1

Comparación de dos procesos cromatográficos para la purificación de lactoferrina a partir de suero de queso Martínez-García M. J., Guzmán-Partida, A. M., Vázquez-Moreno, L y Ramos-Clamont M.

G*.

Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo A.C. Carretera a la Victoria Km 0.6

Hermosillo, Sonora. Coordinación de Ciencia de los Alimentos. Tel/fax 662 280 00 58. e-

mail gramos@ciad.mx

Resumen El suero lácteo subproducto de la elaboración de queso cuya Demanda Bioquímica de

Oxígeno (DBQ) es de 50,000 ppm se descarga contaminado las aguas y suelos

mexicanos. La recuperación de sus nutrientes, entre ellos, las proteínas, disminuye la

DBQ hasta en un 95%. Las proteínas del suero pueden utilizarse en las industrias

alimentaria y farmacéutica, como la Lactoferrina (Lf), proteína con funciones

antibacterianas, antioxidantes e inmunomodulatorias. Se compararon dos procesos para

la purificación de Lf, las cromatografías de intercambio iónico (IEC) y de afinidad por

metales inmovilizados (IMAC). En la IEC se utilizó Sulfopropil-Sefarosa, la adsorción de

proteínas se promovió con solución de fosfatos (PBS), pH 6.7 y la elución aplicando un

gradiente de NaCl (0.1 a 1 M). La matriz aceptó hasta 800 mg de proteína de suero

obteniéndose 3.29 ±1.4 mg de Lf. Para IMAC se utilizó Sefarosa-IDA-Cu++, la adsorción

de las proteínas se promovió con Tris-Ac. Acético 0.05M, NaCl 0.5M, pH 5 y la elución

con la misma solución a pH de 4 y 3. La matriz aceptó hasta 80 mg de proteína de suero

obteniéndose 0.08 mg de Lf contaminada con inmunoglobulinas. En conclusión IEC fue

más efectiva que IMAC para la purificación de lactoferrina.

Abstract Whey is a byproduct of the cheese making process with a biological oxygen demand

(BOD) of 50, 000 ppm. Whey represents an environmental problem for Mexico because is

disposed in water and lands. However the nutrient recovery of whey can reduce DOD in

95%. Whey proteins have potential applications in food and clinical industries. One of

them, Lactoferrin (Lf) is know to act as antibacterial, antioxidant and immunomodulator

factor. A comparison of two chromatography process for lactoferrin purification was done.

For LF purification with Ion Exchange Chromatography (AEC) a Sulphopropyl-Sepharose

matrix was used. Protein adsorption was promoted with PBS buffer, pH 6.7 while elution

2

was complete using a NaCl gradient (0.1 a 1 M). Matrix accepted up to 800 mg of whey

proteins and eluted 3.29 ±1.4 mg of Lf. Purification of Lf by Immobilized metal ion affinity

chromatography (IMAC) was done using a Sepharose-IDA-Cu++ matrix. Protein adsorption

was promoted with 0.05M Tris-Acetic acid, 0.5M NaCl, pH 5 while elution was complete

using the same solution at pH of 4 y 3 respectively. Sepharose-IDA-Cu++ matrix accepted

up to 80 mg of whey protein and eluted 0.08 mg of lactoferrin and immunoglobulins. In

conclusion AEC was more effective for Lf purification than IMAC.

Introducción

La producción de queso en México es una actividad rentable que aumenta año

con año. Sin embargo, durante el proceso de elaboración, se genera una gran cantidad

(relación 9:1 con respecto al queso) de suero lácteo el cual generalmente se elimina

como efluente, constituyendo un problema potencial de contaminación. La Demanda

Bioquímica de Oxígeno (DBO) del suero es de 50,000 ppm, un programa de recuperación

de nutrientes del suero podría reducir hasta en un 95% el valor de la DBO de las aguas

residuales de la industria láctea. Esto también aumentaría la rentabilidad de la empresa

(CONAMA, 1998).

Entre las proteínas del suero que pueden recuperarse se encuentra la lactoferrina

(Lf). Esta glicoproteína de 80 kDa tiene la capacidad de unir y transportar el hierro a

través de la sangre. Además, presenta otras funciones como su actividad bactericida,

antioxidante e inmunomodulatoria, que pueden aprovecharse tanto en la industria

alimentaria como en la farmacéutica. Las principales fuentes comerciales de Lf son el

suero de queso y la leche descremada, ambas de origen bovino (Tomita et al., 2002).

Para el 2003, se estimó una producción mundial de 73 toneladas de Lf; Nueva Zelanda

es el principal productor, mientras que Asia y Europa la consumen como suplemento

alimenticio o como antimicrobiano en cosméticos y pastas de dietes. Recientemente la

FDA aprobó el uso de lactoferrina en canales de carne para el control del crecimiento

microbiano (Wakabayashi et al., 2006).

El aislamiento y purificación de proteínas se basa en estrategias que exploten

propiedades físicas químicas y biológicas de la molécula tales como su carga, su

tamaño, su solubilidad, o sus propiedades de unión específica a otras moléculas. En base

a lo anterior, las proteínas pueden separarse por diversos métodos entre los que

destacan la precipitación por salado o con solventes y los métodos cromatográficos.

Estos últimos presentan la ventaja de ser más específicos y flexibles en lo que al

establecimiento de condiciones se refiere, lo que permite preservar más fácilmente la

estabilidad y la actividad biológica de la proteína purificada (Burnouf, 1995). En este

3

trabajo se comparan dos tipos de cromatografías IEC e IMAC para la purificación de

lactoferrina a partir de suero de queso.

Materiales y Métodos Materiales

Los ensayos de inmunodetección se realizaron con anti-Lf bovina producida en

cabra y anti IgG de cabra ligada a peroxidasa producida en conejo de los Laboratorios

Bethyl Labs (Montgomery, TX, EUA). La matriz cromatográfica Sulfopropil-Sefarosa se

adquirió en GE Healthcare (Upsala, Suecia). La matriz cromatográfica Sefarosa-IDA se

sintetizó en la Universidad de Arizona según Porath y Olin (1995). El resto de los

reactivos utilizados se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). El suero se

obtuvo de la elaboración de queso fresco por el método tradicional.

Purificación de lactoferrina

La purificación se llevó a cabo en un equipo ÄKTA Purifier (GE Healthcare,

Suecia). Para la IEC se utilizó una matriz de Sulfopropil-Sefarosa empacada en una

columna XK16 a un volumen de cama (VC) de 10 mL. La matriz se equilibró con 5 VC de

pBS 10 mM, pH 6.7 (Solución A). El suero (200-1600 mg de proteína total), se aplicó a la

columna y se promovió la adsorción de sus proteínas en presencia de la solución A,

misma que se utilizó como fase móvil y solución de lavado. Las proteínas débilmente

unidas se eliminaron con solución A con NaCl 0.1 M. La elución se promovió

desarrollando un gradiente de 0.1–1 M de NaCl. La columna se regeneró con 5 VC de

NaCl 1 M, 2 VC de NaOH 1 M y 10 VC de agua Milli Q.

Para la purificación de Lf por IMAC se utilizaron 10 mL de VC de Sefarosa-IDA-

Cu++. La matriz se equilibró con 5 VC de Tris-Ac. Acético 0.05M, NaCl 0.5M, pH 5

(Solución B). Las proteínas del suero (20-80 mg) se aplicaron a la columna, se promovió

la adsorción con solución B y la elución fue con la misma solución a distinto pH (4 y 3). La

matriz se regeneró con 5 VC de Guanidina 4M, 5 VC de EDTA 10 mM y 10 VC de agua

MilliQ. En ambos casos la proteína se estimó por el método de Bradford (1970) utilizando

una curva estándar de albúmina de suero bovino (BSA). La caracterización de las

fracciones cromatográficas de IEC e IMAC se realizo por electroforesis SDS-PAGE en

geles de poliacrilamida al 10% tiñendo con plata (Laemmli, 1970) y por inmunodetección

con anti-lactoferrina bovina con Western Blot con el sistema avidina-peroxidasa (Towbin

et al., 1979).

4

0.6

0.5

1.0

0.9

0.8

0.7

0.4

0.3

0.2

0.1

0

NaC

l(M

)N

aCl

(M)

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-0,5

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

fracciones

-0,5

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

-0,5

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

fracciones

abso

rban

cia

(280

nm

)

21 43

0.6

0.5

1.0

0.9

0.8

0.7

0.4

0.3

0.2

0.1

0

NaC

l(M

)N

aCl

(M)

NaC

l(M

)N

aCl

(M)

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-0,5

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

-0,5

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

fracciones

-0,5

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

-0,5

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

fracciones

abso

rban

cia

(280

nm

)

21 43

66

45

31

21

14

126197

kDa

66

45

31

21

14

126197

kDa

66

45

31

21

14

126197

kDa

66

45

31

21

14

126197

kDa

1 2 6663

0.6

0.5

1.0

0.9

0.8

0.7

0.4

0.3

0.2

0.1

0

NaC

l(M

)N

aCl

(M)

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-0,5

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

fracciones

-0,5

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

-0,5

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

fracciones

abso

rban

cia

(280

nm

)

21 43

0.6

0.5

1.0

0.9

0.8

0.7

0.4

0.3

0.2

0.1

0

NaC

l(M

)N

aCl

(M)

NaC

l(M

)N

aCl

(M)

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-0,5

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

-0,5

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

fracciones

-0,5

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

-0,5

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

fracciones

abso

rban

cia

(280

nm

)

21 43

66

45

31

21

14

126197

kDa

66

45

31

21

14

126197

kDa

66

45

31

21

14

126197

kDa

66

45

31

21

14

126197

kDa

1 2 6663

Resultados y Discusión En la figura 1 se muestra el cromatograma típico de la purificación de lactoferrina por

cromatografía de intercambio iónico. El pico 1 muestra la fracción de lavado obtenida con

16 VC, los picos restantes son las eluciones de las proteínas adsorbidas. Las proteínas

que no se adsorbieron específicamente (pico 2), fueron retiradas de la matriz con 7 VC de

la solución A conteniendo NaCl 0.1 M. Posteriormente se realizó un gradiente de NaCl de

0.1-1 M en solución A y se obtuvieron otros dos picos de elución (picos 3 y 4). El pico 3

eluyó con 12 VC a una concentración entre 0.1-0-5 M de NaCl a mientras que el pico

cuatro se obtuvo entre 0.5-1.0 M de NaCl con 12 VC. Las alturas máximas de los picos 3

y 4 se obtuvieron a 0.24 M y 0.75 M de NaCl, respectivamente. Se cargaron desde 200

hasta 1600 mg de proteínas de suero a la matriz cromatográfica, pudiéndose trabajar a

un flujo de fase móvil de 5 mL/min. Los balances de materia mostraron que la columna se

satura al aplicar 800 mg de proteínas de suero y que la capacidad de la matriz es de 0.33

mg de lactoferrina /mL de matriz cromatográfica. Sin embargo, la lactoferrina más pura

(1.60 ± 0.12 mg) se obtiene aplicando 400 mg de proteína a la matriz. La cantidad

obtenida corresponde al contenido reportado en la literatura. La duración del proceso fue

de 4 h.

Figura 1. Cromatograma típico de la purificación de lactoferrina por intercambio iónico. La

adsorción de proteínas se promovió en presencia de PBS pH 6.7 (pico 1). Las proteínas

que no se unieron de manera específica fueron desprendidas con NaCl 0.1 M (pico 2).

Posteriormente se eluyó con un gradiente de 0.1-1 M de NaCl (picos 3 y 4). En el extremo

izquierdo se muestra la electroforesis del pico 4 en el que se obtuvo la Lf (carril 2) y la

5

confirmación por inmunodetección con anti-lactoferrina (carril 3).

En el extremo derecho de la figura 1 se muestra la migración electroforética del pico

4 (carril 2) al aplicar 400 mg de proteína de suero de queso. Se observa una banda de

80 kDa correspondiente a la masa molecular de la Lf bovina (Levay y Viljoen, 1995). No

se observa contaminación con alguna otra proteína. La inmunodetección con anti-

lactoferrina bovina (carril 3), confirmo la presencia de la proteína.

La figura 2 presenta el cromatograma típico y la electroforesis de las fracciones

obtenidas por IMAC para la purificación de Lf. En el cromatograma se observan 3 picos

correspondientes al lavado (Solución B, pH 5) y a las eluciones con solución B a pH 4 y 3,

respectivamente. La matriz aceptó desde 20 a 50 mg de proteínas de suero saturándose

con 40mg. La velocidad máxima de la fase móvil fue de 1 mL/min. La capacidad de la

matriz fue de 0.1 mg de proteína /mL de matriz, obteniéndose un máximo de 0.08 mg de

proteína en un proceso de 4 h. Sin embargo, la Lf no pudo obtenerse pura en este tipo de

cromatografía como indica el carril 4 de la figura 2B en el que se observa una banda de

80 kDa correspondiente a la Lf y otras bandas de 66, 55 y 25 kDa correspondientes a la

albúmina sérica y a las cadenas pesadas y ligeras de las inmunoglobulinas,

respectivamente. Debido a esta contaminación, fue necesario acoplar una columna de

Sefarosa-Heparina a IMAC, con el fin de aplicarle la elución a pH 4 y obtener la Lf pura

añadiendo 4 h más al proceso (Datos no mostrados).

En el Cuadro 1 se resumen los aspectos más relevantes de la comparación de

ambos procesos cromatográficos. Como puede observarse la cromatografía de

intercambio iónico requiere de la mitad del tiempo de proceso (4 h) para obtener de 18 a

20 veces más lactoferrina que la cromatografía de afinidad por metales inmovilizados. En

este último proceso debe además, acoplarse una cromatografía de afinidad por heparina

para obtener la lactoferrina pura, ya que, como se observó en los patrones

electroforéticos de la figura 2, la Lactoferrina obtenida por IMAC se encuentra

contaminada con albúmina e inmunoglobulinas. Otro aspecto importante es que, debido a

que la matriz de intercambio iónico acepta mayores flujos de la fase móvil sin

comprimirse (5 mL/min) y acepta una mayor cantidad de proteínas sin saturarse, tiene

capacidad de escalamiento del proceso

6

Figura 2. Purificación de lactoferrina de suero de queso por IMAC. A) Cromatograma

típico. La adsorción se promovió en presencia de solución Tris Ac. Acético, pH 5 (pico 1.

La elución de las proteínas adsorbidas se realizó con la misma solución pero a pH 4 y 3

(picos 2 y 3), respectivamente. B SDS-PAGE al 10% de las fracciones cromatográficas.

Carril 1 estándares de masa molecular, carril 2 suero de queso, carril 3 fracción de lavado

(pico1), carril 4 fracción de elución a pH 4 (pico 2), carril 5 fracción de elución a pH 3.

La tabla 1 resume los aspectos más relevantes en la comparación de los dos procesos de

purificación.

Cuadro 1. Comparación de los dos procesos cromatográficos para purificación de

lactoferrina de suero de queso

Tipo de cromatografía

Intercambio Iónico Afinidad por Metales Inmovilizados

Matriz cromatográfica Sulfopropil-Sefarosa Sefarosa-IDA-Cu++ Cantidad de proteína que acepta la matriz

400-800 mg 35-40 mg

Velocidad de flujo 5-10 mL/min 0.5-1 mL/min Capacidad de la

matriz 0.33 mg de Lf/ml de matriz 0.1 mg proteína/mL de matriz

Lactoferrina obtenida Pura Contaminada, se requiere acoplamiento con cromatografía en

Sefarosa-Heparina Lactoferrina/corrida 1.60 a 3.29 mg

0.08 a 0.14 mg

7

Referencias Bibliográficas

• Bradford, M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye-binding. Anal. Biochem. 72:248-254.

• Burnouf, T. 1995. Chromatography in plasma fraction: benefits and future trends. J. Chromatogr. B. 664:3-15.

• CONAMA. 1992. Guía para el control y la prevención de la contaminación industrial. Productos Lácteos. Comisión Nacional del Medio Ambiente. Chile

• Laemmli, U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head bacteriophage T4. Nature. 227:680-685.

• Levay, P.F., and Viljoen, M. 1995. Lactoferrin: a general review. Acta Haematol. 80:252-267

• Towbin, H., Staehelin, T., and Gordon, J. 1979. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. 76:4350-4354.

• Tomita, M., Wakabayashi, H., Yamauchi, K., Teraguchi, S., and Hayasawa, H. 2002. Bovine lactoferrin and lactoferricin derived from milk: production and applications. Biochem. Cell Biol. 80:109-112.