto

Ensayos clínicos de Crema de Chillkha 1%

Participantes - IIQ-UMSA (Laboratorio de Bioorgánica del Instituto de Investigaciones Químicas

de la Universidad Mayor de San Andrés) Giovanna Almanza, Yonny Flores, Oscar Mamani, Angela San Martín, Santiago

Tarqui, Arnold Tito, Rodrigo Villagomez, Cecilia Curi, Jimena Yupanqui y Zilma escobar

- IBMB-UMSA (Unidad de Biotecnología Vegetal y Unidad de Genotoxicología del Instituto de Biología Molecular y Biotecnología de la Universidad Mayor de San Andrés)

Oscar Plata, Juan Carlos Bermejo, Freddy Arano, Carmen Ormachea y Jorge Quezada

- UVAG-IBMB-UMSA (Unidad de Vigilancia Ambiental y Genotoxicidad del Instituto de Biología Molecular y Biotecnología de la Universidad Mayor de San Andrés)

Gloria Rodrigo - US-IE (Unidad de Suelos, Instituto de Ecología de la Universidad Mayor de San

Andrés) Patricia Amurrio - LPB-UMSA (Herbario Nacional de Bolivia, Instituto de Ecología de la Universidad

Mayor de San Andrés) Esther Valenzuela - IIFB-UMSA (Laboratorio de Farmacología del Instituto de Investigaciones

Fármaco Bioquímicas de la Universidad Mayor de San Andrés) Eduardo Gonzales, Daly Apaza Ticona, Claudia Godoy Puente, Brenda Siñani

Callisaya - Medicina-UMSA (Departamento de Bioquímica de la Facultad de Medicina de la

Universidad Mayor de San Andrés) Lily Salcedo - LAFAR S.A. (Laboratorios Farmacéuticos Sociedad Anónima) Enrique Ocampo, Roger Cabezas, Mauricio Saavedra - Centro Privado de Rehabilitación (Zona de Miraflores) y Clínica de la “Liga

Deportiva Mejillones” de la ciudad de La Paz Dalton Salinas, Abraham Flores

Agradecimientos especiales a ASDI-SarecPor el financiamiento de los estudios químicos, el equipamiento obtenido y la formación de RRHH

A la UMSA por los fondos IDH otorgados el 2007, 2008 y 2009, los RRHH y la infraestructura

A LAFAR S.A. por el financiamiento de estudiantes y la preparación de cremas

A la OEA por el nuevo impulso que está dando al proyecto

A todos los que ya participaron y los que tienen interés en participar por creer en el proyecto

Gracias