Comparacion de 2 Diluyentes Comerciales Para Criopreservar Semen Bovino Bajo Condiciones Campo en El...

7/24/2019 Comparacion de 2 Diluyentes Comerciales Para Criopreservar Semen Bovino Bajo Condiciones Campo en El Tropic…

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UNIVERSIDAD VERACRUZANA

FACULTAD DE MEDICINAVETERINARIA Y ZOOTECNIA

“COMPARACIÓN DE DOS DILUYENTESCOMERCIALES PARA CRIOPRESERVAR

SEMEN DE BOVINO BAJO CONDICIONES DE

CAMPO EN EL TRÓPICO HÚMEDO.”

TESIS PROFESIONALPARA OBTENER EL TÍTULO DE

MÉDICO VETERINARIO ZOOTECNISTA

PRESENTA:DANIEL M. CARBALLO GUERRERO

ASESORES:DR. RODOLFO CANSECO SEDANOING. RUBÉN GARCÍA GONZALEZ

DR. FELIPE MONTIEL PALACIOS

H. VERACRUZ VER. 2005



Medicina Veterinaria y Zootecnia

INIDICE

RESUMEN…………………………………………………………………….………..1 NTRODUCCION……………………………………………………………..………...2

ANTECEDENTES……………………………………………..………….……………5

ASPECTOS FISIOLÓGICOS ACERCA DEL CONGELAMIENTO DE SEMEN….13

ACCIÓN DE LOS CRIOPROTECTORES INTRA Y EXTRACELULARES…….…16

JUSTIFICACION…………………………………………………………….…….…18

HIPOTESIS………………………………………………………………………..…..19

OBJETIVOS…………………………………………………………………….…….20

METERIAL Y METODOS……………………….…………………………………..21

ANÁLISIS ESTADÍSTICO……………………….…………………………….……30

RESULTADOS…………………………………....………………………………….31

DISCUCIÓN………………………………………………………………………….37

CONCLUCIONES……………………………………………………………………39

BIBLIOGRAFIA……………………………………………………………………..40




DEDICATORIA

A mis padres:

Guido Carballo Cruz y Flora Guerrero Cruz

Por ser siempre para mi un apoyo constante en todos los aspectos y por la forma de

educarme y construir las bases sobre las que edifico mi vida la cual completa hoy un paso

mas al terminar mi carrera de Medico Veterinario Zootecnista, con lo cual espero gratificar

un poco todo el esfuerzo realizado por ellos para conmigo

GRACIAS.




AGRADECIMIENTOS

Agradezco al Dr. Rodolfo Canseco Sedano por toda la ayuda brindada en la

realización de este trabajo y todos los conocimientos que me transmitió durante el mismo,

al M.V.Z. Manuel Vargas I. por todo lo que de él aprendí mientras realizábamos juntos el

trabajo de campo y laboratorio, al Ing. Rubén García G. por todo el apoyo en la elaboración

de la parte estadística, a Francisco T. Barradas Piña por su ayuda y un agradecimiento

especial a Mireya Martínez Ruiz E. por todo lo que me ayudo tanto en la realización de este

trabajo como en la gran mayoría de la carrera en tareas, estudiando y hasta en aspectos

personales, gracias por apoyarme siempre y por todos esos pequeños y grandes detalles

para conmigo; y a todos mis amigos por hacerme pasar momentos agradables y dejarme

recuerdos que estoy seguro no olvidare. También agradezco a la Facultad de Medicina

Veterinaria y Zootecnia y profesores por los conocimientos que en gran parte hoy hacen de

mi un Medico Veterinario Zootecnista.

GRACIAS.




RESUMEN

Daniel M. Carballo Guerrero. “Comparación de dos diluyentes comerciales paracriopreservar semen de bovino bajo condiciones de campo en el trópico húmedo.” Tesis profesional.

Asesores: Rodolfo Canseco Sedano, Rubén García González. y Felipe Montiel Palacios.Facultad de Medicina y Zootecnia; Universidad Veracruzana, Veracruz, Ver. 2005.

Con el fin de evaluar un nuevo diluyente (Andromed) a base de soya para la

criopreservación de semen bovino en el trópico húmedo y tratar de determinar su mejor

tiempo de equilibrio, se comparó Andromed con Triladyl, este último ya validado con

buenos resultados. Se trabajó en la zona centro del estado de Veracruz, México, con 18

eyaculados de toros de razas tanto europeas como cebuinas y cruzas, colectados por medio

de electroeyaculación. Cada uno de estos eyaculados se dividió en dos y se diluyó cada

parte con uno u otro diluyente, el semen ya diluido se congeló utilizando tres tiempos de

equilibrio: el primero de 2 a 3 h, el segundo de 4 a 5 h y el tercero de 8 a 9 h, en todos los

casos se trabajó con los eyaculados siguiendo los mismos procedimientos, variando

únicamente el tiempo que se mantuvo las dosis en el vapor de nitrógeno, lo cual se hizo

siguiendo las indicaciones de sus fabricantes. Se descongelaron dos dosis de cada

eyaculado de 1 a 3 y de 15 a 20 días después de congelado. Cada vez que se descongeló

semen se evaluó su movilidad a los 0, 30, 60 y 90 minutos pos-descongelado dejándolo en

baño maría durante este tiempo a 37°C. Los resultados fueron analizados por análisis de

varianza. En general, el diluyente tuvo un efecto significativo (P<0.05) sobre la movilidad

posdescongelado siendo el Triladyl mejor que el Andromed. Para ambos diluyentes, el

mejor tiempo de equilibrio fue el de 8 a 9 h (P<0.05). Por otro lado en cuanto al día de

descongelado el semen se comportó muy parecido al permanecer congelado un solo día que

quince (P=0.68071) sin haber diferencia significativa. Con lo anterior se puede concluir que

el mejor tratamiento empleado en este trabajo y bajo estas condiciones fue en el que se

utilizó Triladyl y con un tiempo de equilibrio de 8 a 9 h, aunque el Andromed puede serutilizado en zonas tropicales con resultados aceptables.

1




INTRODUCCIÓN

La contribución de un toro por medio de la monta natural o la InseminaciónArtificial (I. A.), en la eficiencia reproductiva y en la producción de carne, leche o ambas,

es de gran importancia ya que cada toro o su semen representa la mitad de la composición

genética de la progenie (Coulter, 1979).

La dilución apropiada y conveniente del líquido fecundante, recogido por

procedimiento especial, tiene como objeto aumentar el volumen total de la masa

espermática con el fin de poder, a partir de una sola eyaculación, fecundar por medio de la

inseminación artificial al mayor número de hembras posible (Derivaux,1982) y al mismo

tiempo rodear a los espermatozoides de condiciones óptimas para el mantenimiento de la

vitalidad y capacidad fecundante a través del tiempo, circunstancia que ha sido denominada

“lontogénesis” (génesis a distancia); es decir, la posibilidad de fecundar mas allá del

ambiente es que se desenvuelven los sementales (Perez y Perez, 1966).

Historia:

La historia científica de la criopreservación de semen se remonta a 1677, cuando

una carta escrita por Antonie van Leeuwenhoek a la Real Sociedad de Londres reporta su

hallazgo de haber encontrado células móviles en el semen humano (Van Leeuwenhoek A. ,

1677).

Derivaux (1982) informa que los primeros en usar inseminación artificial (I.A)

fueron los árabes en el siglo XIV, pero los primeros datos que se tienen son del fisiólogo

italiano Lauro Spallanzani que inseminó una perra quedando esta preñada en 1779, unos

años mas tarde según Bearden (1982) en 1803 Spallanzani informa que el esperma enfriado

con nieve no muere solo se inmoviliza y que puesto en calor recupera su movilidad por

unas horas.

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Luego en 1866 otro italiano, Mantegazza, reportó sus hallazgos de que el semen

puede ser preservado al reducirse la temperatura. Además, él escribió: “Si el semen humano

puede ser preservado por más de 4 días a la temperatura que se derrite el hielo sin pasar por

ningún cambio, de seguro que los investigadores del futuro podrán mejorar la calidad de los

caballos y vacas, sin tener que pagar mucho dinero por el transporte de los sementales. Será

fácil llevar a cabo inseminaciones artificiales con semen congelado enviado de una

localidad o otra. También es posible que el marido que muere en la guerra pueda fertilizar a

su mujer y tener descendencia, inclusive después de su muerte”. (Mantegazza P., 1866).

Hoy en día, las predicciones de Mantegazza se han cumplido y su visión fue mucho más

excepcional si tomamos en cuenta la falta de evidencia científica de su época.

En 1940 P. H. Phillips y H. A Lardy descubren un medio nutritivo para diluir eleyaculado (Bearden, 1982) y en 1942 Salisbury ideó un diluyente de semen a base de

citrato de sodio y yema de huevo, que resultó de fundamental importancia debido a que

evita el shock frío de los espermatozoides sometidos al congelamiento y a lo que se le debe

la difusión de la I.A. (Oka, 2001).

Después de la 2° guerra mundial, J.O. Almquist fue el primero en comunicar el uso

de la penicilina para el control de los contaminantes bacterianos del semen (Bearden,

1982).

En 1940 se hicieron varios intentos para congelar el semen solamente bajando su

temperatura, pero dieron como resultado una recuperación muy baja como consecuencia de

la formación de cristales de hielo en el interior de los espermatozoides. En esa época no se

daba importancia a la acción de las sustancias crioprotectoras, y los primeros intentos para

evitar la formación de cristales de hielo fue el uso de la vitrificación, un proceso de

congelamiento tan rápido que no permite que se formen los cristales (Polge et al, 1949).

Lo que realmente cambió las técnicas de congelamiento de semen fue el

descubrimiento hecho por A. S. Parkers y C. Polge cuando en 1952 adicionan con éxito la

glicerina al diluyente como medio de protección del espermatozoide al encontrar que si se

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mezclaban los espermatozoides con glicerol y se dejaba así durante una noche antes de la

congelación los resultados de este proceso serían mejores, en este tiempo los

espermatozoides absorben el glicerol para reemplazar cierta cantidad de agua de la célula; a

este periodo se le conoce en la actualidad como tiempo de equilibrio (Bearden, 1982).

Cinco años después en 1957 el servicio de reproductores americanos inició el uso de

nitrógeno líquido como refrigerante para la congelación y almacenamiento del semen.

Mas recientemente se han desarrollado diluyentes a base de soya, lo cual evita

incluir proteínas de origen animal y hace que la preparación del diluyente sea mas

consistente.

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ANTECEDENTES

Por diluyente entendemos la solución acuosa que permite aumentar el volumen del

eyaculado hasta conseguir las dosis necesarias, preservar las características funcionales de

las células espermáticas y mantener el nivel de fertilidad adecuado (Gadea, 2003)

Los primeros medios utilizados para diluir el semen fueron principalmente las

soluciones salinas o azucaradas para aumentar el volumen del semen para su empleo

inmediato más bien que como conservadoras de él (Salisbury, 1982).

Por años se han estado descubriendo, investigando y evaluando muchos medios para

la dilución de semen, especialmente bovino, los cuales antes de la década de 1950 solo

permitía conservar su viabilidad por 1 o 2 o en ocasiones hasta 4 días a temperaturas

aproximadamente de 4 °C en estado líquido o inclusive a temperatura ambiente de 15 a

25°C (Sorensen, 1984); todo esto en gran parte gracias a que se descubrieron los valores de

la yema de huevo que presentó un diluyente “conservador” que reunía las ventajas de

disminuir la actividad metabólica de los espermatozoides y prolongar su fertilidad

conservándolos aproximadamente a 5° C (Salisbury, 1982).

El semen empieza a congelarse exitosamente a principios de los 50´s. El semen

congelado puede almacenarse por tiempo indeterminado. No es raro escuchar que alguien

emplee semen congelado por 10 años o más, proveniente de un semental muerto tiempo

atrás. En la actualidad el medio más común de almacenamiento es nitrógeno líquido, el cual

tiene una temperatura de -196 °C. Otros medios son los mecánicos en los cuales sealmacena aproximadamente a -110°C y el hielo seco y alcohol que alcanza una temperatura

de -79°C (Sorensen, 1984).

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Muchos tipos de diluyentes han sido descritos y unos de ellos son:

Diluyente de yema de huevo fosfatada:

Este medio, responde a la siguiente composición:

Na2HPO4 12H2O = 2,0 g.

KH2PO4 = 0,2 g.

Agua destilada = 100 mL

A esta solución se le adiciona yema de huevo a la concentración del 20 al 50%,

debiendo el pH final estar comprendido entre 7 y 6.8.

Este primer diluyente preparado con yema de huevo, permite conservar la actividad

fertilizante del esperma durante algunos días; presenta el inconveniente de hacer difícil

el examen del esperma en el momento del empleo debido a la presencia de grumos de

grasa, frente a los cuales el fosfato no tiene ninguna actividad dispersante.

Diluyente de yema de huevo citratada:

Se sabía que el esperma contiene ácido cítrico y que la adición de este producto a

una solución de ringer-fosfato aumenta la vitalidad de los espermatozoides y se

demostró entonces que un medio a base de citrato sódico era mejor que el de fosfato y

aseguraba mejor la vida y la fertilidad de los espermatozoides.

Las diluciones de citrato empleadas contienen 2,9 g. de Na3O6H5O72H2O por 100

ml de agua destilada (medio isotónico) al que se le añade la yema de huevo a la

concentración de 20 al 50%.

El medio de citrato es muy simple de preparar, práctico y poco costoso, presenta

también la ventaja sobre el medio de fosfato, de facilitar el examen microscópico, por

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que el citrato, agente quemador, se une al calcio y otros metales pesados ejerciendo así

una acción dispersante sobre los glóbulos grasos de la yema de huevo.

Diluyentes a base de glicocola y glicerina:

Se ha recomendado el medio de yema de huevo con glicocola y que responde a la

siguiente composición: solución de glicocola al 4% e igual volumen de yema de huevo.

A 4°C este medio asegura in vitro una supervivencia de duración más larga que la

que se consigue con los medios de yema de huevo fosfatada y citratada.

Se cree que los efectos favorables de la glicocola serían debidos a su unión conciertos metales pesados que tienen un efecto desfavorable sobre la vitalidad del

espermatozoide.

Lo mismo sucede con la glicerina cuando se adiciona a medios conservados a 5°C y

empleados de inmediato. Se señala que la eficacia reproductora del esperma diluido en

el medio de leche adicionada de un 10% de glicerina es mejorada.

Diluyentes a base de leche:

La leche contiene fosfatos, citratos y azúcares; por esto, fue recomendado como

medio de conservación por autores rusos, que empezaron a utilizarla en la especies en

las que el esperma era bastante difícil de conservar, especialmente en el caballo

semental.

Toda una serie de trabajos han demostrado que la leche homogenizada, la leche

descremada pasteurizada, la leche descremada en botes y la leche en polvo reconstruida

adicionada de antibióticos; especialmente penicilina y estreptomicina, pueden, a

condición de ser hervidas e incluso calentadas durante 10 minutos a 92 y 98°C,

constituir buenos medios de dilución. Si a la leche se le añade yema de huevo en la

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proporción de 5 a 15% se mejora ventajosamente, a la leche también se le podría

agregar glicina o glicerol.

La finalidad fundamental del calentamiento es destruir la actividad espermicida de

la lactenina, proteína de la leche.

Diluyentes gelatinados:

Se recomendó también un medio a base de fosfato-glucosa, gelatinado al cual se le

añadió 10% de yema de huevo y este fue empleado en gran escala en Dinamarca. Sin

embargo, no ofrece ninguna ventaja sobre los medios anteriormente descritos.

También se han utilizado diluyentes a base de leche de coco + yema de huevo los

cuales aseguran una mayor supervivencia a 2-3°C que el medio de citrato-yema de

huevo y diluyentes a base de extractos de músculo, de corazón de buey, de embriones

de ternera, etc, permitiendo una conservación bastante buena, pero tienen la desventaja

de ser de preparación delicada, difíciles de esterilizar y por lo tanto de conservar, y

todos ellos tienen un precio bastante elevado ( Derivaux,1982).

ADICIONES EMPLEADAS EN DILUYENTES:

• Glucosa y Fructuosa

La adición de glucosa o fructuosa a un medio de dilución, parece constituir un

elemento que favorece la vitalidad de los zoospermios. Parece, sin embargo, que estos

azúcares intervendrían más por su acción física al mantener la presión osmótica y un

balance electrolítico conveniente para el medio, que por la energía metabólica que

pudiesen proporcionar a los espermatozoides (Derivaux, 1982).

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• Agentes anitimicrobianos:

Desde 1941 se puso atención al problema de los contaminantes microbianos en el

eyaculado del toro. El número de organismos por mL puede fluctuar entre no

detectables y varios millones; muchos no son patógenos, pero compiten con los

espermatozoides por nutrientes y producen compuestos metabólicos que tienen efectos

adversos sobre la viabilidad de los espermatozoides. Existe la posibilidad de que se

eyaculen algunos patógenos y de que otras fuentes contribuyan a la contaminación.

En 1946 se descubrió el efecto benéfico de añadir antibióticos a los diluyentes de

semen. Algunos de los antibióticos empleados en los diluyentes son:

SulfonamidasPenicilinas

Estreptomicinas

Polimixina (Bearden, 1982)

Características que debe reunir un diluyente:

o

Deben ser isotónicos al semen (tener la misma concentración de iones libres).

o Capacidad amortiguadora (evitar cambios de pH al neutralizar los ácidos producidos

por el metabolismo de los espermatozoides).

o Proteger a los espermatozoides de las lesiones producidas por el choque térmico.

o Proporcionar nutrientes para el metabolismo de los espermatozoides.

o Controlar contaminantes microbianos.

o Los espermatozoides deben de estar protegidos contra daño durante la congelación

y descongelación.

o

Debe preservar la vida de los espermatozoides con un mínimo de efecto sobre la

fertilidad (Bearden, 1982).

Los diluyentes deben de poseer los puntos antes citados además de ser de

preparación fácil, estables y económicos (Salisbury, 1982).

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Bajo los criterios mencionados anteriormente, en los últimos años, laboratorios

comerciales han elaborado concentrados para la preparación de diluyentes de fácil uso a

nivel de campo y sin la necesidad de tener que contar con un laboratorio con equipo

sofisticado, ya que los diluyentes anteriormente descritos y otros mas han funcionado

adecuadamente, pero tienen el inconveniente que a nivel de campo es difícil reunir todas las

condiciones para su elaboración.

Ejemplos de concentrados comerciales para la elaboración de diluyentes son:

El universal de IMV:

Fabricado en Francia, por la compañía IMV. Este es un concentrado de dos pasos,en el cual hay que preparar la porción glicerada y la no glicerada. El concentrado es

llamado “Concentrado buffer EUROPHOS bovino” y contiene buffer de iones

hidrogenados, ácido cítrico y carbohidratos; además de un frasco con antibióticos llamada

“antibióticos CSS” equivalente a 60 mg. de tilosina, 300mg. de gentamicina y 180/360 mg.

de lincospectina; y una botella con glicerol (Manual de Universal de IMV).

Triladyl:

Fabricado en Alemania, por el laboratorio Minitube; este es un concentrado para la

preparación de un diluyente listo para el uso de un solo paso, que esta basado en Tris

(Hidroxi-metil aminometano, un amortiguador sintético) y además contiene agua

bidestilada, glicerol, ácido cítrico, fructosa y por cada 100 mL contiene los siguientes

antibióticos: tilosina 5mg, gentamicina 25mg, espectinomicina 30mg y lincomicina 15mg.

Para su preparación se adicionan tres partes de agua bidestilada, una parte de yema de

huevo y una parte del concentrado comercial (Manual de Triladyl).

Cabe mencionar que este es el más comúnmente empleado para diluir y congelar

semen bovino en la actualidad, y es uno de los que se va a comparar en esta investigación.

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Sobre estos dos últimos diluyentes comerciales se tiene referencia de

investigaciones de campo en zonas tropicales en las que se ven que los dos pueden ser

empleados exitosamente (Villa, 1996).

Diladyl:

Fabricado también en Alemania por la misma empresa que fabrica el Triladyl; este

es para preparación en dos pasos, esta constituido por una fracción “A”, una “B” (con

glicerol) y una “C” con antibióticos (Catalogo, Minitube)

Y más recientemente este mismo laboratorio, minitube saco al mercado un

concentra al cual no se le debe aplicar yema de huevo para la elaboración del diluyente, y

es el segundo concentrado comercial que se va a utilizar para el estudio en este caso.

Andromed:

Es un diluyente a base de lecitina de soya es de la nueva generación de medio

andrológico libre de ingredientes de origen animal, para la congelación de semen bovino.

Este medio tiene ventajas sobre sus antecesores, ya que ha logrado tasas de no retorno hasta

de 2.6% mayores que los diluyentes convencionales preparados a base de yema de huevo

(del 67.85% con los preparados a base de yema de huevo contra un 70.45% con el diluyente

sin yema de huevo), esto se demostró en un estudio de campo realizado por el Centro de

Dermatología y Andrología de la Universidad Justun-Leibig de Giessen Alemania (Aires,

2003). En este estudio se compararon los porcentajes de no retorno al estro de 20,000

vacas (10,000 por grupo) inseminadas con eyaculados divididos y diluidos ya sea en

diluyentes convencionales de tris+yema de huevo o en Andromed (Minutube, 2003).

También existen otros estudios con diluyente a base de soya los cuales revelan a

diferencia del antes mencionado que los diluyentes a base de yema de huevo tienen una

ligera ventaja en cuanto a la tasa de no retorno con respecto a los elaborados con soya como

lo señalan estudios hechos con Biociphos-Plus, el cual se agrupa dentro del grupo de

diluyentes a base de soya (Harina, 2000; Thun, 2002).

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Las ventajas del diluyente sin yema de huevo son las siguientes:

⊕ No tiene ingredientes de origen animal.

⊕ No existe riesgo de contaminación bacteriana.

⊕ Altas tasas de concepción, incrementa tasa de no retorno.

⊕ Formula antibiótica estandarizada según EC.

⊕ Fácil de preparar, ahorra tiempo, por ejemplo solo se debe de diluir el contenido

de una botella de Andromed (200 ml) en 800 ml de agua destilada para preparar

un litro de diluyente.

⊕

Microscopia:

Fácil de evaluar. Por ser altamente transparente, permite una calidad

de imagen óptima cuando se observa al microscopio ya que no se observan las burbujas

comunes en los diluyentes a base de yema de huevo o leche. De esta forma, los eyaculados

de calidad cuestionable pueden ser detectados y evaluados mas fácilmente. Por lo tanto se

puede implementar un mejor estándar de selección.

⊕ Otras aplicaciones:

Debido a su excelente calidad esta indicado también para la

preservación de semen líquido y eyaculados con baja concentración o donde se requieren

altas tasas de dilución. Es recomendado también en la investigación celular que usa a losespermatozoides como modelo y que permite la evaluación del semen en sistemas

computarizados como el CASA. (Minutube, 2003)

Hay que tomar en cuenta que los resultados escritos anteriormente se dieron en unos

condiciones diferentes a las que tenemos en nuestra zona, tanto climáticas como razas

genéticas, etc.

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ASPECTOS FISIOLOGICOS ACERCA DEL CONGELAMIENTO DE

SEMEN

Siendo el agua la fuente esencial para las funciones vitales de cualquier organismo, noes raro pensar que la falta o solidificación de ésta cause incompatibilidad para la vida. Sin

embargo, la permanencia de una célula en estado de congelación se contrapone a lo

anterior, ya que con el método de congelamiento se puede preservar una célula a

temperaturas extremadamente bajas, permitiendo que el metabolismo se reduzca

“absolutamente”, sin que pierda su potencial vital. A temperaturas de -196°C no hay

reacciones bioquímicas ni energía térmica dentro de la célula, aun más, no hay evidencia de

que puedan haber cambios de índole genético. No obstante, dicha estabilidad solamente

puede ser mantenida a temperaturas por debajo de los -130°C, ya que, a temperaturas

mayores, puede haber agua no congelada intracelularmente la cual permite funciones

metabólicas, causando degradación de la célula. (Palacios, 1994)

Al pensar en criopreservar semen se debe tener claro que el objetivo es mantener los

siguientes requerimientos y propiedades de un espermatozoide para poder fertilizar:

•

Metabolismo para llevar a cabo la producción de energía para sus funciones.• Proteínas necesarias para la sobrevivencia dentro del aparato reproductor femenino,

y para la adhesión al ovocito en el momento de la fertilización.

• Enzimas acrosomales útiles para la penetración al ovocito.

• Capacidad de movimientos progresivos. (Amann and Pickett, 1987)

Está comprobado que al reducir la temperatura por debajo de los 20°C, el

espermatozoide comienza a presentar cambios biofísicos, principalmente en la membrana plasmática, pero no es sino cuando se somete a temperaturas entre los 0°C y los -20°C, o

hasta los -60°C, que el espermatozoide sufre efectos de descomposición iónica y de

líquidos suficientemente graves para causar un choque térmico. Esto se puede detectar al

microscopio por la presencia de espermatozoides con la cola doblada, con pérdida de

movilidad por la disminución de energía, o realizando movimientos en círculo, lo cual se

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debe al aumento de la permeabilidad de la membrana plasmática y a la salida de iones y

moléculas.

El problema en la crioconservación no es la habilidad del espermatozoide para

mantenerse viable a -196°C, sino sortear el daño que ocurre durante el congelamiento y

descongelamiento, al pasar la célula por una zona crítica entre -15°C y -60°C durante la

cual se producen fenómenos que se derivan del proceso de enfriamiento, tales como

formación de cristales intra y extracelularmente, deshidratación y distorsión de la

membrana. (Daw et al., 1973)

Bajo condiciones normales, el daño que una célula sufra durante el congelamiento

depende de la velocidad de enfriamiento a la que ocurra dicho proceso. Mientras disminuyala temperatura, antes de llegar a -5°C, los líquidos aún no sufren cambios, pero al bajar de

esta temperatura, se comienzan a formar cristales extracelularmente de agua pura, logrando

que por el mismo fenómeno de cristalización todos los solutos queden separados del cristal,

aumentando así la concentración de sales en la porción de agua que aún no se congela (agua

precongelada) (Palacios, 1994). El término precongelado define al momento umbral antes

de que una célula o su ambiente sean congelado (Franks et al, 1983). Dentro de la célula

hay también agua precongelada, la cual se difunde hacia el exterior de la célula para que la

concentración de sales en el interior y el exterior de a misma se equilibren, sucediendo así

la deshidratación celular. Si el agua no sale rápidamente hay formación de cristales

intracelulares, que dañan mecánicamente a la célula. Si la tasa de enfriamiento es lenta, la

alta concentración de sales que queda en la porción no congelada dentro de la célula pueden

dañarla, además de deshidratarla, por lo que se hace importante encontrar el ritmo óptimo

de enfriamiento. (Amann and Pickett, 1987)

Con la finalidad de entender mejor este proceso se hace necesario remontarse a la

fisiología de la membrana espermática. La configuración bilaminar de las cadenas de

ácidos grasos de los fosfolípidos, junto con las proteínas integrales y periféricas, conforman

una barrera hidrofóbica difícil de atravesar. Los fosfolípidos de la membrana se pueden

mover lateralmente en la membrana, por lo que se dice que la membrana es un mosaico

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fluido. La fluidez de la membrana puede alterarse por varios factores, entre ellos la

temperatura. Al bajar ésta se produce un reacomodo de las cadenas de fosfolípidos en

forma de paquetes, ya sea en forma bilaminar o hexagonal, formándose con esto regiones

cristalinas. Sin embargo, hay regiones es las que todavía existen líquidos, y aquellas

proteínas que fueron separadas del bloque cristalino se agrupan, de forma que se

constituyen brechas de comunicación en la membrana. (Palacios, 1994)

Una hipótesis que también se plantea explica que el descender la temperatura por

debajo de 0°C disminuye la formación de ATP, por lo que la bomba de sodio-potasio de la

membrana plasmática (ATP dependiente) también disminuye su actividad. Esto causa que

el potasio que atraviesa la membrana para salir, fluya a una tasa mayor que el potasio que

entra, por lo que la concentración de K intracelular disminuye, y la relación Na-K se altera.Esto causa una despolarización parcial de la membrana, abriéndose por ello los canales de

calcio, el cual activa enzimas fosfolipasas, ocasionando una alteración general de las

membranas. Otra alternativa de explicación plantea que la célula se vuelve menos tolerante

a los cambios bruscos de volumen y concentración cuando está a temperaturas por debajo

de -5°C. (Fahy, 1986)

Dependiendo del ritmo de enfriamiento los eventos que suceden son distintos. Cuando

el ritmo de congelación es rápido (reducción de la temperatura mayor a 10-20°C/min) al

agua intracelular no le da tiempo de salir, por que se forman cristales que, al aumentar el

ritmo de congelamiento se hacen cada vez más pequeños, hasta hacerse imperceptibles aún

con el microscopio electrónico. Esto es saludable para la célula mientras permanezca en

este estado. No obstante, esos microcristales son termodinámicamente inestables, por lo que

al ser descongelados, tienden a agruparse (recristalización) y formar cristales más grandes,

que sin son letales para la célula, por lo que la solución es un ritmo de descongelamiento

rápido (Watson, 1986). No se conoce bien como la forma de recristalización daña la célula.

Se cree que no es físico el daño, es más, se piensa que directamente es inocuo, pero se

genera cambios letales en el sistema celular, los que son de carácter letal.

Con un ritmo de descongelamiento lento (reducción de la temperatura menor a

5°C/min) se puede evitar el congelamiento celular, por que este ritmo permite que el agua

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intracelular y extracelular encuentren su equilibrio, ya que el agua intracelular puede salir

continuamente, mientras el exterior se va congelando. Llega un momento, en que célula

prácticamente no tiene agua y no se congela. Hay evidencias que indican que cuando

aproximadamente el 90% del agua es removido, el 10% restante no es capas de congelarse

a ninguna temperatura. Pero ante esta situación la proporción de hielo extracelular es tan

grande que le causa daño a la membrana por su lado externo. (Mazur, 1984)

ACCION DE LOS CRIOPROTECTORES INTRA Y

EXTRACELULARES

Teóricamente se podría hacer más resistente a un espermatozoide reduciéndole el

número de poros en la membrana y reduciéndole la funciones ATP-dependientes, así como

la agregación proteínica y formación de bloques lipídicos. Presumiblemente ésta es la

acción de las lipoproteínas de la yema de huevo o de la leche en los diluyentes, y de

crioprotectores, como por ejemplo el dimetil sulfóxido, la botaina y el glicerol. Aunque no

se tiene bien determinado se la acción del glicerol tiene efectos externos o internos en la

célula, hay evidencias de que la presencia de un aditivo crioprotector reduce la

concentración de sales intracelulares a una temperatura dada, debido a que incrementa la

fracción no congelada en el exterior de la célula. El problema que se presenta con estoscrioprotectores es que también produce toxicidad, y que esta toxicidad disminuye la

concentración de otros aditivos que pueden ser usados en el diluyente y por lo tanto limita

la eficiencia de ellos.

En los diluyentes utilizados, tanto para semen refrigerado como para semen congelado,

ha sido necesario incluir leche descremada o yema de huevo, sobre todo ésta última. A

pesar de haber sido utilizada desde hace varias décadas, lo único que se conoce sobre el

efecto de la yema de huevo es que su inclusión mejora la fertilidad del semen. Tiene

bondades conocidas pero perjuicios desconocidos, especialmente actividades de tipo

enzimático potencialmente dañinas.

16




Uno de los obstáculos que se presenta para realizar la evaluación del semen es estudios

de diluyentes con base en yema de huevo, es la consistencia de la misma, la cual interfiere,

tanto por la viscosidad que produce en el diluyente, como por la poca nitidez que tiene el

campo visual del microscopio. La densidad del diluyente con yema de huevo puede influir

en la dirección o movimiento espermático. De hecho los estudios de viabilidad espermática

en humanos requieren efectuar lavado de las células para evitar distorsiones en la medición,

aunque esto, eventualmente, puede causar pérdida en la movilidad.

Recientemente han surgido investigaciones en las que se utilizan alternativas

proteínicas dentro del diluyente en lugar de la yema de huevo, así pues, se ha utilizado

albúmina sérica bovina, suero equino, suero bovino, proteína de soya, calostro, alcohol

polivinílico, etc. Todos ellos proveen la oportunidad de hacer estudios in vitro con buenavisibilidad ante el microscopio. (Palacios, 1994)

17




JUSTIFICACION

El poder contar con nuevos diluyentes de semen es un punto importante, mas aún si

éstos tienen algunas ventajas o son mas fáciles de usar; así, tener poco a poco mejoresresultados con las dosis de semen congeladas, lo cual esperamos con el diluyente estudiado

en este trabajo.

Esto es muy importante ya que la inseminación artificial es una herramienta de gran

utilidad en la ganadería mundial y un aspecto relevante en esto es el utilizar dosis de semen

bien elaboradas las cuales hayan sido trabajadas con un buen diluyente y con pasos

adecuados en su preparación.

18




HIPÓTESIS

El Andromed es tan eficiente como el Triladyl para mantener la viabilidad de los

espermatozoides pos-descongelado.

19




OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL

Evaluar un nuevo diluyente para la criopreservación de semen bovino, del cual no

se tiene datos de utilización en zonas tropicales.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1. Comparar el Andromed con otro diluyente comercial (Triladyl) ya validado en

zonas tropicales y así poder tener un punto de referencia para su utilización o

recomendación.

2. Estudiar cual es el tiempo óptimo de equilibrio en zonas tropicales del Andromed y

ver si no se pueden prolongar o disminuir del tiempo que se recomienda en zonas

templadas.

20




MATERIAL Y MÉTODOS

MATERIAL Y EQUIPO NECESARIO

En campo:

Toro semental adulto.

Electroeyaculador y sistema de sujeción de animal.

Cristalería (tubo de ensayo graduado, matraz Erlenmeyer)

Cubeta con agua.

Tijeras.

Toallas limpiadoras de papel absorbentes.

Cono de recolección de semen.

Cinta métrica.

Guantes para palpar.

Diluyentes previamente preparados.

Lubricante.

En laboratorio:

Microscopio de contraste de fases.

Filtro de luz (para el microscopio)

Baño maría.

Cristalería:

matraces Erlenmeyer, probeta graduada (50, 100 y 200 mL), cajas de petri, varas

mezcladoras de vidrio, pipetas, portaobjetos y cubreobjetos. Papel filtro

Huevos de gallina frescos

Agua bidestilada estéril

Jeringas desechables (10 y 20 mL)

Pinzas largas.

21




Cámara de refrigeración a 5°C con mesa y anaqueles de trabajo (esto puede ser un

refrigerador horizontal).

Dispositivos para llenado y sellado de pajillas.

Termo cryogénico con nitrógeno líquido.

Bastones de aluminio, goblets plásticos para termo y pajillas de 0.5ml.

Block de distribución y rack de congelación.

Termo de unicel (20 x 40 cm. de base).

Autoclave.

Cronómetro.

Cámara de Newbauer.

Pipeta de glóbulos blancos.

Microcapilares.

Platina eléctrica

Reglas para medir el nitrógeno.

Toallas de papel absorbentes.

LOCALIZACION.

El rancho donde se trabajaron los toros fue el “JF” ubicado en el municipio

Medellín de Bravo, zona central del estado de Veracruz; a una latitud norte de 19° 03' y una

longitud oeste de 96° 09', con un clima cálido-húmedo-extremoso con una temperatura

promedio de 25.3 °C; su precipitación pluvial media anual es de 1,417.8 mm. (Oficina de

Programa de Gobierno)

El laboratorio donde se llevó a cabo el procesamiento y evaluación de semen fue el

de Genética Bovina de México S.A. de C.V. ubicado en la calle Caoba # 34

Fraccionamiento Floresta. Veracruz, Ver.

22




ANIMALES A TRABAJAR

Se utilizaron toros de por lo menos 14 meses de edad con una circunferencia

escrotal de 31 cm. o mas, con una movilidad espermática en masa e individual de al menos

70%, un total de células morfológicamente normales de al menos 70% y con una

concentración espermática por lo menos de 350 millones de células por mililitro, la raza fue

indiferente pero cabe mencionar que fueron brahman, suizo europeo, simmental y simbra; a

los cuales se les recolectaron 18 eyaculados diferentes.

MANEJO Y ALIMENTACION DE LOS ANIMALES.

No fueron sometidos a cambios de alimentación especial durante todo el trabajo derecolección del semen, lo cual significa que llevaron el programa de alimentación que se

encontraba ya establecido en el rancho.

Fueron manejados de acuerdo al tipo de instalaciones de su rancho para no provocar

una situación de estrés que pudiera afectar los resultados de este estudio.

RECOLECCIÓN Y EVALUACIÓN DEL SEMEN

1.- Obtención del semen.

El semen se recolectó mediante la técnica de electroeyaculación. Este método es

muy conveniente ya que no requiere cooperación del animal (entrenamiento previo), ni

presencia de hembra en celo. Sin embargo debe ser manejado por alguien que conozca la

técnica y el uso de este, para no ser sometidos a un estrés excesivo con su utilización.

23




2.- Evaluación del semen.

La concentración se obtuvo por medio del hemotocitómetro: diluyendo las muestras

1:200 en solución tampón-formol salino (Carvalho, 2002), y llenando las dos

cámaras del hemocitómetro. Se contaron 5 cuadros grandes de cada cámara (80

cuadros pequeños), a aumento de 40X; el total de células contadas se multiplicó por

10 000 000 para obtener el número de células por ml de semen eyaculado

(Sorensen, 1984; Salisbury, 1982; Bearden, 1982).

La movilidad se determinó de manera subjetiva dándole un valor en porcentaje de 0

a 100%, observando al microscopio de contraste de fases a bajo aumento (10X y

40X), utilizando un porta y un cubreobjetos previamente calentados a 37 °C en la

platina eléctrica.

Esta se evaluó inmediatamente después de recolectado el semen y después

de descongelarlo, de uno a tres días después de congelado y de igual forma 15 a 20

más días después. El descongelamiento se hizo de la manera tradicional (en baño

de agua a 37°C por 25-30 segundos), se secó la pajuela cuidadosamente antes de

abrirla, asegurándose que el portaobjetos y termo platina estuvieran precalentados a

exactamente 37°C. Las lecturas se llevaron a cabo lo más pronto posible con el fin

de que no fueran engañosas. Posteriormente la movilidad se determinó a los 30, 60

y 90 minutos post-descongelado, teniendo siempre al semen en baño maría.

Para evaluar la morfología se usó el contraste de fases del microscopio y con ayuda

del filtro de luz, se observaron las anormalidades y se representan en porcentaje,

para esto se contaron 100 células y se determinó el porcentaje de anormalidades.

El volumen se observó directamente en el recipiente de colección.

24




PROCESAMIENTO

1.- Determinación del número de espermatozoides viables del eyaculado.

Espz viables = Vol. x concentración x % de movilidad x % de normalidad.

Ejemplo:

Espz viables= 5 ml x 1500 mill/ml x 0.85 x 0.90 =5737.5 millones de células en el

eyaculado.

2.- Determinación del número de dosis potenciales.

En general se requieren 10 millones de células viables en el momento de la

inseminación. Sin embargo bajo condiciones de campo se considera que más de un 50% de

las células pueden morir durante alguna fase del proceso de congelación-descongelación,

por lo que se debe de poner un mínimo de 20 millones de espermatozoides en cada dosis.

En base a eso, se determina el número de dosis que se pueden obtener dividiendo el número

total de espermatozoides viables entre el número de espermatozoides (espz) por dosis.

Siguiendo el ejemplo: 5737.5 = 286

20

3.- Determinar la cantidad de diluyente necesario.

El total de espermatozoides por dosis debe estar suspendido en un volumen final de

0.5 ml, por lo tanto, para las dosis del ejemplo es necesario tener un volumen total de 143

ml (286 x 0.5). si consideramos que el volumen inicial del semen era de 5 ml, entonces es

necesario 138 de diluyente (143 – 5).

Siguiendo el ejemplo:

286 x 0.5 = 143

143 – 5 = 138

25




4.- Preparación del diluyente.

TRILADYL

La composición final de este diluyente debe de contener una parte del concentrado

de Triladyl, tres partes de agua bidestilada y una unidad de yema de huevo.

Mezclar 100 ml de Triladyl en 300 ml de agua. Esta solución es estable y puede

guardarse en refrigeración a 5°C. Cuando se vaya a utilizar para la dilución, mezclar esta

solución madre con 100 ml de yema de huevos en una probeta graduada. En este paso se

debe de abrir los huevos y separar totalmente la clara pasando repetidamente la yema de uncascarón a otro o utilizar un separador de cocina de yema, teniendo cuidado de no romper

la membrana. Colocar la yema en un papel filtro estéril y hacerla rodar cuidadosamente

hasta despegar todos los restos de la clara; colocar el filtro con la yema en la boca de la

probeta y abrir con cuidado la membrana de manera que el liquido de la yema pueda gotear

directamente a la solución madre, con cuidado de que la membrana quede atrapada en el

papel filtro. Una vez completados los 100 ml necesarios, mezclar todo el diluyente con

ayuda de una vara estéril de vidrio. Evitar en lo posible la formación de espuma. De ser

posible filtrar el diluyente en una compresa de tela estéril (una capa de gasas puede ser

útil). Colocar el diluyente en el baño maría para permitir que se iguale a la temperatura del

semen.

ANDROMED

Se tiene que utilizar exactamente 200 ml del diluyente más 800 ml de agua a +35°C.

El agua tiene que ser de alta calidad, como mínimo bidestilada.

26




5.- Dilución del semen.

Se hace un pre-dilución del semen directamente en el recipiente recolección y se

transfiere a un matraz Erlenmeyer (2:1 dos partes de diluyente por una de semen), esto en el

rancho y recién colectado el semen.

Se completa el diluyente necesario utilizando una pipeta graduada para medir con

exactitud la cantidad agregada (es importante en todo momento considerar que se está

tratando con células vivas que son muy sensibles a los cambios bruscos de temperatura o

condiciones físicas como las agitaciones violentas.), esto ya estando en el laboratorio y así

permanecerán por el tiempo necesario para completar cada tratamiento.

6.- Preparación de la pajillas, goblets y bastones.

Mientras se completa el tiempo de equilibrio se pueden rotular las pajillas

necesarias con el nombre del semental, así como su registro y otros datos que se consideren

importantes. La rotulación puede hacerse de forma manual (utilizando un marcador de

punta fina de tinta permanente) o utilizando métodos mecánicos más eficientes. Se pueden

preparar también los goblets suficientes para la cantidad de pajillas a preparar (los hay de

diez y de cinco pajillas por goblet), y rotular los bastones de aluminio necesarios (uno por

cada dos goblets).

7.- Envasado del semen.

Una vez pasado el tiempo de equilibrio del semen (dependiendo del tratamiento y a

4°C) se procedió a envasar el semen diluido en las pajillas. El proceso de empaquetado de

las dosis va a realizarse a aproximadamente 5°C.

27




CONGELAMIENTO

TRILADYL

El proceso de congelamiento se hace enteramente en el cuarto frío. Se vierte

nitrógeno líquido en el termo de unicel de manera tal que el nivel superior quede a unos 4

centímetros por debajo del nivel superior del rack de congelación (puede hacerse una marca

antes de verter el nitrógeno al termo). Esto es con el fin de que las pajillas no toquen

directamente el nitrógeno sino que sean congeladas con sus vapores.

Se coloca la gradilla de distribución y el rack en posición (rack sobre la gradilla) y

se distribuyen uniformemente las pajillas. Llevarlo al termo de unicel con nitrógeno.Taparlo y permitir un mínimo de 15 a 20 minutos para que los vapores del nitrógeno

congelen las pajillas. Dejar caer las pajillas al nitrógeno del termo o colocarlas con los

goblets y permitir que naden libremente en el nitrógeno. Tomar el rack y repetir el proceso

hasta completar el total de las pajillas.

Una vez congeladas todas las pajillas colocar los goblets en los bastones y se

transfieren al termo cryogénico donde permanecerán hasta su uso.

ANDROMED

Se tienen que mantener las pajillas llenadas a 5°C. Luego la congelación se hace

horizontalmente a 4 cm. sobre nitró líquido igual que con el Triladyl con la diferencia de

que con éste solo permanecerán de 7 a 10 minutos en el vapor antes de ser trasferidas a

nitrógeno líquido.

28




Descripción de tratamientos:

Tratamiento #1:

Triladyl en equilibrio de 2 a 3 horas.

Tratamiento #2:

Andromed en equilibrio de 2 a 3 horas.

Tratamiento #3:


Tratamiento #4:Andromed en equilibrio de 4 a 5 horas.

Tratamiento #5:


Tratamiento #6:

Andromed en equilibrio de 8 a 9 horas.

Cabe mencionar que el tiempo que las pajillas ya llenadas van a estar en el vapor de

nitrógeno fue el recomendado por el laboratorio fabricante de los concentrados y que todos

los demás pasos realizados desde la colecta del semen hasta el congelamiento del mismo

fueron los mismos en todos los casos, también que a cada eyaculado se le hizo cada uno de

los tratamientos antes mencionados, o sea que cada eyaculado se congeló de seis maneras

diferentes.

29




Análisis estadístico:

Analítico (puesto que se busca la asociación entre la variable dependiente y las

independientes), Transversal (ya que hay seguimiento en el tiempo), Experimental (dado

que se manipularon las variables independientes), y Aplicado (ya que se tiene interés en su

aplicación y esta orientado a un objetivo practico determinado).

Técnica estadística de análisis: diseño experimental factorial de dos factores (2x3).

Factor – 1.- Diluyente

Nivel 1.- Triladyl

Nivel 2.- Andromed

Factor – 2.- Tiempo de equilibrio Nivel 1.- de 2 a 3 horas

Nivel 2.- de 4 a 5 horas

Nivel 3.- de 8 a 9 horas

Modelo lineal de análisis factorial:

yijk = µ + αi + β j + ( αβ )ij + eijk

Donde:

yijk = Observación de la variable de respuesta “porcentaje de movilidad”

µ = La gran media

αi = Efecto del i-ésimo nivel del diluyente

β j = Efecto del j-ésimo nivel del tiempo de equilibrio

( αβ )ij = Efecto de interacción del i-ésimo nivel del diluyente y del j-ésimo nivel del tiempo

de equilibrio.

eijk = Error experimental aleatorio con media cero y varianza σ2.

30




Variables:

Variable dependiente:

Descripción: Porcentaje de movilidad del semen.

Tipo: Cuantitativo.

Escala de medición: De razón.

Variables independientes:

Descripción: Diluyente en el proceso de congelación de semen.

Niveles: Triladyl y Andromed.

Tipo: Cualitativa.

Escala de medición: Nominal

Descripción: tiempo de equilibrio.

Niveles: (2 a 3; 4 a 5 y de 8 a 9 horas)Tipo: Cualitativa

Escala de medición: Ordinal.

Resultados:

Los datos fueron analizados tomando en cuenta el día de que se evaluó la movilidad

del semen descongelado, habiendo aquí dos diferentes ocasiones, de uno a tres días después

de congelado y 15 a 20 días después de congelado; los minutos de descongelado en que se

observó la movilidad (0, 30, 60 y 90); el tiempo de equilibrio que se dejó el semen antes de

congelarse (de 2 a 3h, de 4 a 5h y de 8 a 9h) y el tipo de diluyente usado (Triladyl y

Andromed).

De todos los análisis de los datos y sus interacciones se determinó que hay un

diferencia significativa (p<0.05) de el tiempo de equilibrio con cada uno de los diluyentes

siendo el mejor tiempo de equilibrio el de 8 a 9 horas en los dos diluyentes como se puede

apreciar en la gráfica 1, en donde se expresan las medias de cada tiempo de equilibrio.

31




18.17

29.11

34.49

0

5

10

15

20

25

30

35

40

% de movilidad

pos-

descongelado

2 a 3 hrs 4 a 5 hrs 8 a 9 hrs

Tiempo de equilibrio

Gráfica 1: Efecto del tiempo de equilibrio sobre la movilidad

pos-descongelado. (P<0.05)

También se encontró que el factor diluyente tuvo diferencia significativa (P<0.05),

dando mejores resultados el triladyl, esto se debe en gran parte a que de los 18 eyaculados

estudiados, solo 15 resistieron el proceso de congelado y descongelado con ambos

diluyentes, los tres restantes solo lo hicieron con triladyl y por el contrario no se observo

ninguno que resistiera el mismo proceso solo con andromed, por estas razones la grafica 2,

donde se aprecia el factor diluyente por si solo, queda de la siguiente forma.

30.86

23.65

0

10

20

30

40

% de

movilidad pos-

descongelado

Triladyl Andromed

Diluyentes

Gráfica 2: Efecto del diluyente sobre la movilidad pors-

descongelado. (P<0.05)

32




Ahora bien aquí puede entrar la interrogante de cómo se comporta la movilidad pos-

descongelado si nada mas se analizan los eyaculados que si resistieron el proceso de

congelado y des-congelado tanto con Andromed y Triladyl, pero al igual que al analizarlo

con los 18 eyaculados totales en los 15 con esas condiciones, con el Triladyl la movilidad

sigue siendo mejor que con el Andromed y con este último si aumenta algo como es de

suponerse con respeto a la gráfica 2, pero no considerablemente, como se puede apreciar en

la gráfica 3.

30.97

28.04

0

5

10

15

20

25

30

35

% de movilidad

pos-

descongelado

Triladyl Andromed

Diluyentes

Gráfico 3: Efecto del diluyente sobre la movilidad pos-

descongelado tomando en cuenta los 15 eyaculados que

respondieron con ambos diluyentes

Al analizar la interacción entre el diluyente y el tiempo de equilibrio también se

puede determinar como el mejor tratamiento de los utilizados fue el que constituye al

Triladyl a un tiempo de equilibrio de entre 8 a 9 horas, como se podrá apreciar en la gráfica

4, como era de esperarse al ver todo lo antes mencionado.

33




20.0316.31

31.9

26.31

40.65

28.33

05

10

15

20

25

3035

40

45

% de movilidad

pos-

descongelado

2 a 3 4 a 5 8 a 9

Tiempo de equilibrio

Gráfica 4:Efecto de la interacción diluyente y tiempo de equilibrio

sobre la movilidad pos.descongelado

Triladyl

Andromed

Otro factor que tuvo diferencia significativa (p<0.05), fue el porcentaje de

movilidad relacionado únicamente con los minutos en que se observó el semen después de

descongelado, esto debido a que los espermatozoides van muriendo poco a poco después de

descongelarse. Al hacer una inseminación, se pretende que después de un tiempo

considerable posterior al descongelamiento queden espermatozoides vivos y que estos sean

un cantidad adecuada la cual permita la eventual fecundación de un gameto femenino.

Grafica 5: Efecto del tiempo pos-descongelado sobre la

movilidad (P<0.05)

32.9329.16

25.3721.57

0

10

20

30

40

0 30 60 90

Minutos pos-descongelado

% d

e m o v i l i d a d p o s -

d e s c o n g e l a d o

34




Otro factor que evaluamos fue el día en que se descongelaron muestras. Como ya se

había mencionado antes, esto fue de 1 a 3 días después de congelado y de la misma forma,

15 a 20 días después de congelado, y se nota como en este factor no hay diferencia

significativa (p>0.05). En la gráfica 6 apreciamos como se comporta casi igual el semen

después de estar un día congelado que quince.

27.47

27.04

26.5

27

27.5

% de movilidad

pos-descongelado

1 a 3 días 15 a 20 días

Días que permanesio congelado el semen

Gráfica 6: Efecto de los días que permanesió congelado el semen

sobre la movilidad pos-descongelado. (P=0.6807)

Viendo todas las gráficas hasta aquí descritas se pueden ahora apreciar mejor las

interacciones de todos los factores combinados, y para una mejor visualización se presentan

cuatro gráficas diferentes donde seguimos denotando lo mismo que en las anteriores; que la

movilidad cae conforme pasan los minutos pos-descongelado, que el semen congelado con

Triladyl presenta una movilidad mejor que con el Andromed, que al descongelar las dosis

un día o quince después de congelado la movilidad es muy similar y que el tiempo de

equilibrio mejor para ambos diluyentes en de 8 a 9 h.

35




Gráfica 8: Semen congelado con

Triladyl y descongelado 15 a 20

después.

2521.38

16.66

12.5

36.1133.61

28.33

23.88

45.8343.88

39.72

35.27

0

5

10

15

20

25

30

35

40

4550

0 30 60 90


% M

o v i l i d a d


Triladyl y descongelado de 1 a 3

días despues.

26.3823.61

18.8815.83

39.72

35.55

31.1126.94

45.83

41.3838.88

34.44

0

5

10

15

20

25

30

35

40

4550

0 30 60 90


% d

e m o v i l i d a d

Eq. 2 a 3 hr s Eq. 4 a 5 hr s

Eq. 8 a 9 hr s

Gráfica 10: Semen congelado

con Andromed y descongelado

15 a 20 después.

21.66

17.22

14.16

10.83

31.3828.61

24.44

20.83

36.11

30.55

27.5

23.61

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 30 60 90


% M

o v i l i d a d


Andromed y descongelado de 1 a3 días despues.

22.5

16.9415.27

11.94

31.38

27.525

21.38

33.33

29.72

24.44

21.38

0

5

10

15

20

25

30

35

0 30 60 90


% d

e m o v i l i d a d

Eq. 2 a 3 hr s Eq. 4 a 5 hr s

Eq. 8 a 9 hr s

36




Discusión:

Con todo lo hasta aquí visto con respecto a los resultados y análisis anteriores

podemos ver como el Andromed también puede ser un diluyente considerado para el

congelamiento de semen bovino en zonas tropicales como lo es Veracruz, al igual que el

Triladyl ya antes estudiado y validado como efectivo (Villa, 1996), pero con la salvedad

que se encontró una mejor movilidad pos-descongelado con el Triladyl, por lo menos bajo

las condiciones de este estudio. Nuestros resultados no concuerdan con los reportados por

el Centro de Dermatología y Andrología de la Universidad Justun-Leigib (Alemania)

donde hay otro tipo de clima y bajo otras condiciones; muy difícilmente utilizadas bajo el

abajo cotidiano de campo que se tiene en esta zona, en el cual se evaluaron los mismos

diluyen

e de yema de huevo se tiene

na tasa de no retorno al estro mayor en vacas inseminadas que con eyaculados diluidos

tiempo de equilibrio de al menos 2 h. En

determinó que este es un tiempo insuficiente y que es mejor esperar al

menos

tr

tes utilizados en nuestro estudio (Aires, 2003).

Por otro lado, hay estudios realizados con otros diluyentes a base de soya

(Biociphos-Plus) los cuales denotan resultados similares al del presente estudio, en donde

se ve que con los eyaculados preparados con diluyentes a bas

u

con concentrados a base de soya (Thun, 2002; Harina, 2000).

Otro aspecto que cabe recalcar es, que el tiempo de equilibrio evaluado más

adecuado para ambos diluyentes fue el de 8 a 9 h, aspecto visto también en la investigación

realizada por Villa (1996), y que se contrapone a las indicaciones dadas por el fabricante

con respecto al Andromed que recomienda un

este estudio se

de 6 a 9 h para su mejor equilibración.

Por otro lado los eyaculados diluidos y congelados con Andromed tienen una mejor

visibilidad en el microscopio y con otros puntos como su fácil preparación, el no poseer

ingredientes de origen animal los cuales pueden representar un riesgo de contaminación

bacteriana, el no necesitar de materiales como el papel filtro (que debe de estar previamente

esterilizado representando un gasto mas de tiempo, energía eléctrica en el autoclave y agua

37




bidestilada para el autoclave) y huevos de gallina, que al final de cuenta vienen siendo un

gasto económico mas, representan ventajas de éste diluyente sobre el Triladyl, siempre y

cuando, el eyaculado resista el proceso de congelado y des-congelado adecuadamente con

Andromed, como lo menciona su fabricante (Minitube, 2003). Estos “ahorros” económicos

se pueden contrarrestar con el precio mismo del concentrado comercial, ya que el

mperatura de entre 36 y 38°C, este procedimiento

ormalmente se hace en centros de congelamiento con prestigio mundial como lo es el

de su congelamiento, teniendo

sultados muy similares que si se le deja congelado 15 días o mas, ya que su movilidad

osdecongaldo se comporta muy similar en los dos casos.

Andromed tiene un precio más elevado que el Triladyl.

También cabe mencionar que bajo condiciones normales de trabajo se debe de

evaluar la movilidad al momento de descongelarse una dosis y un tiempo considerado

después de al menos una hora y media para determinar si esta sigue siendo satisfactoria, ya

que hay eyaculados que al descongelarse se les ve una movilidad considerada como buena

y poco tiempo después todo los espermatozoides pueden estar muertos o muy pocos conmovilidad progresiva, factor no deseado y por la cual se debe de considerar si dar como

aptas dosis de semen o no dependiendo de este monitoreo, para todo esto es necesario dejar

la dosis de semen en baño maría a una te

n

ubicado en Francia, IMV, y otros mas.

Otro aspecto importante de mencionar y que se denota en este estudio es que el

semen congelado se puede utilizar desde un día después

re

p

38




Conclusiones:

1.

El semen diluido y congelado con Triladyl posee en promedio una movilidad pos-

descongelado mejor que el diluido y congelado con Andromed.

2.

El mejor tiempo de equilibrio evaluado en nuestro estudio para ambos diluyentes es

el de 8 a 9 horas.

3. La mejor movilidad pos-descongelado en este trabajo fue obtenida cuando usamos

Triladyl con un tiempo de equilibrio de 8 a 9 horas.

4. El Andromed puede considerarse como un diluyente apto para congelar semen

bovino, pero requiere de mas estudios que puedan estandarizar su forma de uso a

nivel de campo en el trópico

5.

Aunque el Andromed es más fácil de preparar, y tiene ciertas ventajas sobre elTriladyl en nuestro estudio este último diluyente produjo los mejores resultados.

39




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