COMPETENCIA DE PSEUDOMONAS Y LACTOBACILLUS EN LA ...
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UNIVERSIDAD DE OVIEDO MASTER UNIVERSITARIO EN BIOTECNOLOGÍA ALIMENTARIA “COMPETENCIA DE PSEUDOMONAS Y LACTOBACILLUS EN LA PRODUCCIÓN DE ÁCIDOS LÁCTICO Y LACTOBIÓNICO PARA USO EN ALIMENTOS FUNCIONALES” TRABAJO FIN DE MASTER POR MELISA VIGIL GARCIA JULIO, 2015
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UNIVERSIDAD DE OVIEDO
MASTER UNIVERSITARIO EN BIOTECNOLOGÍA
ALIMENTARIA
“COMPETENCIA DE PSEUDOMONAS Y
LACTOBACILLUS EN LA PRODUCCIÓN
DE ÁCIDOS LÁCTICO Y
LACTOBIÓNICO PARA USO EN
ALIMENTOS FUNCIONALES”
TRABAJO FIN DE MASTER
POR
MELISA VIGIL GARCIA
JULIO, 2015
RESUMEN
El interés en la reutilización y revalorización de los subproductos crece a la vez
que lo hace la preocupación por el medio ambiente. En el presente trabajo se estudia la
utilización de suero de queso, residuo altamente contaminante de la industria
alimentaria, para producir ácidos orgánicos, en concreto ácido láctico y lactobiónico con
las bacterias Lactobacillus Casei y Pseudomona Taetrolens. Estos ácidos son de gran
interés en muchos sectores de la industria como son alimentario, farmacéutico,
cosmético, químico y textil.
Se hace una comparación de los cultivos puros de cada bacteria con cultivos
mixtos, en condiciones favorables para cada bacteria y se utiliza citometría de flujo para
comprobar el estado fisiológico de las células durante el desarrollo de las
fermentaciones.
Los resultados obtenidos indican que las bacterias en general se desarrollan
mejor y son más productivas en los cultivos puros que en los mixtos además de que el
Lactobacillus Casei tolera mejor la presencia de la otra bacteria en ambos cocultivos
que dicha bacteria.
ABSTRACT
The interest in the reuse and revaluation of byproducts grows at the same time
than concern for the environment. In the present work it has been studied the valorization
of the cheese whey, an important byproduct of the food industry, to produce organic
acids, in particular lactic and lactobionic acids with Lactobacillus Casei and Pseudomona
Taetrolens bacterium. These acids are of great interest in many sectors of industry as
food, pharmaceutical, cosmetic, chemical and textile industries.
In this work, a comparison of the pure cultures and mixed cultures under
favorable conditions fermentations of each bacteria is carry out. Flow cytometry is used
to check the physiological state of cells during the fermentations development. This
technique has been revealed as very useful to follow the physiological state of the
biomass during the fermentation process.
The results obtained show that in general, the cells grow better and present
higher productivity in pure cultures than in mixed cultures. Moreover, the Lactobacillus
Casei bacteria tolerate better the presence of the other bacteria in both mixed cultures
than this bacteria.
INDICE
1. INTRODUCCIÓN 1
1.1. Objeto 3
2. CONSIDERACIONES TEÓRICAS 5
2.1. Mercado actual y producción del ácido láctico 6
2.2. Mercado actual y producción del ácido lactobiónico 7
2.3. Métodos de operación y seguimiento de los bioprocesos 9
2.3.1. Citometría de flujo 10
2.4. Separación de los productos 11
2.4.1. Separación del ácido láctico 11
2.4.2. Separación del ácido lactobiónico 11
2.5. Alimentos funcionales 12
2.6. Interés de la coproducción 13
2.6.1. Ejemplos de cocultivos 14
3. MATERIALES Y MÉTODOS 16
3.1. Medio de cultivo: suero de queso 17
3.2. Microorganismos 17
3.2.1. Lactobacillus Casei 17
3.2.2. Pseudomona Taetrolens 17
3.3. Fermentaciones: condiciones 18
3.3.1. Fermentación con Lactobacillus Casei 18
3.3.2. Fermentación con Pseudomona Taetrolens 18
3.3.3. Fermentación mixta 19
3.4. Toma de muestras y análisis 20
3.4.1. pH 20
3.4.2. Densidad óptica y siembra en placas 20
3.4.3. HPLC 20
3.4.4. Citometría de flujo 21
4. RESULTADOS 23
4.1. Evolución del pH 24
4.2. Densidad óptica 25
4.3. Recuento de placas 26
4.4. Evolución en la concentración de lactosa 30
4.5. Producción de ácido láctico 31
4.6. Producción de ácido lactobiónico 31
4.7. Evolución del estado fisiológico de los microorganismos 32
5. CONCLUSIONES 37
6. BIBLIOGRAFÍA 39
7. APÉNDICES 42
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Propiedades y características del ácido láctico. 7
Tabla 2. Propiedades y características del ácido lactobiónico. 8
Tabla 3. Resumen de datos de producción. 38
Tabla 4. Datos medios de pH de los cultivos. 43
Tabla 5. Datos medios de densidad óptica de los cultivos. 44
Tabla 6. Datos medios de UFCs de Lactobacillus Casei de los cultivos.
45
Tabla 7 Datos medios de UFCs de Pseudomona Taetrolens de los cultivos.
46
Tabla 8. Datos medios de concentración de lactosa de los cultivos.
47
Tabla 9. Datos medios de producción de ácido láctico de los cultivos.
48
Tabla 10. Datos medios de producción de ácido lactobiónico de los cultivos.
49
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Ácido láctico. 6
Figura 2. Ácido lactobiónico. 7
Figura 3. Esquema de funcionamiento del citómetro de flujo. 10
Figura 4. Esquema del proceso fermentativo con Lactobacillus Casei. 18
Figura 5. Esquema del proceso fermentativo con Pseudomona Taetrolens. 19
Figura 6. Equipo de cromatografía líquida de alta resolución. 21
Figura 7. Citómetro de flujo Cytomics FC 500. 22
Figura 8. Evolución del pH en las fermentaciones de Lactobacillus Casei (L.C.), Pseudomona Taetrolens (P.T.), cocultivo en condiciones de
L.C. y cocultivo en condiciones de P.T.
24
Figura 9. Evolución de la densidad óptica en las fermentaciones de L.C. puro, P.T. puro, cocultivo en condiciones de L.C. y cocultivo en condiciones de P.T.
25
Figura 10. Recuento de unidades formadoras de colonias (UFCs) en la fermentación de L.C. puro.
26
Figura 11. Placa de agar MRS con colonias de Lactobacillus Casei. 26
Figura 12. Recuento de UFCs en la fermentación de P.T. puro. 27
Figura 13. Placa de agar NB con colonias de Pseudomona Taetrolens. 27
Figura 14. Recuento de UFCs en la fermentación mixta en condiciones de L.C. 28
Figura 15. Placa de agar NB con colonias de P.T. poco desarrolladas. 29
Figura 16. Recuento de UFCs en la fermentación mixta en condiciones de P.T. 29
Figura 17. Placas de agar con contaminación. 30
Figura 18. Evolución de la concentración de lactosa en los cuatro cultivos. 30
Figura 19. Producción de ácido láctico en el cultivo puro de L.C. y los cocultivos.
31
Figura 20. Producción de ácido lactobiónico en el cultivo puro de P.T. y los cocultivos.
32
Figura 21. Evolución de la fermentación de L.C. puro con tinción CV6/IP. 32
Figura 22. Evolución de la fermentación de P.T. puro con tinción CV6/IP. 33
Figura 23. Evolución de la fermentación en C.C. L.C. con tinción CV6/IP. 33
Figura 24. Evolución de la fermentación de L.C. puro con tinción DiBAC/IP. 34
Figura 25. Evolución de la fermentación de P.T. puro con tinción DiBAC/IP. 35
Figura 26. Evolución de la fermentación en C.C. L.C. con tinción DiBAC/IP. 35
1. INTRODUCCIÓN
1. Introducción
2
El aprovechamiento de sustancias residuales como medida para el ahorro está
a la orden del día en todo el mundo. En todos los procesos de fabricación se obtienen
subproductos o residuos que suponen una reducción en el rendimiento de la operación,
y por tanto un coste. Estos subproductos necesitan ser eliminados de alguna forma, y
en muchas ocasiones pueden ser peligrosos para el medio ambiente, lo que exige de
tratamientos previos o métodos de eliminación más costosos. Por ello en la actualidad,
es primordial buscar alternativas que permitan la reutilización de estos subproductos
para obtener otros productos de valor añadido y reducir en la medida de lo posible la
cantidad de residuo generado, disminuyendo así los costes y creando nuevas fuentes
de ingresos.
En el estudio que se detalla a continuación se emplea suero de queso como
materia prima, que es el líquido resultante de la separación de la grasa y la caseína de
la leche durante el proceso de fabricación del queso. Este elemento, pese a ser
empleado en gran medida como complemento nutricional en piensos para la
alimentación de ganado, fuente de lactosa alimentaria, en la fabricación de fertilizantes
y como materia prima para la obtención de bioetanol (Spalatelu, 2012), supone un
problema debido a que la cantidad empleada para dichos usos es muy reducida en
comparación con las cantidades producidas anualmente en todo el planeta.
Las cantidades de este suero lácteo que se generan anualmente rondan los 160
millones de toneladas a nivel mundial, cifra que debido al aumento de producción de
queso aumenta año a año entre el 1 y 2% aproximadamente (Spalatelu, 2012;
Guimarães et al., 2010). Los residuos generados por el subsector lácteo fabricante de
queso suponen el 26% de los residuos totales generados por la industria alimentaria
(Alonso, 2013).
Comparando la cantidad de queso producido y los residuos que se generan se
puede determinar que por cada kilogramo de queso se producen alrededor de 9 litros
de suero (Guimarães et al. 2010; Siso, 1996), cantidad muy elevada para poder ser
aprovechada en su totalidad.
Por otro lado su aprovechamiento responde también a términos
medioambientales ya que es una sustancia altamente contaminante por su contenido
en proteínas, lípidos, minerales y sobre todo lactosa (5-6%). Este último componente
es el mayor responsable de los altos valores de DQO (entre 60 y 80 g/L) y de DBO (entre
30 y 50 g/L) que presenta el suero, lo que hace inviable su vertido directo a ríos, mares
y ni siquiera a la red de alcantarillado municipal puesto que el tratamiento recibido sería
1. Introducción
3
insuficiente. Un modo de rebajar la DQO es recuperando la proteína, pero solo se
conseguiría reducir en 10 g/L (Guimarães et al., 2010; Siso, 1996, Spalatelu, 2012) lo
que sigue siendo insuficiente. Su vertido supondría serios problemas de contaminación
para el medioambiente ya que afecta a las propiedades físicas y químicas del suelo
dificultando el ejercicio de la agricultura en la zona, y en el caso de ríos, mares o lagos
rebajaría peligrosamente la concentración de oxígeno resultando así mortal para todo
tipo de vida acuífera (Panesar et al., 2007). El suero lácteo es considerado el residuo
más contaminante de la industria alimentaria.
La revalorización de este suero mediante aplicaciones biotecnológicas dando
lugar a productos de gran interés comercial como son los ácidos orgánicos supone un
gran ahorro en tratamiento de residuos a la vez que una nueva fuente de ingresos
deseable en toda industria. Dado el gran volumen disponible, cuya reducción es
imposible por otros métodos, es viable una implantación de estas operaciones
biotecnológicas a escala industrial.
En este caso, los ácidos orgánicos que se van a estudiar son ampliamente
utilizados en la industria textil, alimentaria y farmacéutica. Estos ácidos pueden
obtenerse mediante síntesis química pero por razones que serán explicadas en el
siguiente capítulo es interesante su producción biotecnológica y eso hace que se esté
en plena investigación y desarrollo de métodos eficientes y económicos.
1.1. OBJETIVO
En este trabajo se va a estudiar el uso del suero como materia prima para la
producción biotecnológica conjunta de algunos ácidos orgánicos, en concreto ácido
láctico y lactobiónico, utilizando para ello las especies Lactobacillus Casei y
Pseudomona Taetrolens. Los objetivos de este trabajo son:
El estudio de condiciones de operación diferentes, cada una favorable a
una de las bacterias en cuanto a aireación, agitación y temperatura de
incubación.
La comparación de los experimentos en cocultivo con los cultivos puros
de cada bacteria.
1. Introducción
4
Establecer las mejores condiciones de operación en cocultivos para el
caso concreto de estas dos bacterias.
Utilizar citometría de flujo para comprobar el estado fisiológico de las
células durante los experimentos.
Analizar del progreso de las fermentaciones mediante cromatografía
líquida de alta resolución, medida del pH, densidad óptica y recuento de
unidades formadoras de colonias.
2. CONSIDERACIONES TEÓRICAS
2. Consideraciones teóricas
6
2.1. MERCADO ACTUAL Y PRODUCCIÓN DEL ÁCIDO LÁCTICO
El ácido láctico, ó ácido 2-hidroxipropanoico (figura 1), fue reconocido como
producto de fermentación por Blondeaur ya en el año 1847 (Serna-Cock, 2005), pero
aun en la actualidad continúan las investigaciones para el desarrollo de nuevas técnicas
de fermentación a nivel industrial que consigan disminuir los costes de producción a
través del uso de materias primas recicladas, nuevos microorganismos que alcancen
altas concentraciones de producto y altos rendimientos, y nuevas técnicas de
separación y purificación. Aun así, en el año 2010 fabricantes como Purac, Cargill y
Galactic alcanzaron una producción total de unas 250000 toneladas de ácido láctico por
vía fermentativa (Alonso, 2013), que suponen un 90% de la producción total de ácido
láctico (Panesar et al., 2007).
Figura 1. Ácido láctico.
Este ácido se puede obtener por síntesis química mediante la reacción de
acetaldehído con ácido cianhídrico, lo que produce lactonitrilo que se hidroliza a ácido
láctico, y también mediante la reacción a alta presión de acetaldehído con monóxido de
carbono y agua en presencia de un catalizador que en este caso es ácido sulfúrico
(Serna-Cock, 2005). El problema que deriva de la producción de ácido láctico mediante
síntesis química es que el producto obtenido es una mezcla racémica de los isómeros
L y D ópticamente inactivos, mientras que la producción biotecnológica genera isómeros
puros ópticamente activos (se presentan sus propiedades en la tabla 1) esenciales para
la producción de nuevos polímeros biodegradables, concretamente el ácido poliláctico
(PLA) (Alonso et al., 2010; Panesar et al., 2010). Este polímero se está introduciendo
en el mercado como un gran sustituto de otros polímeros de origen petroquímico.
Además de la producción de plásticos biodegradables, los isómeros ópticamente
activos L(+) son utilizados en la industria alimentaria como conservantes y acidulantes
ya que son el único tipo de ácido láctico metabolizable por el cuerpo humano (Panesar
et al., 2010). Este ácido en general también es utilizado en la industria química como
solubilizador y agente controlador de pH, en la industria farmacéutica para la producción
2. Consideraciones teóricas
7
de medicamentos por sus sales de hierro y calcio, en la industria textil para el teñido y
la impresión y en agricultura como acidulante (Serna-Cock, 2005; Alonso, 2013).
Tabla 1. Propiedades y características del ácido láctico (Alonso, 2010; Serna-Cock,
2005).
Fórmula C3H6O3
Peso molecular 90,08
Punto de fusión (ºC) 52,8 - 54
Punto de ebullición (ºC) 125 - 140
Viscosidad (Ns/m2) 0,040
Densidad (kg/m3) 1,249
Naturaleza Líquida
Precio unitario (€/kg) 1,55
2.2. MERCADO ACTUAL Y PRODUCCIÓN DEL ÁCIDO LACTOBIÓNICO
El ácido lactobiónico (4-O-β-D-galactopyranosiyl-D-gluconic acid) (figura 2) es
ampliamente utilizado en la industria farmacéutica, cosmética, alimentaria y química
debido a sus propiedades antioxidantes, quelantes y humectantes.
Figura 2. Ácido lactobiónico.
Su formación consiste en la oxidación del grupo aldehído libre de la glucosa que
forma la molécula de lactosa a un grupo carboxilo. Existen diversos métodos para
provocar esta reacción como pueden ser métodos químicos, electroquímicos,
biocatalíticos y oxidaciones catalíticas heterogéneas, pero muy pocos son
económicamente rentables a causa de los altos costes de los catalizadores además de
2. Consideraciones teóricas
8
que pueden tener lugar reacciones secundarias indeseables con la consiguiente
generación de subproductos (Alonso et al., 2013).
Actualmente la producción del ácido lactobiónico (LBA) se sitúa entre 15000 y
17000 toneladas al año cuyos principales fabricantes son Solvay (Alemania) y
FriendslandCampina Domo (Países Bajos) (Gutiérrez et al. 2012). Se prevé un
crecimiento anual de producción del 5% aproximadamente puesto que cada vez son
más los usos y aplicaciones que se encuentran para este ácido gracias a sus
propiedades físico-químicas únicas (tabla 2).
Tabla 2. Propiedades y características del ácido lactobiónico (Alonso et al., 2013)
Fórmula C12H22O12
Peso molecular 358,30
Punto de fusión (ºC) 128 – 130
Solubilidad Soluble en agua, ligeramente soluble en
etanol y metanol anhidros.
Naturaleza Sólida
Apariencia Polvo blanco
pKa 3,6
Un uso muy importante que tiene este ácido en medicina es como principal
ingrediente de soluciones para la conservación en frío de órganos y tejidos previa al
trasplante ya que tiene la capacidad de reducir la oxidación provocada por algunos iones
metálicos como el hierro. Además suprime la hinchazón provocada en los tejidos por las
bajas temperaturas, y es incapaz de introducirse en las membranas celulares a causa
de su estructura y tamaño (Gutiérrez et al., 2012). Otra aplicación es en la protección
contra la hepatitis, incluyéndolo en oligonucleótidos antisentido que son introducidos en
las células de Kupffer del hígado con el objetivo de reducir la expresión del factor-α del
tumor que provoca la necrosis (Alonso et al., 2013).
En la industria farmacéutica y cosmética se utiliza como ingrediente
queratinizante y anti-edad en productos para el cuidado de la piel, antioxidante, en el
diseño de nanoparticulas funcionales y nanomateriales portadores de medicinas y
genes. Gracias a sus propiedades emulsificantes es utilizado en la industria química
como base tensoactiva en la producción de detergentes biodegradables, además de
componente anticorrosivo en la fabricación de revestimientos (Gutiérrez et al., 2012,
Alonso et al., 2013).
2. Consideraciones teóricas
9
Desde que el LBA fue reconocido como aditivo alimentario por la Administración
de Alimentos y Medicamentos Americana (US FDA), es ampliamente utilizado en este
sector como gelificante, agente acidulante de sabor dulce, antioxidante, estabilizante,
refuerzo de bebidas funcionales e incluso como sustancia prebiótica (Gutiérrez et al.,
2012, Alonso et al., 2013).
2.3. MÉTODOS DE OPERACIÓN Y SEGUIMIENTO DE BIOPROCESOS
Como en toda reacción química existen diversas formas de operación que varían
en función de los recursos que se posean y de los objetivos que se pretendan alcanzar.
En el caso de los biorreactores, además, entra en juego la forma en que se introduzcan
las células en el caldo de fermentación.
Los biorreactores pueden operar de forma discontinua, alcanzando altas
concentraciones de producto pero bajas productividades (Moresi & Parente, 2014). La
desventaja de este modo de operación es que las células tienen un periodo de
adaptación o retardo bastante largo (lag) antes de comenzar a multiplicarse y producir,
lo que se traduce en tiempos de fermentación bastante largos que se tratan de
compensar con reactores de mayor capacidad. Esto conlleva unos costes operativos
demasiado altos y no resulta rentable (Panesar et al., 2007).
Otra forma de operar es en continuo: se alcanzan bajas concentraciones de
producto pero la productividad es considerablemente más alta sin necesidad de
reactores de gran tamaño. En este caso las células pueden recircularse o inmovilizarse
dentro del tanque:
- La recirculación de células implica un aumento en la concentración de biomasa
dentro del fermentador que supone una mayor producción de ácido, además de
una menor concentración de sustrato en el efluente.
- La inmovilización de células puede realizarse por adsorción, atrapamiento en gel
o enlace covalente. De esta forma se puede tener una alta densidad de células
en el fermentador que podrán ser reutilizadas, y se evita la posterior separación
de la biomasa del caldo de cultivo (Panesar et al., 2007).
En el caso de que tenga lugar una inhibición por producto, se pueden emplear
sistemas que incluyan la separación de éste del medio de cultivo (Moresi & Parente,
2014). Estos métodos de separación serán mencionados más adelante.
2. Consideraciones teóricas
10
2.3.1. Citometría de flujo
En el seguimiento de los bioprocesos los métodos más utilizados para comprobar
el crecimiento de la biomasa son la medida de la densidad óptica (turbidimetría), el peso
seco de las células o el recuento en placas de agar. Estos métodos dan información del
crecimiento celular basándose en su capacidad de reproducción, pero sin tener en
cuenta su estado fisiológico.
Concretamente el recuento de placas es utilizado para comprobar la viabilidad
de las células, considerando que estas son viables si son capaces de reproducirse, pero
además de ser un método lento, a veces no es fiable ya que algunas células tienen
dificultades para crecer en medio artificiales.
La citometría de flujo proporciona información acerca de la heterogeneidad
fisiológica de los cultivos de células y se utiliza también en el análisis cuantitativo de la
biomasa total (Quirós et al., 2007). Consiste en la medida simultánea de varias
características físico-químicas (tamaño, volumen, pH, densidad, potencial de
membrana, contenido en proteínas, capacidad de dispersión de la luz…) de las células
que van pasando una a una en un flujo a través del citómetro. Esta medida se realiza
haciendo incidir un haz de luz perpendicularmente sobre cada célula de forma que se
dispersa vertical y horizontalmente además de excitar los fluorocromos que puedan
estar unidos a las células haciendo que emitan luz (figura 3). Esta luz dispersada y
emitida es captada por unos detectores que la convierten en impulsos eléctricos (March
& Eiros, 2012).
Figura 3. Esquema de funcionamiento del citómetro de flujo.
2. Consideraciones teóricas
11
Así, es posible caracterizar, cuantificar y separar las distintas poblaciones
celulares que pueda haber y se dispondrá de una información más detallada sobre la
viabilidad de las células.
2.4. SEPARACIÓN DE LOS PRODUCTOS
La etapa posterior a la fermentación corresponde a la separación y purificación
de los ácidos obtenidos, cuyos métodos más comunes serán citados a continuación.
2.4.1. Separación del ácido láctico
El ácido láctico en concreto tiene la característica de que sus sales son altamente
solubles en agua, lo que dificulta su separación. Algunas técnicas utilizadas son:
- Recuperación de las sales de calcio (lactato de calcio) mediante precipitación o
concentración por electrodiálisis, y posteriormente regeneración del ácido
adicionando ácido sulfúrico y posteriormente purificándolo mediante intercambio
iónico y descolorización (es el método tradicional y más económico) (Moresi &
Parente, 2014) ó bien regenerando el ácido mediante electrodiálisis con
membrana bipolar e intercambio iónico (Serna-Cock, 2005).
- Recuperación del lactato de calcio y a continuación tratamiento con carbón
activado, o bien extracción con solventes, o esterificación con metanol seguida
de destilación e hidrólisis (Serna-Cock, 2005).
- Mediante extracción con membranas líquidas e intercambio iónico. Puede
utilizarse simultáneamente a la fermentación con un sistema de recirculación.
(Moresi & Parente, 2014).
- Microfiltración con flujo cruzado (Serna-Cock, 2005).
2.4.2. Separación del ácido lactobiónico
Las técnicas de separación y purificación del ácido lactobiónico pueden ser:
- Concentración del ácido y precipitación mediante la adicción de etanol al medio
de fermentación.
2. Consideraciones teóricas
12
- Evaporación del medio para obtener un líquido espeso, seguido de una
deshidratación mediante destilación con dioxano y tolueno y finalmente
cristalización.
- Intercambio iónico con resinas de anión débilmente básico para recuperar la
disolución acuosa de ácido lactobiónico seguido de secado por spray.
- Evaporación para concentrar la disolución, seguido de una cristalización por
precipitación y finalmente un intercambio iónico.
Se siguen investigando métodos de separación y purificación integrados en el
proceso de fermentación de forma que resulten más económicos (Alonso et al., 2013)
2.5. ALIMENTOS FUNCIONALES
El concepto de alimento funcional nació en Japón en los años 80, y en general
se utiliza para denominar a todos aquellos alimentos que poseen alguna de estas
características además de proporcionar los nutrientes necesarios para el organismo:
- Prevenir enfermedades.
- Mejorar el estado físico y mental del consumidor.
- Capacidad para curar algunas dolencias.
Aunque el concepto de alimento funcional es muy general y abarca muchos tipos
de alimentos, se suele emplear para alimentos que contienen ingredientes desarrollados
tecnológicamente que posean algún beneficio para la salud (Siró et al., 2008).
El mercado de estos productos ha crecido enormemente en los últimos años, así
en Europa en mercado de los alimentos funcionales movía entre 3,6 y 7,2 billones de €
en el año 2003 (Siró et al., 2008) y en el año 2013 ha alcanzado los 25 billones de €
(Murcia, 2013). En España concretamente, estos productos suponían el 17% del
mercado alimentario en el 2006 y se prevé que en el 2020 alcanzarán el 40% (Siró et
al., 2008). En el año 2013 la facturación rodaba entre 2,8 y 3,5 millones de € según el
Ministerio de Economía (Murcia, 2013).
En este mercado no sólo entran empresas del sector alimentario, ya que algunas
compañías farmacéuticas empiezan a interesarse en estos productos. Las causas son
que en comparación con los productos farmacéuticos, los alimentos funcionales tienen
tiempos más cortos de desarrollo y unos costes más bajos.
2. Consideraciones teóricas
13
Al principio los alimentos funcionales únicamente incluían vitaminas como la
vitamina C, E ó el ácido fólico, y minerales como el calcio, hierro o zinc. Posteriormente
se fueron incluyendo algunos micronutrientes como el omega 3, el fitosterol o la fibra
soluble (Siró et al., 2008).
Los alimentos funcionales se podrían clasificar de la siguiente forma (Siró et al.,
2008):
- Probióticos: son los que incluyen microorganismos vivos con la capacidad de
conferir algún beneficio para la salud si se ingiere la cantidad adecuada.
- Prebióticos: son ingredientes no digeribles que ayudan a los
microorganismos presentes generalmente en el aparato digestivo a realizar
su actividad beneficiando al consumidor.
- Bebidas funcionales: son bebidas no alcohólicas a las que se les añaden
vitaminas u otros ingredientes funcionales.
- Cereales funcionales: generalmente funcionan como prebióticos incluyendo
fibra soluble en sus ingredientes.
- Productos de panadería: aunque aún no están muy desarrollados, pueden
contener vitaminas, minerales y por supuesto fibra.
- Productos para reducir el colesterol: son productos que contienen ésteres de
fitostanol ó ácidos omega 3 que ayudan en la reducción del colesterol.
2.6. INTERÉS DE LA COPRODUCCIÓN
A la vista de las múltiples propiedades de estos dos ácidos, y del imparable
crecimiento de sus usos y aplicaciones en los distintos sectores industriales, puede
resultar interesante una producción conjunta partiendo de la misma materia prima.
Lo que se pretende es maximizar el rendimiento en cuanto al aprovechamiento
de sustrato, en este caso la lactosa contenida en el suero de queso, de forma que
además de producir ambos ácidos, se reduciría la DQO del suero haciendo más fácil y
económico su posterior tratamiento para su vertido.
Las ventajas de esta metodología de trabajo serían un menor consumo de
recursos, tanto materiales como energéticos, ya que se utiliza un mismo volumen para
2. Consideraciones teóricas
14
la fermentación con ambas bacterias, y se conseguiría una mayor revalorización del
suero.
Como inconvenientes se presentan la posible incompatibilidad entre ambas
bacterias, L. Casei y P. Taetrolens, y la problemática de la posterior separación de
ambos ácidos, que será mencionada en el capítulo correspondiente de este trabajo.
2.6.1. Ejemplos de cocultivos
A continuación se enumeran algunos ejemplos de procesos en los que se
emplean cultivos mixtos, tanto de industria alimentaria como química:
- Elaboración de vino: en los casos en los que el vino se elabora mediante
fermentación espontánea, esta se lleva a cabo con las bacterias y levaduras
endémicas presentes tanto en la superficie de la uva como en los equipos
utilizados en la bodega. Este método de elaboración implica variación en las
características organolépticas y en la velocidad de fermentación de unos años a
otros ya que ni la cantidad ni el orden de sucesión de los microorganismos será
igual (Escalante-Minakata & Ibarra-Junquera).
- Producción de yogurt: la fermentación del yogurt se realiza generalmente de
forma controlada con la interacción de las especies Lactobacillus Bulgaris y
Streptococcus thermophilus (Escalante-Minakata & Ibarra-Junquera).
- Incrementar el valor nutritivo de los residuos de café y té verde mediante
fermentación con cultivos mixtos microbianos para su uso en alimentación de
ganado además de eliminar las emisiones de metano de dichos residuos
(Senevirathne et al., 2012).
- En el tratamiento de aguas residuales para la eliminación de productos
farmacéuticos y de cuidado personal como la cafeína, ibuprofeno, ranitidina y
sulfametoxazol con un cultivo mixto de bacterias heterótrofas (Vasiliadou et al.,
2013).
- En la producción de polihidroxialcanoatos (PHA) utilizando como sustrato glicerol
crudo que es el subproducto principal (10% v/v del éster final) de las industrias
de biodiesel. También se producen polihidroxibutiratos (PHB) todo ello utilizando
cultivos mixtos de bacterias aeróbicas (Moita et al., 2014).
2. Consideraciones teóricas
15
- En la biodegradación de hidrocarburos, concretamente gasoil de PDV rango
diesel, mediante un cultivo mixto de tres cepas de Pseudomonas (Otoniel et al.,
2005)
.
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3. Materiales y métodos
17
3.1. MEDIO DE CULTIVO: SUERO DE QUESO
El suero de queso que se utiliza como medio de cultivo para las fermentaciones
es suministrado por la empresa Industrias Lácteas Asturianas (ILAS-Reny Picot) y se
distribuye en garrafas de 5 L, con una concentración de lactosa de unos 250 g/L
aproximadamente que resulta demasiado alta para este trabajo, por lo que se debe diluir
con agua destilada hasta obtener una concentración cercana a 40 g/L. Además debe
ser esterilizado mediante filtración de forma que se elimina la grasa, bacterias y
proteínas de gran tamaño que puedan interferir en la fermentación. Este proceso se
lleva a cabo mediante microfiltración tangencial por un cassette de membranas de PVDF
(Millipore) con un tamaño de poro de 0,22 µm.
En este caso el volumen resultante a esterilizar tras la dilución sería demasiado
alto, aumentando la probabilidad de contaminación en el proceso de filtración por lo que
se hace una primera dilución, se ajusta el pH del suero a 6,5 con NaOH 6N, después se
filtra y finalmente se rediluye en condiciones de esterilización en campana hasta el
volumen deseado.
3.2. MICROORGANISMOS
3.2.1. Lactobacillus Casei
La bacteria Lactobacillus Casei se mantiene congelada a -18 ºC en una
disolución de glicerol al 40 % v/v. Se reactiva en placas de Man Rogosa and Sharpe
(MRS, Biokar diagnostics) con agar al 2% (p/v), que se incuban a 30 ºC durante 48-72
horas y después se mantienen a 4 ºC.
3.2.2. Pseudomona Taetrolens
La bacteria Pseudomona Taetrolens, al igual que el Lactobacillus Casei, se
mantiene congelada a -18 ºC en una disolución de glicerol al 40% v/v. Se reactiva en
placas de Nutrient Broth (NB, que contiene 1 g/L de extracto de carne, 2 g/L de extracto
de levadura, 5 g/L de peptona y 5 g/L de NaCl) con agar al 2% (p/v), que se incuban a
30 ºC durante 48 horas y después se mantienen a 4 ºC.
3. Materiales y métodos
18
3.3. FERMENTACIONES: CONDICIONES
3.3.1. Fermentación con Lactobacillus Casei
Tras la reactivación en placas de agar MRS, se inoculan 250 ml de caldo MRS
con una colonia aislada de bacterias en condiciones microaerófilas, a 37 ºC y sin
agitación durante 16 horas. A continuación se añaden 10 ml (10% v/v) de este caldo a
90 ml de suero que se utiliza como preinóculo, y se mantienen en las mismas
condiciones pero con agitación de 100 rpm durante 20 horas.
Finalmente, con 50 ml del preinóculo (10% v/v) se inoculan 450 ml de suero
(figura 4) y se incuban en las mismas condiciones de temperatura, agitación y aireación.
Siembra en placa
Preinóculo MRS
Preinóculo suero
Inóculo suero experimento
72 h
16 h
20 h
250ml MRS en botella de
250ml
90ml suero en botella de
100ml
450ml suero en botella de
500ml
10ml (10% inóculo)
50ml (10% inóculo)
Figura 4. Esquema del proceso fermentativo con Lactobacillus Casei.
3.3.2. Fermentación con Pseudomona Taetrolens
Una vez reactivada la bacteria en placas de agar NB, se utiliza una colonia
aislada para inocular 100 ml de caldo NB que se incuban en un matraz de 500 ml (el
volumen de líquido debe ser aproximadamente 1/5 del volumen del recipiente para
conseguir las condiciones de aireación deseadas) a 30 ºC y con una agitación de
250 rpm durante 10 horas. Después se utiliza la biomasa contenida en un 10% (v/v) (se
centrifuga a 12000xg durante 10 minutos, se elimina el sobrenadante y se resuspende
3. Materiales y métodos
19
en suero) para inocular 100 ml de suero que será utilizado como preinóculo, incubado
en las mismas condiciones durante 12 horas.
Por último, con la biomasa contenida en 40 ml del preinóculo se inoculan 400 ml
de suero que serán incubados en botellas de 2 L en las mismas condiciones citadas
anteriormente (figura 5).
Siembra en placa
Preinóculo NB
Preinóculo suero
Inóculo suero experimento
48 h
10 h
12 h
100ml NB en matraz de
500ml
100ml suero en matraz de
500ml
400ml suero en botella de 2L
Biomasa en 10ml (10% inóculo)
Biomasa en 40ml (10% inóculo)
Figura 5. Esquema del proceso fermentativo con Pseudomona Taetrolens.
3.3.3. Fermentación mixta
Las fermentaciones con cocultivo de bacterias se realizan por cuadriplicado, de
forma que dos se incuban en las condiciones óptimas para el Lactobacillus Casei y otras
dos en las condiciones óptimas para la Pseudomona Taetrolens. En ambas opciones se
trabaja de la misma forma que en las fermentaciones puras hasta los preinóculos de
suero.
En el cocultivo en condiciones óptimas para el Lactobacillus Casei la
fermentación se lleva a cabo en botellas de 500 ml que inicialmente contienen 450 ml
de suero. Se inoculan con 50 ml (10% v/v) del preinóculo de L.Casei, y con la biomasa
contenida en 50 ml del preinóculo de P. Taetrolens.
En el caso del cocultivo en condiciones óptimas para la Pseudomona Taetrolens,
las fermentaciones se realizan en botellas de 2 L que contienen 360 ml de suero inicial.
3. Materiales y métodos
20
Se inoculan con 40 ml (10% v/v) del preinóculo de L.Casei y con la biomasa contenida
en 40 ml del preinóculo de P.Taetrolens.
Tanto las fermentaciones puras como las mixtas se realizan por duplicado como
experimentos independientes.
3.4. TOMA DE MUESTRAS Y ANÁLISIS
Todas las muestras tanto de cultivos puros como de cocultivos recibirán el mismo
tratamiento que se detalla a continuación.
3.4.1. pH
Se toma una alícuota de 2 ml que es centrifugada durante 10 minutos a 12000xg
(KUBOTA High Speed Refrigerated Centrifuge 6500). El sobrenadante se vuelca en otro
tubo y se mide su pH (pH-meter BASIC 20+ CRISON).
3.4.2. Densidad óptica y siembra en placas
Se toma una alícuota de 1 ml en un tubo Eppendorf y se centrifuga (Eppendorf
Centrifuge 5415D) durante 5 minutos a 13200 x g. El pellet obtenido se resuspende en
NaCl 0,7 % (p/v), se diluye 1 a 10 y se mide su densidad óptica por triplicado para
comprobar el crecimiento celular, a una longitud de onda de 600 nm en el
espectrofotómetro (UV-VIS spectrophotometer UV-1203 SHIMADZU).
Para la siembra en placas se realizan diluciones seriadas de dicho pellet
resuspendido, también con NaCl 0,7 % (p/v), y en función del dato obtenido de densidad
óptica se siembran unas diluciones u otras.
3.4.3. HPLC
El sobrenadante de dicha alícuota de 1 ml se utiliza para medir la evolución de
las concentraciones de sustratos y productos (en este caso lactosa, ácido láctico y
lactobiónico) mediante cromatografía de líquidos de alta eficacia (HPLC).
Como la concentración de lactosa es mucho mayor que la de los ácidos se deben
hacer dos diluciones distintas de cada muestra, una a 1:5 para los ácidos y otra a 1:20
para la lactosa, ambas con agua destilada y filtradas mediante una jeringa que incorpora
un filtro de 0,45 µm.
3. Materiales y métodos
21
La fase móvil utilizada en la cromatografía es una disolución de H2SO4 0,450 mM
en agua MiliQ, previamente filtrada a vacío con un tamaño de poro de 0,22 µm y
sometida a ultrasonidos durante 30 minutos.
La columna del cromatógrafo es un modelo ICSep ICE-ION-300 (Transgenomic
Inc., San José, California) que opera a una temperatura de 75 ºC, con un flujo de la fase
móvil de 0,3 ml/min y una presión aproximada de 40 bar. El detector utilizado es el índice
de refracción (RID) del cromatógrafo Agilent (modelo Serie 1200, California) y el
software para la adquisición de datos es el Agilent ChemStation. El Equipo se muestra
en la figura 6.
Figura 6. Equipo de cromatografía líquida de alta resolución.
3.4.4. Citometría de flujo
Para la observación y el seguimiento del estado fisiológico de las células, estas
se analizan cada cierto tiempo mediante citometría de flujo.
Se toma una muestra de 1 ml y se elimina el sobrenadante tras haberla
centrifugado a 13200xg durante 6 minutos. Se lava el pellet resultante dos veces con un
tampón fosfato salino (PBS) (filtrado a 0,22 µm, esterilizado y con pH de 7,4). Se somete
a ultrasonidos durante unos segundos y se reparten en tubos eppendorf volúmenes de
200 µl para proceder a su tinción. Uno de ellos se analiza sin teñir para utilizarlo como
control negativo, y otro se tiñe con el fluorocromo SYBR Green. Este fluorocromo se une
al ADN por lo que tiñe todas las células independientemente de su estado fisiológico y
se utiliza para distinguir la señal que corresponde a las bacterias con la señal de ruido
del aparato. La solución de trabajo del SYBR Green se prepara a partir de una solución
3. Materiales y métodos
22
stock congelada, añadiendo 10 µl de dicha solución stock a 990 µl de una mezcla de
PBS y ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). Se añaden 2 µl para la tinción y se incuba
durante 15 minutos en oscuridad.
En otro tubo se utiliza una mezcla de los fluorocromos ChemChromeV6 (CV6) e
Ioduro de Propidio (IP). El fluorocromo CV6 tiñe células con actividad metabólica y se
encuentra en solución stock congelada. La solución de trabajo se prepara a partir de
50 µl de solución stock que se añaden a 450 µl de agua destilada estéril. Para teñir se
utilizar 8 µl y se incuba durante 15 minutos en oscuridad. El fluorocromo IP, por el
contrario, penetra en las células con la membrana dañada. La solución de trabajo se
prepara a partir de 140 µl de la solución stock congelada, añadidos a 860 µl de agua
destilada estéril. Para teñir se utilizan 7,5 µl y se incuba durante 30 minutos en
oscuridad.
Por último el tubo restante se tiñe con los fluorocromos IP y bis-(1,3-
dibutilbarbiturato) trimetinaoxonol (DiBAC43). El fluorocromo DiBAC4
3 penetra en las
células que presentan la membrana despolarizada y aumentan la señal cuando la célula
no es viable. La solución de trabajo se prepara a partir de 5 µl de la solución stock
congelada y 995 µl de la mezcla PBS y EDTA. Se tiñe con 40 µl y se incuba 15 minutos
en oscuridad.Como controles se utilizaron células tanto de P.Taetrolens como de
L.Casei, en plena fase exponencial de crecimiento y tratadas con alcohol isopropilo, por
separado, combinando células vivas con dañadas, y combinando ambas especies.
El citómetro de flujo utilizado es el Cytomics FC 500 (Beckman Coulter) con
fuente láser de iones y con cuatro detectores de fluorescencia (figura 7). El software
utilizado para la adquisición de datos es el Cytomics RXP (Beckman Coulter).
Figura 7. Citómetro de flujo Cytomics FC 500.
4. RESULTADOS
4. Resultados
24
4.1. EVOLUCIÓN DEL PH
En las siguientes gráficas se presenta la evolución del pH de las distintas
fermentaciones:
Figura 8. Evolución del pH en las fermentaciones de Lactobacillus Casei (L.C.),
Pseudomona Taetrolens (P.T.), cocultivo en condiciones de L.C. y cocultivo en
condiciones de P.T.
Se observa que las fermentaciones en las que entra en juego el Lactobacillus
Casei parten de un pH más bajo, aproximadamente de 5,3. Esto se debe a que el inóculo
se realiza con suero que ya ha bajado de pH debido a la actividad del L.C., mientras que
la fermentación de la Pseudomona pura se inocula únicamente con la biomasa y no
afecta al pH inicial del suero que es 6,5. En esta fermentación se observa una leve
subida de pH inicial, esto es causado por los subproductos nitrogenados que aparecen
al ser metabolizadas las proteínas del suero. Cuando comienza la producción de ácido
el pH comienza a descender.
Ambos cocultivos alcanzan un pH final de 3,7 aproximadamente, siendo el
cocultivo en condiciones de P.T. ligeramente más rápido (datos en apéndice, tabla 4).
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
0 20 40 60 80
pH
Tiempo (h)
Cocultivo Cond. L.C.
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
0 50 100
pH
Tiempo (h)
Cocultivo Cond. PT
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
0 20 40
pH
Tiempo (h)
L. Casei puro
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
0 50 100
pH
Tiempo (h)
P. Taetrolens puro
4. Resultados
25
4.2. DENSIDAD ÓPTICA
A través de la densidad óptica (apéndice, tabla 5) se puede comprobar el
crecimiento de la biomasa. En las gráficas que se presentan a continuación se observan
las curvas de crecimiento en cada tipo de fermentación:
Figura 9. Evolución de la densidad óptica en las fermentaciones de L.C. puro, P.T.
puro, cocultivo en condiciones de L.C. y cocultivo en condiciones de P.T.
Las gráficas de cocultivos presentan una mayor cantidad de biomasa, cosa que
era de esperar ya que se inocula con el doble de bacterias. El cocultivo en condiciones
de L.C. alcanza la unidad de densidad óptica mientras que en condiciones de P.T. llega
casi al 1,2, pero también parte del doble de biomasa al inicio por lo que el crecimiento
en valor absoluto es mayor en el cocultivo de L.C.
Con los datos del recuento en placas y citometría se podrá determinar que
bacterias son las que mejor soportan las condiciones de cocultivo.
0,00,20,40,60,81,01,2
0 20 40
Den
sid
ad ó
pti
ca
Tiempo (h)
L.Casei puro
0,00,20,40,60,81,01,2
0 50 100
Den
sid
ad ó
pti
ca
Tiempo (h)
P. Taetrolens puro
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
0 20 40 60 80
Den
sid
ad ó
pti
ca
Tiempo (h)
Cocultivo Cond. L.C.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 50 100
Den
sid
ad ó
pti
ca
Tiempo (h)
Cocultivo Cond. P.T.
4. Resultados
26
4.3. RECUENTO DE PLACAS
El recuento de placas sirve para hacer una comprobación cualitativa y
cuantitativa del crecimiento bacteriano ya que además de conocer cómo crecen, se
comprueba que es la bacteria objeto de estudio y no una contaminación.
En la figura 10 se presenta el recuento de las fermentaciones de L.C. puras, y
en la figura 11 un ejemplo de una placa con agar MRS en la que ha crecido la bacteria
(datos en apéndice, tabla 6).
Figura 10. Recuento de unidades formadoras de colonias (UFCs) en la fermentación de L.C. pura.
Figura 11. Placa de agar MRS con colonias de Lactobacillus Casei.
0,0E+00
1,0E+07
2,0E+07
3,0E+07
4,0E+07
5,0E+07
6,0E+07
7,0E+07
8,0E+07
9,0E+07
1,0E+08
0 20 40 60 80
UFC
s
Tiempo (h)
L. Casei puro
4. Resultados
27
Los valores de UFCs son muy dispares de unas fermentaciones a otras, de ahí
los valores tan grandes de los errores en la figura 10. Aun así se observa un crecimiento
hasta alcanzar casi los 6 x 107 UFCs en un mililitro en las primeras horas de
fermentación seguido de un descenso leve pero continuo a causa de la muerte de las
bacterias.
En la figura 12 se presentan los valores medios de UFCs para las fermentaciones
de P.T. pura, así como una placa de agar NB con colonias de Pseudomona en la figura
13 (datos en apéndice, tabla 7).
Figura 12. Recuento de UFCs en la fermentación de P.T. pura.
Figura 13. Placa de agar NB con colonias de Pseudomona Taetrolens.
0,0E+00
2,0E+07
4,0E+07
6,0E+07
8,0E+07
1,0E+08
1,2E+08
1,4E+08
1,6E+08
0 20 40 60 80
UFC
s
Tiempo (h)
P. Taetrolens puro
4. Resultados
28
Al igual que en el caso del Lactobacillus Casei, en las primeras horas de
fermentación la cantidad de bacterias aumenta considerablemente hasta los 1,47 x 106
UFCs por mililitro, y después desciende de forma algo más brusca.
En los cocultivos se hacen siembras en ambos medios (NB y MRS), pero cada
bacteria crece solamente en su medio. En la figura 14 se muestran los recuentos de
UFCs del cocultivo en condiciones de L.C., tanto de Pseudomona como de Lactobacillus
(datos en apéndice, tablas 6 y 7).
Figura 14. Recuento de UFCs en la fermentación mixta en condiciones de L.C.
En el cocultivo las tendencias son más irregulares aunque se aproximan a las
anteriores, con un crecimiento inicial más lento que en los cultivos puros hasta casi los
1,5 x 108 UFCs de ambas bacterias, seguido de un descenso causado por la muerte de
estas.
En las placas de agar se observa que las colonias de Pseudomona, a partir de
las 8 horas son mucho más pequeñas que en el cultivo puro (figura 15), en cambio las
colonias de Lactobacillus tienen el mismo tamaño en cocultivo y en cultivo puro.
Los recuentos de UFCs del cocultivo en condiciones de P.T. se muestran en la
figura 16 para ambas bacterias (datos en apéndice, tablas 6 y 7). El L.C. muestra un
crecimiento muy pequeño en las primeras de horas llegando a 7,9 x 107 UFCs por
mililitro, y luego desciende suavemente. La cantidad de UFCs de P.T. cae directamente
a cero en las primeras 8 horas y no muestra ningún crecimiento.
0,0E+00
5,0E+07
1,0E+08
1,5E+08
2,0E+08
2,5E+08
3,0E+08
3,5E+08
0 20 40 60 80
UFC
s
Tiempo (h)
L.C. en C.C. L.C.
0,0E+00
5,0E+07
1,0E+08
1,5E+08
2,0E+08
2,5E+08
0 20 40 60 80
UFC
s
Tiempo (h)
P.T. en C.C. L.C.
4. Resultados
29
Figura 15. Placa de agar NB con colonias de P.T. poco desarrolladas.
Figura 16. Recuento de UFCs en la fermentación mixta en condiciones de P.T.
No se cuenta con muchos datos del cocultivo en condiciones de Pseudomona
Taetrolens ya que en varias ocasiones resultó contaminado por otras bacterias que
fueron identificadas a la hora de hacer el recuento en las placas. En la figura 17 se
muestran algunas de estas contaminaciones. En la primera imagen estas colonias
tienen una textura diferente que se puede apreciar en la ampliación, y en la segunda
imagen se ve claramente ya que son de otro color.
0,0E+00
2,0E+07
4,0E+07
6,0E+07
8,0E+07
1,0E+08
0 10 20 30
UFC
s
Tiempo (h)
L.C. en C.C. P.T.
0,0E+00
2,0E+07
4,0E+07
6,0E+07
8,0E+07
0 20 40 60
UFC
s
Tiempo (h)
P.T. en C.C. P.T.
4. Resultados
30
Figura 17. Placas de agar con contaminación.
4.4. EVOLUCIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE LACTOSA
La concentración de lactosa presente en el suero de todos los cultivos sigue una
tendencia descendente, lo que es de esperar ya que es el sustrato de la reacción, pero
muy irregular como se puede observar en la figura 18 (datos en apéndice, tabla 8). Parte
de un valor de entre 35 y 50 g/L y desciende hasta los 25 o 30 g/L según el cultivo.
Figura 18. Evolución de la concentración de lactosa en los cuatro cultivos.
20
30
40
50
60
70
80
90
0 20 40 60 80 100
Co
nce
ntr
ació
n (
g/L)
Tiempo (h)
Lactosa
L. Casei
P. Taetr.
CC. Cond. L.C.
CC. Cond. P.T.
4. Resultados
31
4.5. PRODUCCIÓN DE ÁCIDO LÁCTICO
A continuación (figura 19) se compara la producción de ácido láctico del cultivo
puro de L.C. con ambos cocultivos.
Figura 19. Producción de ácido láctico en el cultivo puro de L.C. y los cocultivos.
La fermentación en la que se alcanza más concentración de ácido láctico es en
el cultivo puro de L.C., llegando a 10 g/L a las 72 horas. En el cocultivo en condiciones
de L.C. se llega a una concentración menor pero bastante cercana, de 8,2 g/L, y en el
cocultivo en condiciones de P.T., a las 72 horas la concentración aún era de 4,3 g/L,
llegando a los 5,1 a las 96 horas (datos en apéndice, tabla 9).
4.6. PRODUCCIÓN DE ÁCIDO LACTOBIÓNICO
Al igual que en el apartado anterior, se presenta en la figura 20 una comparación
de la producción de ácido lactobiónico del cultivo puro de P.T. y los dos cocultivos.
En el cultivo puro de P.T. se alcanza una concentración de 10,7 g/L a las 98
horas, mientras que en los cocultivos este valor es bastante más bajo. En el cocultivo
en condiciones de Pseudomona únicamente se llega a 2,5 g/L de ácido, cifra que se
mantiene desde las 54 horas hasta el final de la fermentación, y en el cocultivo en
condiciones de L.C. no se llega a producir nada (datos en apéndice, tabla 10).
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 20 40 60 80 100
Co
nce
ntr
ació
n (
g/L)
Tiempo (h)
Ácido lácticoL. Casei
CC. Cond. L.C.
CC. Cond. P.T.
4. Resultados
32
Figura 20. Producción de ácido lactobiónico en el cultivo puro de P.T. y los cocultivos.
4.7. EVOLUCIÓN DEL ESTADO FISIOLÓGICO DE LAS CÉLULAS
A continuación se presentarán las imágenes de citometría donde se puede
comprobar el estado de las células. Las primeras figuras (figuras 21, 22 y 23) muestran
las células con la tinción de CV6-IP, de las fermentaciones puras y los cocultivos.
Figura 21. Evolución de la fermentación de L.C. puro con tinción CV6/IP.
0
2
4
6
8
10
12
14
0 20 40 60 80 100
Co
nce
ntr
ació
n (
g/L)
Tiempo (h)
Ácido lactobiónicoP. Taetr.
CC. Cond. L.C.
CC. Cond. P.T.
4. Resultados
33
Figura 22. Evolución de la fermentación de P.T. puro con tinción CV6/IP.
Figura 23. Evolución de la fermentación en cocultivo con condiciones L.C. con tinción
CV6/IP.
4. Resultados
34
En el cuadrante F1 se encuentran las células teñidas por el CV6, lo que significa
que son metabólicamente activas. En todas las fermentaciones se observa un aumento
en el porcentaje de células de este cuadrante con el tiempo, a excepción de las 72 horas
en las que la cantidad de células metabólicamente activas disminuye como era de
esperar.
En el cuadrante F4 se muestran las células teñidas por el IP, es decir, las células
con la membrana dañada. Hasta las 72 horas apenas hay células dañadas en ninguna
fermentación.
El cuadrante F2 recoge las células teñidas por ambos fluorocromos, por lo que
sería células vivas pero con la membrana dañada. Únicamente aparecen células en este
cuadrante en la fermentación de Pseudomona Taetrolens pura, y la cantidad va
disminuyendo con el tiempo.
En las figuras 24, 25 y 26 se muestran los citogramas de Dibac e IP. En este
caso el cuadrante F1 recoge las células teñidas por Dibac, lo que supone que son
células con la membrana despolarizada.
Figura 24. Evolución de la fermentación de L.C. puro con tinción Dibac/IP.
4. Resultados
35
Figura 25. Evolución de la fermentación de P.T. puro con tinción Dibac/IP.
Figura 26. Evolución de la fermentación en C.C. L.C. con tinción Dibac/IP.
4. Resultados
36
El Dibac no tiñe las células de ninguna de las fermentaciones, sin embargo en
la fermentación de Pseudomona Taetrolens pura aparecen células teñidas con IP, es
decir, con la membrana dañada (cuadrante F4). Con el paso de las horas el porcentaje
de células dañadas disminuye.
5. CONCLUSIONES
5. Conclusiones
38
A la vista de los resultados obtenidos se puede concluir que los cultivos mixtos
en las condiciones de operación que se han estudiado son menos productivos que los
cultivos puros.
En el cocultivo en condiciones favorables para Lactobacillus Casei, esta bacteria
parece desarrollarse sin problema y sintetizar ácido láctico, pero lo hace en menor
cantidad que cuando se encuentra en cultivo puro. La Pseudomona Taetrolens en estas
condiciones se desarrolla muy poco. Se pueden contabilizar colonias en las placas de
agar y se observa un aumento en cantidad, pero a partir de cierto tiempo estas colonias
son muy pequeñas. Además no se produce nada de ácido lactobiónico por lo que se
concluye que estas condiciones no son nada favorables para la Pseudomona
Taetrolens.
En el cocultivo en condiciones favorables para Pseudomona Taetrolens, el
Lactobacillus Casei se desarrolla y produce aunque en menor cantidad que en los otros
cultivos. La Pseudomona también se desarrolla peor, y produce la cuarta parte de ácido
lactobiónico que llega a producir en el cultivo puro. En la tabla 3 se muestra un resumen
de los datos de producción.
Tabla 3. Resumen de datos de producción.
L.C. puro P.T. puro CC. cond. L.C. CC. cond. P.T.
Ácido láctico (g/L) 10,1 - 8,2 5,1
Ácido lactobiónico (g/L) - 10,7 0 2,5
El Lactobacillus Casei es capaz de convivir en sus condiciones con la
Pseudomona Taetrolens influyendo únicamente en la producción de ácido láctico que
desciende 2 g/L, y también es capaz de adaptarse a las condiciones de aireación,
temperatura y agitación de dicha bacteria aunque la producción baje significativamente.
Por otra parte, la Pseudomona se ve más afectada por la presencia del
Lactobacillus, ya que en el cocultivo en condiciones de P.T. la producción de
lactobiónico desciende mucho, y en las condiciones de L.C. directamente no sintetiza
nada.
En las imágenes proporcionadas por el software de citometría de flujo no se
distinguen una bacteria de la otra, por lo que hay que recurrir al recuento en placas para
comprobar el crecimiento de cada una de ellas.
6. BIBLIOGRAFÍA
6. Bibliografía
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7. APÉNDICES
7. Apéndices
43
Tabla 4. Datos medios de pH de los cultivos.
pH
Tiempo (h)
L. C. puro P. T. puro Cocultivo Cond. L.C.
Cocultivo Cond. P.T.
0 5,38 6,46 5,41 5,64
3 5,02
4 4,94 6,38 5,06 5,18
5 4,92
6 4,78 6,58 4,77 5,08
7 4,89
8 4,59 6,35 4,56 5,09
9 4,86
10 4,43 6,57 4,37 5,09
11 4,83
12 4,32 6,40 4,26 5,12
20 5,89
24 3,82 6,19 3,81 4,55
24,5 4,46
28 3,62 6,04 3,74 4,33
31 4,36
32 3,60 5,89 3,69 4,20
36 4,99 4,25
48 3,59 5,58 3,76 3,86
54 3,84
56 5,14 3,48 3,90
60 3,96
72 4,88 3,51 3,82
96 3,70
98 4,49 3,97
100 3,77
7. Apéndices
44
Tabla 5. Datos medios de densidad óptica de los cultivos.
Densidad óptica
Tiempo (h) L. C. puro P. T. puro Cocultivo Cond. L.C.
Cocultivo Cond. P.T.
0 0,120 6,455 0,287 0,538
4 0,224 6,375 0,367 0,576
6 0,345 6,580 0,477 0,800
8 0,514 6,350 0,571 0,629
10 0,539 6,565 0,678 0,745
12 0,672 6,398 0,735 0,728
20 5,890
24 0,703 6,185 0,928 0,910
28 0,813 6,040 0,951 1,027
32 0,763 5,890 0,992 1,084
36 4,990 0,997
48 0,830 5,575 0,998 1,156
54 1,134
56 5,140 0,923 1,082
60 1,132
72 4,875 0,929 1,155
96 1,035
98 4,490
100 1,317
7. Apéndices
45
Tabla 6. Datos medio de UFCs de Lactobacillus Casei en los cultivos.
UFCs L. Casei
Tiempo (h) L. C. puro Cocultivo Cond. L.C.
Cocultivo Cond. P.T.
0 2,49E+06 9,83E+06 5,33E+07
4 1,29E+07 2,49E+07
6 1,67E+07 2,92E+07
7 6,07E+07
8 2,79E+07 3,76E+07
9 7,90E+07
10 5,02E+07 4,00E+07
12 5,83E+07 4,86E+07
24 5,31E+07 5,83E+07
24,5 4,73E+07
27,5 4,50E+07
28 3,47E+07 6,31E+07
32 4,94E+07 1,51E+08
48 4,68E+07 1,41E+08
56 3,49E+07 7,95E+07
72 3,47E+07 8,34E+07
7. Apéndices
46
Tabla 7. Datos medio de UFCs de Pseudomona Taetrolens en los cultivos.
UFCs P. Taetrolens
Tiempo (h) P. T. puro Cocultivo Cond. L.C.
Cocultivo Cond. P.T.
0 7,47E+06 8,10E+06 6,87E+07
3 1,08E+07
4 8,18E+06 7,95E+06
6 6,29E+06 2,67E+06
7 1,50E+06
8 4,70E+07 2,42E+07
9 4,67E+06
10 1,10E+08 3,12E+07
11 0,00E+00
12 1,47E+08 3,38E+07
24 9,23E+07 3,75E+07
24,5 0,00E+00
27,5 0,00E+00
28 9,53E+07 5,25E+07
31 0,00E+00
32 3,83E+07 7,08E+07
48 5,47E+07 1,45E+08 0,00E+00
56 5,15E+07 9,28E+07
72 2,40E+07 3,42E+07
98 0,00E+00
7. Apéndices
47
Tabla 8. Datos medios de concentración lactosa de los cultivos.
Lactosa (g/L)
Tiempo (h) L. C. puro P. T. puro Cocultivo Cond. L.C.
Cocultivo Cond. P.T.
0 34,947 50,568 34,897 43,065
2 48,239
4 39,336 55,409 33,216 45,390
6 37,501 49,340 33,443 32,363
8 37,198 48,500 35,673 41,014
10 37,389 40,179 39,718 38,646
12 35,644 40,003 39,388 40,127
14 29,687
16 28,945
18 26,181
20 27,994
22 26,171
24 30,607 37,701 37,992 36,428
28 28,900 45,785 39,441 34,389
32 32,343 27,315 36,963 32,896
36 29,121 29,780
48 28,866 30,055 41,502 27,905
54 28,540
56 26,173 34,052 30,934
60 29,027
72 22,559 35,176 27,627
96 25,793
98 24,598
100 25,959
7. Apéndices
48
Tabla 9. Datos medios de producción de ácido láctico de los cultivos.
Ácido láctico (g/L)
Tiempo (h) L. C. puro Cocultivo Cond. L.C.
Cocultivo Cond. P.T.
0 1,527 1,075 2,329
4 1,657 1,574 1,393
6 1,954 1,128 0,992
8 2,570 2,186 1,721
10 2,939 3,006 1,594
12 3,425 3,298 1,717
24 4,196 4,698 2,705
28 4,877 5,519 2,770
32 4,598 6,000 3,248
36 3,360
48 5,852 7,225 3,899
54 4,042
56 7,334 7,289 4,063
60 4,180
72 10,088 8,166 4,310
96 5,114
100 4,843
7. Apéndices
49
Tabla 10. Datos medios de producción de ácido lactobiónico de los cultivos.
Ácido lactobiónico (g/L)
Tiempo (h) P. T. puro Cocultivo Cond. L.C.
Cocultivo Cond. P.T.
0 0,000 0,000 0,000
2 0,000 0,000
4 0,263 0,000 0,000
6 0,641 0,000 0,000
8 1,325 0,000 0,000
10 1,901 0,000 0,000
12 3,035 0,000 0,011
14 2,092 0,000
16 2,329 0,000
18 1,496 0,000
20 2,953 0,000
22 3,265 0,000
24 4,001 0,000 0,944
28 7,134 0,000 1,217
32 8,167 0,000 1,398
36 4,431 0,000 1,840
48 9,592 0,000 2,617
54 2,729
56 9,981 0,000
72 10,121 0,000 2,707
98 10,665 0,000
100 2,495
