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COMPARACIÓN DE DOS DILUYENTES (LACTOSA-GLICEROL-YEMA DE HUEVO; INRA-DFORMAMIDA-YEMA DE HUEVO) EN LA PRESERVACIÓN DE SEMEN EQUINO. STEFANIA PINEDA GONZÁLEZ SILVIA MARÍA PINILLA ARENAS UNIVERSIDAD DE LA SALLE FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA BOGOTÁ D.C 2007
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COMPARACIÓN DE DOS DILUYENTES (LACTOSA-GLICEROL-YEMA DE HUEVO;
INRA-DFORMAMIDA-YEMA DE HUEVO) EN LA PRESERVACIÓN DE SEMEN
EQUINO.
STEFANIA PINEDA GONZÁLEZ
SILVIA MARÍA PINILLA ARENAS
UNIVERSIDAD DE LA SALLE
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA
BOGOTÁ D.C
2007
COMPARACIÓN DE DOS DILUYENTES (LACTOSA-GLICEROL-YEMA DE HUEVO;
INRA-DFORMAMIDA-YEMA DE HUEVO) EN LA PRESERVACIÓN DE SEMEN
EQUINO.
STEFANIA PINEDA GONZÁLEZ
Código14022080
SILVIA MARÍA PINILLA ARENAS
Código 14021028
Trabajo para optar al título de
MÈDICO VETERINARIO.
DIRECTORES
Dr. César Augusto Díaz Rojas
Docente del área de Reproducción Animal, Universidad de la Salle
Dr. David O. Pineda S.
Docente del área de Reproducción Animal, Universidad UDCA.
UNIVERSIDAD DE LA SALLE
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA
BOGOTÁ D.C
2007
DIRECTIVOS
Rector Hermano Fabio Gallego Arias Vicerrector de promoción Y desarrollo humano Hermano Edgar Figueroa Abrajim Vicerrector Administrativo Dr. Mauricio Fernández Fernández Decano de la facultad Dr. Pedro Pablo Martínez Méndez Secretario Académico Dra. María Teresa Uribe Mallarino.
i
AGRADECIMIENTOS.
Al Programa de Medicina Veterinaria de la Universidad de la Salle. A la Policía Nacional de Colombia en especial al Mayor Bulla, Capitán Bonilla,
Teniente Vega, Teniente Rojas, Teniente Carolina y a todo el personal del
criadero Mancilla, por facilitarnos las posibilidades para realizar esta investigación.
Al Doctor David Pineda, por toda su colaboración, atención, dedicación paciencia y
conocimientos brindados, los cuales nos orientaron e hicieron posible el desarrollo
de este trabajo.
Al Doctor César Díaz, que con su paciencia, colaboración y ayuda nos oriento
para sacar adelante este proyecto.
Y a todas aquellas personas que de una u otra forma nos ayudaron y nos
apoyaron durante la realización de este trabajo.
ii
COMPROMISO “Todo lo escrito y expuesto en este trabajo se encuentra bajo parámetros de
responsabilidad y honestidad, y los contenidos que aquí se manejan son de
carácter estrictamente educativo y científico; por tanto tampoco incluye ideas que
sean contrarias a la doctrina de la iglesia católica en asuntos de dogma y moral”.
iii
RESUMEN
El presente trabajo se llevó a cabo en la ciudad de Facatativá Cundinamarca en el
criadero Mancilla que pertenece a la Policía Nacional de Colombia, donde
contamos con 12 ejemplares de diferentes razas de tiro pesado; con los que
realizamos el estudio de la comparación entre el diluyente lactosa-EDTA-yema de
huevo, como control y el nuevo diluyente propuesto INRA-D-Formamida-Yema de
huevo. Para tal investigación, se tomaron muestras de semen de cada uno de los
doce caballos y se analizó por examen macroscópico y microscópico cada
eyaculado, posteriormente realizamos el proceso de congelación del semen con
cada uno de los diluyentes, después se realizó el proceso de descongelación;
enfatizando en los porcentajes de motilidad, supervivencia, y viabilidad del semen
post-descongelación, de esta forma obtenemos los resultados de cada semental
expresados en porcentaje, luego se procede a promediar y estandarizar los
resultados mediante el método estadístico ANAVA. De esta manera se puede
determinar que el diluyente INRA-Dimetil-formamida-yema de huevo, obtuvo
mejores resultados en porcentajes de motilidad, cantidad de espermatozoides
vivos y presencia de espermatozoides anormales. Sin embargo en cada una de
las morfoanomalías, tanto mayores como menores, no hubo diferencia entre los
dos diluyentes. Por otra parte no se presentó ninguna diferencia entre las
muestras envasadas en pajillas de 0.5 y las envasadas en pajillas de 0.25. Por lo
anterior, este trabajo permite establecer, cual de los dos criopreservantes protege
mejor las células de los efectos adversos del proceso de congelación y por lo tanto
cual aumenta los porcentajes de fertilidad; además según los resultados obtenidos
se puede establecer que tipo de envase es el más conveniente con respecto a la
congelación del semen.
iv
ABSTRACT
The present work was developed in Facatativa - Cundinamarca at the Mancilla
Breeding Place, owned by the Colombian National Police, where we used 12
heavy work different breed horses; with them, we developed the comparison study
between the lactose-EDTA-egg yolk, as a control and the new proposed diluents
INRA-D-Formamida-egg yolk. For such investigation, semen samples where taken
from each one of the 12 horses and it was analyzed by macroscopic and
microscopic examination of each ejaculation, then, we developed the semen
freezing process with each one of the diluents, after, the de-freezing process was
developed; taking into account the motility percentages, survival, and post de-
freezing semen viability. In this manner we obtain the results of each expressed in
percentage. Then, the results are averaged and standardized using the ANOVA
statistics method.
In this manner, It can be determined that the INRA-D-Formamida-egg yolk
obtained better results in motility percentage, live spermatozoids and abnormal
spermatozoids. Nevertheless, on each one of the major and minor abnormalities,
there was no difference between the diluents. By other way, there was no
difference between the samples with different size of packing, 0.5 and 0.25.
Because of the above, this work makes possible to establish, which one of the two
cryo-preservants is better to protect the cells from the adverse effects of the
freezing process and increase the fertility percentages; In addition, in accordance
with the obtained results, the most convenient type of packing can be established
for the semen freezing process.
v
TABLA DE CONTENIDO Pag.
INTRODUCCIÒN 1 1. MARCO TEÒRICO 3 1.1 CARACTERÍSTICAS DEL SEMEN EN CABALLOS 3 1.1.1 Metabolismo del Espermatozoide 4 1.2 SISTEMA DE RECOLECCIÓN DEL SEMEN 6 1.3 EVALUACIÓN DE LA CALIDAD DEL SEMEN 8 1.3.1 Examen Microscópico 9 1.3.2 Examen Microscópico 11 1.4 CHOQUE TÉRMICO 14 1.5 CENTRIFUGACIÓN 16 1.6 DILUYENTES DEL SEMEN 18 1.7 SISTEMA DE CONSERVACIÒN DE SEMEN EQUINO 19 1.7.1 Refrigeración del Semen 19
1.7.2. Criobiología espermática 24
1.7.2.1. Utilización de Crioprotectores Alternativos 28
1.7.2.2. Adición del diluyente de congelación 32
1.7.2.3 Congelación y almacenamiento 34
1.7.2.4. Descongelación del semen 35
1.8. FERTILIDAD DEL SEMEN CONGELADO 36 2. MATERIALES Y MÉTODOS 38 2.1 MARCO GEOGRÁFICO 38 2.2 MARCO DEMOGRÁFICO 38 2.3 COLECTA DEL SEMEN 39 2.4 EVALUACIÓN DEL SEMEN 40 2.4.1. Evaluación Macroscópica 40 2.4.2 Evaluación Microscópica 41 2.5 CENTRIFUGACIÓN 43
vi
2.6 ADICIÓN DE DILUYENTES DE CONGELACIÓN 43 2.7. CONGELACIÓN 45 3. ANÁLISIS ESTADÍSTICO 46 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 47 4.1 CARACTERÍSTICAS DEL SEMEN PRE Y POST CONGELACIÓN CON LOS DILUYENTES LACTOSA - GLICEROL- YEMA DE HUEVO E INRA- DIMETIL-FORMAMIDA YEMA DE HUEVO . 47 4.2. PORCENTAJE DE ANORMALIDADES EN LOS ESPERMATOZOIDES DE SEMEN EQUINO, PRECONGELACIÒN Y POSTCONGELACIÒN. 57 4.3. CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LA EVALUACIÓN DE SEMEN DE EQUINO ENVASADO EN PAJILLAS DE 0.5 Y 0.25. 66 4.4. CANTIDAD DE ANORMALIDADES PRESENTES EN EYACULADOS DE SEMEN EQUINO ENVASADOS EN PAJILLAS DE 0.5 Y 0.25. 72 CONCLUSIONES 79 RECOMENDACIONES 82 BIBLIOGRAFÌA 84 ANEXOS 90
vii
LISTA DE TABLAS Pag.
Tabla 1. Medidas de valores seminales equinos, según varios autores 9 Tabla 2. Diluyentes utilizados para centrifugación de semen 17 Tabla 3. Diluyentes a base de leche descremada 17 Tabla 4. Diluyente Glucosa –EDTA 18 Tabla 5. Diluyentes empleados comúnmente para la refrigeración del semen. 21 Tabla 6. Morfología Espermática (Eosina Nigrosina) 43 Tabla 7. Porcentaje de Motilidad de semen equino pre y post-congelación. 48 Tabla 8. Espermatozoides vivos en semen equino pre y post-congelación. 50 Tabla 9. Espermatozoides muertos de semen equino pre y post-congelación. 53 Tabla 10. Espermatozoides normales de semen equino pre y post-congelación. 54 Tabla 11. Espermatozoides anormales de semen equino pre y post-congelación. 56 Tabla 12. Anormalidades de cabeza de espermatozoides en semen equino pre y post congelación. 58 Tabla 13. Gota citoplasmática proximal de espermatozoides en semen equino pre y post congelación. 59 Tabla 14. Anormalidades de pieza intermedia de espermatozoides en semen equino pre y post congelación. 61 Tabla 15. Cabezas sueltas de espermatozoides en semen equino Pre y post congelación. 62 Tabla16. Gota citoplasmática distal de espermatozoides en semen de equino pre y post congelación. 64 Tabla 17. Anormalidades de flagelo de espermatozoides en semen equino pre y post congelación. 65 Tabla 18. Resultados de la evaluación de la motilidad de semen equino envasado en pajillas de 0.5 y 0.25. 66 Tabla 19. Evaluación de espermatozoides vivos de semen equino envasado en pajillas de 0.5 y 0.25. 67 Tabla 20. Espermatozoides muertos de semen equino envasado en pajilla de 0.5 y 0.25. 68 Tabla 21. Evaluación de espermatozoides normales de semen e quino envasado en pajillas de 0.5 y 0.25. 69 Tabla 22. Evaluación de espermatozoides de semen equino envasado en pajillas de 0.5 y 0.25. 70 Tabla 23. Anormalidades de cabeza de espermatozoides de semen equino envasado en pajillas de 0.5 y 0.25. 72
viii
Tabla 24. Gota citoplasmática proximal de espermatozoides de semen equino envasado en pajillas de 0.5 y 0.25. 73 Tabla 25. Anormalidades de pieza intermedia de espermatozoides en semen equino envasado en pajillas de 0.5 y 0.25. 74 Tabla 26. Cabezas sueltas de espermatozoides en semen equino envasado en pajillas de 0.5 y 0.25. 75 Tabla 27. Gota citoplasmática distal de espermatozoides en semen equino envasado en pajilla de 0.5 y 0.25. 76 Tabla 28. Anormalidades de flagelo de espermatozoides en semen equino envasado en pajillas de 0.5 y 0.25. 77
ix
LISTA DE GRÀFICAS Pag.
Gráfica 1. Porcentaje de Motilidad Espermática de semen equino pre y post-congelación. 48 Gráfica 2. Espermatozoides vivos de semen equino pre y post-congelación. 52 Gráfica 3. Espermatozoides muertos de semen equino pre y post-congelación. 53 Gráfica 4. Espermatozoides normales de semen equino pre y post-congelación. 55 Gráfica 5. Espermatozoides Anormales de semen equino pre y post-congelación. 56 Gráfica 6. Anormalidades de cabeza de espermatozoides en semen equino pre y post- congelación. 58 Gráfica 7. Gota citoplasmática proximal de espermatozoides en semen equino pre y post congelación. 59 Gráfica 8. Anormalidades de pieza intermedia de espermatozoides en semen equino pre y post-congelación. 61 Gráfica 9. Cabezas sueltas de espermatozoides en semen equino pre y post-congelación. 62 Gráfica 10. Gota Citoplasmática Distal de espermatozoides en semen equino pre y post congelación. 64 Gráfica 11. Anormalidades de Flagelo de espermatozoides en semen equino pre y post congelación. 65 Gráfica 12. Motilidad Progresiva de semen equino envasado en pajillas de 0.5 y 0.25. 67 Gráfica 13. Espermatozoides vivos de semen equino envasados en pajillas de 0.5 y 0.25. 68 Gráfica 14. Espermatozoides muertos en semen equino envasado en pajilla de 0.5 y 0.25. 69 Gráfica 15. Espermatozoides Normales en semen de equino envasado en pajillas de 0.5 y 0.25. 70 Gráfica 16. Espermatozoides Anormales de semen equino envasado en pajillas de 0.5 y 0.25. 71 Gráfica 17. Anormalidades de cabeza de espermatozoides de semen equino envasado en pajillas de 0.5 y 0.25. 73 Gráfica 18. Gota citoplasmática proximal de espermatozoides en semen equino envasado en pajillas de 0.5 y 0.25. 74 Gráfica. 19 Anormalidades de pieza intermedia de espermatozoides en semen equino envasado en pajillas de 0.5 y 0.25. 75 Gráfica 20. Cabezas sueltas de espermatozoides en semen equino envasado en pajillas de 0.5 y 0.25 . 76
x
Gráfica 21. Gota citoplasmática distal de espermatozoides en semen equino envasado en pajillas de 0.5 y 0.25. 77 Gráfica 22. Anormalidades de flagelo de espermatozoides en semen equino envasado en pajillas de 0.5 y 0.25. 78
xi
LISTA DE ANEXOS
Pag. Anexo 1. Preparación de la solución de Formol Citrato 90 Anexo 2. Preparación del diluyente Glucosa-EDTA 90 Anexo 3. Lactosa-Glicerol-Yema de huevo 91 Anexo 4. INRA –Dimetil- formamida-Yema de huevo 91 Anexo 5. Curva de congelación de semen 92 Anexo 6.Estadística Descriptiva por Tratamiento 93 Anexo 7. Estadística Descriptiva por Pajilla 95 Anexo 8. Estadística Descriptiva por Tratamiento – Pajilla 96 Anexo 9. Anava para Tratamiento 99 Anexo 10. Anava para Tratamiento y Pajilla 107
xii
INTRODUCCIÓN
Como es notorio el crecimiento en los últimos años del interés por el uso de
semen congelado en la industria equina, algunas razas importantes como el
Cuarto de Milla y el Árabe, recientemente se incluyeron dentro del rol de las que
permiten el uso de esta técnica. Hoy el 80% de todas las asociaciones de
criaderos de caballos instaladas en los Estados Unidos de América y en muchos
otros países, permiten la comercialización y el uso de semen criopreservado, lo
que conduce a realizar estudios para evolucionar y hacer más efectivo el proceso
de congelación y también obtener mejores porcentajes de supervivencia después
de la descongelación. Estos estudios sobre técnicas adecuadas para preservación
y almacenamiento del semen son de gran importancia en reproducción animal ya
que posibilitan maximizar, el aprovechamiento de animales de alto potencial
genético también como permiten la preservación por tiempo indeterminado de
patrimonios genéticos de animales que puedan fallecer. 1 Existe sí la limitante en
la criopreservación del semen, conocida como el factor diluyente o extender; en la
actualidad existen varios protocolos de congelación que requieren estudios
comparativos, que nos permiten identificar el diluyente más eficiente. La
inseminación artificial equina proviene de tiempos atrás con los árabes en el siglo
IVX; a principios del siglo XX empezó a ser empleada para la producción de
caballos en masa y de esta forma nace el primer programa de inseminación
artificial equina en Rusia. Afortunadamente en la década de los años 80 la
inseminación artificial con semen congelado entró en auge y salió de la fase de
estancamiento en que se encontraba. Trabajos coinciden en que el principal factor
de variación que determina la congelación es propio del individuo, sin embargo el
mayor y mas preocupante inconveniente es el choque térmico al cual están
1 Pineda. D. S., Biotecnología de la Reproducción en Animales Domésticos., Universidad de Nariño, Programa de Medicina Veterinaria. Pasto- Nariño. 2002. p. 88-92.
1
expuestos los espermatozoides durante el proceso de congelación y
descongelación, reduciendo así en gran medida la capacidad de fertilización y la
calidad. Es por esta razón que varios autores y especialistas en el área de
reproducción equina coinciden en la necesidad de utilizar un diluyente y un
criopreservante que aporte lipoproteínas y energía que protejan al espermatozoide
del choque térmico; sin embargo es el crioprotector el que durante el proceso de
congelación lleva la mayor responsabilidad, siendo el glicerol un crioprotector
penetrante clásico que aún con los avances actuales presenta inconvenientes con
el semen equino, motivo por el cual las amidas y especialmente la Dimetil-
Formamida se propone como una solución teniendo en cuenta sus características
crioprotectoras y su poder de penetración celular. 2 Por otra parte, el uso de
crioprotectores ha causado polémica en la comunidad científica, pues, aunque se
requieren como constituyentes de los diluyentes para proteger las células
espermáticas contra los efectos adversos de la congelación, Amman en 1995
reporta que no se ha logrado encontrar la sustancia más apropiada, así como
tampoco la cantidad adecuada para tal fin. Las características fisicoquímicas de
los crioprotectores no son suficientes para proveer las condiciones adecuadas ni la
protección celular durante el proceso de congelación, en efecto se ha demostrado
que el primer factor limitante es la toxicidad que este genera, produciendo lesiones
tanto de tipo osmótico como bioquímico. De acuerdo a lo anterior, el presente
estudio pretende comparar el efecto de los diluyentes LACTOSA-GLICEROL-
YEMA DE HUEVO e INRA-DFORMAMIDA-YEMA DE HUEVO como
criopreservantes de semen equino por medio de la evaluación de la motilidad y
morfología espermática en muestras pre y postdescongelación y con dos tipos de
pajillas 0.25 y 0.5 ml. Y así generar un protocolo de congelación novedoso para
semen de equinos; con el cual se logre mejorar las tasas de fertilidad que se
obtienen actualmente con otros diluyentes.
2 Braun, W. . Determining fertility in stallions.Veterinary Medicine (1989).p.192-199
2
1. MARCO TEÓRICO 1.1 CARACTERÍSTICAS DEL SEMEN EN CABALLOS El semen es el producto eliminado a través de la uretra durante la eyaculación;
está formado por una fracción celular, compuesta por los espermatozoides, y una
porción líquida (plasma seminal) que actúa como vehículo de los espermatozoides
y está producida por las glándulas sexuales accesorias y una pequeña porción de
fluidos procedentes del testículo, epidídimo y conducto deferente.3
El espermatozoide del caballo, como el del resto de los mamíferos, está formado
por varias porciones: cabeza, cuello, tracto intermedio y flagelo, cada una de las
cuales cumple una función definida durante el proceso de fertilización. Todo el
espermatozoide está rodeado de una membrana plasmática que a pesar de ser
continua, presenta diferencias regionales en composición y función. La membrana
plasmática esta formada por una doble capa de lípidos, una interfase de
fosfolípidos y agua y un glicocáliz. Los principales lípidos encontrados en la
membrana son fosfolípidos y colesterol. Cuanto mayor es la cantidad de
fosfolípidos, mas fluida es la membrana. El 50% del peso de la membrana esta
compuesto de otras proteínas, dichas proteínas estructurales pueden actuar como
canales o poros para permitir el pasaje de pequeñas moléculas. Bajo ciertas
circunstancias como el enfriamiento o la congelación, ocurre una transición de
fase en la cual una porción líquida de la membrana plasmática se transforma en
gel, pudiendo causar alteraciones estructurales irreversibles o disturbios
metabólicos y muerte celular.
3 Kenney, R.M.; Hurtgen, J; Pierson, R; Witherspoon, D.; Simons,J. Clinical fertility evaluation of the stallion society for theriogenology Manual.1983.
3
En espermatozoides equinos la temperatura en que este cambio de fase ocurre de
forma más intensa es 20.7 ºC más baja de la que genera el mismo fenómeno en
las especies porcina y bovina, esto puede reflejar una variación en la tolerancia a
caídas bruscas en la temperatura.
1.1.1. Metabolismo del espermatozoide
Morel en 1999 afirma que la principal fuente de energía disponible para los
espermatozoides eyaculados son los carbohidratos de sustrato extracelular. Y que
los espermatozoides equinos metabolizan rápidamente los monosacáridos como
la glucosa, pero tienen capacidad muy limitada para utilizar otros azucares o
carbohidratos más complejos. La glucosa se liga a proteínas de transporte para
atravesar la membrana plasmática.
La necesidad energética es suplida en 90% por los sustratos exógenos y el
restante 10% por fuentes intracelulares como los fosfolípidos. No hay
almacenamiento de glucosa en células espermáticas. La producción endógena de
ATP es relativamente constante. A partir de los sustratos exógenos, ella depende
del medio y la temperatura. Amann en 1964 sostiene que los espermatozoides
equinos dependen principalmente del metabolismo aeróbico para la producción de
ATP. Álvarez y Storey en 1984 dicen que este metabolismo produce cantidades
significativas de peroxido de hidrógeno en las mitocondrias, que tiene un efecto
adverso sobre las membranas por causar la peroxidación de los lípidos,
comprometiendo la integridad estructural, la motilidad, y la viabilidad espermática.4
4 Palma, A. Gustavo, Biotecnología de la Reproducción, Balcarce, Argentina, 2001. p. 528
4
Sustancias antioxidantes presentes en el plasma seminal reducen este efecto,
después de consumido el oxígeno difundido en el plasma seminal o del diluyente,
los espermatozoides pasan a depender del metabolismo anaeróbico que tiene
como producto final el ácido láctico. 5
Mann en 1964 propone que el aumento de la concentración de ácido láctico en el
medio extracelular conduce a una disminución de pH, la cual conduce a una
disminución del metabolismo con reducción de la producción de ATP y
consecuente disminución de la motilidad. Esto es observado en el enfriamiento
lento de semen a 5ºC.
El plasma seminal tiene importantes efectos en la motilidad de los
espermatozoides, su capacidad de supervivencia y la resistencia de los
espermatozoides a los cambios producidos durante los procesos de refrigeración y
congelación, aunque su función aún no la comprendemos totalmente.6
El plasma seminal contiene factores capaces de estimular o deprimir la motilidad
del semen; la adición de plasma seminal a los espermatozoides obtenidos del
epidídimo (0% plasma seminal) provoca un aumento inmediato de la motilidad.7
Mientras que otros autores han observado una disminución en la motilidad del
semen incubado con plasma seminal tras 24 a 48 horas de mantenimiento en
refrigeración.8
5 Pickett, B.W.; Sullivan, J.J.; Seidel, G.E . Effects of frequency of ejaculation on seminal characteristics and spermatozoal output . Journal Animal Science. 1975, p. 917-923. 6 Amann, R.P.; Pickett, B.W. Principles of cryopreservation and a review of cryopreservation of stallion spermatozoa. Equine Veterinary Science. 1987, p. 145-173. 7 Jasko, D.J.; Moran, D.M.; Farlin, M.E.; Squires, E.L. Effect of seminal plasma dilution or removal on spermatozoal motion characteristics of cooleted stallion semen. Theriogenology. 1991, p. 1059-1067. 8 Braun, J.; Sakai, M.; Hochi, S.; Oguri,N. Preservation of ejaculated and epididymal stallion spermatozoa by cooling and freezing. Theriogenology. 1994, p. 819-828.
5
Tanto el volumen del eyaculado como su concentración son parámetros muy
variables, y presentan una baja repetibilidad incluso dentro de eyaculados de un
mismo semental .Sin embargo el volumen y la concentración están inversamente
relacionados, de suerte que el número total de espermatozoides por eyaculado,
que se obtiene como el producto de multiplicar el volumen del eyaculado y la
concentración espermática, es un valor altamente repetible en caballos sometidos
a un ritmo regular de eyaculación.9
Los espermatozoides equinos presentan un tipo de movimiento ligeramente
circular debido a la implantación paraaxial del flagelo; al menos un 50% o un 60%
de los espermatozoides deben tener un movimiento progresivo. 10
1.2. SISTEMA DE RECOLECCIÓN DEL SEMEN Se han empleado diversos sistemas para la recogida del semen en los équidos.
Algunos, como el condón o el dispositivo intracervical, no proporcionan muestras
adecuadas y no son empleados normalmente excepto en aquellos sementales que
no aceptan la vagina artificial, lo cual ocurre con mayor frecuencia en los caballos
acostumbrados a realizar monta natural. La vagina artificial es el sistema óptimo
de recogida de semen en los équidos. Existen varios modelos de vaginas
artificiales: Nikishawa, Missouri, Hannover o el modelo Colorado; todas ellas están
creadas bajo el mismo principio y constan de una doble camisa dentro de la cual
se introduce agua caliente y en ocasiones aire con el fin de aportar la temperatura
y presión adecuadas para estimular la eyaculación. Tischner desarrolló en Polonia
un modelo de vagina artificial "abierta", que es empleada en muchos laboratorios
debido a que permite la recogida selectiva de las distintas fracciones del
eyaculado11
9 Clément, F.; Vidament, M.; Magistrini, M. Estimation du pouvoir fècondant de ľ etalon. Special Reproduction des Equidès. 1992, p. 947-957 10 Malmgren, L. Assessing the quality of raw semen: A review. Theriogenology.1997, p. 532-530. 11 Op cit. Palma A. G. 2001, p.527
6
Últimamente se han descrito técnicas alternativas de recolección de semen, Love
en 1992 determina que la recolección de semen con Vagina Artificial es sin duda
el método más eficaz para la obtención de un eyaculado. Cuando, debido a
lesiones músculo-esqueléticas o neurológicas, el padrillo no logra hacer el salto o
alcanzar la erección se puede intentar la recolección con Vagina Artificial en
estación o utilizando métodos alternativos.12
La xilacina, un agente alfa-adrenérgico, ha sido utilizado con el fin de inducir la
eyaculación ex-copula en sementales incapaces de montar o de eyacular in-
copula. McDonnell y Love en 1991 emplearon xilacina para inducir la eyaculación
en sementales normales obteniendo un eyaculado en el 25% de las pruebas.
Otros alfa-adrenérgicos como la detomidina y la romifidina son capaces de inducir
también la eyaculación ex-cópula; en la experiencia del autor los eyaculados
obtenidos presentan menor volumen y mayor concentración que los eyaculados
obtenidos mediante vagina artificial, pero tanto el número total de
espermatozoides por eyaculado como la motilidad se encuentran dentro de rangos
normales.13
La temperatura interna de la vagina artificial en el momento de la recogida se sitúa
entre 44 y 50ºC, debe procurarse que el eyaculado pase inmediatamente al tubo
colector, atemperado a 38ºC, para evitar que los espermatozoides sean dañados
por la alta temperatura. Sin embargo otros autores como por ejemplo W. Eduard
Allen en 1994 sugiere que la temperatura del agua de la vagina artificial debe ser
de 50 a 52ºC para conseguir una temperatura en su luz de unos 440C.14
12 McDonnell, S.M.; Love, C.C. Xilacine-induced ex copula ejaculation in stallions. Theriogenology. 1991, p. 73-76. 13 Blanco, M.; Serres, C.; Del Río, A.; López, J.; Sánchez, J.; Meikle, A.; Gómez- Cuètara, C.; Mateos, E. Inducción de la eyaculaciòn ex cópula en equidos mediante métodos farmacológicos. I congreso Ibérico de Reproducción Animal. Estoril Portugal. 1997. 14 Pickett, B.W. Factors affecting sperm production and output. Equine reproduction. Ed. McKinon, Pennsylvania. 1993
7
Como estímulo sexual se emplea una yegua en celo, si no se cuenta con la
posibilidad de una yegua en celo este se puede inducir por medio de la aplicación
de Prostaglandina F2alfa o sus análogos o también con progestágenos, otra
alternativa es el empleo de hembras con quistes ováricos o tumores de la
granulosa, porque presentan celo permanente, o el empleo de hembras
ovariectomizadas con o sin tratamiento estrogénico en pequeñas dosis de 0.12 a
0.25 mg (Cipionato de estradiol) a intervalos superiores a 4 días .
1.3. EVALUACIÓN DE LA CALIDAD DEL SEMEN
La evaluación de semen se realiza como parte del examen andrológico para
verificar la potencia generandi en la compra y venta de reproductores, antes del
inicio de la temporada de monta e inseminación artificial. El análisis clásico
comprende la evaluación de la concentración, número total de espermatozoides
en el eyaculado, motilidad y morfología. Los valores fisiológicos se muestran en la
tabla 1. El análisis aislado de los valores espermáticos no presenta alta correlación
con la fertilidad del padrillo. Sin embargo el porcentaje de espermatozoides
viables, mótiles presentan alta correlación con la fertilidad del macho. El semen
equino presenta grandes diferencias en la calidad entre los eyaculados de un
mismo individuo, por ello es necesario realizar el examen de varios eyaculados
para determinar la calidad del semen, analizando dos eyaculados obtenidos con
una hora de intervalo o estableciendo la media de una serie de eyaculados.15
En los animales mantenidos en reposo sexual el primer eyaculado contiene más
espermatozoides y su motilidad es menor debido a la eliminación de los
espermatozoides acumulados en las ampollas y conductos deferentes, los cuales
al estar almacenados a temperatura corporal tienen una menor motilidad.
15 Pattie W.A.; Dowset, K.F. The repeatability of seminal characteristics of stallions. Journal Reproduction fertility. 1982, p. 9-13.
8
Para la realización de las determinaciones de calidad seminal se debe eliminar el
gel del eyaculado, mediante filtración o aspirado, ya que los espermatozoides se
adhieren al gel dificultando las observaciones.16
Tabla 1. Medidas de valores seminales equinos, según varios autores17
Autor/es Valores seminales Pickett y col Dowsett y Klug(1982) Mattos y col (2975) Pattie (1982) (1989) Volumen total (ml) 66 63.6 - -
Volumen sin gel (ml) 52 45.3 75.6 60.0
Volumen de gel (ml) 7 16.8 - -
Concentración (106/ml)
281 178.0 304.5 250.0
Nr. Total de Epz 15 7.2 21.6 12.0
Motilidad total (%) 73 72.1 63.1 50.0
Movimiento Progresivo (%)
- - 35.6 25.0
Epz Vivos (%) - - 69.5 75.0
Epz sin alteraciones morfológicas (%)
- - 55.6 50.0
1.3.1 Examen Macroscópico Después de retirado el recipiente recolector de la VA, se debe tomar precaución
de no someter el semen a cambios bruscos de temperatura. La fracción gel,
producida por las vesículas seminales, debe ser separada lo más rápido posible,
debido al efecto negativo que tiene sobre los espermatozoides. Algunas vaginas
16 Op cit. Clément, F.; Vidament, M.; Magistrini, M. 1992, p.947-957 17 Op cit. Palma A. G. 2001, p. 532
9
artificiales poseen filtros descartables, cuando eso no ocurre es posible adaptarles
un filtro. Amann y col en 1983 reportan que los filtros de nylon con poros de 37µm
son los más indicados porque retienen un número menor de espermatozoides. 18
- Volume . El volumen del eyaculado es la suma del volumen del semen y el gel.
El volumen del semen sin el gel es determinado a través de la lectura de la
probeta graduada, después de la filtración.
- Aspecto. Después de la separación del gel el aspecto del semen es evaluado,
teniendo en cuenta como base su coloración y consistencia. La coloración del
semen varía de gris ceniza a blanco y la consistencia puede variar de acuoso a
lechoso. El aspecto del semen da una idea de la concentración espermática.
Cuanto más blanco lechoso, mayor es su concentración. Además de eso, la
apariencia permite establecer la presencia de urospermia y hemospermia. En caso
de urospermia, su presencia puede ser detectada por el olor a orina en el semen.
- pH . El pH del semen equino varía entre 6,2 y 7,8 esto es un reporte de Amann y
col en 1983. Sin embargo otros autores como Kenney y col en 1983; reportan
que el pH del semen equino se sitúa entre 7.2 y 7.6. Pickett en 1993, afirma que el
pH está inversamente correlacionado con la concentración, de manera que con
concentraciones menores el pH tiende a ser mayor. El pH puede ser medido por
medio de un potenciómetro o de manera menos exacta, a través de cintas
indicadoras de pH. Este debe ser determinado inmediatamente después de la
recolección por que el reposo genera la formación de ácido láctico. 18 Op cit. Palma A. G. 2001. p. 533
10
1.3.2 Examen Microscópico - Pruebas de motilidad Tras la recogida del eyaculado el primer parámetro que debemos analizar es la
motilidad, debido a que ésta se altera por los cambios de temperatura y el tiempo
de incubación .Después de la recolección se inicia una disminución progresiva de
la motilidad espermática. Por eso la evaluación de la motilidad debe ser
determinada inmediatamente o como máximo, 5 minutos después de la
recolección. La motilidad será evaluada tanto en el semen in natura como en el
diluido. Para el estudio de la motilidad en este momento se pueden usar
soluciones diluyentes como aquellas utilizadas para el enfriamiento del semen
preferentemente aquellas con yema de huevo porque esta torna la solución
ópticamente opaca; sin embargo, el semen puro tiende a aglutinarse lo que
dificulta la estimación. Para una mejor evaluación el semen debe diluirse en un
medio adecuado a una concentración constante entre 25 y 50 x 106 spz/ml.
Generalmente esta evaluación se realiza mediante la estimación subjetiva y se
debe estimar el porcentaje de células mótiles o motilidad total (MT) y el porcentaje
de células con motilidad progresiva (MP). 19
La estimación visual de la motilidad tiene el inconveniente de ser altamente
subjetiva, y sus resultados dependen en gran medida de la experiencia del
observador, por lo que se han desarrollado sistemas de análisis de semen
asistidos por computador (Computer-Assisted Sperm Analysis, CASA) que
permiten una mayor objetividad y la evaluación de un mayor número de
parámetros para definir el movimiento de los espermatozoides.20
19Op cit. Palma A. G. 2001. p. 534. 20 Op cit. Malmgren, L. 1997. p.530-532
11
La motilidad del semen presenta una correlación escasa con la fertilidad, tanto con
el empleo de semen fresco como descongelado reporta Samper y col en 1991; En
un estudio reciente Bedford y col en 1995 compararon la motilidad y fertilidad del
semen refrigerado a 4°C en un diluyente de leche desnatada con o sin yema de
huevo, a pesar de que la motilidad fue significativamente mejor en el diluyente
conteniendo yema de huevo la fertilidad obtenida con este diluyente (17%) fue
inferior a la obtenida con el diluyente sin yema (58%). Sin embargo la estimación
de la motilidad continúa siendo el parámetro más empleado para la predicción de
la capacidad fecundante del semen.21
- Número de espermatozoides El volumen de eyaculado, una vez filtrado y libre de gel, se determina mediante el
uso de una probeta graduada, esta es una manera práctica de medir el volumen
implementada por Pickett en 1993. Kenney y col en 1983 y Graham en 1996
proponen que la concentración de espermatozoides se calcula en millones de
espermatozoides por mililitro (spz/ml), este parámetro es extremadamente
importante para calcular el número de espermatozoides por eyaculado o el
volumen de semen más diluyente necesario para preparar cada dosis de
inseminación. La concentración de semen se calcula generalmente como lo
reportan Pickett en 1993 y Graham en 1996 que es mediante espectrofotometría,
este método determina la cantidad de luz dispersada al atravesar una muestra y la
concentración se determina por comparación con una curva Standard. La medida
de la concentración mediante espectrofotometría tiene un alto costo cuando se
analizan pocas muestras y pierde precisión en eyaculados poco concentrados o
contaminados, en estos casos es preferible el uso de una cámara
hemocitométrica, afirman Pickett, en 1993 y Graham en 1996.
21 Boyle, M.S. Artificial insemination: assessing stallion seminal quality after freezing. Equine Veterinary Journal. p. 5-6.
12
Para el recuento en la cámara de Neubauer puede ser utilizada una dilución de
1:20 o 1:40 en una solución fijadora de formol – salina o hayem. El número total de
espermatozoides se obtiene multiplicando la concentración por el volumen del
semen ajustándose la unidad de medida a cm³ o mm³.22
- Coloración supravital La coloración supravital realizada con eosina amarillada al 2% reportada por
Krause en 1966; determina de forma mas objetiva las células viables para
determinar la integridad de la membrana plasmática. Cuando las células sufren
una lesión de la membrana, absorben el colorante. Los espermatozoides
coloreados y sin colorearse se cuentan con un aumento de 400x hasta un total de
200 células. El resultado es expresado en porcentaje. Los espermatozoides no
coloreados representan a las células viables y los coloreados a las células
muertas. La determinación de las morfoanomalías puede realizarse en
preparaciones húmedas o fijadas sobre un portaobjetos. Existen diversas
clasificaciones para las alteraciones morfológicas, sin embargo la suma de las
alteraciones de acrosoma y cabeza no deben pasar 5% y 10% respectivamente y
el número total de las alteraciones no debe ser superior a 30%. Las anormalidades morfológicas de los espermatozoides se clasifican atendiendo
a su origen como primarias, aquellas que se producen durante la
espermatogénesis, o secundarias, cuando su origen se encuentra en la
maduración y el paso a través del epidídimo o posteriormente. Este origen no ha
sido comprobado en caballos por lo que se utiliza otra clasificación que divide las
morfoanomalías en función de su efecto en la fertilidad como mayores (cabeza
anormal, gota citoplasmática proximal, anormalidades de la pieza intermedia) y
menores (cabeza suelta, gota citoplasmática distal y anomalías del flagelo). 23
22 Op cit. Palma A. G. 2001.p. 535. 23 Opcit. Palma A. G. 2001, .p. 536.
13
1.4 CHOQUE TÉRMICO
El enfriamiento del semen disminuye la actividad metabólica de los
espermatozoides, reduce el crecimiento bacteriano y de esa manera, prolonga la
viabilidad de los espermatozoides afirma Katila en 1997. El choque térmico, en
equinos es el conjunto de alteraciones que los espermatozoides sufren cuando
son sometidos a un enfriamiento rápido de 20˚ C a 5˚C. Esas alteraciones están
representadas por la pérdida rápida de motilidad, la alteración del tipo de motilidad
con un movimiento retrogrado y circular, reducción del metabolismo, lesión del
acrosoma y de la membrana plasmática, acompañada de pérdida de los
componentes intracelulares. Estas alteraciones son en parte irreversibles. Con el
enfriamiento, los lípidos sufren una transición a la fase líquida cristalina y
posteriormente a una de gel. Una vez que se encuentran en estado de gel, los
lípidos tienden a agregarse, además de volverse más permeables a los iones.
Cuando los espermatozoides están alterados, los iones Na+ y Ca++ que entran a
las células espermáticas son retirados por medio de transporte activo. A 5˚C la
permeabilidad al Ca++ crece significativamente, superando la capacidad de
eliminación de los iones por medio de las bombas de Ca++. Así el Ca++ se acumula
en el espermatozoide alcanzando niveles tóxicos.24
Es posible que el acrosoma sufra más, con estas alteraciones, una pérdida mayor
de capacidad fecundante de la que sería esperado de la reducción de la motilidad.
Los efectos del choque térmico son más evidentes en el congelamiento de semen,
cuando los espermatozoides sufren alteraciones más semejantes a la capacitación
y al envejecimiento. La severidad del efecto del choque térmico depende del grado
de enfriamiento, intervalo entre temperaturas y la variación de la temperatura.
Estos efectos pueden ser reducidos a través del enfriamiento controlando los
24 Hammerstedt, R.H.; Graham, J.K.; Nolan, J.P. Cryopreservation of mammalian sperm: What we ask them to survive. Journal of Andrology. 1990, p. 73-88.
14
intervalos críticos de temperatura entre 19˚C y 8˚C y por medio de la adición de
lípidos (yema de huevo) o proteína (leche) en el diluyente del semen. También fue
sugerido que la variaciones de la composición y la concentración de NaCl es
responsable de la variación de la tolerancia del semen de diferentes padrillos al
enfriamiento y la congelación. 25
Los espermatozoides de algunos padrillos parecen ser más sensibles que otros a
la presencia de plasma seminal, en estos animales más sensibles, disminuye el
mantenimiento de la motilidad. La centrifugación y eliminación parcial del plasma
seminal beneficia a los machos cuyos eyaculados presentan baja tolerancia al
enfriamiento, almacenamiento, dilución del semen y acondicionamiento de rutina.26
Esto es válido en particular para semen almacenado por más de 24h. Este
procedimiento, sin embargo, no se justifica para el semen de padrillos, cuyos
eyaculados toleran el enfriamiento y almacenaje usando procedimientos de
rutina.27
1.5. CENTRIFUGACIÓN El método más utilizado para la separación del plasma seminal de la fase rica en
espermatozoides es la centrifugación. La misma permite la separación del
plasma, aumenta la concentración espermática y también ofrece un mayor control
de la dilución utilizada en el semen enfriado o congelado. Sin embargo la
centrifugación no es inocua. Además de una pérdida de 10% a 20% de los
espermatozoides en el sobrenadante, puede reducir la motilidad o aumentar el
número de alteraciones morfológicas de las células espermáticas. Para reducir
25 Amann, R.O.; Graham, J.K .Spermatozoal function .Equine Reproduction. Ed. McKinnon, Febiger, Pennsylvania 1993 26 Aurich, J.E.; Kühne, A.; Hoppe, H.; Aurich, C. Seminal plasma affects membrane integrity and motility of equine spermatozoa after cryopreservation. Theriogenology, 1996, p. 791-797 27 Nishikawa, Y. Studies on the preservation of raw and frozen equine semen. Journal Reproduction Fertility, 1975, p.99-104.
15
ese efecto se puede disminuir la fuerza centrífuga, acortar el tiempo de
centrifugación, usar diluyentes en la centrifugación (Tabla 2) y usar líquido
isotónico denso sobre los espermatozoides. Para congelar el semen se agrega,
comúnmente un diluyente a base de glucosa- EDTA o citrato-EDTA. 28
Después el botón de semen se resuspende con un segundo diluyente para el
almacenamiento o criopreservación. Cuando el semen esta destinado a ser
utilizado fresco o enfriado se emplea solo un diluyente para la centrifugación y
resuspensión ya que no se lleva a cabo la criopreservación. El diluyente puede ser
mezclado con el semen y colocado en fracciones. Importante es que sea pre-
enriquecido para estar a la misma temperatura que el semen. La proporción
semen /diluyente normalmente utilizada es de 1:1 o 1:2. Existe una gran variación
en la fuerza centrífuga y la velocidad utilizada por los autores. Martin y col, en
1979 usaron 1000 gravedades durante 5min y Klug en 1993 800 gravedades
durante 10 min. Otros autores como Brinsko y col en el 2000, emplearon una
fuerza centrífuga menor durante un periodo mayor: 200 gravedades en 12 min o
400 gravedades en 15 min. 29
Tabla 2. Diluyentes utilizados para centrifugación de semen
Diluyentes
Glucosa-EDTA
(Martín y col.,1997)
Citrato-EDTA
(Cochran y col.,1984)
28 Op cit. Pickett, B.W.; Sullivan, J.J.; Seidel, G.E.1975.p. 917-923. 29 Op cit. Palma A. G. 2001,p. 550
16
Tabla 3. Diluyentes a base de leche descremada30.
Leche descremada en polvo-glucosa de
Kenney I
(Kenney y col., 1975)
INRA 82
(Magistrini y col., 1992; ljaz y
Ducharme, 1995)
Leche descremada en polvo-glucosa de
Kenney II. (Kenney y col., 1975)
Tyrode modificado por Kenney( ljaz y
Ducharme , 1995)
E-Z Mixin
(Province y col., 1984, 1985)
Medio Tyrode
Tabla 4. Diluyente Glucosa -EDTA31
Glucosa 6gr.
EDTA 0.37gr.
Bicarbonato Sódico 0.12gr.
Citrato sódico dihidrato 0.37gr.
Penicilina G. sódica 50.000 UI
Estreptomicina 50mg
Agua Destilada 100ml
pH 7.2 -7.4 Osmolaridad 450mOsm
30Op cit. Palma A. G. 2001,p. 550 31 Heitland , A.V.; Jascko, D.J.; Graham, J.K.; Squires, E.L.; Amann, R.P.; Pickett, B.W. Mortility and fertility of stallion spermatozoa cooled and frozen in a modified skim milk extender containing egg yolk and liposome. Biology of reproduction. P. 753-759.
17
1.6. DILUYENTES DEL SEMEN
Los diluyentes de semen contienen componentes protectores que permiten la
sobrevivencia espermática fuera de tracto reproductivo. Además de esto
aumentan el volumen de la dosis inseminante. Yema de huevo, leche y glicerol
son los componentes más adicionados para la protección de los espermatozoides
frente al descenso de temperatura. Las lipoproteínas presentes en la leche y la
yema de huevo protegen a los espermatozoides del choque térmico. Substratos
metabolizables como glucosa constituyen la fuente de energía para las células
espermáticas. Los diluyentes deben contener sustancias con alta capacidad
tampón para neutralizarlos. Los antibióticos son adicionados en forma rutinaria a
los diluyentes para retardar o eliminar el crecimiento de bacterias que
invariablemente contaminan el semen como consecuencia de la recolección.
Como se muestra en la (tabla 4), los antibióticos más empleados son la penicilina
G-potásica o sódica cristalina, la gentamicina o amikacina, la estreptomicina o
penicilina G-potásica cristalina. La combinación de penicilina G-potásica cristalina
con amikacina fue más eficaz en el control de bacterias anaerobias. La presión
osmótica y el pH del diluyente deben ajustarse para favorecer la sobrevivencia
espermática. La osmolaridad del plasma seminal es de 300 mOsm/l
aproximadamente. Mantener la osmolaridad del diluyente próxima a la isotonicidad
(entre 277 y 322 mOsm/Kg.) favorece la motilidad espermática in Vitro afirman
Mairellies y col en 1999. La osmolaridad de los diluyentes a base de leche puede
variar entre 300 y 400 mOsml/l, el valor ideal es 350mOsm/l. El pH de los
diluyentes puede variar entre 6,7 y 7,2 sin afectar la calidad espermática durante
el almacenamiento. 32
32 Brinsko, S.P.; Varner, D.D .Artificial insemination. Equine Reproduction. Ed. McKinnon. Pennsylvania. 1993
18
Por este motivo, cuando la gentamicina o amikacina, que reducen el pH del
medio, son incluidos en el diluyente, debe ser adicionado bicarbonato de Na para
ajustar el pH.33
1.7. SISTEMAS DE CONSERVACIÓN DE SEMEN EQUINO34 1.7.1 Refrigeración del semen. El semen equino es refrigerado con el fin de alargar la vida de los
espermatozoides equinos y mantener su capacidad fecundante, de esta manera el
semen puede ser almacenado y transportado antes de su uso. La refrigeración del
semen alarga la vida del espermatozoide al disminuir el metabolismo basal de la
célula, esta disminución de la temperatura provoca una serie de daños en la célula
que se conocen como choque frío o “cold shock” y que se traducen en un patrón
irregular de movimiento, pérdida de la motilidad, alteración de la membrana
acrosomal y plasmática, disminución del metabolismo y pérdida de componentes
intracelulares. 34
Las alteraciones inducidas por el choque frío en los espermatozoides dependen de
una serie de factores, entre los que se destacan la especie animal, la temperatura
final alcanzada, la velocidad de refrigeración, la dilución y el tiempo de exposición
a la temperatura final.35 De una forma general, la refrigeración del semen diluido a
temperaturas de 5°C a 6°C mantienen mejor la viabilidad espermática durante el
almacenamiento en comparación con el mantenimiento a temperatura ambiente
(15°C-25°C). 35
33 Op cit. Palma A. G. 2001, p. 543. 34 Watson, P.F. Artificial insemination and the preservation of semen. Marshall`s physiology of reproduction. Male reproduction. Lamming. Londres. 1990 35 Amann, R.P.; Pickett, B.W. Principles of cryopreservation and a review of cryopreservation of stallion spermatozoa. Equine Veterinary Science 1987, p. 145-173.
19
Este aumento de la viabilidad espermática es favorecido por la mayor reducción
de la actividad metabólica a temperaturas bajas. Durante el enfriando, sin
embargo, los espermatozoides están expuestos a los efectos negativos del
choque térmico. La extensión de ese efecto adverso sobre los espermatozoides no
depende tanto de la temperatura sino más de la velocidad con que desciende.
Mattos y col en 1997 no observaron, sin embargo, una disminución significativa del
semen enfriado 1°C/min hasta 4 °C. La mayoría de los autores concuerdan que el
enfriamiento lento (<0,03°C a 0,1-0,05°C/min) mantiene mejor la motilidad y la
fertilidad de los espermatozoides equinos.36
El semen diluido puede ser enfriado rápidamente de 37°0 a 20°C. La fase crítica,
de mayor susceptibilidad de los espermatozoides al choque térmico, se encuentra
en el intervalo entre 19°C y 8°C. El enfriamiento rápido puede ser retomado a
partir de 8°C hasta la temperatura de almacenamiento, que varía entre 6°C y 4°C.
Para minimizar los efectos del choque frío y el almacenamiento a bajas
temperaturas es necesario en primer lugar diluir el semen en un medio adecuado,
en segundo lugar refrigerar las células a ritmo inferior a – 0.05°C/ minuto y por
ultimo incubar el semen el menor tiempo posible.37
Tabla 5. Diluyentes empleados comúnmente para la refrigeración del semen38.
Diluyente de leche desnatada Diluyente glicina – yema de huevo
(Kenney et al,1975) (H. merkt)
36 Pickett, B.W.; Komarek, R.J. Effect of cold shock and freezing on loss of lipid from spermatozoa. Journal Dairy Science.1996 ,p. 753-757. 37 Ibid.1996,p. 753-757 38 Pickett, B.W.; Amann, R.P. Extension and storage of stallion spermatozoa. A review Equine Veterinary Science. 1987, p. 289-302.
20
Los diluyentes a base de leche descremada en polvo como Kenney o E-Z-Mixin
son usados comúnmente para la dilución de semen para la Inseminación Artificial,
tanto con semen fresco como refrigerado, por mantener bien la motilidad
espermática y la fertilidad. La leche descremada UHT o la leche descremada en
polvo reconstituida (10 g de leche en polvo con 0,1% de grasa en c.s.p 100ml de
agua destilada; reportados por Meirelles y col en 1999), pueden ser utilizados
como diluyentes para la preservación de semen equino refrigerado. Mattos en el
2000 sugiere que sean evaluadas diversas marcas, tanto de leche descremada en
polvo como UHT, porque existen variaciones en los resultados obtenidos entre
marcas. 39
Esto es atribuido a diferencias en la composición de estos productos, debido a la
presencia de aditivos. Province y col en 1985 obtuvieron mejor mantenimiento de
la motilidad espermática con diluyente a base de leche descremada en polvo-
glucosa que con el empleo de leche descremada. El uso de glucosa, una fuente
extra de energía y bicarbonato, un tampón en los diluyentes Kenney y E-Z Mixin
pueden ser los factores responsables de la mejor conservación de la motilidad
rectilínea progresiva y de mejores índices de concepción obtenidos con estos
diluyentes, frente a la leche descremada. El diluyente INRA 82 es comúnmente
usado en Francia. Según ljaz y Ducharme en 1995, mantiene mejor la motilidad
que el Kenney y E-Z Mixin. El Semen equino diluido con INRA82 refrigerado a 5 ˚C
durante 96h mantiene la motilidad total de 56%.Se cree que la gelatina presente
en algunos diluyentes, puede tener una función estabilizadora de la membrana.40
39 Martin, J.C.; Klug, E.; Günzel, A.R. Centrifugation of stallion semen and its storage in large volume straws. En: Journal Reproduction and Fertility. (1979) Vol 27 p. 47-51. 40 Pickett, B.W.; Amann, R.P. Extension and storage of stallion spermatozoa. A review Equine Veterinary Science. 1987, p. 289-302.
21
A pesar que la obtención de buenos resultados de preñez, diluyentes a base de
gelatina, por ejemplo el diluyente a base de crema de leche y gelatina, no son
utilizados comercialmente debido a que su preparación es más trabajosa y la
presencia de partículas de grasa no permite la evaluación microscópica del
semen.41
El diluyente INRA 96, es un diluyente químicamente definido que incluye
componentes de la leche. Mantiene la viabilidad espermática a 15˚C por un
periodo mayor que el diluyente INRA 82. Semen diluido con INRA 96, mantenido a
15˚C durante 72h resultó en 48% fertilidad/ciclo. Este diluyente es una alternativa
para ser empleada en padrillos con espermatozoides sensibles al choque térmico
afirma Batallier y col en 1998. Los diluyentes a base de yema de huevo son
usados principalmente para la conservación de semen debido a su acción
protectora la cual es atribuida a la fracción lipoproteína de baja densidad, los
fosfolípidos que se ligan a la membrana plasmática. ljaz y Ducharme en 1995
observaron que semen diluido en diluyente Dimitropulos, alcanzó 56% y 41% de
motilidad, después de la conservación a 5˚C durante 24h y 48h respectivamente.42
Está indicada la eliminación del plasma seminal, porque ocurre una interacción
adversa entre el plasma seminal y la yema de huevo. Este efecto se manifiesta
después de 6h de refrigeración como una detención de la motilidad espermática y
después de 24h también, como una falta de la motilidad total, como lo reporta
Bedford y col en 1995. Amann y Pickett en 1987 observaron que este efecto no se
presentó, cuando la yema de huevo fué utilizada en una cantidad de 2%.
Numerosos autores han ensayado el empleo de diversos aditivos para la dilución
del semen equino con el fin de disminuir los efectos del choque frío, como la
lactosa o la rafinosa y los liposomas de fosfatidilserina y colesterol o con el fin de
41 Op cit. Palma A. G. 2001, p.543 42 Ibid, 544.
22
alargar la vida media de los espermatozoides refrigerados empleando para ello
albúmina sérica bovina (BSA) antioxidantes o teofilina.43
- Otros medios de refrigeración. Leche desnatada A. Solución tamponada Hepes (HBS) pH 7.2 Osmolaridad 320mOsm
Leche Desnatada B Osmolaridad 310 mOsm
FR1 pH 7.2 Osmolaridad 320 mOsm
BWW pH 7.2, Osmolaridad 320 mOsm44
43 Arns, M.J.; Webb, G.W.; Kreider, J.L.; Potter, G.D.; Evans, J.W. Use of different nonglycolysable sugars to maintain stallion sperm viability when frozen or stored at 37°C and 5 °C in a bovine serum albumin medium. Journal Reproduction and Fertility.987, p. 135-141. 44 Heitland,A.V.; Jasko, D.J.; Squires, E.L.; Graham, J.K.; Pickett, B.W.; Hamilton, C. Factors affecting motion characteristics of frozen-thawed stallion spermatozoa. Journal Veterinary Equine. 1996,p. 47-53
23
1.7.2. Criobiología espermática
En el año 1949 investigadores británicos Polge, Smith y Parkes informaron que los
espermatozoides pueden ser protegidos de los riesgos de la congelación
adicionándoles glicerol, el cual al agregarse a los diluyentes permite sobrevivir a
los espermatozoides a temperaturas extremadamente bajas (-196ºC). Estos
autores demostraron la acción protectora de la glicerina la cual básicamente
modifica el tipo de cristales que se forman durante la congelación y reducen y en
algunos casos impiden la lesión de las células lo cual permite una supervivencia
mediante el proceso lento de enfriamiento y congelación. El descubrimiento de la
capacidad crioprotectora del glicerol, hace 50 años, permitió el desarrollo de las
técnicas de congelación en diversas células, especialmente el espermatozoide de
bovino. Sin embargo, el éxito obtenido en la criopreservación e inseminación
artificial con semen de bovino no ha podido ser repetido en otras especies.
Posteriormente Linde puso a punto la criopreservación de esperma con nitrógeno
líquido el cual provenía de trabajos industriales y dieron como base el nacimiento
propiamente de la criobiología. En enero de 1951 los ingleses reportaron el primer
ternero nacido de semen congelado utilizando la técnica y los procedimientos
anteriormente mencionados, donde los aportes fundamentales fueron la adición
del glicerol y la congelación o criopreservación inicialmente en nieve carbónica y
alcohol y posteriormente en nitrógeno líquido. 45
Este semen fue congelado por el personal de Prentice en ABS, durante el
proceso de criopreservación los especialistas de la época se dieron cuenta que al
menos un 50% de los espermatozoides morían o se hacían inmóviles durante la
congelación y descongelación. Avanzando la investigación se encontró que esto
se veía afectado por el pH del diluyente, por la velocidad de congelación y por la
osmolaridad del medio. Aun en la actualidad no conocemos por completo la
naturaleza exacta de las lesiones debidas al proceso de congelación y 45 Op cit. Pineda, S.D. 2002, p. 88-92.
24
descongelación algunos especialistas mencionan que el perjuicio se debe a la
diferencia de presión de vapor entre el hielo y el agua a temperaturas inferiores a
los 0ºC, también se sabe que están implicadas las membranas celulares las
cuales sufren alteración y que aun con los crioprotectores como la glicerina no son
protegidos en su totalidad ya que hay en algunos casos perdida de lípidos de los
espermatozoides durante la congelación debido posiblemente a la permeabilidad
de la membrana. Actualmente podemos definir la velocidad óptima de congelación
como aquella que permite una deshidratación y que evita la formación de cristales
intracelulares reduciendo a un menor tiempo posible su exposición a desequilibrio
osmótico progresivo de las soluciones, por lo tanto los criobiólogos consideran que
el “Seeding” o siembra controlada de cristales es parte fundamental en el éxito de
la criopreservación de esperma. Contrariamente a su acción crioprotectora el
glicerol induce a daños en los espermatozoides, los efectos tóxicos del glicerol
pueden ser de naturaleza osmótica o pueden ser resultado de daños bioquímicos
que ocurren en la secuencia de interacciones entre el crioprotector y los
componentes del espermatozoide, se cree que hay variaciones del volumen
celular dependiendo de la entrada y la salida del crioprotector y agua (choque
osmótico) sean una de las principales causas de la baja viabilidad del semen
después de la descongelación. 46
Ball y Vo en el 2001 evaluaron la tolerancia osmótica de los espermatozoides
equinos con la adición y remoción de diferentes agentes concluyendo que la
adición y remoción del glicerol resultó en un mayor estrés osmótico caracterizado
por una disminución de la motilidad, disminución de la integridad celular y
acrosomal comparado con otros crioprotectores estudiados. 47
46 Op.cit Pineda, S.D. 2002, p. 90 47 Ibid,. 2002, p. 88-92.
25
Aunque la glicerina continuará por mucho tiempo siendo la ideal de congelación y
por esta razón se la toma siempre como patrón de comparación, otros
crioprotectores han sido investigados no solamente para mejorar las condiciones
de congelación de semen sino para obtener mejores resultados en la congelación
de embriones. Hasta el momento el glicerol no ha podido ser reemplazado sin
embargo se encuentran sustancias o compuestos afines con características
protectoras como el dimetil sulfoxido (DMSO) el cual es de rápida penetración y de
efecto tampón. 48
La mayoría de las alteraciones de la estructura de la membrana son consecuencia
de choque térmico, deshidratación, toxicidad de las sales, formación de hielo
intracelular, fluctuaciones del volumen/superficie celular o alteraciones del
equilibrio metabólico. La primera etapa a cumplir es la refrigeración, desde la
temperatura corporal hasta 5°C, intervalo en que los espermatozoides son
sensibles al choque térmico. Cuando la temperatura desciende por debajo del
punto de congelación, ocurre un fenómeno conocido como supercooling, antes
que haya formación de cristales de hielo. La cristalización libera calor residual que
eleva la temperatura de la solución. El uso de técnicas de siembra y vitrificación,
con la finalidad de evitar el supercooling no resultaron en beneficios evidentes.49
El efecto de la criopreservación depende de la curva de congelación. Si la
velocidad de congelación es lenta, los espermatozoides se deshidratan y no se
forman cristales grandes de hielo. Este procedimiento resulta, sin embargo, en
elevadas concentraciones intracelulares de solutos que pueden dañar a los
espermatozoides. 50
48 Alvarenga M.A. Novos Conceitos relacionados a congelacăo de sĕmen de garanhŏes. M.A. Alvarenga, Departamento de Reproducăo Animal e Radiología Veterinaria. Facultad de Medicina Veterinaria e Zootecnia-UNESP. Campus de Botucatu-SP-Brasil. 2005. 49 Op cit. Amann, R.P.; Pickett, B.W. 1987,p. 148-150 50 Graham, J.K. Effect of seminal plasma on the motility of epididymal and ejaculated spermatozoa of the ram and bull during the criopreservation process .Theriogenology. 1994, p. 1151-1152
26
Si el semen fuera enfriado rápidamente (-60°C/min) el agua intracelular no dispone
de tiempo suficiente para difundir fuera de la célula antes de congelarse,
formándose cristales intracelulares menores. La formación inicial de hielo
intracelular puede resultar en lesión celular, pero es más grave si éstos se
disuelven y vuelven a forma cristales más grandes en el interior de las células
espermáticas. La reversión de este proceso debe ocurrir durante la
descongelación. Cuando el semen alcanza temperaturas por debajo del rango de
temperatura crítico (-15°C a -60°C), los espermatozoides se tornan relativamente
inertes y pueden ser transferidos al nitrógeno líquido para su almacenamiento. En
este momento las células son menos susceptibles a lesiones inducidas por las
altas concentraciones de sales. Los espermatozoides pueden ser conservados por
tiempo indeterminado a esta temperatura. 51
Sustancias crioprotectoras pueden ser incorporadas al medio para proteger los
espermatozoides durante la congelación. Los crioprotectores son clasificados
según su capacidad de penetrar las células como crioprotectores internos y
externos. Los crioprotectores externos (lactosa, manosa, trehalosa) no penetran la
membrana plasmática y ejercen su acción en le medio externo. La sucrosa y la
trehalosa, además se ha demostrado que son capaces de estabilizar las
membranas durante los procesos de congelación. Los crioprotectores internos,
como el dimetilsulfoxido y el glicerol, son capaces de penetrar al interior del
citoplasma celular. El glicerol aumenta la osmolalidad del medio externo
favoreciendo la deshidratación celular, aumenta el porcentaje de agua sin congelar
a bajas temperaturas, disminuye la concentración de sales en el medio externo y
aumenta el tamaño de los canales de agua descongelada. 52
51 Anchordoguy, T.J.; Rudolph, A.S.; Carpenter, J.F.; Crowe, J.H. .Modes of interaction of cryoprotectants with membrane phospholipids during freezing. Cryobiology .1987, p. 324-331. 52 Op.cit Anchordoguy, T.J.; Rudolph, A.S.; Carpenter, J.F.; Crowe, J.H. . 1987. p. 324-331
27
Además de sus efectos osmóticos, existen evidencias de que el glicerol actúa
directamente sobre los componentes de la membrana disminuyendo su fluidez,
formando uniones entre las proteínas e induciendo un aumento de las
necesidades energéticas.53
Crioprotectores no penetradores como las lipoproteínas de la yema de huevo,
actúan sólo en el compartimiento extracelular. No se conoce aún exactamente el
mecanismo de acción de este crioprotector; como lo reportan observaciones
realizadas por Hammested y col en 1990. Sin embargo otros autores como Parks
y Graham en 1992, sugieren que la yema de huevo y los fosfolípidos de bajo peso
molecular ejercen también una acción beneficiosa en las células durante los
procesos de congelación y descongelación debido a que las membranas celulares
sufren una pérdida de lípidos durante los procesos de refrigeración y congelación
y estos compuestos parece que ejercen su acción sustituyendo o minimizando el
efecto de la pérdida de lípidos. Estudios realizados por Graham en 1996 afirman
que la adición de concentraciones elevadas de crioprotectores es tóxica para los
espermatozoides, los cuales pueden sufrir una reducción de la fertilidad. Por ese
motivo deben ser empleados manteniendo un equilibrio que proporcione el
máximo de protección con mínimo efecto tóxico. 54
53 Parks, J.E.; Graham, J.K. Effects of cryopreservation procedures on sperm membranes. Theriogenology.1992,p. 209-222 54 Op cit. Hammerstedt, R.H.; Graham, J.K.; Nolan, J.P. 1990, p.73-88
28
1.7.2.1. Utilización de crioprotectores alternativos
Existen hasta el momento nuevas propuestas sobre la criopreservación de semen
con diferentes tiempos de congelación, diferentes diluyentes y diferentes
crioprotectores, muchas de estas técnicas en la actualidad son tan complicadas
que cada casa comercial especialmente aquellas multinacionales que distribuyen
semen las consideran como verdaderos secretos industriales.
En la experiencia del autor a lo largo de 15 años de estudio él observó una
marcada mejoría en la resistencia del semen de caballos al proceso de
congelación y descongelación esto ocurrió con la sustitución del glicerol por
crioprotectores alternativos. Demick et al en 1976 también observaron una
disminución acentuada de la fertilidad del semen de caballos refrigerado en
medios de dilución que contenía glicerol por un periodo de 2 horas. Tselutin et al
en 1999 determinó que para varios tipos de aves el glicerol también es altamente
contraceptivo. Para estas especies de animales, principalmente las aves, que son
sensibles al glicerol los crioprotectores a base de amidas han sido mostrados
menos tóxicos y más eficientes en la capacidad de preservar el potencial de
fertilización después de congelado. Recientemente estudios de laboratorio
demostraron que determinado tipo de amidas posibilitan una mejor significancia de
resistencia a la congelación del semen de la mayoría de los caballos
principalmente considerados malos congelantes. 55
A pesar de que existe muy poca información al respecto, en la utilización de
amidas como agente crioprotector para espermatozoides en la especie equina,
existe una gran cantidad de datos relacionados con el uso de este compuesto en
el congelamiento de semen de otras especies.
55Op cit. Alvarenga M.A. 2005.
29
Trabajos realizados en la antigua unión soviética por Otpushchennikoy y
Kriustosa en 1985 y Adreev et al en 1984 en la década de los 80, demostraron
altos índices de fertilidad con el uso de la Dimethyl-formamida para semen de
gansos y de gallos, sin embargo autores poloneses como Lukaszewics en el 2001
en una publicación mas reciente obtuvieron altos índices de fertilidad (92.9%) con
uso de semen congelado de gallos donde fué empleada la Dimethyl-formamida.
Pocos y recientes fueron los trabajos encontrados en la literatura donde se utilizó
derivados de amidas para criopreservación de espermatozoides de caballos, como
aquellos realizados por Keith et al en 1998; Alvarenga et al en el 2000; Alvarenga
y Leao en el 2002, Gomes et al en el 2002; Henry et al en el 2002; Medeiros et al
en el 2002; y Vidament et al en el 2002. Por otra parte Keith en 1998, estudiando
diferentes tipos de amidas, metil-formamida, Dimethyl-formamida y acetamida,
observaron que la metil-formamida y dimetil-formamida fueron similares al glicerol
en la capacidad de preservar la viabilidad y motilidad espermática en caballos.
Medeiros et al en el 2000 comparo diferentes tipos y concentraciones de amidas
(dimetill-formamida, dimetil-acetamida y metil-formamida) observó que las amidas
siempre fueron superiores al glicerol para la criopreservación de semen de
caballos; siendo mas marcadas las diferencias para el grupo de caballos
considerados malos congelantes cuando se congelaban con glicerol.
Trabajando con 18 reproductores de raza Brasilera Mangalarga Marchador,
Gomes et al en el 2002 observó que de estos solamente 4 presentaban un buen
patrón de motilidad cuando la congelación era con glicerol, cuando a los mismos
caballos se les congelo con dimetil-formamida 14 presentaban buena motilidad
después de congelados. Alvarenga et al en 1999 al estudiar 4 crioprotectores
(glicerol, etilenglicol, dimetilformamida y DMSO) demostró que el crioprotector
Dimetil-formamida fue superior a los otros estudiados en cuanto al parámetro
motilidad total en el momento inmediato a la descongelación. Recientemente
Alvarenga en el año 2003, cuando trabajo con un gran numero de reproductores
(55) donde fueron comparados el glicerol y la dimetil-formamida observó también
30
haber sido superior la motilidad después de descongelado, cuando se uso el
crioprotector dimetil-formamida (50.3% contra 33.4%). En este trabajo la utilización
del crioprotector Dimetil-formamida fué superior al glicerol en cuanto a motilidad
post descongelación en 40 de los 55 caballos estudiados, el porcentaje de
caballos con semen de buena calidad después de descongelado, que presentó
una motilidad mayor del 40% fue de 38% (21/55) para el grupo congelado con
glicerol. Y de 80% (44/55) para el grupo congelado con Dimetil-formamida.
Cuando comparadas las razas en cuanto a resistencia al proceso de congelación
observaron que los caballos de raza Mangalarga Marchador fueron los que
tuvieron peor resistencia al proceso de congelación cuando se uso el glicerol como
agente crioprotector, de un total de 17 caballos MM. Solamente 2 es decir el
11.7% presentó una motilidad total superior al 40% con el uso del glicerol, cuando
se uso Dimetil-formamida 11 reproductores ósea el 64% presentaron buena
motilidad después de la congelación.
Una significativa mejora en la motilidad después de la descongelación fué
observada en todas las razas con el uso del Dimetil-formamida, también un
aumento en el número de caballos con semen con buen patrón de
descongelación, fue observado en el grupo congelado con Dimetil-formamida;
64% contra 84% y 75% de los caballos de la raza MM, Hipismo y Cuarto de Milla
respectivamente presentaron motilidad total después de descongelación superior
al 40% contra el 11, 35 y 50% de los caballos para la misma raza cuando eran
congelados con glicerol.
Pocos son los trabajos que envuelven test de fertilidad con el uso del Dimetil-
formamida, un trabajo resiente, fué el reportado por Vidament et al, en el 2002 y
un grupo de investigadores franceses, que compararon la fertilidad entre el glicerol
y el dimetil-formamida; en este trabajo se utilizaron 4 caballos, con buena actitud
para congelamiento, estos autores relataron que habían sido similares los
resultados de fertilidad cuando comparaban el glicerol y el Dimetil-formamida.
31
Al inseminar un total de 48 ciclos con semen congelado en glicerol, donde 24
ciclos con el mismo semen fueron congelados en Dimetil-formamida obtuvieron 52
y 50% de preñez respectivamente. Por otro lado Medeiros et al en el 2002 cuando
trabajó con semen congelado de un caballo con baja calidad de semen después
de congelado con glicerol, observó mejoras significativas de la fertilidad cuando
utilizó dimetil-formamida, en este trabajo fueron inseminadas 30 yeguas con
semen de un único caballo congelado con glicerol y con dimetil- formamida,
ninguna de las yeguas inseminadas con glicerol fue detectada en estado de
gestación, por otro lado 6 animales es decir el 40% de la inseminaciones con
Dimetil-formamida fueron detectadas gestaciones positivas en el 2002 fueron
relatados los nacimientos de los primeros potros oriundos de semen de caballos
congelados utilizando dimetil-formamida como crioprotector. Alvarenga et al en el
2002 y varios médicos veterinarios y centros de reproducción han usado en Brasil
rutinariamente a nivel comercial la dimetil-formamida en la criopreservación de
semen de caballos con relatos de campo de buena fertilidad, estudios están en
evolución, verificando las razones por las cuales los crioprotectores derivados de
las amidas protegen mejor los espermatozoides de equinos de las crio - injurias.
Además acreditan que el bajo peso molecular de este agente comparado con el
glicerol induce a un menor daño osmótico.56
1.7.2.2. Adición del diluyente de congelación
Una variedad de protocolos está disponible para la criopreservación de semen
equino, sin embargo no hay estudios comparativos controlados que indiquen cuál
es la técnica más eficiente. Actualmente es común el uso de 2 diluyentes en la
congelación de semen equino, uno para la dilución inicial y la centrifugación y otro
para la congelación.
56 Opcit. Alvarenga. M.A 2005.
32
Actualmente se emplean como crioprotectores la yema de huevo o la yema de
huevo y la leche desnatada, además del glicerol. La mayoría de los diluyentes de
congelación contienen una mezcla de sales minerales, azucares, EDTA, yema de
huevo y glicerol y son derivados de los desarrollados por Martín y col en 1979 a
partir de este diluyente, Cochran y col en 1984 emplearon un 2%, 4%, o 6% de
glicerol, encontrando que la motilidad post-descongelación fué superior empleando
la concentración del 4%. En otra serie de experimentos llevados a cabo por
Cristanelli y col en 1985, la inclusión en este diluyente de un 16% o un 20% de
yema de huevo y de un 3% o un 4% de glicerol fue superior al empleo de un 12%
de yema de huevo o un 2% de glicerol. 57
En la encuesta realizada por Samper y Morris en 1998, la mayoría de los
laboratorios emplean el diluyente lactosa – EDTA. El semen diluido con lactosa-
EDTA-yema de huevo no necesita ser refrigerado a 5°C antes de la congelación.
De esta forma, puede ser envasado a temperatura ambiente.58
Los diluyentes de congelación incluyen también, el Diluyente Lactosa- EDTA –
Yema de huevo, Leche-Yema-Colorado (CO), Tris-Citrato- Yema y SM – EY.59
El diluyente empleado en los países del Este, utiliza también la yema de huevo
como crioprotector, otros diluyentes contienen una proporción de yema de huevo
inferior al 5%, y en algunos casos parte de la lactosa ha sido sustituía por manitol.
Otros diluyentes emplean una mezcla de yema de huevo y leche desnatada. En
China se ha utilizado un diluyente que consiste en una solución de sacarosa
enriquecida con yema de huevo y leche desnatada con un 5% de glicerol Burns y
57 Burns, P.J.; Reasener, D.S. Computerized analysis of sperm motion: effects of glycerol concentration on the cryopreservation of equine spermatozoa. Journal Equine Veterinary Science, 1995, p. 377-380. 58Tischner, M. Evaluation of deep-frozen semen in stallions. Journal Reproduction and Fertility.1979, p.53-59 59 Samper, J.C.; Morris, C.A. Current methods for stallion semen cryopreservation. En: Theriogenology (1998), p. 895-903
33
Reasner en 1995 emplean un diluyente semejante rico en glucosa y sacarosa,
leche desnatada y yema de huevo. En Francia se emplea un diluyente compuesto
de azucares, sales minerales, leche desnatada y yema de huevo, al que se le
añade un 2.5% de glicerol. Este diluyente ha sido ligeramente modificado por
Heitland y col, mediante la adición de un tampón (HEPES), un 4% de yema de
huevo y un 4% de glicerol (SM – EY).60
Los Diluyentes a base de leche descremada y yema de huevo empleados con
mayor frecuencia para la congelación de semen equino incluyen el diluyente
Palmer, SM – EY, y Burns61
1.7.2.3 Congelación y Almacenamiento
El semen puede ser congelado sobre vapores de nitrógeno o mediante un
congelador programable. Cochran y col en 1984 y Cristanelli y col en 1985
compararon el efecto de la congelación del semen a ritmo rápido (sobre vapores
de nitrógeno líquido, aproximadamente -60°C minuto) o moderado (mediante un
congelador programable a -10 grados / minuto hasta alcanzar -10°C y – 25°C /minuto hasta -120°C). No encontraron diferencias en la motilidad post-
descongelación. Heitland y col en 1996 tampoco encontraron diferencias en la
motilidad post-descongelación del semen congelado a diferentes velocidades
(distancia sobre la superficie del nitrógeno líquido). El semen de caballo
generalmente es congelado y descongelado a ritmos altos, la mayoría de los
laboratorios que emplean congeladores programables utilizan ritmos de
enfriamiento de – 10°C /minuto entre 20°C y -15°C que son aumentados a -25°C/
minuto o -60°C / minuto entre -15°C y -120°C. 62 60 Op cit. Tischner, M. 1979,p. 53-59 61 Burns, P.J.; Reasener, D.S. Computerized analysis of sperm motion. effects of glycerol concentration on the cryopreservation of equine spermatozoa. Journal Equine Veterinary Science, 1995, p. 377-380 62 Cristanelli, M.J.; Squires, E.L.; Amann, R.P.; Pickett, B.W.Fertility of stallion semen processed, frozen and thawed by a new procedure. Theriogenology Vol. 22, no 1 (1984) , p.39-45.
34
Para la congelación con vapor de nitrógeno, las pajuelas deberán estar dispuestas
horizontalmente en un soporte de malla metálica 1 a 4 cm por encima de la
interfase líquido: gas. La distancia del nitrógeno líquido y el tiempo de
permanencia en el vapor determinan la velocidad de enfriamiento y la temperatura
final. Semen congelado en pajuelas de 0,5 ml debe ser mantenido 4 cm sobre el
nitrógeno líquido durante 10min y antes de ser transferido al nitrógeno líquido. La
desventaja de este método es que el control de la curva de congelación no es muy
preciso. A pesar de ello, Cochran y col. en 1985 no observaron diferencias en la
motilidad después de la congelación/descongelación con este método y en una
congeladora programable.63
Al menos una pajuela de cada partida de semen congelado debe ser
descongelada para evaluar su calidad. Por reportes de Wilhelm y col en 1996 se
dice que el porcentaje de espermatozoides mótiles después de la descongelación
está correlacionado con la fertilidad del padrillo, entonces Cristanelli y col en 1984
y Leipold y col. en 1998 sugieren que el semen, para ser usado en lA, debe tener
una motilidad post descongelación superior a 30% o 35% lo que también afirman
posteriormente Klug y col. en 1977; y Vidament y col en 1999. Cuando la muestra
descongelada no alcanza este valor, toda la partida de semen debe ser
descartada. El tiempo de almacenamiento en nitrógeno líquido no parece afectar
a la motilidad post-descongelación del semen y varios autores han señalado el
nacimiento de potros empleando semen congelado durante varios meses o años.64
1.7.2.4. Descongelación del semen El sistema y velocidad de descongelación del semen dependen de la velocidad de
congelación y el sistema de empaquetado empleado. El semen envasado en
63 Samper, J.C.; Morris, C.A. Current methods for stallion semen cryopreservation. Theriogenology. 1998, p. 895-903. 64 Op cit.Heitland , A.V.; Jascko, D.J.; Graham, J.K.; Squires, E.L.; Amann, R.P.; Pickett, B.W. 1996, p. 47-53.
35
macropajuelas de 5 o 2.5 ml es descongelado mediante inmersión en agua a 50
°C durante 45 segundos. El semen envasado en pajuelas de 0.5ml es
descongelado mediante inmersión en un baño maría a 37°C durante 30 segundos
o a 75°C durante 7 segundos. Cochran y col en 1984 compararon estas dos
técnicas y obtuvieron un aumento de 4 al 5 % en la motilidad del semen
descongelado mediante inmersión a 75 °C durante 7 segundos. Borg y col en
1997 compararon la motilidad, morfología e integridad de al membrana plasmática
del semen descongelado mediante estos dos métodos y no encontraron
diferencias en estos parámetros, excepto en el porcentaje de espermatozoides
vivos determinado mediante azul de anilina, que fué superior tras descongelar a
37°C. La tasa de preñez con semen congelado es más baja que la obtenida con
semen fresco o refrigerado. Cristanelli y col en 1984 comprobaron que la tasa de
preñez son semen congelado fue 86% de la correspondiente a la obtenida con
semen fresco diluido. 65
1.8. FERTILIDAD DEL SEMEN CONGELADO
La fertilidad obtenida mediante el uso de semen descongelado es inferior a la
obtenida en monta natural o con semen fresco. Los índices de fertilidad por celo
obtenidos con semen congelado varían entre el 17 y el 37% según diversos
autores. Cuando se analizan los resultados de fertilidad con semen congelado en
condiciones de campo y en un gran número de yeguas los índices de gestación
por celo se sitúan alrededor del 30%, y el índice de gestaciones por temporada
alrededor del 70%, tan solo un 15% inferior a la obtenida con semen fresco,
aunque las yeguas deban ser inseminadas con un número mayor de ciclos los
resultados de fertilidad obtenidos con semen congelado dependen de un gran
número de factores, el primero de todo el propio semental. A pesar de la selección
de los eyaculados la fertilidad de los distintos sementales es muy variable y esta 65 Op cit. Palma A. G. 2001, p. 551-554
36
fertilidad no parece tener correlación con la fertilidad obtenida con semen fresco
de los mismos sementales. La fertilidad del semen congelado también puede
depender, como ya se ha indicado, de los diluyentes y el sistema de procesado del
semen. El aumento del número de espermatozoides por dosis de inseminación, al
igual que ocurre en la inseminación con semen fresco o refrigerado, va a provocar
un aumento en la fertilidad. 66
Pace y Sullivan en 1975 observaron una mejora en la fertilidad cuando la dosis de
inseminación aumentó de 40 a 80 millones de espermatozoides con motilidad
progresiva post-descongelación, pero no cuando se ascendió hasta 160 millones,
sin embargo Volkman y Van Zyl en 1987 observaron una mejora de la fertilidad
del 44% al 73% cuando la dosis de inseminación fue aumentada de 175 a 294
millones de espermatozoides con motilidad progresiva post-descongelación, e
igualmente Vidament y col en 1997 obtuvieron mejores índices de fertilidad
empleando 300 millones de espermatozoides por dosis frente a 150 millones. De
los estudios anteriores se deduce que el número crítico de espermatozoides
necesarios para obtener la máxima fertilidad se sitúa por encima de 100 millones
de espermatozoides con motilidad progresiva y por debajo de 300. Se ha
recomendado el empleo de de 250 millones de espermatozoides con motilidad
progresiva por dosis.67
66 Samper, J.C.; Hellander, J.C.; Grabo, B.G. Relationship between the fertility of fresh and frozen stallion semen and semen quality. Journal Reproduction and fertility. 1991, p. 107- 114 67 Graham, J.K. Analysis of stallion semen and its relation to fertility. Veterinary Clinics of North America. Equine practice 1996, p. 119-130
37
2. MATERIALES Y MÉTODOS MARCO GEOGRÁFICO El presente estudio se realizó en el Hara de Mancilla propiedad de la Policía
Nacional de Colombia localizada en el municipio de Facatativá perteneciente al
Departamento de Cundinamarca en el Km 3 via la Vega. El criadero tiene una
altitud de 1.690 metros sobre el nivel del mar con temperatura promedio de 12°C,
precipitación anual de 840 mm y humedad relativa del 80%. El criadero cuenta con
una extensión de 24 hectáreas y el número total de animales es de 243; de los
cuales 160 son hembras y 83 son machos. Los sementales que hacen parte del
programa de reproducción animal consumen 4 comidas diarias compuestas por
concentrado, pasto y agua a voluntad; la primera comida es a las 6:00 am, la
segunda es a las 9:00 am, la tercera es a las 11:00 am y la cuarta es a las 2:00
pm. Los animales se encuentran alojados en pesebreras menos el caballo Tártaro
el cual se encuentra en potrero.
2.1 MARCO DEMOGRÁFICO Se utilizaron 12 sementales entre los 6 y 16 años de edad, con un promedio de
condición corporal de 3.5 a 4; dentro de estos, se encuentran animales de raza
Silla Argentina,Pura Sangre Ingles, Silla Francesa, Mestizo Argentino, Olddenburg,
y Westfalen, provenientes del Hara de Mancilla, destinados en la actualidad al
programa de Reproducción e inseminación artificial. En este proyecto se tomaron
dos muestras de semen por caballo, donde una parte de la muestra, se diluyó con
LACTOSA-GLICEROL-YEMA DE HUEVO y la otra parte con INRA-
DFORMAMIDA-YEMA DE HUEVO. Posteriormente se procedió a envasar en dos
clases de pajilla 0.5 Y 0.25 para cada uno de los tratamientos. Los reproductores
fueron sometidos a colecta de semen dentro de las instalaciones del criadero
Mancilla.
38
2.3. COLECTA DEL SEMEN
La colecta se realizó con la vagina artificial modelo Hannover, la cual esta
compuesta de un tubo rígido, un tubo flexible o interno de goma, un vaso
recolector de plástico que incluye un prefiltro, 4 bandas de goma, una válvula y la
manija de cuero. El tubo flexible y el vaso recolector fueron esterilizados antes de
su uso. Posteriormente el espacio comprendido entre la pared interna del tubo
rígido y el tubo flexible se llenó, con 3 litros de agua a una temperatura de 50-
55°C. Dependiendo de la temperatura ambiente para alcanzar una temperatura
interna de 42 a 44°C. A continuación se llevó a cabo la lubricación de la vagina
artificial con gel KY de Jhonson & Jonson, el cual tiene la propiedad de no ser
espermicida, dicho lubricante se distribuyó en el interior de la vagina artificial
uniformemente. Concluido el montaje, se introdujo un termómetro en el interior de
la vagina para controlar la temperatura hasta el momento de la recolección.
Para la recolección del semen es necesario la presencia de una yegua en celo, en
este caso se hizo uso de las yeguas en celo, que el criadero destina para el
desarrollo del programa de inseminación artificial. Las yeguas fueron debidamente
aseguradas por medio de sueltas o trabones. Una vez que el equipamiento para
evaluación y manipulación del semen, (baño María, platina térmica, etc.) la yegua
en celo, la vagina artificial montada, están preparados, el reproductor fue
conducido al lugar de la recolección que en este caso es al aire libre; cuando el
semental salta, el operador con la vagina artificial se aproxima, tomando el pene y
desviándolo con la mano; para la desviación es importante dirigir la mano sobre le
pene y desviarlo ligeramente, sin fijarlo, porque se podrían interrumpir los reflejos
de la copula; además, la válvula de la vagina artificial es removida y se retira una
39
parte del agua, la válvula se vuelve a poner nuevamente y es mantenida abierta,
de esta forma se obtiene el eyaculado en el tubo colector. 68
2.4. EVALUACIÓN DEL SEMEN 2.4.1. Evaluación Macroscópica - Volumen del semen Inmediatamente después de la colecta se filtró el semen 2 veces, el volumen del
semen sin el gel se determinó a través de la lectura con probeta graduada,
después de la filtración.
- Aspecto y coloración del semen Después de la separación del gel el aspecto del semen fue evaluado, teniendo en
cuenta como base su coloración y consistencia. La coloración del semen varío de
gris ceniza a blanco y la consistencia varío de acuoso a lechoso.
El aspecto del semen da una idea de la concentración espermática. Cuanto más
blanco lechoso, mayor es su concentración. 69
- pH del semen Una vez evaluado el aspecto se procedió a realizar la medición de los valores de
pH. La medición en este caso se llevó a cabo con cintas indicadoras de pH, para
esto, se introdujo la cinta indicadora de pH, dentro del semen fresco hasta que la
cinta quedo completamente humedecida, posteriormente se comparo el color que
tomo la cinta, con los colores encontrados en la tabla que indican los valores de
pH. El pH se determinó inmediatamente después de la recolección por que el
reposo genera la formación de ácido láctico.70
68 Malmgren, L. Assessing the quality of raw semen: A review. En: Theriogenology. Vol. 48. (1997), p. 530-532 69 Palma, A. G. Biotecnología de la Reproducción, Balcarce, Argentina, 2001. p. 533. 70 Op cit. Palma A. G. 2001, p. 533.
40
2.4.2 Evaluación Microscópica - Motilidad En cuanto al examen microscópico de la muestra el primer parámetro que se
evaluó fue la motilidad, dicho parámetro se determinó inmediatamente después
de la recolección debido a que la demora disminuye la motilidad espermática.
La motilidad espermática progresiva fue estimada mediante el método visual,
subjetivo. Para la motilidad se colocaron 2 pequeñas gotas de semen puro
homogeneizado sobre una lámina portaobjetos limpia y precalentada en platina
térmica y cubierta con lámina cubreobjeto, la motilidad se determinó con un
aumento de 200X, observando varios campos de cada gota, y se expresó el
resultado en porcentaje; utilizando como referencia los valores expresados
continuación: 71
Examen Microscópico de la muestra: (Método visual subjetivo) Motilidad Progresiva (%):
Muy bueno 80-100%
Bueno 60-79%
Regular 40-59%
Malo<40%
71 Opcit. Palma A. G. 2001, p.543- 534
41
- Concentración
La concentración de la muestra, se determinó mediante la cámara de Neubauer;
para lo cual se diluyó el semen puro, en solución de formol citrato en proporción
de 1:20 (Ver anexo1). La cámara de Neubauer se montó deslizando la lámina con
presión sobre los bordes humedecidos hasta que se forman los anillos de Newton.
La cámara posee 2 hemicámaras, conteniendo cada una de ellas 16 cuadraros
menores. Con una pipeta Pasteur se tomó una alícuota de semen diluido y
homogeneizado y se transfirió a cada hemicámara por medio de capilaridad entre
el piso de la cámara y la lámina que la cubre. Después de 5 minutos, necesarios
para la sedimentación de las células espermáticas, el cálculo se realizó utilizando
la siguiente formula: 72
C= Nº total de espermatozoides contados h(altura)=1/10
___________________________________ Donde: d (dilución)=1/20
h.d.a. a (altura)=1/25mm2
- Porcentaje de vivos y muertos y morfología
Se utilizó una coloración supravital realizada con eosina nigrosina lo que evaluó de
forma mas objetiva las células viables y así de esta forma determinando la
integridad de la membrana plasmática, puesto que cuando las células sufren una
lesión de la membrana, absorben el colorante. La coloración se llevó a cabo
depositando en una extremidad del portaobjetos precalentado, una gota de semen
y 2 gotas de colorante, con ayuda del cubreobjetos, la gota de semen se mezcló
con las gotas de colorante y se realizó el extendido, el cual fué secado durante 10
minutos sobre la platina térmica. Los espermatozoides coloreados y sin colorearse
fueron contados con un aumento de 100x y aceite de inmersión hasta un total de
72 Opcit. Palma A. G. 2001, p. 534
42
100 células el resultado fué expresado en porcentaje. Los espermatozoides no
coloreados representan a las células viables y los coloreados a las células
muertas. Para la determinación de las morfoanomalías se utilizó esta misma
tinción de eosina nigrosina y se evaluó en el microscopio con un aumento de 100x
y con aceite de inmersión, estas morfoanomalías no deben superar el 30%.73
Para esto se tuvo en cuenta los parámetros de la siguiente tabla:
Tabla 6. Morfología Espermática (Eosina Nigrosina)
Mayores Anormalidades de Cabeza
Gota citoplasmática Proximal
Anormalidades de Pieza intermedia
Menores Cabeza Suelta
Gota citoplasmática distal
Anormalidades del flagelo
2.5 CENTRIFUGACIÓN Terminada la evaluación espermática se procedió a diluir el semen en extender de
centrifugación (Glucosa-EDTA), (Ver anexo 2) en la proporción de 1:1. Para la
elaboración de dicho diluyente se utilizó vidriería estéril, en frasco tapa azul, se
adicionó glucosa, EDTA, Bicarbonato sódico, Citrato sódico, Penicilina G y
estreptomicina, completando el volumen con agua destilada, luego se ajustó el pH
y la osmolaridad. Posteriormente se sometió a centrifugación de 2.500 rpm
durante 10 min.
73 Op cit. Amann, R.P.; Pickett, B.W. 1987,p. 150-151
43
2.6 ADICIÓN DE DILUYENTES DE CONGELACIÓN
Terminada la centrifugación se procedió a eliminar el sobrenadante dejando solo
la perla que contenía los espermatozoides, esta perla fué resuspendida en 1ml de
diluyente de congelación Lactosa-Glicerol-Yema de huevo glicerol ò INRA-D-
formamida-Yema de huevo. (Ver anexo 3). Para la preparación del diluyente
Lactosa-EDTA-Yema de huevo, se utilizó un frasco estéril tapa azul, donde se
adicionó la solución de lactosa al 11%, luego se procedió a agregar Glucosa –
EDTA proveniente del diluyente de centrifugación ya preparado. Se adicionó la
yema de huevo libre de clara, se calculó y adicionó el glicerol y el Equex. Todo
este procedimiento se realizó a 35°C, en baño de Maria tanto para la preparación
del diluyente de centrifugación como para los diluyentes de congelación.
Para la preparación del diluyente INRA-D-formamida-Yema de huevo, se tomó un
frasco tapa azul estéril, se adicionó glucosa, lactosa, rafinosa, el citrato sódico, el
citrato potásico, y el hepes en las cantidades descritas, luego se adicionó la
Dimetil formamida, la yema de huevo y los antibióticos y se mezcló en agitador
magnético suavemente. Esta mezcla se realizó a 35°C.
Teniendo preparados los diluyentes de congelación, se añadió el resto de
diluyente de acuerdo al cálculo de la concentración producto de aplicar la siguiente
formula:
Volumen (ml) x concentración (106) x Motilidad (%)
____________________________________________
Concentración deseada de la pajilla x 100 x106
44
A continuación se procedió a llenar y sellar las pajillas, este procedimiento se llevó
a cabo por medio de un peine de aspiración; técnica manual, se selló con polivinil
y se marcó debidamente cada pajilla con nombre del criadero, nombre del caballo
y número de registro. Teniendo en cuenta dosis de 200 millones de
espermatozoides por pajilla; envasada en pajillas de 0.5 y 0.25 respectivamente.74
2.7. CONGELACIÓN
El semen se encuentra a una temperatura de 35°C, mientras se realiza el proceso
de mezcla con el diluyente de centrifugación, y se centrifuga, esta temperatura
disminuye a 30°C, luego se procede a adicionar el diluyente de congelación donde
la temperatura disminuye a 25°C, a continuación se procedió a disminuir
suavemente la temperatura de 25°C donde se encontraba, a una temperatura de
5°C, colocando las pajillas en una nevera calibrada a 5°C, durante 1 hora, con el
fin de que la disminución de la temperatura fuera lenta de –0.2° C/min. Luego el
total de pajillas calculadas se llevó a vapores de nitrógeno líquido, colocándolas a
4cm de la superficie del nitrógeno durante 20 min. a una temperatura de -60°C;
después se sumergieron inmediatamente en nitrógeno líquido a una temperatura
de -196°C por un tiempo de 5 minutos, después de transcurrido este tiempo se
procedió a descongelar la pajilla índice, esta descongelación se llevó a cabo en
baño de Maria a 38° C durante 30 segundos, para comprobar su calidad, se
evaluó la motilidad progresiva, así como también el porcentaje de vivos y muertos,
la morfología y viabilidad del semen que se congeló. Las demás pajillas
congeladas se pasan lo más rápido posible a termo de congelación. (Ver anexo 4).
74 Op cit. Palma A. G. 2001, p.552
45
3. ANÁLISIS ESTADÍSTICO El modelo estadístico que realizaremos es, el análisis de varianza que es un
método para comparar dos o más medias. Esta prueba se realiza para comparar
dos poblaciones y determinar si una es más variable que la otra en alguna medida
específica. En el ANAVA se formulan dos hipótesis; La hipótesis nula, es que las
dos poblaciones tienen la misma varianza, es decir que en promedio las
poblaciones se comportan igual y la hipótesis alternativa o alterna es que una
población tiene mayor varianza que la otra, es decir que en promedio las
poblaciones se comportan diferente. Para esta prueba se obtienen muestras
aleatorias de cada población y se calculan las varianzas muestrales. En este caso
tendremos 2 factores de tratamiento. Factor A con dos niveles, lactosa-EDTA-
yema de huevo y el otro es INRA- D formamida- yema de huevo. El factor B es el
tipo de pajilla de 0.5 y 0.25. Modelo: Completamente al azar con arreglo factorial 2
x 2 ( ) ijkjkkjijkY ετλλτµ ++++=
Donde:
: Respuesta, porcentaje de motilidad, porcentaje de vivos y muertos, y
porcentaje de morfoanomalias.
ijkY
µ : Media general del modelo
jτ : Efecto del diluyente
kλ : Efecto de la pajilla
( ) jkτλ : Efecto de la interacción
ijkε : Error experimental
46
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1. CARÁCTERISTICAS DEL SEMEN PRE Y POST CONGELACIÓN CON LOS DILUYENTES LACTOSA - GLICEROL - YEMA DE HUEVO E INRA D- FORMAMIDA YEMA DE HUEVO
Como primer parámetro comparativo a tener en cuenta para la congelación se
tomaron los indicadores macroscópicos de calidad de semen, motilidad volumen,
pH y aspecto los cuales se encontraron bajo parámetros normales. Durante el
estudio se realizó también un análisis de la calidad del semen pre y post
congelación, obteniendo los siguientes resultados: - Motilidad progresiva
La motilidad individual progresiva precongelación de los equinos del estudio fué
69.167% ± 11.39% (Tabla.7) la cual es buena aunque esta por debajo de los
parámetros para congelación, debido a que algunos de los ejemplares utilizados
presentaron problemas de acostumbramiento a la colecta con vagina artificial,
además de alteraciones en el manejo.
En la gráfica 1 puede observarse que con el diluyente INRA – Dimetil-formamida-
Yema de huevo tiene un porcentaje de motilidad que corresponde al 57.479% ±
5.4499% (Tabla 7). El cual es superior al diluyente Lactosa- Glicerol- Yema de
huevo que presentó una motilidad del 50.208% ± 8.1187 %; esta disminución de
la motilidad del 7.27 % es altísimamente significativa (p<0.001) (ver anexo 6).
47
Tabla. 7 Porcentaje de Motilidad de semen equino pre y post-congelación.
Item Media S n
Precongelación
INRA-Dformamida- Yema de Huevo.
Lactosa-Glicerol-Yema
de huevo
69.167 a
57.479 b
50.208 c
11.389
5.4499
8.1187
24
48
48 S= Desviación estándar n Letras con superíndice diferente indica diferencia altisimamente significativa (p< 0.001)
= tamaño de la muestra
Gráfica. 1. Porcentaje de Motilidad Espermática de semen equino pre y post-congelación.
69,16
50,20857,47
01020304050607080
Preconge Glicerol Amida
%
En el estudio se obtuvo mejor porcentaje de motilidad para el tratamiento INRA-D-
formamida yema de huevo, lo que indica que el uso de este diluyente en la
congelación de semen equino puede presentar resultados superiores en cuanto a
calidad y viabilidad del semen, que el diluyente Lactosa- Glicerol- yema de huevo,
lo cual concuerda con los trabajos de Alvarenga et al en 2005 al estudiar 4
crioprotectores (glicerol, etilenglicol, Dimetilformamida y DMSO) demostró que el
crioprotector Dimetil-formamida fue superior a los otros estudiados en cuanto al
parámetro motilidad total en el momento inmediato a la descongelación.
48
Recientemente, trabajó con un gran número de reproductores donde fueron
comparados el glicerol y la Dimetil-formamida observó también que en la Dimetil-
formamida fue superior la motilidad después de descongelado 75
Heitland y col en 1976 observaron una disminución acentuada de la motilidad del
semen de caballos en medios de dilución que contenía glicerol por un periodo de 2
horas. 76 Sin embargo Vidament et al, en el 2002 comparó la motilidad entre el
glicerol y la Dimetil-formamida; obteniendo resultados similares de motilidad que
no fueron estadísticamente significativos.77
A pesar de que existe muy poca información acerca de la molécula Dimetil-
formamida dentro de la congelación como agente crioprotector para
espermatozoides en la especie equina, existe una gran cantidad de datos
relacionados con el uso de este compuesto en el congelamiento de semen de
otras especies arrojando resultados superiores y de mejor calidad para la
congelación de semen.
Los compuestos derivados de amidas presentan una mayor protección celular
debido a que son compuestos orgánicos con puntos de ebullición elevados,
presentan excelentes propiedades disolventes y son bases muy débiles, además
son compuestos polares y pueden unirse entre si mediante enlaces por puentes
de hidrógeno; esta propiedad las hace capaz de formar en distintas condiciones el
catión o el anión de una sal, constituyéndola en un molécula de tipo anfótero.78
75 Alvarenga M.A. Novos Conceitos relacionados a congelacăo de sĕmen de garanhŏes. M.A. Alvarenga, Departamento de Reproducăo Animal e Radiología Veterinaria. Facultad de Medicina Veterinaria e Zootecnia-UNESP. Campus de Botucatu-SP-Brasil. (2005). 76 Heitland , A.V.; Jascko, D.J.; Graham, J.K.; Squires, E.L.; Amann, R.P.; Pickett, B.W. Mortility and fertility of stallion spermatozoa cooled and frozen in a modified skim milk extender containing egg yolk and liposome. Biology of reproduction. ( 1976) .p. 753-759. 77 Vidament, M.; Dupere, A.M.; Julienne, P.; Evain, A.; Noue, P.; Palmer, E.. Equine frozen semen: Freezeability and fertility field results. Theriogenology 48 : (2002) p. 907-918. 78Op cit.. Alvarenga M.A. 2005.
49
Además el bajo peso molecular de este agente comparado con el glicerol induce a
un menor daño osmótico; como lo afirma Varner y col en 1987 las características
fisicoquímicas ideales que un agente crioprotector debe cumplir son: bajo peso
molecular, alta solubilidad en medios acuosos, y principalmente baja toxicidad
celular.79
- Espermatozoides Vivos
En la tabla 8 se observa el porcentaje de espermatozoides vivos antes de la
congelación, el cual fue 84.500% ± 3.6116%; que muestra un alto porcentaje de
espermatozoides vivos y el semen es congelable. El porcentaje de
espermatozoides vivos para el tratamiento INRA – Dimetil-formamida- Yema de
huevo fue de 65.188% ± 5.5874% (Tabla 8, gráfica 2); para el diluyente Lactosa-
Glicerol- Yema de huevo que presentó 63.625% ± 6.1735% de espermatozoides
vivos; esta disminución del 1.56 % es significativa (p<0.05) (ver anexo 6).
Tabla. 8 Espermatozoides vivos en semen equino pre y post-congelación.
Item Media S n
Precongelación INRA-Dformamida- Yema de Huevo.
Lactosa-Glicerol-Yema de huevo
84.500 a
65.188 b
63.625 c
3.6116
5.5874
6.1735
24
48
48
S= Desviación estándar n Letras con superíndice diferente indica diferencia significativa (p< 0.05)
= tamaño de la muestra
79 Varner, D.D. ; Blanchard , T.L. ; Love, C.L. ; Garcìa, M.C. ; Kenney, R.M..Effects of seminal fractionation and dilution ratio on equine spermatozoal motility parameters. (1987) p.709-723
50
El mayor número de espermatozoides vivos con el tratamiento INRA –Dimetil-
formamida – Yema de huevo indica una mejor calidad para la congelación de
semen equino. Por lo cual tiene una gran relación con lo que reportan autores
tales como Medeiros et al en el 2000 que observaron peor resistencia al proceso
de congelación en los caballos de raza Mangalarga Marchador cuando se uso el
glicerol como agente crioprotector, es así como, de un total de 17 caballos
solamente 2 es decir, el 11.7% presentó un porcentaje de espermatozoides vivos
superior al 40% con el uso del glicerol, pero cuando se usó Dimetil-formamida 11
reproductores, el 64%, presentaron buena viabilidad y un porcentaje superior al
40% de espermatozoides vivos postcongelación.80
En 1949 investigadores británicos Polge, Smith y Parkes informaron que los
espermatozoides pueden ser protegidos de los riesgos de la congelación
adicionándoles glicerol, el cual al agregarse a los diluyentes permite sobrevivir a
los espermatozoides a temperaturas extremadamente bajas (-196ºC). Estos
autores demostraron la acción protectora de la glicerina la cual básicamente
modifica el tipo de cristales que se forman durante la congelación y reducen y en
algunos casos impiden la lesión de las células lo cual permite una supervivencia
mediante el proceso lento de enfriamiento y congelación. El glicerol aumenta la
osmolalidad del medio externo favoreciendo la deshidratación celular, aumenta el
porcentaje de agua sin congelar a bajas temperaturas, disminuye la concentración
de sales en el medio externo y aumenta el tamaño de los canales de agua
descongelada. Además de sus efectos osmóticos, existen evidencias de que el
glicerol actúa directamente sobre los componentes de la membrana disminuyendo
su fluidez, formando uniones entre las proteínas e induciendo un aumento de las
necesidades energéticas.81
80 Op cit.. Alvarenga M.A. 2005. 81 Pineda. D. S., Biotecnología de la Reproducción en Animales Domésticos., Universidad de Nariño, Programa de Medicina Veterinaria. Pasto- Nariño. (2002). p. 88-92.
51
Lovelock & Polge 1954 mencionan que los mecanismos de acción del glicerol esta
dado por sus propiedades de unión; depresión del punto de congelamiento y la
consecuente disminución de la concentración de electrolitos de la fracción no
congelada de la solución; protegiendo las células espermáticas de los efectos
nocivos de la solución supersaturada durante el proceso de congelamiento, lo cual
puede explicar los porcentajes más bajos pero no significativos con respecto a la
supervivencia de la Dimetil - formamida con respecto al glicerol, es así, como las
amidas presentan 3 sitios de unión del hidrógeno con la molécula de agua la mitad
en comparación con el glicerol, entre tanto por poseer menos viscosidad y
solubilidad al agua en contraposición al glicerol, permite mayor permeabilidad de
la membrana disminuyendo la posibilidad de daño celular por estrés osmótico
causado por los crioprotectores.82
No solo el diluyente influye en el número de espermatozoides vivos; Blach y col en
1989 estudiaron la viabilidad de los espermatozoides en las distintas fases de la
congelación, tras la centrifugación y redilución del semen, observando que se
producía una disminución del 15% en el porcentaje de espermatozoides vivos, con
estas prácticas. Además, Parlevliet y Colenbrander en 1999 afirman que el
porcentaje de espermatozoides vivos y morfológicamente normales es el
parámetro que mejor indica la fertilidad de un semental. En el estudio realizado la
centrifugación y la dilución del semen no produjo impacto sobre la viabilidad
espermática.83
82 Op cit.. Pineda D.S., 2002. 83 Nishikawa, Y. Studies on the preservation of raw and frozen equine semen. En: Journal Reproduction Fertility, Vol.23 (2000) .p.99-104.
52
Gráfica. 2 Espermatozoides vivos de semen equino pre y post-congelación.
84,5
63,62 65,18
0
20
40
60
80
100
Preconge Glicerol Amida%
- Espermatozoides Muertos
En la tabla 9 el porcentaje de espermatozoides muertos antes de la congelación
fue 15.500 % ± 3.6116%. Esto representa los espermatozoides que normalmente
pueden morir durante el proceso de colecta y manipulación del semen. En la
gráfica 3 se observa el porcentaje de espermatozoides muertos para el tratamiento
INRA – Dimetil-formamida- Yema de huevo fue de 34.813% ± 5.5874 % (Tabla 9).
El diluyente Lactosa- Glicerol - Yema de huevo presento 36.375% ± 6.1735% de
espermatozoides muertos; este aumento en el número de espermatozoides
muertos, del 1.56 % fué significativa (p<0.05) (ver anexo 6).
Tabla. 9 Espermatozoides muertos de semen equino pre y post-congelación.
Item Media S n
Precongelación INRA-Dformamida- Yema de Huevo.
Lactosa-Glicerol-Yema de huevo
15.500 a
34.813 b
36.375 c
3.6116
5.5874
6.1735
24
48
48
S= Desviación estándar n = tamaño de la muestra Letras con superíndice diferente indica diferencia significativa (p< 0.05)
53
Gráfica 3. Espermatozoides muertos de semen equino pre y post-congelación.
15,5
36,37 34,81
05
10152025303540
Preconge Glicerol Amida%
Debido a esto se puede concluir que para el diluyente lactosa EDTA yema de
huevo que es el que contiene glicerol, este porcentaje es mayor que para el
diluyente INRA-Dimetil- formamida-yema de huevo. Resultados que tienen
congruencia, con los reportes realizados por Heitland y col en 1996 donde
observaron que el glicerol induce a daños en los espermatozoides; los efectos
tóxicos del glicerol pueden ser de naturaleza osmótica o pueden ser resultado de
daños bioquímicos que ocurren en la secuencia de interacciones entre el
crioprotector y los componentes del espermatozoide, concluyendo que lo anterior
es una de las principales causas de la baja viabilidad y mortalidad del semen
después de la descongelación. 84
Por otro lado Vidament y col en 2002 afirman que aun no se conoce por completo
la naturaleza exacta de las lesiones debidas al proceso de congelación y
descongelación; mencionaron que el perjuicio se debe a la diferencia de presión
de vapor entre el hielo y el agua a temperaturas inferiores a los 0ºC, también se
sabe que están implicadas las membranas celulares las cuales sufren alteración y
formación de cristales de hielo intra y extracelulares, deshidratación celular y
aumento de concentración de solutos y que aún con los crioprotectores como la
glicerina no son protegidos en su totalidad ya que también en algunos casos se 84 Heitland , A.V.; Jascko, D.J.; Graham, J.K.; Squires, E.L.; Amann, R.P.; Pickett, B.W. Mortility and fertility of stallion spermatozoa cooled and frozen in a modified skim milk extender containing egg yolk and liposome. En: Biology of reproduction. P.: 753-759. 1995.
54
presenta perdida de lípidos de los espermatozoides durante la congelación debido
posiblemente, a la permeabilidad de la membrana, lo cual hace que aumente el
número de espermatozoides muertos. 85
- Espermatozoides Normales
La tabla 10 se especifica el porcentaje de espermatozoides normales
precongelación lo cual fue de 84.083% ± 6.8899%. Este porcentaje representa un
valor que se tiene en cuenta como parámetro aceptable para la cantidad de
espermatozoides normales presentes en una muestra que aspira a ser congelada.
La diferencia de 0.14 % entre los dos tratamientos no es significativa (p>0.05).
(Ver anexo 6) puesto que para el tratamiento INRA – Dimetil- formamida- Yema de
huevo el porcentaje de espermatozoides normales fue de 79.042% ± 7.6491%
(Tabla 10) y para el diluyente Lactosa- Glicerol- Yema de huevo fue de un
78.896% ± 8.4154 %. (Ver gráfica 4).
Tabla. 10 Espermatozoides normales de semen equino pre y post-congelación.
Item Media S n
Precongelación INRA-Dformamida- Yema de Huevo. Lactosa-Glicerol-Yema de huevo
84.083 a
79.042 b
78.896 b
6.8899
7.6491
8.4154
24
48
48
S= Desviación estándar n = tamaño de la muestra Letras con superíndice igual indica diferencia no significativa (p> 0.05) De lo anterior puede deducirse que los espermatozoides normales en el semen
congelado con los dos diluyentes presentan una diferencia que no es significativa,
lo cual muestra que los eyaculados pueden tener porcentajes similares de
85Op.cit Vidament, M.; Dupere, A.M.; Julienne, P.; Evain, A.; Noue, P.; Palmer, E.. 2002
55
viabilidad y fertilidad; Como lo corroboran Kenney y Col, 1983 donde encuentran
que el número de espermatozoides morfológicamente normales en el eyaculado
es el parámetro más importante para la clasificación de los sementales como
aptos, dudosos o no aptos en un examen de fertilidad según las normas de la
sociedad de Teriogenología. Claro que Dowsett y Pattie en 1982 no encontraron
correlación entre las características morfológicas y la fertilidad; mientras Braun y
col en 1994 observaron que los sementales de alta fertilidad presentaban menos
de un 20% de morfoanomalías totales.86
Gráfica 4. Espermatozoides normales de semen equino pre y post-congelación.
84,0470,09
79,04
0
20
40
60
80
100
Preconge Glicerol Amida
%
- Espermatozoides con Anormalidades
Al analizar el porcentaje de espermatozoides anormales se obtuvo un resultado de
15.917% ± 6.8899% precongelación. Es un resultado aceptable para una muestra
que requiere ser congelada, puede ser resultado de los diferentes inconvenientes
que se presentan durante la colecta. Para el diluyente INRA-Dimetil-formamida-
Yema de huevo el porcentaje corresponde a 20.958% ± 7.6491 y para el diluyente
Lactosa- Glicerol- Yema de huevo es de 20.979% ± 8.3856 (Ver tabla 11, ver
gráfica 5). Con lo que se puede afirmar que el porcentaje de espermatozoides
anormales es mayor para el tratamiento Lactosa- Glicerol -Yema de huevo en
86 Dowsett, K.F.; Pattie, W.A. (1982) :Characteristics and fertility of stallion semen. J. Reproduction Fertility. Suplemento 32, paginas 1-8.
56
comparación con el porcentaje obtenido con el diluyente INRA-Dimetil-formamida-
Yema de huevo. La diferencia de 0.021% no es significativa (p>0.05), (Ver anexo
6).
Tabla. 11 Espermatozoides anormales de semen equino pre y post-congelación.
Item Media S n
Precongelación INRA-Dformamida- Yema de Huevo.
Lactosa-Glicerol-Yema de huevo
15.917 a
20.958 b
20.979 b
6.8899
7.6491
8.3856
24
48
48
S= Desviación estándar n = tamaño de la muestra Letras con superíndice igual indica diferencia no significativa (p> 0.05)
Gráfica 5. Espermatozoides Anormales de semen equino pre y post-congelación.
15,91
20,97 20,95
0
5
10
15
20
25
Preconge Glicerol Amida
%
En este caso el porcentaje de espermatozoides anormales, puede deberse a
causas individuales de cada semental, o por factores externos a que afecten el
animal. Como lo reportan trabajos realizados por McDonnell y col en 1991 donde
demostraron que los espermatozoides pueden tener un grado de inmadurez
(morfoanomalías espermáticas) o la célula espermática puede sufrir un deterioro
en su estructura celular, bien sea por alteraciones del plasma seminal o
57
agresiones extrínsecas realizadas en la manipulación del laboratorio de
inseminación. 87
Así como también Merkt, y Klug, en 1975 demostraron que el medio ambiente
influye sobre la fertilidad del semen y varía este efecto de acuerdo con la acción
del factor nocivo (temperaturas altas o extremadamente bajas) produciendo un
aumento de las formas anormales de la cabeza, acrosoma, cuello y pieza
intermedia, gota citoplasmática proximal y cola enrollada. Por otra parte Parks y
col en 1992 demostraron la correlación entre los defectos espermáticos y la
fertilidad sin embargo dada la gran variedad de factores que afectan la fertilidad de
un semental pocos experimentos han sido lo suficientemente sensibles para
establecer los niveles de tolerancia de varios defectos espermáticos que serian
compatibles con la buena fertilidad; por lo tanto se acepta como mínimo un nivel
de tolerancia de 70% de espermatozoides normales.88
4.2. PORCENTAJE DE ANORMALIDADES EN LOS ESPERMATOZOIDES DE SEMEN EQUINO, PRECONGELACIÒN Y POSTCONGELACIÒN. - Anormalidades de Cabeza
Puede observarse en la tabla 12 que con el diluyente INRA – Dimetil-formamida-
Yema de huevo, se tiene un porcentaje de anormalidades de cabeza, que
corresponde a 3.0909 % ± 2.4271 %, con el diluyente Lactosa- Glicerol- Yema de
huevo el porcentaje corresponde al 3.8125% ± 1.9397%, por tanto aumentó el
porcentaje de espermatozoides con anormalidades de cabeza, con este último
diluyente en un 0.72 % lo que indica que la diferencia no es significativa (p>0.05)
87 McDonnell, S.M.; Love, C.C. Xilacine - induced ex copula ejaculation in stallions. En: Theriogenology. Vol. 36 ( 1991) p. 73-76. 88 Merkt, H.; Klug, E.; Krause, D.; Bader, H. Results of long-term storage of stallion semen frozen by the pellet method. En: Journal. Reproduction Fertility. (1975) Vol 23 p.105-106.
58
(Ver anexo 6). Dicho porcentaje en el semen precongelación, corresponde a
2.9333 % ± 1.3345%, valor aceptable para la fertilidad del semen (Ver gráfica 6).
Tabla. 12 Anormalidades de cabeza de espermatozoides en semen equino pre y post congelación.
Item Media S n Precongelación INRA-Dformamida-Yema de huevo. Lactosa-Glicerol-Yema de huevo
2.9333 a
3.0909 a
3.8125 a
1.3345
2.4271
1.9397
15
11
16 S= Desviación estándar n = tamaño de la muestra Letras con superíndice igual indica diferencia no significativa (p> 0.05)
Gráfica 6. Anormalidades de cabeza de espermatozoides en semen equino pre y post- congelación.
2,933,81
3,09
0
1
2
3
4
5
Preconge Glicerol Amida
%
En los últimos años autores como Pickett, et al en 1993, concluyen que el origen
de estas morfoanomalías es tipo mayor, es decir de origen testicular, sin embargo
no está bien aclaradas las causas que llevan a la formación de estas alteraciones
morfológicas. Por otra parte Watson en 1990 afirmó que existe una gran variación
de formas y tamaños entre los espermatozoides con macro y microcefalea aunque
esta es bastante común y generalmente se encuentran en proporciones muy
pequeñas. Aparentemente estos defectos son ocasionados por una distribución
desigual de los cromosomas durante la meiosis y generalmente la mayoría de
59
estas células mueren o son fagocitadas por las células de sertolli antes de llegar
al estadio de espermatide, razón por la cual no se encuentran en altos porcentajes
en el extendido del semen.89
- Gota Citoplasmática Proximal Los resultados obtenidos en la tabla 13 se muestra que el porcentaje de gota
citoplasmática proximal para el diluyente INRA – Dimetil -formamida- Yema de
huevo, corresponde a 5.6591% ± 2.7190% .Con el diluyente Lactosa- Glicerol-
Yema de huevo el porcentaje corresponde a 4.6500% ± 3.0344%; por tanto es
más bajo, el porcentaje de espermatozoides con presencia de gota citoplasmática
proximal, con este último diluyente en un 0.72 %; lo que no presenta una
diferencia significativa (p>0.05), este porcentaje precongelación, corresponde a
4.9286 % ± 1.8590%. Por tanto no presenta problemas para las muestras a ser
congeladas. (Ver gráfica 7, ver anexo 6).
Tabla. 13 Gota citoplasmática proximal de espermatozoides en semen equino pre y post
congelación.
Item Media S n Precongelación
INRA-
Dformamida-Yema de huevo.
Lactosa-Glicerol-Yema de huevo
4.9286 a
5.6591 a
4.6500 a
1.8590
2.7190
4.6500
14
44
40
S= Desviación estándar n = tamaño de la muestra Letras con superíndice igual indica diferencia no significativa (p> 0.05)
89 Pickett, B.W. Factors affecting sperm production and output. En: Equine reproduction. Ed. McKinon, (1993), Pennsylvania.
60
Gráfica 7. Gota citoplasmática proximal de espermatozoides en semen equino pre y post
congelación.
4,92 4,655,65
0123456
Preconge Glicerol Amida%
La presencia de gota citoplasmática proximal en los espermatozoides de los dos
tratamientos no mostró una similar a los estudios realizados por Jasko y col en
1990 reportan que casi todos los espermatozoides que se encuentran en la
cabeza del epidídimo tienen una gota citoplasmática en esta posición. Luego, a
medida que van descendieron hacia la cola del epidídimo se observa que el 90%
de los espermatozoides tienen una gota citoplasmática en la parte distal. Una alta
incidencia de gotas citoplasmáticas proximales se pueden ver en animales jóvenes
que no han atravesado completamente el periodo de pubertad, en animales
adultos las gotas proximales en el eyaculado son un signo de disturbio de la
función epididimal o testicular. 90
Heitland y col en 1995 observaron un aumento agudo del número de gotas
proximales 7 a 10 días después de un periodo de estrés en animales adultos,
indicando que se han afectado los espermatozoides que se encontraban
transitando por el epidídimo. No obstante en condiciones más graves, se puede
90 Jasko, D.J.; Lein, D.H.; Foote, R.H. A comparison of two computer automated semen analysis instruments for the evaluation of sperm motion characteristics in the stallion. En: Journal. Andrology. (1990), p 453.
61
afectar la espermatogenesis y causar un aumento de la incidencia de las gotas
proximales.91
- Anormalidades Pieza Intermedia
Los tratamientos no presentaron diferencias significativas (p>0.05), (Ver anexo 6);
en el número de anormalidades de pieza intermedia obtenidos pre y post-
congelación; puesto que el porcentaje para el tratamiento INRA– Dimetil-
formamida- Yema de huevo, corresponde a 2.5% ± 1.6984% y para el tratamiento
Lactosa- Glicerol- Yema de huevo el porcentaje corresponde a 3.4% ± 2.0656%
(Ver tabla 14); por tanto es mayor el porcentaje de espermatozoides con
anormalidades de pieza intermedia, con este último diluyente en un 0.9%. El
porcentaje de espermatozoides con anormalidades de pieza intermedia
precongelación, corresponde a 2.5714 % ± 0.7868% lo que no presenta problemas
en la viabilidad de las muestras. (Ver tabla 14, ver gráfica 8).
Tabla. 14 Anormalidades de pieza intermedia de espermatozoides en semen equino pre y post congelación.
Item Media S n Precongelación INRA-Dformamida-Yema de huevo. Lactosa-Glicerol-Yema de huevo
2.5714 a
2.5000 a
3.4000 a
0.7868
1.6984
2.0656
7
14
10
S= Desviación estándar n = tamaño de la muestra Letras con superíndice igual indica diferencia no significativa (p> 0.05)
91 Heitland , A.V.; Jascko, D.J.; Graham, J.K.; Squires, E.L.; Amann, R.P.; Pickett, B.W. Mortility and fertility of stallion spermatozoa cooled and frozen in a modified skim milk extender containing egg yolk and liposome. En: Biology of reproduction. (1995) .p.753-759.
62
Gráfica 8. Anormalidades de pieza intermedia de espermatozoides en semen equino pre y
post-congelación.
2,57
3,4
2,5
00,5
11,5
22,5
33,5
4
Preconge Glicerol Amida
%
No se obtuvo ninguna diferencia marcada entre los tratamientos, en cuanto a la
presencia de anormalidades de pieza intermedia; estudios realizados por
Hammerstedt en 1990 determinan que las anormalidades de pieza intermedia son
un defecto producido por la tinción pero puede haber algunos casos raros de
sementales con este defecto, cuando evaluamos la motilidad individual vemos una
gran cantidad de espermatozoides con movimientos en círculo. Estas
anormalidades de la pieza intermedia tiene forma de arco iris o de U.92
- Cabeza Suelta
Al analizar la presencia de cabezas sueltas se observó que con el diluyente INRA
– Dimetil-formamida- Yema de huevo, se tiene un porcentaje, de 3.0000 % ±
1.3257% y con el diluyente Lactosa- Glicerol- Yema de huevo el porcentaje
correspondía a 3.8065 % ± 2.4416% (Ver tabla 15); por tanto es mayor el
porcentaje de espermatozoides con cabeza suelta, en este último diluyente en un
0.80 %; lo que hace que la diferencia no sea significativa (p>0.05), (Ver anexo 6).
92 Hammerstedt, R.H.; Graham, J.K.; Nolan, J.P. Cryopreservation of mammalian sperm: What we ask them to survive. En: Journal of Andrology. Vol.11, no1 (1990), p. 73-88.
63
Dicho porcentaje para el eyaculado precongelación corresponde a 2.5556% ±
1.5092% valor que no tiene significancia en la evaluación del semen para la
congelación. (Ver tabla 15, ver gráfica 9).
Tabla. 15 Cabezas sueltas de espermatozoides en semen equino Pre y post congelación.
Item Media S n Precongelación
INRA-
Dformamida-Yema de huevo.
Lactosa-
Glicerol-Yema de huevo
2.5556 a
3.0000 a
3.8065 a
1.5092
1.3257
2.4416
9
34
31
S= Desviación estándar n = tamaño de la muestra Letras con superíndice igual indica diferencia no significativa (p> 0.05)
Gráfica 9. Cabezas sueltas de espermatozoides en semen equino pre y post-congelación.
2,55
3,8
3
00,5
11,5
22,5
33,5
4
Preconge Glicerol Amida
%
Para ninguno de los dos tratamientos, el porcentaje de cabezas sueltas representa
un valor significativo; estas morfoanomalías han sido estudiadas por Graham en
1994 donde afirmó que se pueden encontrar espermatozoides decapitados en
pequeño número en semen normal. Este defecto puede ser producido por
envejecimiento o por un defecto de implantación de la cola en la placa basal.
Cuando se encuentra en mayor cantidad están asociados con defectos en la
termorregulación del testículo y en estos casos es producido, aparentemente, por
64
un defecto en la espermiogenesis. Las cabezas sueltas y muchos
espermatozoides muertos se encuentran en animales con una acumulación del
semen en la cola del epidídimo, normalmente los espermatozoides envejecidos
son eliminados de la cola del epidídimo a través de un movimiento peristáltico
hacia la uretra, animales con defecto en este mecanismo de trasporte tienen un
gran acúmulo de estos espermatozoides e la cola del epidídimo.93
- Gota Citoplasmática Distal
En cuanto a la presencia de gota citoplasmática distal, con el diluyente INRA
Dimetil-formamida- Yema de huevo, se tiene un porcentaje, que corresponde a
5.1053% ± 2.9664% , por el contrario con el diluyente Lactosa- Glicerol- Yema de
huevo el porcentaje corresponde a 5.2683% ± 3.0743% (Ver tabla 16); por esta
razón el porcentaje de espermatozoides con gota citoplasmática distal aumenta,
con este ultimo diluyente en un 0.16%, es decir que la diferencia no es significativa
(p>0.05), (Ver anexo 6).
Para el semen precongelación el valor de de espermatozoides con gota
citoplasmática distal es de 4.8889% ± 2.5179% lo que tampoco representa un
valor significativo dentro de la evaluación seminal y no presenta problemas con la
viabilidad del espermatozoide. (Ver tabla 16, ver gráfica 10).
93 Graham, J.K. Effect of seminal plasma on the motility of epididymal and ejaculated spermatozoa of the ram and bull during the criopreservation process En: Theriogenology. Vol. 41 (1994), p. 1151-1152
65
Tabla. 16 Gota citoplasmática distal de espermatozoides en semen de equino pre y post congelación.
Item Media S n Precongelación
INRA-
Dformamida-Yema de huevo.
Lactosa-
Glicerol -Yema de huevo
4.8889 a
5.1053 a
5.2683 a
2.5179
2.9664
3.0743
18
38
41
S= Desviación estándar n = tamaño de la muestra Letras con superíndice igual indica diferencia no significativa (p> 0.05)
Gráfica 10. Gota Citoplasmática Distal de espermatozoides en semen equino pre y post
congelación.
4,88 5,26 5,1
0123456
Preconge Glicerol Amida
%
La presencia de gota citoplasmática distal no fue marcada para ninguno de los
dos tratamientos; trabajos como los de Brinsko y col en 1993 reportan, que entre
el 65 y el 95% de los espermatozoides almacenados en la cola del epidídimo
tienen la gota citoplasmática en esta posición. Esta gota es liberada cuando los
espermatozoides de mezclan con los fluidos seminales en la eyaculación. Existe
un factor hemolítico en las vesículas seminales que induce la liberación de la gota
distal. Aparentemente este defecto no afecta la fertilidad y por lo tanto, si los
66
espermatozoides son normales pero con gota distal, deben ser considerados
como normales. 94
- Anormalidades de Flagelo
En las tabla 17 se muestran los resultados obtenidos en el proceso de
congelación de las muestras seminales con los diluyentes INRA-Dimetil-
formamida-Yema de Huevo y Lactosa-Glicerol-Yema de huevo; 8.5217 % ±
3.6923%, 8.5217% ± 3.1037% respectivamente. Por tanto no hubo diferencia
significativa (p>0.05), (Ver anexo 6); entre estos dos diluyentes en cuanto a las
anormalidades de flagelo. En la muestra precongelación el valor obtenido
corresponde a 6.3636% ± 2.6645% valor no representativo en muestras que serán
congeladas. (Ver tabla 17, ver gráfica 11).
Tabla. 17 Anormalidades de flagelo de espermatozoides en semen equino pre y post congelación.
Item Media S n
Precongelación
INRA-Dformamida-Yema de huevo.
Lactosa-Glicerol-Yema de huevo
6.3636 a
8.5217 a
8.5217 a
2.6645
3.6923
3.1037
22
46
46 S= Desviación estándar n = tamaño de la muestra Letras con superíndice igual indica diferencia no significativa (p> 0.05)
94 Brinsko, S.P.; Varner, D.D .Artificial insemination. En: Equine Reproduction. Ed. McKinnon. (1993) Pennsylvania.
67
Gráfica 11. Anormalidades de Flagelo de espermatozoides en semen equino pre y post congelación.
6,36
8,52 8,52
02
46
810
Preconge Glicerol Amida%
No se obtuvo grandes diferencias entre los dos tratamientos para la presencia de
dicha morfoanomalía; referencias bibliográficas sobre las anormalidades de flagelo
como las investigaciones de Barth y col. en 1989 afirman que estas anormalidades
(colas abaxiales, accesorias y múltiples) están usualmente asociadas entre si, sin
embargo las colas abaxiales son más comunes. Se han visto animales que
producen hasta un 100% de colas abaxiales sin reducción de la fertilidad. La
presencia de cola accesoria es poco común, pero es aparentemente hereditaria,
estas colas están generalmente presentes junto con las colas abaxiales y las colas
dobles pero no se sabe a ciencia cierta si estos espermatozoides tienen reducida
su capacidad de fertilizar el ovulo. 95
4.3. CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LA EVALUACIÓN DE SEMEN DE EQUINO ENVASADO EN PAJILLAS DE 0.5 Y 0.25. - Motilidad progresiva
Los datos que presentamos a continuación no presentan diferencias significativas
(p>0.05). (Ver anexo 7) Puede observarse que en la pajilla de 0.5 se tiene un
porcentaje de motilidad progresiva que corresponde a 53.625 % ± 7.4022% (Ver
95 Barth, A.D.; Oko, R.J. Evaluation of the spermiogram. En: Abnormal Morphology of the Bovine spermatozoa. Ed. Barth, A.D y Oko, R.J. Iowa University press, Ames (1989)
68
tabla 18). Con la pajilla de 0.25 el porcentaje corresponde a 54.063% ± 8.2292%
(Ver tabla 18); por tanto hubo aumento del porcentaje de motilidad progresiva con
esta última pajilla en un 0.43%. (Ver gráfica12).
Tabla 18. Resultados de la evaluación de la motilidad de semen equino envasado en pajillas de 0.5 y 0.25
Item Media S n
Pajilla 0.5 ml
Pajilla 0.25 ml
53.625 a
54.063 a
7.4022
54.063
48
48
S= Desviación estándar n = tamaño de la muestra Letras con superíndice igual indica diferencia no significativa (p> 0.05)
Gráfica 12. Motilidad Progresiva de semen equino envasado en pajillas de 0.5 y 0.25
53,62 54,06
0102030405060
0,5 0,25
%
- Espermatozoides Vivos
El número de espermatozoides vivos presentes en la pajilla de 0.5 corresponde a 64.125% ± 6.3468%. En la pajilla de 0.25 el porcentaje corresponde a 64.688% ±
5.4895% (Ver tabla 19, ver gráfica 13); por tanto hubo aumento del porcentaje de
espermatozoides vivos con esta ultima pajilla en un 0.56% razón por la cual la
diferencia no es significativa (p >0.05); (Ver anexo 7).
69
Tabla 19. Evaluación de espermatozoides vivos de semen equino envasado en pajillas de 0.5 y 0.25
Item Media S n
Pajilla 0.5 ml
Pajilla 0.25 ml
64.125 a
64.688 a
6.3468
5.4895
48
48
S= Desviación estándar n = tamaño de la muestra Letras con superíndice igual indica diferencia no significativa (p> 0.05)
Gráfica 13. Espermatozoides vivos de semen equino envasados en pajillas de 0.5 y 0.25
64,68 64,12
010203040506070
0,25 0,5
Pajilla
%
- Espermatozoides Muertos
El número de espermatozoides muertos presentes en la pajilla de 0.5 corresponde
a 35.875% ± 6.3468% .En la pajilla de 0.25 el porcentaje corresponde a 35.313%
± 5.4895% (Ver tabla 20, ver gráfica 14); por tanto hubo aumento del porcentaje
de espermatozoides vivos con la pajilla de 0.5 en un 0.562% razón por la cual la
diferencia no es significativa (p>0.05), (Ver anexo 7).
70
Tabla 20. Espermatozoides muertos de semen equino envasado en pajilla de 0.5 y 0.25
Item Media S n Pajilla 0.5 ml Pajilla 0.25 ml
35.875 a
35.313 a
6.3468
5.4895
48
48
S= Desviación estándar n = tamaño de la muestra Letras con superíndice igual indica diferencia no significativa (p> 0.05)
Gráfica 14. Espermatozoides muertos en semen equino envasado en pajillas de 0.5 y 0.25
35,31 35,87
05
10152025303540
0,25 0,5
Pajilla
%
- Espermatozoides Normales En la tabla 21 puede observarse que en la pajilla de 0.5 se tiene un porcentaje de
espermatozoides normales del 78.979% ± 8.5614%, el porcentaje para eyaculados
envasados en pajilla de 0.25 corresponde a 78.958% ± 7.4860% es decir hubo
una disminución con esta ultima pajilla en un 0.021% lo que indica que no hubo
diferencia significativa (p>0.05); (Ver anexo 7); (Ver gráfica 15).
71
Tabla 21. Evaluación de espermatozoides normales de semen equino envasado en pajillas de 0.5 y 0.25
Item Media S n Pajilla 0.5 ml Pajilla 0.25 ml
78.979 a
78.958 a
8.5614
7.4860
48
48
S= Desviación estándar n = tamaño de la muestra Letras con superíndice igual indica diferencia no significativa (p> 0.05)
Gráfica 15. Espermatozoides Normales en semen de equino envasado en pajillas de 0.5 y
0.25
78,95 78,97
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0,25 0,5
Pajilla
%
- Espermatozoides Anormales
En las muestras descongeladas envasadas en pajillas de 0.5 y 0.25 los resultados
obtenidos fueron 21.021% ± 8.5614%; 20.917% ± 7.4515% (Ver tabla 22)
respectivamente. La diferencia fue de 0.10% lo que indica que esta no hay
diferencia significativa (p>0.05); (Ver anexo 7); (Ver gráfica 16).
72
Tabla 22. Evaluación de espermatozoides de semen equino envasado en pajillas de 0.5 y 0.25
Item Media S n
Pajilla 0.5 ml
Pajilla 0.25 ml
21.021 a
20.917 a
8.5614
7.4515
48
48
S= Desviación estándar n = tamaño de la muestra Letras con superíndice igual indica diferencia no significativa (p> 0.05)
Gráfica 16. Espermatozoides Anormales de semen equino envasado en pajillas de
0.5 y 0.25
20,91 21
0
5
10
15
20
0,25 0,5
Pajilla
%
En este trabajo se aprecia el efecto de la congelación del semen de equino en
pajillas de 0.5ml y 0.25ml sobre la viabilidad y capacidad del espermatozoide en
cuanto a motilidad, porcentaje de vivos y muertos y número de espermatozoides
normales, dichos parámetros se reducen de igual forma en los dos tipos de
pajillas.
Cuando el semen es sometido a un proceso de congelación se presenta un
abatimiento de la calidad espermática, que se manifiesta principalmente en una
disminución de la motilidad. Según Vidament y col en 1998; este fenómeno se
atribuye, en mayor grado, a una alteración de los componentes celulares aunado a
73
un trastorno en el intercambio iónico, involucrando al potasio y quizá a los fosfatos
presentes en los diluyentes.96
La congelación de semen en diferentes presentaciones, como son las pajillas de
0.25ml y 0.5 ml, implica cambios en el volumen y superficie de la pajilla, en la
concentración espermática / volumen, en el grado de dilución, y por lo mismo en el
ritmo de congelación.
En cuanto la recuperación de la motilidad progresiva Alvarenga en el 2005 obtuvo
resultados muy parecidos al trabajar con el criopreservante Dimetil formamida.97
Samper y col en 1998 explican que debido a que las dosis de semen en el equino
deben contener un número elevado de espermatozoides en un reducido volumen
la proporción semen / diluyente o grado de dilución puede afectar la sobrevivencia
de los espermatozoides, en nuestro caso en los resultados obtenidos no se
encontraron diferencias en la motilidad progresiva al descongelar en ningún
tratamiento. La congelación de semen de equino en vapores de nitrógeno líquido
utilizando un termo de icopor con cubeta de acero inoxidable previamente probado
con termocupla y termómetro es una técnica de campo sencilla y barata, que
proporciona buenos resultados. Los parámetros de motilidad, porcentaje de vivos
y muertos y espermatozoides normales obtenidos con los métodos, y condiciones
del presente trabajo se encuentran dentro de los criterios considerados para su
aplicación en la inseminación artificial de la yegua.98
96 Op.cit, Vidament, M.; Cognard, E.; Yvon, J.M.; Palmer, E.; Magistrini, M. (1998) 97 Op.cit. Alvarenga, M.A 2005 98 Samper, J.C.; Morris, C.A. Current methods for stallion semen cryopreservation. En: Theriogenology (1998), p. 895-903
74
4.4. CANTIDAD DE ANORMALIDADES PRESENTES EN EYACULADOS DE SEMEN EQUINO ENVASADOS EN PAJILLAS DE 0.5 Y 0.25. - Anormalidades de Cabeza Puede observarse que en la tabla 23 las anormalidades de cabeza de los
espermatozoides presentes en la pajilla de 0.5 corresponden a 2.9375 % ±
1.1236%. El porcentaje en pajilla de 0.25 corresponde a 4.3636 % ± 2.9419%; por
tanto el porcentaje de espermatozoides con anormalidades de cabeza, en esta
ultima pajilla aumentó en un 1.42%. (Ver gráfica 17, ver anexo 7). De esta forma
se concluye que no hubo diferencia significativa (p>0.05).
Tabla 23. Anormalidades de cabeza de espermatozoides de semen equino envasado en pajillas de 0.5 y 0.25
Item Media S n
Pajilla de 0.5
Pajilla de 0.25
2.9375 a
4.3636 a
1.1236
2.9419
16
11
S= Desviación estándar n = tamaño de la muestra Letras con superíndice igual indica diferencia no significativa (p> 0.05)
Gráfica 17. Anormalidades de cabeza de espermatozoides de semen equino envasado en
pajillas de 0.5 y 0.25
4,36
2,93
012345
0,25 0,5
Pajilla
%
75
- Gota citoplasmática proximal
En la pajilla de 0.5 se tiene un porcentaje de gota citoplasmática proximal, que
corresponde a 4.9070% ± 3.0301%, con la pajilla de 0.25 el porcentaje
corresponde a 5.4634% ± 2.7667% (Ver tabla 24); en este caso hubo aumento en
el porcentaje de gota citoplasmática proximal con esta ultima pajilla en un 0.55%,
(Ver gráfica 18) lo que indica que no hay diferencia significativa (p>0.05); (Ver
anexo 7).
Tabla 24. Gota citoplasmática proximal de espermatozoides de semen equino envasado en
pajillas de 0.5 y 0.25
Item Media S n
Pajilla de 0.5
Pajilla de 0.25
4.9070 a
5.4634 a
3.0301
2.7667
43
41 S= Desviación estándar n = tamaño de la muestra Letras con superíndice igual indica diferencia no significativa (p> 0.05)
Gráfica 18. Gota citoplasmática proximal de espermatozoides en semen equino
envasado en pajillas de 0.5 y 0.25
5,44,9
0
1
2
3
4
5
6
0,25 0,5
Pajilla
76
- Anormalidades de pieza intermedia
La tabla 25 muestra que el porcentaje de anormalidades de pieza intermedia en
pajilla de 0.5 es de 2.2222% ± 1.2019%, este porcentaje con la pajilla de 0.25 es
de 3.2667% ± 2.1202%, esto demuestra un aumento de 1.04 % en la pajilla de
0.25. (Ver gráfica 19, ver anexo 7) lo anterior indica que la diferencia no es
significativa (p>0.05).
Tabla 25. Anormalidades de pieza intermedia de espermatozoides en semen equino envasado en pajillas de 0.5 y 0.25
Item Media S n
Pajilla de 0.5
Pajilla de 0.25
2.2222 a
3.2667 a
1.2019
2.1202
9
15
S= Desviación estándar n = tamaño de la muestra Letras con superíndice igual indica diferencia no significativa (p> 0.05)
Gráfica. 19 Anormalidades de pieza intermedia de espermatozoides en semen equino envasado en pajillas de 0.5 y 0.25
2,223,26
01234
0,25 0,5
Pajilla
%
77
- Cabezas Sueltas
En las tabla 26 las muestras descongeladas, presentaron porcentaje de cabezas
sueltas de 3.063% ± 2.0847%; 2.8788% ± 1.7277%; en las pajilla de 0.5 y 0.25
respectivamente, (Ver gráfica 20, ver anexo 7). Por tanto hubo disminución en el
porcentaje de cabezas sueltas en la pajilla de 0.25 en un 1.02%. Esto indica una
diferencia no significativa (p>0.05).
Tabla 26. Cabezas sueltas de espermatozoides en semen equino envasado en pajillas de
0.5 y 0.25
Item Media S n
Pajilla de 0.5
Pajilla de 0.25
3.063 a
2.8788 a
2.0847
1.7277
32
33 S= Desviación estándar n = tamaño de la muestra Letras con superíndice igual indica diferencia no significativa (p> 0.05)
Gráfica 20. Cabezas sueltas de espermatozoides en semen equino envasado en pajillas de
0.5 y 0.25
2,87
3,9
0
1
23
4
5
0,25 0,5
Pajilla
%
78
- Gota citoplasmática distal
Cuando analizamos la presencia de gota citoplasmática distal, en la pajilla de 0.5,
el porcentaje correspondió a 5.2821%. ± 3.2196 (Ver tabla 27); Con la pajilla de
0.25 el porcentaje es de 5.1000% ± 2.8175%; entonces hubo una disminución no
significativa (p>0.05); (Ver anexo 7) en el porcentaje de gota citoplasmática distal
con esta ultima pajilla en un 0.18%.(Ver gráfica 21).
Tabla 27. Gota citoplasmática distal de espermatozoides en semen equino envasado en pajilla de 0.5 y 0.25
Item Media S n
Pajilla de 0.5
Pajilla de 0.25
5.2821 a
5.1000 a
3.2196
2.8175
39
40
S= Desviación estándar n = tamaño de la muestra Letras con superíndice igual indica diferencia no significativa (p> 0.05)
Gráfica 21. Gota citoplasmática distal de espermatozoides en semen equino envasado en pajillas de 0.5 y 0.25
5,1 5,2821
012345678
0,25 0,5
%
79
- Anormalidades de flagelo
Según lo analizado en la tabla 28, el porcentaje de anormalidades de flagelo
presentes en los espermatozoides de las pajillas de 0.5 y 0.25 corresponde a
8.8889% ± 3.2067% y 8.1702% ± 3.5589%; respectivamente (Ver gráfica 22) por
tanto hubo disminución en el porcentaje de anormalidades de flagelo en la pajilla
de 0.25 en un 0.71%. Lo que representa una diferencia no significativa (p>0.05);
(Ver anexo 7).
Tabla 28. Anormalidades de flagelo de espermatozoides en semen equino envasado en pajillas de 0.5 y 0.25
Item Media S n
Pajilla de 0.5
Pajilla de 0.25
8.8889 a
8.1702 a
3.2067
3.5589
45
47
S= Desviación estándar n = tamaño de la muestra Letras con superíndice igual indica diferencia no significativa (p> 0.05)
Gráfica 22. Anormalidades de flagelo de espermatozoides en semen equino envasado en pajillas de 0.5 y 0.25
8,178,88
0
2
4
6
8
10
0,25 0,5
Pajilla
%
Según los resultados en la evaluación post-descongelación de las pajillas de 0.5ml
y 0.25 ml con respecto a las morfoanomalías espermáticas que presentamos
anteriormente, podemos concluir que no hubo diferencia importante entre los dos
tipos de envase.
80
CONCLUSIONES
- El diluyente INRA-Dimetil-formamida-yema de huevo, presentó mejores
porcentajes en cuanto a motilidad progresiva, cantidad de espermatozoides
vivos y muertos y espermatozoides normales, por tanto las muestras
congeladas con este diluyente presentan una mayor viabilidad.
- El parámetro que mayor diferencia presentó entre los dos tratamientos, fue
la motilidad progresiva, obteniendo resultados altamente significativos para
el semen congelado con el diluyente INRA-Dimetil-formamida-yema de
huevo.
- Estadísticamente las anormalidades de cabeza, la cantidad de cabezas
sueltas, las anormalidades de pieza intermedia, la presencia de gota
citoplasmática proximal y distal y las anormalidades del flagelo, no
presentaron ninguna diferencia significativa entre los tratamientos.
- La Dimetil-formamida puede ser usada como crioprotector para la
congelación de semen de equinos criollos, en especial para aquellos
animales que presentan problemas en el proceso de congelación.
- Se determina que la congelación de las muestras de semen en pajillas de
0.5 y 0.25ml no presentó ninguna diferencia significativa, en cuanto a
motilidad progresiva, cantidad de espermatozoides vivos y muertos, así
como tampoco para la presencia de espermatozoides con morfoanomalías;
por lo que la utilización de cualquiera de ellas es apropiada para dicho
proceso.
81
- En el proceso de manipulación del semen equino, se obtuvo los mejores
resultados en cuanto a motilidad progresiva, menos cantidad de
morfoanomalías y mayor concentración; cuando se realizó la centrifugación
a 2.500 revoluciones /minuto, durante diez minutos.
- Bajo las condiciones de este experimento, la centrifugación no afectó en
gran manera la motilidad de los espermatozoides eyaculados, durante su
procesamiento y tras la descongelación.
- La curva de congelación utilizada, presentó muy buenos resultados en el
proceso de congelación de las muestras y aseguró de esta manera la
viabilidad del semen post descongelación.
- La reducción de la temperatura del semen, al límite de 4 grados, tiene
resultados superiores cuando se hace una disminución paulatina en un
periodo de una hora; sin embargo se obtienen buenos resultados cuando se
realiza en un periodo de 30 minutos.
- El semen de los equinos evaluados, presenta un proceso adecuado de
congelación cuando se mantiene por un periodo de 20 minutos en vapores
de nitrógeno líquido a una altura de 4cm de del mismo.
- El procedimiento de doble filtración dió mejores resultados en la eliminación
del plasma seminal.
- Algunos de los parámetros como volumen y concentración, variaron de
forma leve en aquellos sementales que no estaban entrenados para el uso
de la vagina artificial.
82
- Durante el desarrollo de la investigación se refleja la variabilidad individual
en la congelación, pues el semen de algunos animales presentan mayor
adaptabilidad y resistencia para este proceso que otros.
83
RECOMENDACIONES
- Debe someterse el semental a una limpieza completa de prepucio y de
pene con jabón quirúrgico y posterior secado esto garantiza la buena
calidad de la colecta.
- La vagina artificial y todos los elementos de la congelación deben ser
estériles, esto garantiza la calidad del semen congelado.
- El semen debe filtrarse 2 veces para garantizar la separación completa del
gel, esto hace que la resistencia del semen a la congelación sea mayor.
- El diluyente de centrifugación debe estar a la misma temperatura del semen
puro (35 ºC ), esto se considera factor crítico que influye directamente en la
calidad del semen.
- La calidad del botón, posterior a la centrifugación depende de la
individualidad de cada semental, este factor es fundamental a tener en
cuenta para determinar las revoluciones por minuto y el tiempo de
centrifugación.
- La evaluación andrológica del semental define el protocolo de congelación y
permite calcular la concentración de cada dosis siendo ideal 200 millones
de espermatozoides efectivos.
- Para los caballos cuyo semen es sensible a la congelación se puede
utilizar Dimetil-formamida al 4% como crioprotector.
84
- La descongelación del semen debe ser estricta por eso se recomienda
descongelar a 35 º C durante 30 segundos este factor es fundamental
debido a que favorece la motilidad y la supervivencia espermática.
85
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91
ANEXOS
Anexo 1. Preparación de la solución de Formol Citrato Solución de Formol Citrato
Na2HPO4 4.93 gr.
KH2PO4 2.54 gr.
Formaldehído
38%
125.50 gr.
NaCl 5.41 gr.
Agua destilada c.s.p 1000 ml Palma, A. G. Biotecnología de la Reproducción, Balcarce, Argentina, p.: 535
Anexo 2. Preparación del diluyente Glucosa-EDTA
Glucosa 6 gr
EDTA 0.37 gr
Bicarbonato sódico 0.12 gr
Citrato Sódico dihidratado 0.37 gr
Penicilina G sódica 50.000 UI
Estreptomicina 50mg
Agua destilada 100 ml
pH 7.2- 7.4 y la osmolaridad 450 mosm
92
Anexo 3. Lactosa-EDTA-Yema de huevo Solución de lactosa al 11% 50ml
Glucosa-EDTA 25ml
Yema de huevo 20ml
Glicerol 5ml
Equex STM(Minitub) 0.6ml
Se centrifugó a 10.000 gravedades durante 20 minutos y se filtró.
Anexo 4. INRA –Dimetil- formamida-Yema de huevo
Glucosa 25 gr
Lactosa 1.5gr
Rafinosa 1,5gr
Citraro Na 0.25
Citrato K 0.41gr
Hepes 4,7gr
Dimetil formamida 4%
Yema de huevo 2%
Gentamicina 10 ug/ml
Penicilina 10 UI/ml
93
Anexo 5. Curva de congelación de semen
TIEMPO Vs. TEMPERATURA
-200,00
-150,00
-100,00
-50,00
0,00
50,00
0 20 40 60 80 100 120
Tiempo (Minutos)
Tem
pera
tura
(C)
94
Anexo 6. Estadística Descriptiva por Tratramiento STATISTIX FOR WINDOWS DATOS, 06/13/07, 12:14 DESCRIPTIVE STATISTICS FOR TRATAMIEN = 0 ANORCABE ANORFLAGE ANORMAL ANORPIEZI CABEZSUEL N 15 22 24 7 9 MEAN 2.9333 6.3636 15.917 2.5714 2.5556 SD 1.3345 2.6645 6.8899 0.7868 1.5092 VARIANCE 1.7810 7.0996 47.471 0.6190 2.2778 SE MEAN 0.3446 0.5681 1.4064 0.2974 0.5031 C.V. 45.495 41.871 43.287 30.598 59.057 MINIMUM 1.0000 1.0000 10.000 2.0000 1.0000 MAXIMUM 5.0000 10.000 35.000 4.0000 6.0000 GCITDISTA GCITPROX MOTINDIVI MOTPROGRE MUERTOS N 18 14 24 24 24 MEAN 4.8889 4.9286 70.000 69.167 15.500 SD 2.5179 1.8590 11.421 11.389 3.6116 VARIANCE 6.3399 3.4560 130.43 129.71 13.043 SE MEAN 0.5935 0.4969 2.3313 2.3248 0.7372 C.V. 51.503 37.720 16.315 16.466 23.300 MINIMUM 1.0000 2.0000 50.000 50.000 10.000 MAXIMUM 9.0000 10.000 80.000 80.000 20.000 NORMAL VIVOS N 24 24 MEAN 84.083 84.500 SD 6.8899 3.6116 VARIANCE 47.471 13.043 SE MEAN 1.4064 0.7372 C.V. 8.1942 4.2741 MINIMUM 65.000 80.000 MAXIMUM 90.000 90.000 DESCRIPTIVE STATISTICS FOR TRATAMIEN = 1 ANORCABE ANORFLAGE ANORMAL ANORPIEZI CABEZSUEL N 16 46 48 10 31 MEAN 3.8125 8.5217 20.979 3.4000 3.8065 SD 1.9397 3.1037 8.3856 2.0656 2.4416 VARIANCE 3.7625 9.6329 70.319 4.2667 5.9613 SE MEAN 0.4849 0.4576 1.2104 0.6532 0.4385 C.V. 50.878 36.421 39.971 60.753 64.143 MINIMUM 2.0000 2.0000 11.000 1.0000 1.0000 MAXIMUM 10.000 15.000 50.000 6.0000 10.000
95
GCITDISTA GCITPROX MOTINDIVI MOTPROGRE MUERTOS N 41 40 0 48 48 MEAN 5.2683 4.6500 M 50.208 36.375 SD 3.0743 3.0344 M 8.1187 6.1735 VARIANCE 9.4512 9.2077 M 65.913 38.112 SE MEAN 0.4801 0.4798 M 1.1718 0.8911 C.V. 58.354 65.256 M 16.170 16.972 MINIMUM 1.0000 1.0000 M 30.000 10.000 MAXIMUM 10.000 15.000 M 60.000 50.000 NORMAL VIVOS N 48 48 MEAN 78.896 63.625 SD 8.4154 6.1735 VARIANCE 70.819 38.112 SE MEAN 1.2147 0.8911 C.V. 10.666 9.7029 MINIMUM 50.000 50.000 MAXIMUM 89.000 90.000 DESCRIPTIVE STATISTICS FOR TRATAMIEN = 2 ANORCABE ANORFLAGE ANORMAL ANORPIEZI CABEZSUEL N 11 46 48 14 34 MEAN 3.0909 8.5217 20.958 2.5000 3.0000 SD 2.4271 3.6923 7.6491 1.6984 1.3257 VARIANCE 5.8909 13.633 58.509 2.8846 1.7576 SE MEAN 0.7318 0.5444 1.1041 0.4539 0.2274 C.V. 78.524 43.328 36.497 67.937 44.191 MINIMUM 1.0000 1.0000 11.000 1.0000 1.0000 MAXIMUM 10.000 20.000 36.000 7.0000 5.0000 GCITDISTA GCITPROX MOTINDIVI MOTPROGRE MUERTOS N 38 44 0 48 48 MEAN 5.1053 5.6591 M 57.479 34.813 SD 2.9664 2.7190 M 5.4499 5.5874 VARIANCE 8.7994 7.3927 M 29.702 31.219 SE MEAN 0.4812 0.4099 M 0.7866 0.8065 C.V. 58.104 48.046 M 9.4816 16.050 MINIMUM 1.0000 1.0000 M 50.000 14.000 MAXIMUM 10.000 10.000 M 70.000 43.000 NORMAL VIVOS N 48 48 MEAN 79.042 65.188 SD 7.6491 5.5874 VARIANCE 58.509 31.219 SE MEAN 1.1041 0.8065 C.V. 9.6773 8.5713 MINIMUM 64.000 57.000 MAXIMUM 89.000 86.000
96
Anexo 7. Estadística Descriptiva por Pajilla. STATISTIX FOR WINDOWS DATOS2, 06/13/07, 12:39 DESCRIPTIVE STATISTICS FOR PAJILLA = 1 ANORCABE ANORFLAGE ANORMAL ANORPIEZI CABEZSUEL N 16 45 48 9 32 MEAN 2.9375 8.8889 21.021 2.2222 3.9063 SD 1.1236 3.2067 8.5614 1.2019 2.0847 VARIANCE 1.2625 10.283 73.297 1.4444 4.3458 SE MEAN 0.2809 0.4780 1.2357 0.4006 0.3685 C.V. 38.251 36.075 40.728 54.083 53.367 MINIMUM 1.0000 1.0000 11.000 1.0000 1.0000 MAXIMUM 5.0000 15.000 50.000 5.0000 10.000 GCITDISTA GCITPROX MOTINDIVI MOTPROGRE MUERTOS N 39 43 0 48 48 MEAN 5.2821 4.9070 M 53.625 35.875 SD 3.2196 3.0301 M 7.4022 6.3468 VARIANCE 10.366 9.1816 M 54.793 40.282 SE MEAN 0.5155 0.4621 M 1.0684 0.9161 C.V. 60.953 61.751 M 13.804 17.691 MINIMUM 1.0000 1.0000 M 30.000 10.000 MAXIMUM 10.000 15.000 M 65.000 45.000 NORMAL VIVOS N 48 48 MEAN 78.979 64.125 SD 8.5614 6.3468 VARIANCE 73.297 40.282 SE MEAN 1.2357 0.9161 C.V. 10.840 9.8975 MINIMUM 50.000 55.000 MAXIMUM 89.000 90.000 DESCRIPTIVE STATISTICS FOR PAJILLA = 2 ANORCABE ANORFLAGE ANORMAL ANORPIEZI CABEZSUEL N 11 47 48 15 33 MEAN 4.3636 8.1702 20.917 3.2667 2.8788 SD 2.9419 3.5589 7.4515 2.1202 1.7277 VARIANCE 8.6545 12.666 55.525 4.4952 2.9848 SE MEAN 0.8870 0.5191 1.0755 0.5474 0.3007 C.V. 67.418 43.560 35.625 64.904 60.014 MINIMUM 2.0000 1.0000 11.000 1.0000 1.0000 MAXIMUM 10.000 20.000 40.000 7.0000 7.0000
97
GCITDISTA GCITPROX MOTINDIVI MOTPROGRE MUERTOS N 40 41 0 48 48 MEAN 5.1000 5.4634 M 54.063 35.313 SD 2.8175 2.7667 M 8.2292 5.4895 VARIANCE 7.9385 7.6549 M 67.719 30.134 SE MEAN 0.4455 0.4321 M 1.1878 0.7923 C.V. 55.246 50.641 M 15.222 15.545 MINIMUM 1.0000 1.0000 M 40.000 14.000 MAXIMUM 10.000 10.000 M 70.000 50.000 NORMAL VIVOS N 48 48 MEAN 78.958 64.688 SD 7.4860 5.4895 VARIANCE 56.041 30.134 SE MEAN 1.0805 0.7923 C.V. 9.4810 8.4861 MINIMUM 60.000 50.000 MAXIMUM 89.000 86.000 Anexo 8. Estadistica Descriptiva por Tratamiento – Pajilla STATISTIX FOR WINDOWS DATOS, 06/13/07, 12:21 DESCRIPTIVE STATISTICS FOR TTORONPAJ = 1 ANORCABE ANORFLAGE ANORMAL ANORPIEZI CABEZSUEL N 8 23 24 2 14 MEAN 3.3750 8.6087 20.875 3.5000 4.7143 SD 1.1877 2.7260 9.2281 2.1213 2.6144 VARIANCE 1.4107 7.4308 85.158 4.5000 6.8352 SE MEAN 0.4199 0.5684 1.8837 1.5000 0.6987 C.V. 35.192 31.665 44.206 60.609 55.457 MINIMUM 2.0000 2.0000 11.000 2.0000 1.0000 MAXIMUM 5.0000 15.000 50.000 5.0000 10.000 GCITDISTA GCITPROX MOTINDIVI MOTPROGRE MUERTOS N 21 21 0 24 24 MEAN 5.1429 4.5238 M 50.833 36.417 SD 3.3658 3.2034 M 8.2970 6.9151 VARIANCE 11.329 10.262 M 68.841 47.819 SE MEAN 0.7345 0.6990 M 1.6936 1.4115 C.V. 65.446 70.812 M 16.322 18.989 MINIMUM 1.0000 1.0000 M 30.000 10.000 MAXIMUM 10.000 15.000 M 60.000 45.000 NORMAL VIVOS N 24 24 MEAN 79.125 63.583 SD 9.2281 6.9151 VARIANCE 85.158 47.819
98
SE MEAN 1.8837 1.4115 C.V. 11.663 10.876 MINIMUM 50.000 55.000 MAXIMUM 89.000 90.000 DESCRIPTIVE STATISTICS FOR TTORONPAJ = 2 ANORCABE ANORFLAGE ANORMAL ANORPIEZI CABEZSUEL N 8 23 24 8 17 MEAN 4.2500 8.4348 21.083 3.3750 3.0588 SD 2.4928 3.5010 7.6495 2.1998 2.0758 VARIANCE 6.2143 12.257 58.514 4.8393 4.3088 SE MEAN 0.8814 0.7300 1.5614 0.7778 0.5034 C.V. 58.655 41.507 36.282 65.180 67.862 MINIMUM 2.0000 3.0000 11.000 1.0000 1.0000 MAXIMUM 10.000 15.000 40.000 6.0000 7.0000 GCITDISTA GCITPROX MOTINDIVI MOTPROGRE MUERTOS N 20 19 0 24 24 MEAN 5.4000 4.7895 M 49.583 36.333 SD 2.8172 2.9170 M 8.0645 5.4825 VARIANCE 7.9368 8.5088 M 65.036 30.058 SE MEAN 0.6300 0.6692 M 1.6462 1.1191 C.V. 52.171 60.904 M 16.265 15.089 MINIMUM 2.0000 1.0000 M 40.000 20.000 MAXIMUM 10.000 10.000 M 60.000 50.000 NORMAL VIVOS N 24 24 MEAN 78.667 63.667 SD 7.7103 5.4825 VARIANCE 59.449 30.058 SE MEAN 1.5739 1.1191 C.V. 9.8013 8.6113 MINIMUM 60.000 50.000 MAXIMUM 89.000 80.000 DESCRIPTIVE STATISTICS FOR TTORONPAJ = 3 ANORCABE ANORFLAGE ANORMAL ANORPIEZI CABEZSUEL N 8 22 24 7 18 MEAN 2.5000 9.1818 21.167 1.8571 3.2778 SD 0.9258 3.6857 8.0362 0.6901 1.3198 VARIANCE 0.8571 13.584 64.580 0.4762 1.7418 SE MEAN 0.3273 0.7858 1.6404 0.2608 0.3111 C.V. 37.033 40.141 37.966 37.157 40.265 MINIMUM 1.0000 1.0000 11.000 1.0000 1.0000 MAXIMUM 4.0000 15.000 36.000 3.0000 5.0000
99
GCITDISTA GCITPROX MOTINDIVI MOTPROGRE MUERTOS N 18 22 0 24 24 MEAN 5.4444 5.2727 M 56.417 35.333 SD 3.1290 2.8815 M 5.1829 5.8210 VARIANCE 9.7908 8.3030 M 26.862 33.884 SE MEAN 0.7375 0.6143 M 1.0580 1.1882 C.V. 57.472 54.649 M 9.1868 16.475 MINIMUM 1.0000 1.0000 M 50.000 15.000 MAXIMUM 10.000 10.000 M 65.000 43.000 NORMAL VIVOS N 24 24 MEAN 78.833 64.667 SD 8.0362 5.8210 VARIANCE 64.580 33.884 SE MEAN 1.6404 1.1882 C.V. 10.194 9.0015 MINIMUM 64.000 57.000 MAXIMUM 89.000 85.000 DESCRIPTIVE STATISTICS FOR TTORONPAJ = 4 ANORCABE ANORFLAGE ANORMAL ANORPIEZI CABEZSUEL N 3 24 24 7 16 MEAN 4.6667 7.9167 20.750 3.1429 2.6875 SD 4.6188 3.6703 7.4089 2.1931 1.3022 VARIANCE 21.333 13.471 54.891 4.8095 1.6958 SE MEAN 2.6667 0.7492 1.5123 0.8289 0.3256 C.V. 98.974 46.362 35.705 69.779 48.456 MINIMUM 2.0000 1.0000 11.000 1.0000 1.0000 MAXIMUM 10.000 20.000 35.000 7.0000 5.0000 GCITDISTA GCITPROX MOTINDIVI MOTPROGRE MUERTOS N 20 22 0 24 24 MEAN 4.8000 6.0455 M 58.542 34.292 SD 2.8580 2.5538 M 5.6104 5.4172 VARIANCE 8.1684 6.5216 M 31.476 29.346 SE MEAN 0.6391 0.5445 M 1.1452 1.1058 C.V. 59.543 42.243 M 9.5836 15.797 MINIMUM 1.0000 1.0000 M 50.000 14.000 MAXIMUM 10.000 10.000 M 70.000 41.000 NORMAL VIVOS N 24 24 MEAN 79.250 65.708 SD 7.4089 5.4172 VARIANCE 54.891 29.346 SE MEAN 1.5123 1.1058 C.V. 9.3487 8.2443 MINIMUM 65.000 59.000 MAXIMUM 89.000 86.000
100
Anexo 9. Anava para Tratamiento STATISTIX FOR WINDOWS DATOS, 06/13/07, 12:40 ONE-WAY AOV FOR VIVOS BY TRATAMIEN SOURCE DF SS MS F P ------- ---- --------- --------- ------ ------ BETWEEN 2 7810.76 3905.38 128.40 0.0000 WITHIN 117 3558.56 30.4151 TOTAL 119 11369.3 CHI-SQ DF P BARTLETT'S TEST OF ------ ------ ------ EQUAL VARIANCES 7.55 2 0.0230 COCHRAN'S Q 0.4627 LARGEST VAR / SMALLEST VAR 2.9219 COMPONENT OF VARIANCE FOR BETWEEN GROUPS 100.911 EFFECTIVE CELL SIZE 38.4 SAMPLE GROUP TRATAMIEN MEAN SIZE STD DEV --------- ---------- ------ ---------- 0 84.500 24 3.6116 1 63.625 48 6.1735 2 65.188 48 5.5874 TOTAL 68.425 120 5.5150 CASES INCLUDED 120 MISSING CASES 0 STATISTIX FOR WINDOWS DATOS, 06/13/07, 12:44 TUKEY (HSD) COMPARISON OF MEANS OF VIVOS BY TRATAMIEN HOMOGENEOUS TRATAMIEN MEAN GROUPS --------- ---------- ----------- 0 84.500 I 2 65.188 .. I 1 63.625 .. I THERE ARE 2 GROUPS IN WHICH THE MEANS ARE NOT SIGNIFICANTLY DIFFERENT FROM ONE ANOTHER. CRITICAL Q VALUE 3.358 REJECTION LEVEL 0.050 STANDARD ERRORS AND CRITICAL VALUES OF DIFFERENCES VARY BETWEEN COMPARISONS BECAUSE OF UNEQUAL SAMPLE SIZES.
101
STATISTIX FOR WINDOWS DATOS, 06/13/07, 12:45 ONE-WAY AOV FOR ANORCABE BY TRATAMIEN SOURCE DF SS MS F P ------- ---- --------- --------- ------ ------ BETWEEN 2 6.69627 3.34813 0.93 0.4028 WITHIN 39 140.280 3.59692 TOTAL 41 146.976 CHI-SQ DF P BARTLETT'S TEST OF ------ ------ ------ EQUAL VARIANCES 4.09 2 0.1295 COCHRAN'S Q 0.5152 LARGEST VAR / SMALLEST VAR 3.3077 COMPONENT OF VARIANCE FOR BETWEEN GROUPS -0.01798 EFFECTIVE CELL SIZE 13.8 SAMPLE GROUP TRATAMIEN MEAN SIZE STD DEV --------- ---------- ------ ---------- 0 2.9333 15 1.3345 1 3.8125 16 1.9397 2 3.0909 11 2.4271 TOTAL 3.3095 42 1.8966 CASES INCLUDED 42 MISSING CASES 78 STATISTIX FOR WINDOWS DATOS, 06/13/07, 12:45 ONE-WAY AOV FOR ANORMAL BY TRATAMIEN SOURCE DF SS MS F P ------- ---- --------- --------- ------ ------ BETWEEN 2 490.063 245.031 4.01 0.0203 WITHIN 117 7146.73 61.0832 TOTAL 119 7636.79 CHI-SQ DF P BARTLETT'S TEST OF ------ ------ ------ EQUAL VARIANCES 1.19 2 0.5517 COCHRAN'S Q 0.3989 LARGEST VAR / SMALLEST VAR 1.4813
102
COMPONENT OF VARIANCE FOR BETWEEN GROUPS 4.79031 EFFECTIVE CELL SIZE 38.4 SAMPLE GROUP TRATAMIEN MEAN SIZE STD DEV --------- ---------- ------ ---------- 0 15.917 24 6.8899 1 20.979 48 8.3856 2 20.958 48 7.6491 TOTAL 19.958 120 7.8156 CASES INCLUDED 120 MISSING CASES 0 STATISTIX FOR WINDOWS DATOS, 06/13/07, 12:46 TUKEY (HSD) COMPARISON OF MEANS OF ANORMAL BY TRATAMIEN HOMOGENEOUS TRATAMIEN MEAN GROUPS --------- ---------- ----------- 1 20.979 I 2 20.958 I 0 15.917 .. I THERE ARE 2 GROUPS IN WHICH THE MEANS ARE NOT SIGNIFICANTLY DIFFERENT FROM ONE ANOTHER. CRITICAL Q VALUE 3.358 REJECTION LEVEL 0.050 STANDARD ERRORS AND CRITICAL VALUES OF DIFFERENCES VARY BETWEEN COMPARISONS BECAUSE OF UNEQUAL SAMPLE SIZES. STATISTIX FOR WINDOWS DATOS, 06/13/07, 12:46 ONE-WAY AOV FOR ANORPIEZI BY TRATAMIEN SOURCE DF SS MS F P ------- ---- --------- --------- ------ ------ BETWEEN 2 5.22442 2.61221 0.92 0.4107 WITHIN 28 79.6143 2.84337 TOTAL 30 84.8387 CHI-SQ DF P BARTLETT'S TEST OF ------ ------ ------ EQUAL VARIANCES 5.04 2 0.0805 COCHRAN'S Q 0.5491 LARGEST VAR / SMALLEST VAR 6.8923
103
COMPONENT OF VARIANCE FOR BETWEEN GROUPS -0.02327 EFFECTIVE CELL SIZE 9.9 SAMPLE GROUP TRATAMIEN MEAN SIZE STD DEV --------- ---------- ------ ---------- 0 2.5714 7 0.7868 1 3.4000 10 2.0656 2 2.5000 14 1.6984 TOTAL 2.8065 31 1.6862 CASES INCLUDED 31 MISSING CASES 89 STATISTIX FOR WINDOWS DATOS, 06/13/07, 12:46 ONE-WAY AOV FOR CABEZSUEL BY TRATAMIEN SOURCE DF SS MS F P ------- ---- --------- --------- ------ ------ BETWEEN 2 15.9796 7.98980 2.22 0.1135 WITHIN 71 255.061 3.59241 TOTAL 73 271.041 CHI-SQ DF P BARTLETT'S TEST OF ------ ------ ------ EQUAL VARIANCES 11.70 2 0.0029 COCHRAN'S Q 0.5963 LARGEST VAR / SMALLEST VAR 3.3918 COMPONENT OF VARIANCE FOR BETWEEN GROUPS 0.19854 EFFECTIVE CELL SIZE 22.1 SAMPLE GROUP TRATAMIEN MEAN SIZE STD DEV --------- ---------- ------ ---------- 0 2.5556 9 1.5092 1 3.8065 31 2.4416 2 3.0000 34 1.3257 TOTAL 3.2838 74 1.8954 CASES INCLUDED 74 MISSING CASES 46 STATISTIX FOR WINDOWS DATOS, 06/13/07, 12:47
104
ONE-WAY AOV FOR GCITDISTA BY TRATAMIEN SOURCE DF SS MS F P ------- ---- --------- --------- ------ ------ BETWEEN 2 1.85223 0.92611 0.11 0.8928 WITHIN 94 811.406 8.63197 TOTAL 96 813.258 CHI-SQ DF P BARTLETT'S TEST OF ------ ------ ------ EQUAL VARIANCES 0.89 2 0.6396 COCHRAN'S Q 0.3843 LARGEST VAR / SMALLEST VAR 1.4908 COMPONENT OF VARIANCE FOR BETWEEN GROUPS -0.25083 EFFECTIVE CELL SIZE 30.7 SAMPLE GROUP TRATAMIEN MEAN SIZE STD DEV --------- ---------- ------ ---------- 0 4.8889 18 2.5179 1 5.2683 41 3.0743 2 5.1053 38 2.9664 TOTAL 5.1340 97 2.9380 CASES INCLUDED 97 MISSING CASES 23 STATISTIX FOR WINDOWS DATOS, 06/13/07, 12:48 ONE-WAY AOV FOR MOTPROGRE BY TRATAMIEN SOURCE DF SS MS F P ------- ---- --------- --------- ------ ------ BETWEEN 2 5776.76 2888.38 45.20 0.0000 WITHIN 117 7477.23 63.9079 TOTAL 119 13254.0 CHI-SQ DF P BARTLETT'S TEST OF ------ ------ ------ EQUAL VARIANCES 18.05 2 0.0001 COCHRAN'S Q 0.5757 LARGEST VAR / SMALLEST VAR 4.3671 COMPONENT OF VARIANCE FOR BETWEEN GROUPS 73.5540 EFFECTIVE CELL SIZE 38.4 SAMPLE GROUP TRATAMIEN MEAN SIZE STD DEV --------- ---------- ------ ---------- 0 69.167 24 11.389
105
1 50.208 48 8.1187 2 57.479 48 5.4499 TOTAL 56.908 120 7.9942 CASES INCLUDED 120 MISSING CASES 0 STATISTIX FOR WINDOWS DATOS, 06/13/07, 12:48 TUKEY (HSD) COMPARISON OF MEANS OF MOTPROGRE BY TRATAMIEN HOMOGENEOUS TRATAMIEN MEAN GROUPS --------- ---------- ----------- 0 69.167 I 2 57.479 .. I 1 50.208 .... I ALL 3 MEANS ARE SIGNIFICANTLY DIFFERENT FROM ONE ANOTHER. CRITICAL Q VALUE 3.358 REJECTION LEVEL 0.050 STANDARD ERRORS AND CRITICAL VALUES OF DIFFERENCES VARY BETWEEN COMPARISONS BECAUSE OF UNEQUAL SAMPLE SIZES. STATISTIX FOR WINDOWS DATOS, 06/13/07, 12:48 ONE-WAY AOV FOR MUERTOS BY TRATAMIEN SOURCE DF SS MS F P ------- ---- --------- --------- ------ ------ BETWEEN 2 7810.76 3905.38 128.40 0.0000 WITHIN 117 3558.56 30.4151 TOTAL 119 11369.3 CHI-SQ DF P BARTLETT'S TEST OF ------ ------ ------ EQUAL VARIANCES 7.55 2 0.0230 COCHRAN'S Q 0.4627 LARGEST VAR / SMALLEST VAR 2.9219 COMPONENT OF VARIANCE FOR BETWEEN GROUPS 100.911 EFFECTIVE CELL SIZE 38.4 SAMPLE GROUP TRATAMIEN MEAN SIZE STD DEV --------- ---------- ------ ---------- 0 15.500 24 3.6116 1 36.375 48 6.1735 2 34.813 48 5.5874 TOTAL 31.575 120 5.5150
106
CASES INCLUDED 120 MISSING CASES 0 STATISTIX FOR WINDOWS DATOS, 06/13/07, 12:49 TUKEY (HSD) COMPARISON OF MEANS OF MUERTOS BY TRATAMIEN HOMOGENEOUS TRATAMIEN MEAN GROUPS --------- ---------- ----------- 1 36.375 I 2 34.813 I 0 15.500 .. I THERE ARE 2 GROUPS IN WHICH THE MEANS ARE NOT SIGNIFICANTLY DIFFERENT FROM ONE ANOTHER. CRITICAL Q VALUE 3.358 REJECTION LEVEL 0.050 STANDARD ERRORS AND CRITICAL VALUES OF DIFFERENCES VARY BETWEEN COMPARISONS BECAUSE OF UNEQUAL SAMPLE SIZES. STATISTIX FOR WINDOWS DATOS, 06/13/07, 12:49 ONE-WAY AOV FOR NORMAL BY TRATAMIEN SOURCE DF SS MS F P ------- ---- --------- --------- ------ ------ BETWEEN 2 502.762 251.381 4.10 0.0187 WITHIN 117 7170.23 61.2840 TOTAL 119 7672.99 CHI-SQ DF P BARTLETT'S TEST OF ------ ------ ------ EQUAL VARIANCES 1.24 2 0.5380 COCHRAN'S Q 0.4006 LARGEST VAR / SMALLEST VAR 1.4918 COMPONENT OF VARIANCE FOR BETWEEN GROUPS 4.95045 EFFECTIVE CELL SIZE 38.4 SAMPLE GROUP TRATAMIEN MEAN SIZE STD DEV --------- ---------- ------ ---------- 0 84.083 24 6.8899 1 78.896 48 8.4154 2 79.042 48 7.6491 TOTAL 79.992 120 7.8284 CASES INCLUDED 120 MISSING CASES 0
107
STATISTIX FOR WINDOWS DATOS, 06/13/07, 12:49 TUKEY (HSD) COMPARISON OF MEANS OF NORMAL BY TRATAMIEN HOMOGENEOUS TRATAMIEN MEAN GROUPS --------- ---------- ----------- 0 84.083 I 2 79.042 .. I 1 78.896 .. I THERE ARE 2 GROUPS IN WHICH THE MEANS ARE NOT SIGNIFICANTLY DIFFERENT FROM ONE ANOTHER. CRITICAL Q VALUE 3.358 REJECTION LEVEL 0.050 STANDARD ERRORS AND CRITICAL VALUES OF DIFFERENCES VARY BETWEEN COMPARISONS BECAUSE OF UNEQUAL SAMPLE SIZES. STATISTIX FOR WINDOWS DATOS, 06/13/07, 12:50 ONE-WAY AOV FOR VIVOS BY TRATAMIEN SOURCE DF SS MS F P ------- ---- --------- --------- ------ ------ BETWEEN 2 7810.76 3905.38 128.40 0.0000 WITHIN 117 3558.56 30.4151 TOTAL 119 11369.3 CHI-SQ DF P BARTLETT'S TEST OF ------ ------ ------ EQUAL VARIANCES 7.55 2 0.0230 COCHRAN'S Q 0.4627 LARGEST VAR / SMALLEST VAR 2.9219 COMPONENT OF VARIANCE FOR BETWEEN GROUPS 100.911 EFFECTIVE CELL SIZE 38.4 SAMPLE GROUP TRATAMIEN MEAN SIZE STD DEV --------- ---------- ------ ---------- 0 84.500 24 3.6116 1 63.625 48 6.1735 2 65.188 48 5.5874 TOTAL 68.425 120 5.5150 CASES INCLUDED 120 MISSING CASES 0
108
STATISTIX FOR WINDOWS DATOS, 06/13/07, 12:50 TUKEY (HSD) COMPARISON OF MEANS OF VIVOS BY TRATAMIEN HOMOGENEOUS TRATAMIEN MEAN GROUPS --------- ---------- ----------- 0 84.500 I 2 65.188 .. I 1 63.625 .. I THERE ARE 2 GROUPS IN WHICH THE MEANS ARE NOT SIGNIFICANTLY DIFFERENT FROM ONE ANOTHER. CRITICAL Q VALUE 3.358 REJECTION LEVEL 0.050 STANDARD ERRORS AND CRITICAL VALUES OF DIFFERENCES VARY BETWEEN COMPARISONS BECAUSE OF UNEQUAL SAMPLE SIZES. Anexo 10. Anava para Tratamiento y Pajilla STATISTIX FOR WINDOWS DATOS2, 06/13/07, 12:28 ANALYSIS OF VARIANCE TABLE FOR VIVOS SOURCE DF SS MS F P ------------- ---- ---------- ---------- ------- ------ TRATAMIEN (A) 1 58.5938 58.5938 1.66 0.2007 PAJILLA (B) 1 7.59375 7.59375 0.22 0.6438 A*B 1 5.51042 5.51042 0.16 0.6936 RESIDUAL 92 3245.46 35.2767 ------------- ---- ---------- TOTAL 95 3317.16 STATISTIX FOR WINDOWS DATOS2, 06/13/07, 12:28 ANALYSIS OF VARIANCE TABLE FOR ANORMAL SOURCE DF SS MS F P ------------- ---- ---------- ---------- ------- ------ TRATAMIEN (A) 1 0.01042 0.01042 0.00 0.9900 PAJILLA (B) 1 0.26042 0.26042 0.00 0.9500 A*B 1 2.34375 2.34375 0.04 0.8507 RESIDUAL 92 6052.29 65.7858 ------------- ---- ---------- TOTAL 95 6054.91
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STATISTIX FOR WINDOWS DATOS2, 06/13/07, 12:29 ANALYSIS OF VARIANCE TABLE FOR GCITDISTA SOURCE DF SS MS F P ------------- ---- ---------- ---------- ------- ------ TRATAMIEN (A) 1 0.53430 0.53430 0.06 0.8114 PAJILLA (B) 1 0.90002 0.90002 0.10 0.7569 A*B 1 4.87716 4.87716 0.52 0.4717 RESIDUAL 75 699.016 9.32021 ------------- ---- ---------- TOTAL 78 705.327 CASES INCLUDED 79 MISSING CASES 17 CAUTION: The sums of squares, mean squares, and F-tests are approximate for analyses with missing values. See the manual for details and instructions for constructing exact F-tests. STATISTIX FOR WINDOWS DATOS2, 06/13/07, 12:30 ANALYSIS OF VARIANCE TABLE FOR MOTPROGRE SOURCE DF SS MS F P ------------- ---- ---------- ---------- ------- ------ TRATAMIEN (A) 1 1268.76 1268.76 26.40 0.0000 PAJILLA (B) 1 4.59375 4.59375 0.10 0.7579 A*B 1 68.3438 68.3438 1.42 0.2361 RESIDUAL 92 4420.96 48.0539 ------------- ---- ---------- TOTAL 95 5762.66 STATISTIX FOR WINDOWS DATOS2, 06/13/07, 12:31 TUKEY (HSD) COMPARISON OF MEANS OF MOTPROGRE BY TRATAMIEN HOMOGENEOUS TRATAMIEN MEAN GROUPS --------- ---------- ----------- 2 57.479 I 1 50.208 .. I ALL 2 MEANS ARE SIGNIFICANTLY DIFFERENT FROM ONE ANOTHER. CRITICAL Q VALUE 2.808 REJECTION LEVEL 0.050 CRITICAL VALUE FOR COMPARISON 2.8098 STANDARD ERROR FOR COMPARISON 1.4150 ERROR TERM USED: RESIDUAL, 92 DF
110
STATISTIX FOR WINDOWS DATOS2, 06/13/07, 12:35 ANALYSIS OF VARIANCE TABLE FOR GCITPROX SOURCE DF SS MS F P ------------- ---- ---------- ---------- ------- ------ TRATAMIEN (A) 1 24.1177 24.1177 2.88 0.0935 PAJILLA (B) 1 6.46954 6.46954 0.77 0.3820 A*B 1 1.54268 1.54268 0.18 0.6689 RESIDUAL 80 669.714 8.37143 ------------- ---- ---------- TOTAL 83 701.844 CASES INCLUDED 84 MISSING CASES 12 CAUTION: The sums of squares, mean squares, and F-tests are approximate for analyses with missing values. See the manual for details and instructions for constructing exact F-tests. STATISTIX FOR WINDOWS DATOS2, 06/13/07, 12:35 ANALYSIS OF VARIANCE TABLE FOR MUERTOS SOURCE DF SS MS F P ------------- ---- ---------- ---------- ------- ------ TRATAMIEN (A) 1 58.5937 58.5937 1.66 0.2007 PAJILLA (B) 1 7.59375 7.59375 0.22 0.6438 A*B 1 5.51042 5.51042 0.16 0.6936 RESIDUAL 92 3245.46 35.2767 ------------- ---- ---------- TOTAL 95 3317.16 STATISTIX FOR WINDOWS DATOS2, 06/13/07, 12:36 ANALYSIS OF VARIANCE TABLE FOR ANORFLAGE SOURCE DF SS MS F P ------------- ---- ---------- ---------- ------- ------ TRATAMIEN (A) 1 0.01815 0.01815 0.00 0.9686 PAJILLA (B) 1 12.4254 12.4254 1.06 0.3053 A*B 1 7.14481 7.14481 0.61 0.4363 RESIDUAL 88 1028.24 11.6845 ------------- ---- ---------- TOTAL 91 1047.82 CASES INCLUDED 92 MISSING CASES 4
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