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Clave de registro de la CGPI 20050004

DESARROLLO TÉCNICO DE LA INVESTIGACIÒN (ANEXO)

�Expresión de la ciclooxigenasa 2, la sintasa inducible del óxido nítrico y la alfa-glicoproteína ácida en la patología de la lepra murina�.

(Con este material se está preparando un manuscrito para publicación en

una revista internacional)

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INTRODUCCIÓN

La lepra murina La lepra murina fue descrita por V. K. Stefansky en 1902, quien encontró la enfermedad en ratas mientras trabajaba en una campaña de desratización en la ciudad de Odessa en Ucrania (Stefansky, 1902). Posteriormente, la enfermedad fue reportada en Inglaterra por Dean, y años mas tarde en otros países por otros investigadores. Los reportes de Stefansky y Dean señalaban una gran similitud entre la lepra humana y la lepra de los roedores no solo en cuanto a los microorganismos causales sino también en cuanto a las características patológicas de ambas enfermedades. Lo anterior condujo a que durante muchos años la lepra murina se tomara como modelo de estudio de la lepra en los humanos. Sin embargo, años más tarde, con el mejor conocimiento de los microorganismos causales y de las enfermedades en sí, se descartó la identidad entre ellas. A pesar de esto, la lepra murina sigue siendo un interesante sujeto de estudio porque se trata de una enfermedad infecciosa que comparte varias características con la lepra humana, y de esta última todavía quedan muchas preguntas por contestar. Del estudio de la lepra murina se ha podido establecer, por ejemplo, que la forma maligna de la enfermedad puede evolucionar a partir de la forma benigna y que esta transición depende de cambios en la capacidad de respuesta inmunológica del individuo infectado. También se ha aprendido que el bacilo de la lepra murina, Mycobacterium lepraemurium (MLM), es un parásito altamente exitoso porque ha desarrollado una serie de mecanismos de evasión que también pueden operar en el caso de M. leprae. El modelo de la lepra murina es además interesante porque aparte de las semejanzas con la lepra humana también muestra diferencias. Una de las diferencias más notables es su absoluta incapacidad para afectar al sistema nervioso, observación que abre una nueva línea de investigación tendiente a entender las propiedades del hospedero y el parásito que permiten o evitan la infección neural en cada caso.

Mycobacterium lepraemurium (Generalidades)

Mycobacterium lepraemurium (MLM) es un bacilo ácido-alcohol resistente (BAAR), que mide de 2 a 7 �m de largo y de 0.3 a 0.4 �m de ancho. Es un microorganismo no cultivable in vitro y la manera tradicional de propagarlo, es mediante infecciones seriadas en ratón con bacilos purificados de lesiones de ratones previamente infectados. Se ha reportado que existen cepas de MLM con diferencias en su virulencia, pero no se han descrito las razones de estas diferencias. También se han reportado diferencias en la susceptibilidad a la enfermedad entre varias cepas de ratones. Los ratones C57BL se han considerado resistentes a la infección leprosa, los ratones BALB/c y NIH son cepas de resistencia/susceptibilidad intermedia y los ratones C3H son altamente susceptibles a la misma (Kawagachi Y, 1959). En realidad no hay cepas totalmente resistentes a la lepra murina pero en algunas cepas (C57BL) la

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enfermedad evoluciona de manera lenta y las lesiones no alcanzan la extensión de las cepas susceptibles. La enfermedad en estas cepas �resistentes� adquiere las características de la lepra tuberculoide en los humanos en tanto que en los animales susceptibles la enfermedad semeja a la lepra lepromatosa, con peculiaridades propias de cada caso. Los animales de susceptibilidad intermedia, desde nuestro punto de vista, constituyen el grupo más adecuado para el estudio de los cambios inmunopatológicos que ocurren durante la infección. En nuestra experiencia, los ratones NIH muestran una susceptibilidad a la lepra similar a la de los ratones BALB/c, desarrollan una enfermedad benigna (tuberculoide) que luego evoluciona a su forma maligna (lepromatoide).

Aspectos inmunológicos de la lepra murina

La enfermedad evoluciona básicamente en dos etapas: una etapa inicial en la cual se genera un estado de inmunidad celular, aparentemente eficiente pero de corta duración. Durante esta etapa, la proliferación de linfocitos inducida por antígeno es óptima, como también es óptima la activación de los macrófagos en las lesiones tempranas de la lepra. Conforme la enfermedad avanza, el estado de inmunidad conferido por la infección comienza a desvanecerse hasta desaparecer por completo en las etapas avanzadas de la enfermedad. La pérdida de inmunidad protectora ocurre en forma paralela a la expresión de la inmunidad humoral contra MLM, y a la replicación de los bacilos en las lesiones, que en consecuencia aumentan en número y tamaño. La inmunidad protectora en la etapa temprana de la infección se deduce del estado de activación bioquímica de los macrófagos (que se tornan �galactosidasa-positivos), del bajo número de bacilos contenidos en estas células, y de la tinción granular que presentan muchos de ellos (Fig. 1) (Rojas-Espinosa y col, 1988). Como en la lepra de los humanos, la pérdida en la respuesta inmune celular es al principio específica para el microorganismo causal (MLM) pero después se hace más general, llegando a afectar también la respuesta humoral contra antígenos timo dependientes (Rojas-Espinosa O y col, 1976).

Figura 1. Activación bioquímica de los macrófagos y cantidad de BAAR presentes en los granulomas de ratones infectados con MLM.

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El granuloma de la lepra murina La lesión primaria de la lepra humana y murina es el granuloma. Aunque no hay datos sobre las características del granuloma inicial (porque en los humanos los pacientes se descubren mucho tiempo después de la primoinfección, cuando la enfermedad ya se ha establecido, y porque en el ratón las lesiones en los órganos blanco son conspicuas también hasta varias semanas después de la infección), suponemos que la reacción inflamatoria primaria es de tipo polimorfonuclear y que esta reacción inicial estimula la acumulación de macrófagos y linfocitos, es decir la formación del granuloma, y la primera respuesta inmunitaria en contra del bacilo de la lepra. En consecuencia, los cambios inmunológicos que ocurren en este granuloma incipiente tampoco son conocidos. Para el tiempo en el que ya se observan los granulomas tempranos en los órganos blanco, es posible que el ambiente inmunológico del granuloma, y del hospedero mismo, se encuentre ya modificado, de alguna manera, por la infección. Glicoproteína ácida α-1 (AGP) La AGP, también conocida como �orosomucoide�, es una glicoproteína constituyente del suero normal cuyos niveles se elevan en estados de inflamación aguda, neoplasias, artritis reumatoide y quemaduras severas. A pesar de que esta proteína se conoce desde hace muchos años sus funciones no son bien conocidas (Chiu y col., 1977; Cheresh y col., 1984; Kushner y Mackiewics, 1987). La AGP es una proteína de 41-43 kDa, altamente glicosilada (cerca del 45%). En el ratón se han identificado 2 isoformas, AGP1 y AGP2, de 187 aminoácidos cada una, con cinco y seis sitios de glicosilación, respectivamente. Aunque se sintetiza principalmente en el hígado también se ha encontrado en procesos inflamatorios del pulmón y otros órganos (Fournier y col, 2000), y en los macrófagos alveolares del humano y de las ratas sujetos a diversos estímulos inflamatorios (Crestani B y col., 1998: Fournier y col 1999). Las citocinas IL-1 e IL-6 y los glucocorticoides se han identificado como los moduladores principales de su expresión en el hígado de diversas especies, entre ellas, el humano, la rata, el ratón y el conejo (Vannice y col., 1984; Thomas y col., 1989; Fournier y col., 2000). In vitro la AGP inhibe la función de las células T: blastogénesis, proliferación en cultivos de mezclas de linfocitos, proliferación en respuesta a mitógenos, y formación de rosetas E. También inhibe la quimiotaxis de PMN y la generación de anión superóxido por estas células, así como la agregación plaquetaria. En monocitos y macrófagos induce la expresión de citocinas y receptores como IL-1Ra, TNF-α, IL-1�, IL-6, IL-12 y sTNFR, entre otros (Tilg y col., 1993; Hochepied y col, 2003). In vivo, la AGP protege a ratones del choque letal inducido por TNF (Libert y col., 1994) y muestra un efecto anti-infeccioso al proteger a los eritrocitos murinos de la infección por Plasmodium falciparum (Friedman, 1983). También se ha visto que la AGP se une al receptor CCR5 de los macrófagos humanos e inhibe la infección de estas células por el VIH-1 (Mbemba y col., 2001). En la tuberculosis pulmonar experimental se ha observado una relación directa entre la expresión de esta glicoproteína y el progreso de la infección, habiendo mayor expresión de AGP en

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la etapa tardía de la enfermedad donde predomina un ambiente anti-inflamatorio (Hernández-Pando et al., 1998). Ciclooxigenasa-2 (COX-2). La ciclooxigenasa (COX) es una enzima que participa en el metabolismo del ácido araquidónico, y de ella se reconocen 2 isoformas, una constitutiva (COX-1) y una inducible (COX-2). La enzima constitutiva, COX-1, está presente en casi todas las células mientras que COX-2 se induce en un número de células por estímulos proinflamatorios y por varios factores de crecimiento, entre ellos el factor de crecimiento epidérmico (EGF), el factor de crecimiento de fibroblastos, el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), el factor de crecimiento tumoral beta (TGF-β), el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), y la interleucina-1 (IL-1) (Xie y col., 1992). Los macrófagos sintetizan COX-2 en respuesta a estímulos inflamatorios inducidos por infección, que también incluyen citocinas y factores de crecimiento (Vane y col., 1998). La enzima convierte al ácido araquidónico en prostaglandina H2 de la cual derivan todos los prostanoides y que incluyen a las otras prostaglandinas, a la prostaciclina y al tromboxano A2, todos ellos potentes mediadores de inflamación (Vane, 1994). Sintasa inducible del óxido nítrico (iNOS). Uno de los efectores microbicidas más poderosos que poseen los macrófagos es el óxido nítrico (NO) (Adams y col, 1990, 1991; Akaki y col, 1997; Cunha y col, 1993; Fazal, 1996; Fierro y col, 1996). El NO se libera como biproducto del metabolismo de la L-arginina cuando este aminoácido se transforma en L-citrulina por la sintasa inducible del óxido nítrico (iNOS). De esta enzima se conocen tres isoformas, dos constitutivas y una inducible. Las enzimas constitutivas se encuentran en tejido neuronal (bNOS) y en las células endoteliales (eNOS) en tanto que la enzima inducible iNOS se produce principalmente por macrófagos y otras células con capacidad fagocítica. Algunas células, como las de Langerhans, sintetizan más de una isoforma de la enzima pero aunque estas células produzcan tanto eNOS como iNOS, no hay datos que sugieran que esta propiedad les confiera mayor capacidad microbicida. La expresión de iNOS no es detectable en los macrófagos en reposo pero su síntesis se incrementa notablemente en los macrófagos activados por citocinas tales como el IFN-γ y el TNF-α (Chan y col, 1992; Denis, 1991a, Denis, 1991b; Liew y col, 1990; Gunsegaran y col, 1993; Gazzinelli y col, 1992; Frankova y col, 1998). Aunque se ha descrito que esta secuencia de eventos (IFN-γ→TNF-α→iNOS→NO) ocurre in vivo, ahora se sabe que in vitro algunos microorganismos y sus productos son capaces de inducir la síntesis de TNFα de manera directa, sin la participación del IFN-γ (TNF-α→iNOS→NO) (Valone SE y col, 1998). La inducción de iNOS y la producción de NO, es una propiedad desventajosa de las micobacterias no patogénicas como M. Bovis, BCG. Por el contrario, las micobacterias patógenas, como MLM, M. leprae y M. tuberculosis, son capaces de infectar a los macrófagos sin que estos respondan eficientemente con la producción de TNF-α o de NO (Rojas-Espinosa y col, 2002), lo que representa un mecanismo de evasión de estas bacterias.

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Tratando de relacionar el papel de la cicloxigenasa 2 con el de la iNOS en un modelo de inflamación granulomatosa, Vane y col (1994) inocularon ratones con aceite de Croton tiglium en adyuvante completo de Freund por la vía subcutánea. Encontraron que la actividad de COX-2 aumentó continuamente hasta alcanzar un pico en el día 14 mientras que la expresión de COX-1 (constitutiva) se mantuvo sin cambio hasta el día 21, fecha en la que se terminó el estudio. iNOS, por otro lado, mostró su pico de máxima actividad entre los días 3 y 7 y disminuyó después. La expresión de iNOS y de COX-2 en la etapa aguda de la inflamación sugiere un papel proinflamatorio de los prostanoides y del óxido nítrico en esta etapa (Vane y col, 1994). También existen algunos reportes sobre la contribución de las prostaglandinas como mediadores de inflamación en infecciones causadas por micobacterias. Se ha observado que las lesiones tuberculoides de la lepra expresan menor cantidad de COX-2 que las lesiones lepromatosas (Kiszewski y col., 2003). Esta observación y el hallazgo de que la prostaglandina PGE2 sea capaz de suprimir la inmunidad celular ha llevado a considerar la posibilidad de que las prostaglandinas jueguen un papel importante en la anergía celular característica de los pacientes con lepra lepromatosa. Algo similar se ha sugerido en la tuberculosis experimental (Rangel y col., 2002; Kiszewski y col., 2003). Nitrotirosina (NT) Como ya hemos mencionado iNOS es la enzima encargada de generar NO y este es un metabolito muy importante en la eliminación de bacterias por macrófagos. El NO generado reacciona rápidamente con el anión superóxido (un intermediario del metabolismo del oxígeno) para formar peroxinitritos (ONOO-) que funcionan como oxidantes fuertes. A pH neutro los peroxinitritos están parcialmente protonados, como ácido peroxinitroso (ONOOH), que se descompone rápidamente formando intermediarios con reactividad similar al ión hidroxilo (.OH), y dióxido de nitrógeno (.NO2). El anión peroxinitrito es por si mismo un poderoso agente oxidante que reacciona rápidamente con residuos de cisteína y metionina de las proteínas. Los peroxinitritos y el ácido peroxinitroso también nitrosilan e hidroxilan proteínas con residuos aromáticos como la tirosina. La nitrosilación e hidroxilación de la tirosina afecta la función de las proteínas transductoras de señales, al interferir con la actividad de proteín cinasas, fosforilasas y fosfatasas necesarias para su activación (Van der Vliet y col., 1995). La nitrosilación de la tirosina no solo afecta la función de las proteínas transductoras de señales, también parece participar en el daño degenerativo de células y tejidos, como lo sugieren los reportes sobre la presencia de nitrotirosina (NT) en las lesiones ateroescleróticas y sinoviales en pacientes con artritis reumatoide y en las lesiones en los nervios en los pacientes con lepra. La presencia de NT y de iNOS en las lesiones de pacientes con lepra tuberculoide subpolar sugiere que el NO y los peroxinitritos participan en el daño a nervios en estos pacientes (Little, 2001; Schon y col, 2001; 2004). En otro estudio, Hernández-Pando y colaboradores (2001) encontraron la presencia de NT en las lesiones pulmonares de la tuberculosis experimental en el ratón. La participación de la NT parece ser un factor común en la patología de los desórdenes de origen infeccioso y de evolución crónica.

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JUSTIFICACIÓN La lepra de los ratones, como la lepra humana, es una enfermedad de evolución crónica donde la lesión principal es el granuloma. Conforme transcurre el tiempo de infección, los granulomas maduran y este proceso de maduración propicia las condiciones para la replicación del bacilo de la lepra. No se conocen a ciencia cierta, ni los estímulos moleculares que inducen la formación del granuloma, ni los factores que regulan su maduración. Se han descrito diversas proteínas con actividad inflamatoria o anti-inflamatoria en algunos modelos de inflamación crónica, cuyo estudio podría ayudarnos a entender los mecanismos de inducción, maduración y regulación de los granulomas, y su relación con el destino de M. lepraemurium y el progreso de la enfermedad. HIPÓTESIS Durante la maduración de los granulomas en la lepra murina, las proteínas y otros mediadores que confieren un ambiente inflamatorio, propician un estado de inmunidad celular y restringen la replicación del bacilo de la lepra; las proteínas y otros mediadores que confieren un ambiente anti-inflamatorio al granuloma, propician el estado de anergía celular y permiten la replicación del bacilo. OBJETIVO GENERAL: Analizar la expresión de proteínas pro-inflamatorias y anti-inflamatorias, y la presencia de MLM, en los granulomas de la lepra murina a lo largo del tiempo de enfermedad. OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

I. Analizar la expresión de la proteína AGP durante la maduración de los granulomas de la lepra murina.

II. Analizar la expresión de la enzima COX-2 durante la maduración de los granulomas de la lepra murina.

III. Analizar la expresión de la enzima iNOS y del producto de su actividad (NO) durante la maduración de los granulomas de la lepra murina.

IV. Analizar la replicación de MLM durante la maduración de los granulomas de la lepra murina.

V. Correlacionar la expresión de AGP, COX-2, iNOS y MLM durante la maduración de los granulomas de la lepra murina.

MATERIALES Y MÉTODOS

I. Preparación de la suspensión de Mycobacterium lepraemurium. Mycobacterium lepraemurium se aisló de los tejidos de ratones NIH con 4 a 5 meses de infección leprosa usando una combinación de las técnicas de Prabhakaran (1976) y Draper (1980). Las suspensiones se mantuvieron congeladas en medio de cultivo Middlebrook 7H9 adicionado con 10 % de OADC (acido oleico, dextrosa, albúmina y catalasa) hasta su uso.

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II. Determinación de viabilidad bacilar El grado de viabilidad de la suspensión de MLM se determinó por la técnica de Jarnagin y col (1980) utilizando los cromógenos fluorescentes diacetato de fluoresceína y bromuro de etidio. Las bacterias vivas hidrolizan al diacetato de fluoresceína, expulsan al bromuro de etidio, y emiten fluorescencia verde. Las bacterias muertas no hidrolizan al diacetato de fluoresceína, no expulsan al bromuro de etidio y emiten fluorescencia roja. Se pesó 1 mg de diacetato de fluoresceína (FDA) y se disolvió en 2 ml de acetona. Por otro lado, se pesó 1 mg de bromuro de etidio (BE) y se disolvió en 0.5 ml de PBS. La solución de trabajo se preparó adicionando a 5 ml de PBS, 20 �l de la solución de FDA y 10 �l de la solución de BE. Para medir la viabilidad, la suspensión de bacilos se mezcla con la solución de BE-FDA, se incuba durante 20 min a 37ûC en oscuridad y luego se observa, entre porta- y cubre-objetos, en el microscopio de fluorescencia. El grado de viabilidad en la suspensión se establece por conteo de las bacterias verdes y rojas en un área determinada del campo microscópico.

III. Inoculación de ratones con M. lepraemurium y recolección de las muestras de hígado.

Se inoculó un grupo de ratones NIH, hembras, de 30 g de peso, con 50 x 106 MLM por la vía intraperitoneal (IP). Después, cada 8 días, durante 5 meses, se sacrificaron 10 animales y de ellos se colectaron fragmentos de hígado para determinar en los cortes histológicos la presencia de AGP, COX-2, iNOS y bacilos alcohol ácido resistentes (BAAR), a lo largo de la infección. Simultáneamente se sacrificaron animales sanos como controles de la infección.

IV. Anticuerpos empleados Los anticuerpos primarios empleados en este trabajo fueron obtenidos de diferentes casas comerciales. El anticuerpo anti-nitrotirosina fue un monoclonal de ratón de Zymed (32-1900). El anticuerpo anti-sintasa inducible del óxido nítrico ( iNOS) fue un policlonal de conejo de Santa Cruz Biotechnology (sc-650). El anticuerpo anti-AGP fue producido por ResGen (Invitrogen Co., USA, lote D142-505) y proporcionado por el Dr. Erasmo Martínez del Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias (INER, SS, México). El anticuerpo anti -ciclooxigenasa 2 (COX-2) fue un anticuerpo policlonal de cabra de Santa Cruz Biotechnology (s-1747). Los anticuerpos secundarios (marcados con peroxidasa) fueron, un anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón de Jackson ImmunoResearch (205-035-108), un anticuerpo anti IgG de conejo de SIGMA (A-6667) y un anticuerpo de conejo anti-cabra producido en nuestro laboratorio.

V. Preparación de los cortes de tejido para inmunohistoquímica Inmediatamente después de sacrificar los animales, se extrajo el hígado del cual se seleccionaron fragmentos y se procesaron para hacer cortes en congelación. Los fragmentos de hígado se embebieron en �Tissue Tek�, se congelaron, y se cortaron en secciones de 3 a 4 �m de grosor, en un crióstato Tek Division de Miles, Modelo 4553. Los cortes se adhirieron a portaobjetos perfectamente limpios (Fig. 2) y se fijaron con acetona helada (-20oC) durante 10 min. Las laminillas se recuperaron y la

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acetona se dejo evaporar al aire libre. Las preparaciones fijadas se mantuvieron a temperatura ambiente (TA) hasta su uso.

Figura 2. Disposición de los cortes de hígado en las laminillas de vidrio. La imagen es un ejemplo de cómo se observan los portaobjetos con las secciones de hígado.

VI. Tinción para bacilos. La tinción de bacilos ácido-alcohol resistentes (BAAR) se hizo utilizando el colorante de Ziehl-Neelsen, de la siguiente manera: 1. Sumergir las laminillas en PBS durante 5 min. Repetir dos veces este

procedimiento. 2. Teñir las secciones histológicas durante 15 min con Fucsina-Fenicada de Ziehl-

Neelsen previamente calentada a emisión de vapores. 3. Enjuagar las laminillas con agua corriente hasta eliminar el exceso de colorante 4. Enjuagar las laminillas con alcohol acidulado (HCl al 1% en etanol al 70%)

durante 30 segundos para eliminar el exceso de colorante de los cortes histológicos.

5. Teñir los cortes con hematoxilina férrica durante 10 min. 6. Enjuagar las laminillas con alcohol acidulado durante 30 seg, enjuagar con

agua corriente (30-60 seg) y con agua amoniacal durante 30-60 segundos. 7. Recuperar las laminillas, dejarlas secar al aire y montar las preparaciones con

resina sintética. 8. Observar al microscopio y registrar los resultados. VII. LINE BLOT* (Titulación de los anticuerpos empleados). 1. Preparar las diluciones de los anticuerpos que se van a titular. 2. Preparar una membrana de nitrocelulosa de 10 x 10 cm. 3. Trazar líneas horizontales con cada dilución del anticuerpo sobre la membrana

de nitrocelulosa (el diseño y la separación de las líneas las decide el investigador según sus necesidades). Si se cuenta con un dispositivo para realizar un Western Blot múltiple, usarlo, si no, cortar tiras verticales de la membrana de nitrocelulosa, de 0.5 cm de ancho (Fig. 3).

4. Depositar las tiras en charolas para Western Blot y humedecerlas con PBS 0.15M, pH 7.4, durante 10 min (1 ml/ tira)

5. Retirar el PBS y sustituirlo con 1 ml de albúmina bovina al 3% en solución salina boratos SSB. Incubar a temperatura ambiente (TA) durante 30 min.

6. Adicionar a cada tira, 1 ml de cada una de las diluciones del anticuerpo secundario marcado con peroxidasa, e incubar durante 2 horas a TA.

7. Lavar las tiras con 1 ml de Tween 20 al 0.01 % en SSB durante 5 min. Repetir el procedimiento de lavado 2 veces más.

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8. Retirar la solución de lavado y adicionar 1 ml de la solución de substrato-cromógeno. Incubar a TA durante 15 min hasta la aparición de las bandas coloridas.

9. Enjuagar las tiras con agua, secarlas y registrar los resultados. VIII. Procedimiento inmunohistoquímico para la detección de iNOS, COX-2, AGP y NT. 1. Hidratar los cortes con PBS durante 5 min. Repetir el proceso de lavado, 2

veces más. 2. Incubar los cortes con la solución permeabilizante (Tritón X-100 al 0.25% en

PBS) durante 5 min. 3. Lavar los cortes con PBS durante 5 min y tratarlos con ácido peryódico al

0.228% en agua durante 2 min. 4. Lavar los cortes con PBS durante 5 min, y tratarlos con albúmina bovina al 2%

en PBS durante 30 min. 5. Incubar los cortes con el anticuerpo primario apropiadamente diluido durante

toda la noche a TA. 6. Lavar los cortes con PBS durante 5 min; repetir el proceso de lavado 2 veces

más. 7. Incubar los cortes con el anticuerpo secundario previamente titulado durante 2

horas a TA. 8. Lavar los cortes con PBS durante 5 min a TA; repetir el lavado 2 veces más. 9. Incubar los cortes en la solución de sustrato cromógeno (2 mg de 3,3-

diaminobencidina y 10 µl de peróxido de hidrógeno al 30% en 10 ml de regulador de acetatos, pH= 5.0) durante 10 a 15 min.

10. Lavar los cortes con agua destilada durante 5 min. 11. Recuperar las laminillas, dejarlas secar al aire y teñirlas con hematoxilina

férrica (recién preparada) durante 10 min. 12. Enjuagar las laminillas con alcohol acidulado durante 30 segundos,

enjuagarlas con agua corriente y luego con agua amoniacal durante 30 segundos.

13. Dejar secar las preparaciones, sumergirlas en xilol durante 1 min, y montarlas con resina sintética.

14. Observar las preparaciones al microscopio y registrar los resultados relativos a la presencia de iNOS, COX-2, AGP, NT y BAAR.ç

RESULTADOS La lesión característica de la lepra es el granuloma y en él se decide el destino de la micobacteria y de la enfermedad. Puesto que diversos factores, tanto derivados de las micobacterias (principalmente lípidos) como de las células de la lesión (macrófagos) pueden participar en la formación y maduración del granuloma, decidimos estudiar la participación de 3 proteínas que pudieran jugar algún papel en este proceso: COX-2, AGP e iNOS, así como del producto de reacción entre el óxido nítrico y el anión superóxido (NT).

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Granulomas y su evolución Aunque la infección se establece desde el momento mismo de la inoculación del bacilo, el tiempo de aparición de las lesiones varía según el sitio estudiado. Las lesiones aparecen primero en la grasa asociada a las membranas del peritoneo (omentum), después se observan en el bazo, luego en el hígado y más tarde en la piel y otras estructuras. La naturaleza no linfoide del hígado y su gran volumen nos indujo a estudiar en este órgano la aparición y la evolución de las lesiones a lo largo del tiempo de infección. Las primeras lesiones fueron discernibles hasta la semana 5 y fueron pequeñas colecciones de macrófagos constituidas por no más de 20 células en el plano del corte histológico (Fig. 6). A partir de este tiempo, los granulomas incrementaron en número y tamaño en forma discreta, más o menos constante hasta la semana 19 de infección. Después, entre las semanas 20 y 21, las lesiones aumentaron en área y volumen de manera muy acelerada. Aunque los tiempos en los que ocurren estos cambios pueden cambiar de experimento a experimento, la curva de crecimiento de la fracción granuloma es comparable en forma, así que algún tipo de control en el desarrollo de las lesiones debe operar hasta muy avanzada la enfermedad, después este control se pierde en las etapas terminales de la misma. La figura 4 muestra el área promedio de los granulomas que aparecen a lo largo del tiempo de infección.

Figura 4. Área promedio de los granulomas hepáticos en función de las semanas de infección. La línea negra indica la tendencia del incremento del área de los granulomas. Replicación de Mycobacterium lepraemurium en las lesiones hepáticas de la lepra murina. Aunque la presencia de granulomas hepáticos fue evidente desde la semana 5 de infección, los bacilos no fueron evidentes sino hasta las semanas siguientes. El número de bacilos fue escaso en estos tiempos tempranos de la enfermedad pero mostró una tendencia a aumentar hasta la semana 7 donde alcanzó su máximo (aprox 20 bacilos/granuloma), luego declinó en la semana 8 (menos de 10 bacilos/granuloma). Después de esta semana el número de bacilos se incrementó en forma logarítmica hasta hacerse incontable después de la semana 11 (Fig. 5).

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El escaso número de bacilos de la semana 5 a la semana 8, sugiere que durante este periodo existe un control eficiente de la infección.

Figura 5. Cantidad de bacilos por granuloma hepático en ratones NIH a lo largo de la infección con MLM. La línea punteada indica la tendencia en el incremento de los bacilos en las lesiones.

Figura 6. Maduración de los granulomas hepáticos de ratones infectados con MLM (100X). La presencia de bacilos se hizo evidente desde la semana 5 de infección (los círculos encierran 2 grupos de bacilos en esta semana). Hacia la semana 7 los granulomas son de mayor tamaño y contienen más bacilos dispersos (flechas). A partir de la semana 11 el número de bacilos se incrementó en forma logarítmica hasta ocupar la totalidad del granuloma en la semana 21.

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Detección de COX-2, AGP, iNOS y NT en las lesiones de la lepra murina La detección de estas moléculas requirió del uso de anticuerpos dirigidos contra las mismas. Los resultados que se muestran más adelante para cada molécula se obtuvieron con los anticuerpos titulados por la técnica de �LINE BLOT� desarrollada en el laboratorio. Con esta técnica pudimos escoger una dilución conveniente de los anticuerpos primario y secundario usados en la detección inmunohistoquímica de las moléculas estudiadas. La figura 7 muestra, como ejemplo, el resultado del LINE BLOT empleado para titular el anticuerpo primario de conejo anti-AGP y su anticuerpo secundario correspondiente (cabra anti-conejo, acoplado a peroxidasa). De los resultados mostrados, elegimos la combinación de diluciones 1:100 del anticuerpo primario y 1:400 del secundario por considerar que la intensidad del producto colorido podría ser adecuada cuando la técnica se aplicase a los cortes histológicos. Como se observa en la figura, hay una amplia gama de combinaciones posibles que también podrían dar un resultado satisfactorio.

Figura 7. Técnica de LINE BLOT (resultado). LINE BLOT para titular el anticuerpo anti-AGP y el anticuerpo secundario de cabra anti-AGP acoplado a peroxidasa. La flecha indica la combinación de diluciones elegidas para la determinación de AGP por inmunohistoquímica en el presente trabajo. Dilución 1:100 del anticuerpo primario y 1:400 del anticuerpo secundario. Esta técnica se empleó para titular todos los anticuerpos primarios y secundarios usados en el estudio.

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Histología normal del hígado de ratones NIH sin infectar. Antes de analizar los cortes histológicos de los ratones infectados con MLM, fue necesario conocer la histología normal del hígado con la finalidad de identificar con claridad las modificaciones inducidas por la infección y para identificar las poblaciones celulares que conforman las lesiones. En la figura 8 se muestran secciones histológicas de este órgano teñidas solamente con hematoxilina férrica.

Figura 8. Parénquima hepático normal. Las imágenes muestran la histología normal del hígado de ratón. En A (10 X) se muestra la arquitectura normal del parénquima hepático; se observan dos vasos sanguíneos (el mayor señalado por una flecha) y los hepatocitos teñidos con hematoxilina férrica (azul). En B se muestra el hígado observado a mayor aumento (40 X). Expresión de iNOS, NT, COX-2, AGP en hígado de ratón normal Como era de esperarse, mientras que las proteínas iNOS y COX-2 no se expresan de manera constitutiva en el tejido hepático normal, la AGP muestra una expresión tenue homogénea en todo el parénquima hepático, hecho que no es sorprendente ya que se ha descrito que el hígado es una fuente natural de esta proteína (Fig. 9). En cuanto a NT, nos llamó la atención su presencia en varios vasos sanguíneos del hígado normal y suponemos que esto es el reflejo de la actividad de la óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS). Esta enzima se activa por diversas razones que modifican la homeostasis del tejido en general, entre ellas, la hipoxia y el estrés, situaciones ambas, que pudieran ocurrir en los animales sanos cuando se sujetan a los procesos de anestesia, muerte y sangrado, antes de extraer el hígado.

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Figura 9. Tinción con los anticuerpos anti-iNOS, anti-NT anti-COX 2 y anti-AGP en el hígado de ratones sanos (controles negativos, 40X). Como puede observarse, iNOS, COX-2 y AGP no se observan en el hígado normal pues su expresión se induce por diversos factores patológicos. La tinción para NT, por otro lado, muestra la expresión de NT en el endotelio de un vaso sanguíneo, seguramente su expresión es el resultado de la actividad de eNOS inducida por el estrés al que fue sometido el animal en su manejo y hasta su sacrificio. Expresión de la glicoproteína ácida α 1 (AGP) En la Figura 10 podemos observar la tendencia de expresión de la AGP, donde se señala la presencia de esta molécula desde el inicio de la infección, hasta la etapa tardía de la misma donde seguramente tiene un papel más relevante. El nivel de expresión de todas las moléculas analizadas en este trabajo se hizo utilizando una escala arbitraria construida sobre la base de la intensidad del color generado en la reacción: peroxidasa-peróxido de hidrógeno-3-3, diaminobencidina. La escala fue de 3 (máxima intensidad), 2 (intensidad intermedia), 1 (baja intensidad) y 0 (ausencia de color).

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Figura 10. Expresión de AGP en granulomas hepáticos de ratones infectados con MLM en función del tiempo de infección. La línea verde muestra la evaluación visual y la línea negra muestra la curva de tendencia. Expresión de la ciclooxigenasa 2 (COX-2) En la Figura 11 podemos apreciar que la tendencia de expresión de esta molécula es máxima en la etapa intermedia de la infección y disminuye notablemente en la etapa tardía de la misma.

Figura 11. Expresión de COX-2 en granulomas hepáticos de ratones infectados con MLM. La línea roja corresponde a la apreciación visual, en tanto que la línea negra muestra la curva de tendencia. Expresión de iNOS. iNOS es una molécula que transforma a la L-arginina en L-citrulina al mismo tiempo que propicia la liberación de óxido nítrico (NO). El NO es un metabolito altamente tóxico relacionado con la eliminación de microorganismos, sobre todo aquellos de vida intracelular. iNOS aparece en forma abundante desde la semana 5 de infección, tiempo en el que son discernibles los primeros granulomas, y su expresión se mantiene alta hasta la semana 18. Después de esta semana su expresión tiende a disminuir y en la semana 21 (final del experimento) la enzima ya no es visible en los granulomas bacilíferos aunque algo de la enzima se

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mantiene en las células de de la periferia del granuloma La presencia de bacilos sigue el comportamiento usual, un crecimiento restringido durantes las primeras 8 semanas y un crecimiento �explosivo� a partir de la semana 10 (Figura 12).

Figura 12. Expresión de iNOS en granulomas hepáticos de ratones infectados con MLM. Línea azul: evaluación visual; línea negra: curva de tendencia. Presencia de nitrotirosina (NT) en granulomas hepáticos. La nitrotirosina es el producto de reacción de peroxinitritos con proteínas tirosiniladas. Los peroxinitritos, son a su vez, los productos de reacción del óxido nítrico con el anión superóxido y otros radicales libres del oxígeno. La presencia de NT indica así, los sitios de reacción de los peroxinitritos en el tejido estudiado. La presencia de esta molécula no pudo ser observada en las primeras semanas de infección sino hasta la semana 8, a niveles bajos. A partir de esta semana la presencia de NT incrementó paulatinamente hasta la semana 21, fecha de terminación del experimento. Contrario a lo que pudiera esperarse, el aumento sostenido en cuanto a la presencia de NT fue paralelo al aumento en el número de bacilos, lo que sugiere que no son los bacilos el sustrato de los peroxinitritos sino, probablemente, los macrófagos del granuloma.

Figura 13. Expresión de nitrotirosina en granulomas hepáticos de ratones infectados con MLM. Línea vino: evaluación visual; línea negra: curva de tendencia.

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Relación entre la expresión de iNOS y la presencia de NT. Un hallazgo muy importante para nosotros fue la presencia contrastante de iNOS y nitrotirosina durante todo el tiempo del estudio y claramente evidente en la semana 21. La ausencia de iNOS en los granulomas y la presencia de NT en los mismos, sugiere que la NT se encuentra en las células del granuloma y no en los bacilos. En la Figura 14 se muestra la expresión, inversamente proporcional, de estos dos marcadores.

Figura 14. Tendencias de la expresión de AGP, COX-2, iNOS y NT en granulomas hepáticos de ratones infectados con MLM.

Inte

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DISCUSIÓN Una de las líneas de investigación del laboratorio es el estudio de la lepra murina. Nuestro objetivo es entender los mecanismos inmunopatológicos que suceden durante la enfermedad. En nuestra experiencia, la enfermedad se desarrolla en dos etapas, una relativamente temprana que abarca los primeros 2.5 meses (aproximadamente) de la infección y una etapa tardía que dura el resto del tiempo (Rojas-Espinosa y col., 1988). Debemos señalar, sin embargo, que esta descripción es aplicable a la enfermedad inducida en ratones susceptibles (BALB/c y NIH) inoculados con 50 x 106 bacilos por la vía intraperitoneal y que el tiempo de duración de cada etapa se modifica si la ruta de infección y la dosis de bacilos cambian. Bajo estas condiciones la etapa inicial se caracteriza porque en ella opera la inmunidad celular mientras que en la etapa tardía predomina la respuesta humoral. Durante la etapa inicial, la inmunidad celular, reflejada en la intensa activación bioquímica de los macrófagos, mantiene bajo control la replicación de los bacilos de la lepra sugiriendo la posibilidad del control definitivo de la enfermedad y su erradicación total. En esta etapa, las características histopatológicas de la lepra murina coinciden con las características de la lepra tuberculoide en los humanos. La evolución de la enfermedad, sin embargo, dista mucho de ser detenida. Por razones todavía desconocidas, la activación bioquímica de los macrófagos se pierde al final de la primera etapa de la enfermedad, como también se pierde su capacidad de limitar la replicación del bacilo. Suponemos, pero no lo hemos probado de manera definitiva, que la pérdida de la función microbicida de los macrófagos se debe a un cambio en la inmunidad operante en las lesiones de la lepra, derivado de la activación secuencial de una población celular mediadora de inmunidad celular (células Th1, por ejemplo) seguida de la activación de una población celular con funciones anti-inflamatorias (Th2 y/o reguladoras). El hecho de que los niveles de anticuerpos anti-MLM se incrementen sostenidamente desde el inicio de la segunda etapa de la infección, sugiere la activación de una población Th2 más que la activación de otras células reguladoras, aunque su posible participación no puede ignorarse. Durante la segunda etapa de la infección y sobre todo en la fase tardía, la histología de las lesiones de la lepra es altamente reminiscente de la lepra lepromatosa en el humano. Es de esperarse que además de citocinas, otros mediadores participen en la evolución y maduración de los granulomas en la lepra. En este estudio analizamos la participación de tres proteínas que según la literatura pueden tener un papel pro-inflamatorio y/o anti-inflamatorio en lesiones inducidas en diferentes formas, entre ellas, la infección. Lesiones.- Como en otros estudios similares del laboratorio, las primeras lesiones en el hígado de los animales infectados con MLM por la vía IP, fueron discernibles hasta la semana 5 de infección en la mayoría de los animales. Las lesiones fueron colecciones discretas de células con apariencia de macrófagos y en este tiempo y en este órgano nunca vimos otras estirpes celulares formando parte de los granulomas. Debemos señalar que la descripción de las lesiones y su evolución la hacemos en el hígado primero porque este es un órgano blanco de la enfermedad y segundo, porque siendo un órgano no linfoide nos permite estudiar la

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composición celular de las lesiones y los cambios que suceden en las células, sin confundirnos con lo que podría ocurrir en las células del parénquima, como podría suceder en el caso del bazo. A partir de su aparición, las lesiones aumentaron progresivamente en número y tamaño hasta terminar sustituyendo al parénquima normal. En la etapa más avanzada de la enfermedad las lesiones fueron confluentes y la fracción granuloma ocupó casi la totalidad del órgano. Bacilos (BAAR).- Las primeras lesiones observadas en el hígado en este estudio estuvieron formadas por pocas células (12-20) en el plano del corte pero no contuvieron bacilos. Debido a que la lesión es la respuesta a la infección, la aparente ausencia de bacilos en las lesiones tempranas indica solamente la escasez de bacilos y no su ausencia. En experimentos previos de este tipo hemos podido observar de 1 a 3 bacilos por granuloma inicial. iNOs .- La composición esencialmente macrofágica de los granulomas desde su aparición temprana hasta su confluencia, el alto grado de activación bioquímica de los macrófagos en los granulomas tempranos y la escasez de bacilos en esta etapa, sugieren que los mecanismos microbicidas de los macrófagos operan sobre los bacilos restringiendo su capacidad o velocidad de proliferación. Dentro de estos mecanismos microbicidas, el óxido nítrico podría jugar un papel importante en el control antibacteriano. EL óxido nítrico se genera como biproducto de la conversión de la L-arginina a L-citrulina (Oswald y James, 1996; Hibbs, 1999; MacMicking y col, 1997). La enzima encargada de esta conversión es la óxido nítrico sintasa inducible, iNOS, la cual se induce por la acción de citocinas como IFN-γ y TNF-α sobre los macrófagos. Se sabe que el IFNγ interacciona con su receptor IFNγR en la membrana del macrófago y que esta interacción genera señales que se transducen al interior de la célula en una cascada que termina activando al gene TNFα cuyo producto (TNF-α) activa a su vez al gene iNOS. El gene activado lleva a la producción de iNOS cuyo efecto sobre la arginina ya hemos mencionado (Green y col, 1994; Skerret y Martin, 1996; Frankova y Zidek, 1998). Como es de suponerse, la infección de los macrófagos por microorganismos induce en estas células no sólo la expresión de iNOS sino también de algunas citocinas cuyos efectos pueden ser contrarios a la protección, como se ha visto en el caso de las infecciones por Leishmania major, Mycobacterium leprae y Mycobacterium tuberculosis. Estos microorganismos, causantes de infecciones crónicas, inducen la expresión de citocinas supresoras como el factor de crecimiento tumoral beta (TGF-β) el cual inhibe la producción de TNF-α y con esto la activación del gene iNOS y la producción de NO (Green y col., 1994; Hernández-Pando y col., 1997; Khanolkar-Young S y col., 1998). Nuestros resultados señalan que al inicio de la infección leprosa los pequeños granulomas observados muestran una alta expresión de iNOS y una muy reducida carga bacilar. Suponemos que en esta etapa de la infección la producción de NO también es elevada y que este puede ser uno de los mecanismos de control de la infección. Como los intermediarios reactivos del oxígeno (ROI), el NO puede tener un efecto nocivo directo sobre los microorganismos al producir cambios estructurales severos en los lípidos, ácidos nucleicos, carbohidratos y proteínas de los mismos (Rojas-Espinosa O., 2004). Conforme la infección progresa, la expresión de iNOS se reduce. Las causas de este fenómeno son difíciles de

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establecer pero son seguramente multifactoriales. Llama mucho la atención, por otro lado, que el producto de nitración del óxido nítrico, la nitrotirosina (NT), se detecte en forma abundante en las etapas finales de la infección, sobre todo porque estamos acostumbrados a pensar que la producción de NO depende de la actividad de iNOS. En teoría, el NO, interaccionando con los ROI, principalmente con el anión superóxido, produciría los peroxinitritos responsables de la nitrosilación de proteínas (Muijsers y col, 1997; Ischiropoulos, 1998). La posibilidad de que los radicales libres del oxígeno (ROI) se produzcan en etapas tardías de la enfermedad es muy poco probable ya que tenemos evidencias experimentales de la escasa o nula producción de ROI por macrófagos infectados in vitro con MLM (Rojas-Espinosa y col, 1998) y en todo caso, de producirse, los ROI alcanzarían niveles máximos en la etapa temprana de la enfermedad, cuando todavía es operante la respuesta inmune celular activadora de los macrófagos. Aunque es posible (pero poco probable), que los radicales libres del nitrógeno producidos en abundancia en la etapa temprana de la enfermedad se acumulen como peroxinitritos en la etapa tardía de la misma, también es posible que los peroxinitritos se formen de novo a partir del NO y los ROI producidos por la actividad residual de iNOS (Xia y Zweier (2001). Desconocemos la razón por la cual la presencia de NT no se observa en etapas tempranas de la enfermedad cuando todavía hay actividad importante de iNOS. El hecho es, que la nitrosilación observada en las etapas avanzadas de la enfermedad no parece tener como sustrato a los bacilos (y en estas etapas la cantidad de bacilos es inmensa) sino a las células de los granulomas, que en este tiempo están ya en franco proceso degenerativo. En la semana 21 (el final de nuestro experimento) los granulomas, ya de gran tamaño, se encuentran conformados por una zona macrofágica central altamente bacilífera y una zona periférica, sin bacilos evidentes y con escasa presencia de iNOS. La presencia de iNOS en esta zona puede corresponder a la actividad residual o remanente de la enzima expresada antes, o a la actividad incipiente de las células de reciente arribo al granuloma. La participación de NO, probablemente como peroxinitritos, en el daño tisular también se ha observado en la tuberculosis experimental en el ratón y en la lepra de los humanos. En el ratón, la presencia de NT se ha encontrado en las áreas neumónicas, mientras que en la lepra, la NT se ha observado en las zonas de necrosis de los nervios periféricos (Hernández-Pando y col, 2001; Schon y col, 2001, 2004). Khanolkar-Young y col (1998) determinaron por técnicas inmunohistoquímicas, la presencia de iNOS en las lesiones de pacientes con lepra, a lo largo de todo el espectro de la enfermedad. Encontraron alta expresión de la enzima en las lesiones tuberculoides (TT) y mayor expresión aún en las reacciones reversas de la lepra pero no encontraron la enzima en las lesiones de la lepra lepromatosa (LL), ni en las lesiones BL. Estos resultados indican que la expresión de iNOS ocurre bajo el ambiente pro-inflamatorio de la inmunidad celular. Ciclooxigenasa-2 (COX-2). Además del papel del óxido nítrico en el control de enfermedades causadas por microorganismos intracelulares, otros mediadores también juegan un papel importante. Tal es el caso de las prostaglandinas y otros prostanoides cuya producción tiene que ver con la actividad de la COX-2. En un estudio sobre tuberculosis experimental en el ratón, Rangel-Moreno y col (2002)

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encontraron una baja producción de PGE2 en la fase temprana de la enfermedad y una alta expresión en la fase tardía de la misma. Sugirieron que la baja producción temprana de PGE2 permitió la expresión de iNOS y que su incremento tardío inhibió la expresión de iNOS, su efecto protector vía la actividad de NO, y permitió el progreso de la enfermedad. De manera similar, Kiszewski y col (2003) encontraron alta expresión de COX-2 en las lesiones de pacientes con lepra lepromatosa que podría estar relacionada con la anergia de las células T observada en estos pacientes. En el presente estudio, nosotros encontramos que aunque la enzima COX-2 se expresa en los granulomas hepáticos desde la semana 5, su mayor expresión ocurrió entre las semanas 13 a 17. En este tiempo, aunque la presencia de iNOS es todavía importante, su expresión se encuentra en el proceso de disminución. Es posible que COX-2 participe, en cierto grado, en �el apagamiento� de iNOS, y de la activación bioquímica de los macrófagos en general, contribuyendo al progreso de la enfermedad. Vistos así, nuestros resultados coinciden con los de Rangel-Moreno y col (2002) y Kiszewski y col (2003).

Glicoproteína ácida α1 (AGP). Una molécula adicional relacionada con inflamación es la glicoproteína ácida α-1 (AGP) también llamada orosomucoide. A esta molécula se le han encontrado diversos efectos sobre una variedad de células como los linfocitos, los neutrófilos, las plaquetas y los monocitos. Sobre los monocitos/macrófagos esta molécula tiene la capacidad de inducir la síntesis de varias citocinas y receptores como IL-1Ra, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-12, y sTNFR (Tilg y col, 1993; Hochepied y col, 2003). Por el patrón de citocinas inducidas, es posible que la AGP tenga un efecto dual, induciendo tanto un ambiente pro-inflamatorio como uno anti-inflamatorio, dependiendo de las circunstancias y la fase de la enfermedad. Por su evolución crónica y su composición macrófagica pensamos que sería interesante estudiar la expresión de esta proteína en las lesiones de la lepra murina, sobre todo porque es posible explorar los cambios que ocurren en su expresión a lo largo del proceso de maduración de los granulomas y sus posibles efectos sobre MLM. Nuestros resultados indican que la AGP se observa desde las primeras cinco semanas de la infección, tiempo en el que los granulomas son visibles en el hígado como lesiones incipientes, aunque su expresión alcanzó su máxima intensidad hasta la semana 13. De aquí en adelante, su expresión se mantuvo casi sin cambio hasta el final del experimento, en la semana 21. Seguramente el establecimiento de los bacilos en los macrófagos induce la expresión de AGP y los fenómenos subsecuentes a su actividad como podría ser la producción de IL-1, IL-6 o PGE2 (Andus y col, 1988; Prowse y Baumann, 1989; Fouriner y col, 1999). Otra función importante de la AGP es su capacidad de inhibir tanto la quimiotaxis de PMN como su capacidad para generar ROIs; esta propiedad de la AGP podría explicarnos en cierta forma la ausencia de infiltrado neutrofílico en los granulomas inducidos por MLM en el hígado de los ratones NIH. Es claro que no conocemos los factores que regulan la expresión de AGP en las lesiones de la lepra murina pero es seguro que esta proteína juega un papel importante en las etapas tardías

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de la enfermedad porque en estas etapas su expresión es abundante, y quizá contribuya a mantener un ambiente anti-inflamatorio a favor de la proliferación del bacilo. En resumen, los resultados de este trabajo y de otros realizados previamente en el laboratorio indican que la infección leprosa en el ratón evoluciona en dos fases o etapas, una primera etapa que, bajo las condiciones de nuestro modelo de infección, dura más o menos hasta la semana 10, y una segunda etapa que dura hasta el final del experimento en las semanas 20 a 24. Después de la semana 24 (6 meses de infección), la incidencia de mortalidad es muy alta y los animales fallecen básicamente por disfunción orgánica múltiple ya que en este tiempo, hígado, bazo, médula ósea, peritoneo, y otras estructuras, están excesivamente alterados, transformados en granulomas afuncionales. En la primera etapa, la inmunidad celular es óptima (Rojas-Espinosa y col, 1988) y esto mantiene controlada la carga bacilar. La expresión de iNOS, COX-2 y AGP también se encuentran elevadas, sobre todo entre el final de la primera etapa y el inicio de la segunda etapa (semanas 10-14) y seguramente su alta expresión en este periodo está mas relacionada con actividad anti-inflamatoria que con protección. El ambiente anti-inflamatorio mantendría abatida la inmunidad protectora al mismo tiempo que sería propicio para la replicación del bacilo, ambos efectos en favor de la infección. En apoyo al ambiente anti-inflamatorio creado en la etapa tardía de la enfermedad está la disminución en la expresión de iNOS y COX-2, aunque la expresión de AGP se mantiene elevada. El papel dual de la AGP ya se ha descrito antes (Hochepied T y col., 2003) por lo que no nos sorprende su elevada expresión en esta etapa de la enfermedad, aunque no conocemos con precisión ni sus funciones ni mucho menos, sus mecanismos de acción. CONCLUSIONES 1. La lesión primaria de la lepra murina es el granuloma macrófagico, ya que

nunca observamos la presencia de lesiones con infiltrado polimorfonuclear. 2. Bajo las condiciones del estudio los granulomas en el hígado del ratón

aparecen hasta la semana 5 de infección. Desconocemos como es que los bacilos llegan a los órganos blancos a partir del sitio de inoculación en el peritoneo.

3. La presencia de bacilos en los tejidos es el factor que induce la formación de granulomas ya que nunca vimos bacilos en ausencia de granulomas.

4. Excepto por un periodo temprano de restricción, el número de bacilos en los granulomas tiende a aumentar sostenidamente. La replicación sostenida de M. lepraemurium induce, al mismo tiempo, el aumento en el tamaño de los granulomas.

5. La maduración de los granulomas se acompaña de la expresión de varios mediadores, entre ellos: la ciclooxigenasa 2 (COX-2), la sintasa inducible del óxido nítrico (iNOS) y la glicoproteína ácida α-1 (AGP). Todos estos mediadores se expresan en los granulomas desde la semana 5 pero evolucionan con una cinética particular: la expresión de COX-2 alcanza su máximo entre las semanas 13-17 de infección y después tiende a disminuir; la

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AGP alcanza su máxima expresión en la semana 13 y así se mantiene hasta el final del experimento en la semana 21; iNOS alcanza su mayor expresión hacia la semana 19

6. La disminución en la expresión de iNOS y el incremento en la expresión de COX-2 y AGP durante el transcurso de la enfermedad propician un ambiente anti-inflamatorio en el granuloma, que favorece la replicación de MLM y el progreso de la enfermedad.

7. La información actual sobre el papel de estas proteínas y los resultados de este trabajo no permiten conocer la correlación precisa entre la actividad de estas proteínas y su efecto sobre la maduración de los granulomas de la lepra murina. Es igualmente probable que su expresión esté relacionada una con otra, o que su expresión sea independiente y promovida por otros factores, principalmente por citocinas.

PERSPECTIVAS 1. Consideramos que este trabajo debe ser complementado con el análisis de la

expresión de citocinas con actividad pro-inflamatoria, anti-inflamatoria (TNF- �, INF-�, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, TGF-�) y otras citocinas (IL-2) durante todo el progreso de la enfermedad. Este análisis nos permitiría entender la manera en la que las citocinas participan en la maduración de los granulomas, además de que nos informará sobre su influencia en la expresión de las proteínas analizadas en este trabajo.

2. El análisis, por técnicas inmunohistoquímicas, del fenotipo o los fenotipos de las células que forman parte de los granulomas tempranos y tardíos, nos permitirá conocer el tipo de células que conforman los granulomas y los cambios en estas células durante el progreso de la enfermedad.

3. El estudio de los granulomas, su maduración, las células que los forman, la expresión de iNOS, COX-2, AGP y NT, la expresión de citocinas y la replicación de bacilos en el bazo, es otro aspecto que debemos abordar. Siendo el bazo un órgano linfoide, su estudio nos permitirá analizar la influencia de las células linfoides (linfocitos) y las citocinas que producen, en la formación y maduración de los granulomas macrofágicos.

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