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INFORME FINAL

Clave de registro CGPI: 20070217

“Identificación de los receptores membranales que participan en la entrada de

Mycobacterium lepraemurium a macrófagos murinos”:

DESARROLLO TÉCNICO DE LA INVESTIGACIÓN

(ANEXO)

Productos de la investigación

1. Dos estudiantes PIFI

2. Dos Tesis Doctorales (en proceso)

3. Dos presentaciones en Congresos internacionales.

4. Un artículo Publicado (ver documentos comprobatorios) y un artículo en

preparación.

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“Identificación de los receptores membranales que participan en la entrada de

Mycobacterium lepraemurium a macrófagos murinos”:

RESUMEN

Mycobacterium lepraemurium (MLM), el agente causal de la lepra en los ratones, es un parásito

intracelular de los macrófagos. A diferencia de M. bovis BCG y otras micobacterias no patógenas o

de baja virulencia, M. lepraemurium infecta a los macrófagos sin despertar en ellos los cambios

metabólicos responsables de su actividad microbicida, entre ellos, la producción de radicales libres

del oxígeno, la producción de óxido nítrico y la síntesis y liberación de factor alfa necrosante de

tumores (TNFα).

MLM tampoco induce en estas células su muerte por apoptosis. Penetra a los macrófagos

preferentemente a través de los extremos apicales de sus prolongaciones citoplásmicas de manera

ordenada y se localiza también ordenadamente en forma radial en el interior de las células. BCG,

por el contrario penetra a los macrófagos a través de regiones no definidas, se aloja dentro de las

células de manera desordenada e induce los cambios oxidativos responsables de su muerte. Este

comportamiento diferente en cuanto a la forma de entrada a los macrófagos, su organización

intracelular, y el disparo de los mecanismos microbicidas de las células, sugiere que estas

micobacterias utilizan diferentes vías de entrada y activan diferentes rutas de señalización que

estimulan de manera diferencial la respuesta metabólica de las células. De esta respuesta

metabólica diferencial depende el destino intracelular de los microorganismos y consecuentemente,

el progreso de las enfermedades que producen. En este proyecto pretendemos estudiar los

receptores participantes en la interiorización de M. lepraemurium y M. bovis BCG en los

macrófagos murinos, el tránsito intracelular de las micobacterias, la cascada (o cascadas) de

señalización estimuladas durante el proceso, la cinética de maduración de los fagosomas

micobacterianos y las consecuencias del proceso en general: producción de citocinas, destrucción

de las micobacterias y destrucción de las células, si esto ocurre. En el estudio se incluirá además,

como referencia, a M. tuberculosis, una bacteria ampliamente conocida y estudiada en cuanto a

sus mecanismos de infección y de evasión de la respuesta microbicida de los macrófagos.

INTRODUCCIÓN

Hay quienes piensan, erróneamente, que actualmente el estudio de la lepra es una actividad

irrelevante porque la enfermedad es un mal del pasado. Efectivamente la lepra es una enfermedad

antigua, la primera referencia sobre la misma se hizo en el año 1500 AC en la India, pero como la

tuberculosis, que también es una enfermedad antigua, sigue siendo un problema importante de

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salud pública (1.15 millones de casos registrados en 1998, en más de 80 países) y la causa de

muerte de una parte significante de la población enferma, si bien la enfermedad es más frecuente

en algunos países que en otros (India, África y Asia, las regiones más afectadas; México cuenta

con más de 50,000 casos registrados). El hecho de que las revistas médicas actuales le den

cabida a las investigaciones sobre la lepra y de que haya varias revistas especializadas en

leprología, indica que la enfermedad existe, que es de importancia actual y que todavía se

desconocen muchos aspectos sobre la misma.

Las micobacterias.

Las micobacterias son un grupo de bacterias caracterizadas por poseer una compleja pared

formada por carbohidratos, glicolípidos y glicopéptidos. La gran cantidad de componentes grasos

les confiere la propiedad de colorearse con carbol fucsina y de resistir el efecto decolorante del

alcohol acidulado, razón por la cual se describen como bacterias ácido-alcohol resistentes o BAAR.

Existen varias micobacterias de importancia médica pero las más relevantes, por su frecuencia,

son Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium leprae, causantes de la tuberculosis y la lepra,

respectivamente. Otras micobacterias que pueden causar enfermedad en el humano porque se

comportan como patógenos oportunistas son: Mycobacterium marinum, M. kansasii, M. szulgai, M.

scrofulaceum, M. xenopi, M gordonae, M avium-intracellulare, M. ulcerans, M. haemophilum, M.

malmoense, M. fortuitum-chelonae, M. smegmatis, entre otras. Una micobacteria, patógena para

los bovinos que puede causar enfermedad en el humano es Mycobacterium bovis y de esta

micobacteria se ha derivado la cepa atenuada (M. bovis BCG) que se utiliza como vacuna para

proteger contra la tuberculosis.

Patogenicidad

Las micobacterias patógenas son parásitos obligados de los macrófagos, es decir, para producir

enfermedad requieren multiplicarse dentro de estas células. Son varios los factores que determinan

la patogenicidad de las micobacterias, entre ellos y de manera primordial, las características

estructurales de los microorganismos y asociados a estas, los mecanismos de entrada a las

células hospederas, las cascadas de señalización intracelular que se generan, la interacción de los

microorganismos ingeridos con diversos organelos relacionados con la maduración de los

fagolisosomas (el tránsito intracelular) y la activación de diversos factores de trascripción. Todo

esto, en conjunto, determina la respuesta de las células ante la infección y decide el destino de los

microorganismos, su replicación o su destrucción.

Nuestro modelo de estudio: la lepra murina

Desde hace varios años nuestro laboratorio ha estado interesado en el estudio de la lepra en

cuanto a la relación que se establece entre el agente causal (Mycobacterium leprae) y su célula

hospedera en el humano, el macrófago. Debido a la baja incidencia de la enfermedad en nuestra

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localidad y por razones éticas, el estudio con humanos sólo nos permite llegar hasta ciertos límites,

y dado que el microorganismo no se reproduce en los medios bacteriológicos convencionales, y

tampoco tiene un huésped animal accesible (los armadillos de 9 bandas y ciertas especies de

monos serían las alternativas) (Rojas-Espinosa O y Lovik, 2001) hemos aprovechado la existencia

del modelo de la lepra murina para conocer los factores de patogenicidad de una micobacteria

relacionada con M. leprae, Mycobacterium lepraemurium, y la respuesta que despierta en los

macrófagos de los animales susceptibles.

Aunque esencialmente diferentes, la lepra humana y la lepra murina, y los agentes que las

producen, comparten varias características aunque difieren en otras.

En cuanto a los padecimientos, ambos son enfermedades de naturaleza crónica-granulomatosa,

que afectan la piel y, sin tratamiento, diversos órganos internos. La diferencia obvia entre estas dos

enfermedades es la afección del sistema nervioso en la lepra humana y el respeto del mismo en la

lepra murina. Desde el punto de vista inmunológico también hay similitud entre las dos

enfermedades ya que ambas provocan la pérdida de la inmunidad celular del hospedero contra el

agente infeccioso respectivo sin modificar su capacidad de respuesta humoral. La pérdida de la

respuesta inmune celular contra el agente infeccioso es la razón principal del progreso de la

enfermedad en los animales susceptibles (Rojas-Espinosa, O. Murine Leprosy Revisited, enviado a

“Current topics on the profiles of host immunological response to mycobacterial infections" in the

Special Immunology Review Book, Research Signpost, Japan, 2008). En realidad no se conocen

los mecanismos responsables de la supresión específica de la respuesta inmune celular pero se

sospecha que tienen que ver con el comportamiento del microorganismo bajo el microambiente

tisular generado por la misma infección, ya que la supresión celular no se manifiesta al inicio de la

misma sino cuando el microorganismo, establecido ya en los macrófagos, modula las respuestas

inflamatoria e inmunológica del hospedero (Silva-Miranda et al, 2006). Esto es, los individuos que

llegan a enfermar no son inmunodeficientes al inicio de la infección y la inmunodeficiencia que

desarrollan la adquieren como resultado de las interacciones que se establecen entre el parásito y

el hospedero (Rojas-Espinosa, 2007).

En cuanto a los microorganismos causantes de la lepra humana y murina, M. leprae y M.

lepraemurium, ambos son micobacterias ácido resistentes, no cultivables en medios

bacteriológicos convencionales, y estructuralmente parecidos entre sí. Su gruesa cubierta lipídica,

al mismo tiempo que les confiere protección contra los mecanismos microbicidas del hospedero,

los capacita para entrar casi de manera desapercibida a los macrófagos del mismo y para modular,

en su favor, la respuesta inmunitaria de los individuos susceptibles. Ambos microorganismos, y

contrario a M. bovis BCG, penetran a los macrófagos del hospedero sin estimular en ellos los

mecanismos microbicidas dependientes del oxígeno y el nitrógeno, y tampoco inducen la

producción de niveles significativos de TNFα una citocina relacionada con la activación de

macrófagos (Rojas-Espinosa y col, 2002). Tanto M. leprae como M. lepraemurium son bacterias

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muy evolucionadas que han “aprendido” a penetrar a las células hospederas sin inducir tampoco su

muerte por apoptosis (Rojas-Espinosa y col., datos no publicados). En los ratones, M.

lepraemurium suprime además la activación del sistema del complemento y no infecta al riñón ni al

sistema nervioso, preservando así la integridad del individuo (Rojas-Espinosa y col, 1991a y b).

Lepra murina: la enfermedad

M. lepraemurium (MLM) y la enfermedad que produce fueron descritos en 1902 por Stefansky en la

ciudad de Odesa, Rusia, y posteriormente Dean, en Inglaterra, hizo notar la similitud entre la lepra

humana y la lepra murina. Estas dos enfermedades presentan gran analogía en las lesiones que

causan y también, en cierta forma, en sus agentes causales: Mycobacterium leprae (ML) y

Mycobacterium lepraemurium (MLM) respectivamente. Por estas analogías, la lepra murina se

tomó, durante mucho tiempo, como un modelo de estudio de la lepra humana. Ahora se sabe que

estas enfermedades, y sus agentes etiológicos son en realidad diferentes, aunque mantienen un

cierto grado de similitud. Durante mucho tiempo las analogías entre las dos enfermedades

justificaron el uso de la lepra murina como un modelo de estudio de la lepra humana. Por otra

parte, fuera de su grado de relación con la lepra humana, la lepra murina es en sí una enfermedad

interesante que merece ser estudiada con detalle porque afecta de manera natural a la especie

animal más popular en los laboratorios de investigación biomédica, el ratón (Rojas-Espinosa, O.

Murine Leprosy Revisited, enviado a “Current topics on the profiles of host immunological response

to mycobacterial infections" in the Special Immunology Review Book, Research Signpost, Japan,

2008). A diferencia de la lepra humana, la lepra murina se puede estudiar de manera controlada a

diferentes niveles, incluyendo la selección de la cepa del hospedero y la cepa del parásito, el inicio

de la infección, la dosis y la ruta de infección, y se puede decidir cuando hacer mediciones

relevantes para establecer los cambios clínicos, bacteriológicos, inmunopatológicos e

histopatológicos ocurridos durante la infección. Además, siendo M. lepraemurium, un parásito

intracelular de los macrófagos, el modelo nos permite estudiar no sólo los mecanismos de la

respuesta antibacteriana por parte de los macrófagos, sino también los mecanismos de infección y

de evasión por parte de las bacterias.

El agente causal de la lepra murina: Mycobacterium lepraemurim (MLM)

MLM es un bacilo delgado no móvil, pleomórfico, de 0.3 a 0.4 µm de ancho por 2 a 7 µm de

longitud. Cerca del 40% de su peso son lípidos complejos y por esta característica la micobacteria

se tiñe con fucsina fenicada y resiste la decoloración con alcohol acidulado (tinción de Ziehl

Nelssen). MLM es una micobacteria no cultivable en el laboratorio aunque hay reportes (Mori,

1978) de que la cepa Douglas se ha logrado cultivar en un medio semisólido preparado a base de

yema de huevo, parecido al medio de Lowenstein-Jensen. Otros laboratorios no han tenido éxito en

el cultivo de esta y otras cepas (entre ellas la cepa Hawaii) y por esto el microorganismo se sigue

propagando por infección en el ratón. En nuestro laboratorio trabajamos con la cepa Hawaii que se

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preserva por infecciones seriadas en ratones NIH (National Institutes of Health, Bethesda, MD,

USA). Se han descrito cepas de ratones de distinta susceptibilidad y resistencia a la infección por

MLM; los ratones C3H se reconocen como los más susceptibles, los BALB/c como de

susceptibilidad elevada y los ratones C57BL como los de mayor resistencia. Así mismo se han

descrito otras cepas de susceptibilidad intermedia entre C3H y C57BL (Kawagachi, 1959, Brown y

col, 1982 y Brett, 1984). En nuestra experiencia los ratones NIH se comportan como ratones de

susceptibilidad intermedia y presentan todos los cambios clínicos y bacteriológicos que se

describen dentro del espectro de la lepra ya que la enfermedad temprana exhibe un patrón

“tuberculoide” (benigno) y la enfermedad tardía un patrón “lepromatoso” (maligno).

La superficie de MLM esta constituida por una gruesa capa de lípidos que constituyen la pared de

la micobacteria. Cerca del 60% de la pared celular esta constituida por lípidos y estos lípidos

representan cerca del 40% del peso seco de la bacteria (Azuma y col, 1973).

Dentro de los constituyentes de la pared de las micobacterias en general, se incluyen varias

familias de macromoléculas, entre ellos: ácidos grasos ramificados, ácidos micólicos, glicolípidos,

glicósidos del fenol-phthiocerol, peptidoglicolípidos, lipooligosacaridos y lipopolisacaridos (Luna

Herrera, 1991). Cada familia incluye un amplio número de componentes, algunos de los cuales

como la lipoarabinomanana (LAM), se han reconocido como ligandos de receptores fagocíticos.

En 1987, Gaylord y Brennan publicaron un modelo sobre la estructura de la pared de

Mycobacterium leprae (ML) en el que proponen la ubicación que pudieran tener estos

componentes. Sin embargo, para el caso de Mycobacterium lepraemurium, aunque se han

identificado una serie de lípidos y polisacáridos de la pared y cápsula del microorganismo, hasta

ahora los datos son parciales y no hay una estructura propuesta sobre su ordenamiento en la

bacteria. Por su localización, es seguro que estos sean los componentes que primero son

reconocidos por las macrófagos y las células del sistema inmunitario en general. Existen algunos

reportes que indican que los lípidos de Mycobacterium leprae inactivan las funciones del macrófago

y que por esto participan en la supervivencia de la bacteria en el hospedero (Moura y col, 1997).

Algo similar ocurre en el caso de MLM como lo indican nuestros resultados recientes: la

inoculación de MLM intacto en la almohadilla plantar del ratón no induce una reacción inflamatoria

visible mientras que la inoculación de MLM deslipidizado induce una respuesta inflamatoria

temprana de tipo polimorfo-nuclear (Rojas-Espinosa, manuscrito en preparación).

La respuesta macrofágica contra Mycobacterium lepraemurium

MLM es un patógeno exitoso del macrófago ya que logra penetrar y residir en él sin despertar la

respuesta antibacteriana de la célula. Al respecto, existen varias evidencias de que MLM, a

diferencia de BCG, evade los mecanismos microbicidas de los macrófagos. Mycobacterium bovis

BCG, es una micobacteria no patógena para el ratón y es, en cambio, un excelente inductor de la

respuesta inmunitaria celular en este y otros animales (Rojas-Espinosa y col, 2002). De estas

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evidencias se sabe por ejemplo, que mientras BCG despierta los cambios oxidativos generadores

de radicales libres del oxigeno (peróxido de hidrógeno y anión superóxido) al ingresar a los

macrófagos, MLM no lo hace (Rojas-Espinosa y col, 1998). Por otro lado, MLM infecta a los

macrófagos murinos sin estimular en ellos la producción de cantidades substanciales de TNFα y

.NO; BCG, en cambio, induce en estas células la producción de niveles muy elevados de estos

mediadores (Rojas-Espinosa y col, 2002).

También se sabe que el sistema de la mieloperoxidasa (MPO) juega un papel importante en el

control de la enfermedad causada en el ratón por MLM. Los bacilos cubiertos con MPO (MLM-

MPO) produjeron una enfermedad que evolucionó más lentamente que la enfermedad producida

por los bacilos intactos (Rojas-Espinosa y col, 2002b). Por su parte, Maslov y col (2000a y 200b)

encontraron que la peroxidasa de rábano (HRPO) administrada oralmente a ratones infectados con

Mycobacterium leprae, inhibe la multiplicación y la dispersión sistémica del bacilo, y evita el daño al

hígado y a otros órganos blanco.

La propiedad que tiene MLM de penetrar en los macrófagos sin despertar la respuesta

antibacteriana en estas células sugiere que la bacteria penetra por alguna vía diferente a la

utilizada por BCG.

Otra micobacteria cuya biología está ampliamente explorada, es Mycobacterium tuberculosis.

Sobre este patógeno del humano (y de varias especies experimentales, incluyendo al ratón) hay

abundante información sobre sus mecanismos de entrada a los macrófagos; se conocen los

ligandos más relevantes de la micobacteria, los receptores de los macrófagos, las cascadas de

señalización que se despiertan, el proceso de maduración de sus fagosomas y las consecuencias

resultantes (Schlesinger et al, 1993; Zimmerdi et al, 1996; Hirsch et al, 1994; Chenggang et al,

2000; Palomino y col, 2007, Vergne y col, 2004, y otros). Sobre los receptores de entrada de M.

leprae a los macrófagos y los ligandos reconocidos también hay información abundante aunque no

tan profusa como en el caso de M. tuberculosis (Schlesinger et al, 1990, 1991; Bochud et al, 2003;

Soilleux et al, 2006; Tailleux et al, 2005). Todos estos aspectos, sin embargo, se desconocen para

MLM. En el presente proyecto de investigación, con objeto de establecer las particularidades del

mecanismo de entrada de MLM a los macrófagos murinos, el estudio se hará de manera

comparativa con los cambios que se sabe ocurren durante la entrada de M. bovis BCG y M.

tuberculosis a las mismas células hospederas.

Receptores de macrófagos

Una de las tareas del sistema inmune innato es la de reconocer y eliminar a un gran número de

patógenos a través de su reconocimiento por receptores celulares. Ahora se sabe que el número

de estos receptores es relativamente limitado porque reconocen patrones de ligandos conservados

en casi todos los microorganismos (Aderem y Underhill, 1999). Estos patrones moleculares de

ligandos se denominan PAMP o patrones moleculares asociados a patógenos. Los receptores que

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reconocen a estos patrones moleculares se denominan PRR (pattern recognition receptors) o

receptores de reconocimiento patrón. De estos PRR existe un amplio grupo, entre ellos los TLR,

que reconocen ligandos de una gran variedad de microorganismos (Janeway, 1992). En la Tabla 1

se enlistan algunos de estos receptores y los ligandos que reconocen, particularmente en

micobacterias.

Tabla 1. Algunos receptores fagocíticos de macrófagos y sus ligandos

PRR PAMP

Receptor de manosa (MR) o CD 206 Manosa y Mucosa

CD14 Peptidoglicano, LAM

Scavenger receptor (SR) Lipopolisacáridos

CR1 (CD35), CR3 y CR4 Complemento (C3b, C3bi, C4)

FcOIII/II/I R (CD16,32,64) Fc de anticuerpos

TLRs 1, 2 y 4 o heterodímeros de ellos Lipocompuestos (como LAM y otros).

Receptores involucrados en el ingreso de micobacterias a macrófagos

Existe amplia información sobre los receptores que participan en la fagocitosis de micobacterias,

sobre todo para aquellas de importancia médica como M. tuberculosis y M. leprae.

En el caso de M. tuberculosis, se ha reportado que la bacteria puede penetrar a los macrófagos

humanos a través de los receptores MR, CR3, CR4 y SR, y que el mecanismo mediante el cual la

bacteria evade la muerte intracelular es independiente de la ruta de su entrada, es decir, el destino

de las micobacterias es el mismo independientemente del receptor utilizado para ingresar a las

células, lo cual es cierto tanto para las cepas virulenta H37Rv y no virulenta H37Ra (Schlesinger y

col, 1993; Zimmerli y col, 1996).

Por su parte, Hirsch y col (1994), encuentran que los macrófagos alveolares fagocitan a

Mycobacterium tuberculosis a través de CR4 aunque no descartan la participación de otros

receptores.

En otro estudio, Chenggang y col (2000), trabajando con ratones BALB/c deficientes en CR3,

observaron que los macrófagos derivados de monocitos de médula ósea se infectan eficientemente

con M. tuberculosis H37Rv aun en ausencia de este receptor, lo que indica que CR3 es un receptor

irrelevante o en todo caso redundante para la entrada de esta micobacteria.

En cuanto al receptor de manosa (MR), Astarie-Dequeker y col (1996), encontraron que este

receptor fue incapaz de distinguir entre micobacterias patógenas (M. kansasii) y no patógenas (M.

smegmatis y M. phlei), ya que todas ellas ingresaron de manera comparable en macrófagos

derivados de monocitos (MDM) humanos.

Por otro lado, Means y col (1999) encontraron que Ara-LAM de M. tuberculosis induce la activación

celular dependiente de CD14 y TLR2, no así de TLR4. Sin embargo este grupo de investigadores

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no descarta la participación de otros TLRs como receptores de reconocimiento de otros ligandos de

la micobacteria.

En cuanto a los receptores participantes en la ingestión de M. leprae, Schlesinger y col (1991)

encontraron que CR1 y CR3 participan en la entrada de M. leprae a monocitos humanos y a

macrófagos derivados de monocitos, en tanto que Bochud y col (2003) demostraron que TLR2 es

un receptor importante en la infección causada por Mycobacterium leprae. Lo anterior se determinó

cuando se observó que la mutación de un aminoácido en el TLR2Arg 677

está asociada a una mayor

susceptibilidad a la lepra en individuos de una población coreana.

Recientemente se ha demostrado que un receptor, que inicialmente se creía era exclusivo de

células dendríticas, DC-SIGN (C-type lectin dendritic cell–specific intercellular adhesion molecule-3

grabbing nonintegrin, CD209) se expresa abundantemente en los macrófagos de las lesiones de la

lepra lepromatosa y la tuberculosis (Soilleux y col, 2006 y Tailleux y col, 2005) por lo que se ha

sugerido que DC-SIGN es un receptor importante para la entrada de M. tuberculosis y de M.

leprae. Dada la similitud en las lesiones de la lepra humana y la lepra murina, este hallazgo sugiere

que DC-SIGN podría ser un receptor importante para la entrada de M. lepraemurium a los

macrófagos murinos. Este aspecto es uno de los puntos de estudio del presente proyecto.

En resumen, los receptores descritos que participan en la entrada de Mycobacterium tuberculosis y

Mycobacterium leprae a los macrófagos son:

Mycobacterium tuberculosis:

MR, CR3, CR4 y SR (Schlesinger et al, 1991, 1993; Zimmerli et al, 1996).

CR1, CR3 (Schlesinger et al, 1991)

CR4 (Hirsch et al, 1994)

MR (Astarie-Dequeker et al, 1996)

TLR2, TLR4 (Means, et al. 1999).

DC-SIGN (Soilleux et al, 2006 y Tailleux et al, 2005).

Mycobacterium leprae:

CR1 y CR3 (Schlesinger, et al, 1990 y 1991).

DC-SIGN (Soilleux et al, 2006 y Tailleux et al, 2005).

TLR-2, CD14 (Bochud et al, 2003)

Receptores fagocíticos para Mycobacterium lepraemurium:

En cuanto a los receptores fagocíticos para M. lepraemurium no hay información publicada (como

puede constatarse en MedLine, PubMed, o cualquier otro buscador); nuestro trabajo, que es

pionero, sugiere que TLR-6 y MR podrían ser receptores importantes. Así mismo, dada la similitud

en las lesiones de la lepra humana y la lepra murina, es posible que DC-SIGN también pueda ser

un receptor importante para la entrada M. lepraemurium a los macrófagos, como ya se ha sugerido

para M. tuberculosis y M. leprae. Por esto, uno de los objetivos del presente proyecto, es

corroborar la participación de TLR-6 y MR como receptores promotores de la entrada de MLM a las

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células fagocíticas de ratón y analizar la participación de DC-SIGN como un posible receptor de

entrada de la bacteria a los macrófagos.

Maduración de fagosomas

Posterior a la formación del fagosoma que contiene al microorganismo fagocitado (y posiblemente

un poco de material extracelular), este empieza a modificarse estructuralmente en un proceso

descrito como maduración (Garin y col, 2001; Rink y col, 2005). La maduración del fagosoma inicia

cuando el fagososma interacciona con endosomas tempranos Rab 5+

EEA1+ (antígeno endosomal

temprano 1). Las Rab son un grupo de GTPasas pequeñas parecidas a ras (Rink y col, 2005)

contenidas en la membrana de vesículas o endosomas que tienen la capacidad de unirse a la

membrana de los fagosomas haciendo que estos puedan, finalmente, fusionarse con los

lisosomas.

También existen endosomas que son “reciclados”, estos endosomas expresan en su membrana

moléculas como Rab11 que les conduce hacia la membrana exterior, lo cual permite la exocitosis

de materiales ingeridos e imposibilita su interacción con los lisosomas.

Siguiendo con en el proceso de maduración, un fagosoma temprano (Rab 5+) adquiere otros

marcadores membranales dentro de los cuales están Rab 7, Rab 9, Receptor de Manosa 6-

Fosfato, Sintaxina, y una bomba de protones (protón ATPasa), entre otros, para convertirse en un

fagosoma maduro. La adquisición de estos marcadores por los fagosomas resulta de un proceso

de fusión-fisión con diversas vesículas (endosomas) citoplásmicas (Vieira y col, 2002; Desjardin,

1995). El fagosoma maduro tiene un pH cercano a 5.5, el cual es inferior al encontrado en un

fagosoma temprano (pH 6-6.5), gracias a su interacción con vesículas transportadoras de protón

ATPasa (Rojas-Espinosa y Arce-Paredes, 2003, 2004a, 2004b).

Por otro lado están los lisosomas, los cuales son compartimentos subcelulares que contienen

LAMP (proteína asociada a la membana de los lisosomas) y una variedad de enzimas hidrolíticas

dentro de las cuales está la catepsina D que se ha utilizado como un marcador de fusión fago-

lisosomal. Dentro del fagolisosoma, el pH ácido, las enzimas hidrolíticas, la mieloperoxidasa, las

defensinas y otros péptidos bactericidas, y los metabolitos reactivos del oxígeno y del nitrógeno,

generan un ambiente inhóspito para la mayoría de los microorganismos. Bajo este ambiente, la

bacteria es degradada a pequeños péptidos, oligosacáridos, oligonucleótidos y lípidos, algunos de

los cuales se utilizarán como materia prima para la síntesis de nuevo material celular, otros serán

exocitados y otros más serán presentados como péptidos antigénicos a los linfocitos T (Rojas-

Espinosa y Arce-Paredes, 2003, 2004a, 2004b).

Algunas micobacterias patógenas como M. tuberculosis, M. Avium y M. leprae han sobrevivido

como patógenos porque han desarrollado estrategias para evadir las condiciones inhóspitas del

fagolisosoma (McDonough et al, 1993), en algunos casos la bacteria interfiere con la maduración

del fagosoma (M. tuberculosis y M. avium) (Xu et al, 1994), en otros, la bacteria escapa del

fagosoma para residir en el citoplasma (M. tuberculosis y M. leprae) (van der Wel et al, 2007) y

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cuando no lo hace, su gruesa y compleja cubierta de lípidos la protege del ambiente tóxico del

fagolisosoma (M. tuberculosis y M. lepraemurium) (Wek et al, 2007).

Interesantemente, y en relación a nuestro modelo de estudio, Hart y col (1972) encontraron por

microscopia electrónica de transmisión, que M. lepraemurium es una bacteria fusiogénica, es decir,

que promueve de alguna manera la fusión fago-lisosomal o cuando menos no interfiere con ella.

Aparte de esto, hasta el momento nada se sabe sobre la maduración de los fagosomas de MLM.

M. lepraemurium no sólo resiste las condiciones hostiles del fagolisosoma sino que las aprovecha

para replicarse en él, asegurando así su supervivencia como parásito intracelular.

La Figura 1 ilustra las etapas generales de la maduración de los fagosomas y en negritas se

muestran los marcadores membrananles que se van a estudiar en el presente proyecto.

Figura 1.Cambios en la composición de los fagosomas durante su maduración. En negritas se

señalan los marcadores moleculares a determinar en el presente proyecto (Vieira y col, 2002).

Participación de “lipid rafts” en la fagocitosis

Los “lipid rafts” o balsas lipidicas son estructuras dinámicas presentes en la membrana celular,

ricas en colesterol y esfingolípidos. Se sabe que los “lipid rafts” participan en la entrada o

fagocitosis de bacterias, virus, hongos y otros microorganismos entre los cuales están E. coli,

Pseudomonas aeruginosa, Chlamydia trachomatis, Campylobacter jejuni, Brucella abortus,

Mycobacterium bovis, Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium avium (Zaas y col, 2005). En

el caso especifico de micobacterias se ha reportado que Mycobacterium avium ingresa a

macrófagos murinos a través de un proceso dependiente de “lipid rafts” (Maldonado-García y col,

2004). También se sabe que la fagocitosis de Mycobacterium bovis y Mycobacterium tuberculosis

se reduce hasta 90% cuando se “secuestra” de manera experimental el colesterol de la membrana

de las células fagocíticas (Gatfield y col, 2000). Además se postula que el uso de los “lipid rafts”

como sitios de entrada a las células podría estar ligado a la capacidad de varios microorganismos

de impedir la maduración de sus fagosomas incluyendo la fusión fagolisosomal (Lafont y col, 2005),

lo cual podría explicar la inhibición de la fusión fagolisosomal en el caso de M. tuberculosis.

Aunque nuestra intención es comparar nuestros hallazgos sobre MLM con los obtenidos con M.

tuberculosis (la bacteria de referencia del presente trabajo sobre la cual existen reportes de la

participación de “lipid rafts” en la fagocitosis de la misma), también estamos considerando utilizar el

modelo de Brucella abortus ya que su endocitosis por macrófagos murinos depende de rafts y no

La figura 1, omitida por motivos de tamaño del archivo, se incluye en el informe impreso

12

es una bacteria que tienda formar agregados o grumos como M. tuberculosis (Lapaque y col,

2006). Otra vez, es conveniente señalar que no hay reportes sobre la participación de rafts en la

endocitosis de Mycobacterium lepraemuriurm por macrófagos murinos.

TLRs

El papel de los TLRs o “toll like receptors” en la fagocitosis de diversos microorganismos también

es un tema ampliamente estudiado. Jo y col (2007) hicieron una recopilación sobre el papel de

diferentes TLRs en la fagocitosis de diversas micobacterias (y como podrá notarse no hay

información sobre su participación en la endocitosis de M. lepraemurium). En esta revisión resalta

que la micobacteria más estudiada es Mycobacterium tuberculosis, seguramente por su

importancia clínica y por la alta incidencia de tuberculosis a nivel mundial. Se ha tratado de

determinar cual de los TLRs sería un receptor relevante en la entrada de la micobacteria a las

células del sistema inmune innato con la finalidad de encontrar un blanco terapéutico. Hasta ahora,

el receptor más importante es el TLR2, no solo para MTB sino también para M. bovis y M.

smegmatis (Tabla 1). Esto lo corroboran los trabajos de Saguwara y col. que en 2003 reportaron

que la infección con M. tuberculosis en ratones KO (knock out) en TLR2 ocasiona cambios en el

desarrollo de la enfermedad, las lesiones en pulmón son de mayor tamaño que las lesiones en los

animales no mutados y muestran prominentes infiltrados de neutrófilos. Por el contrario, la

infección en ratones KO para TLR6 no mostró discrepancias con los animales normales, es decir,

TLR6 no parece jugar un papel importante en el desarrollo de la tuberculosis murina experimental.

De acuerdo a nuestros resultados preliminares, el uso de ratones KO en TLR6 sería de gran

utilidad para demostrar la importancia de este receptor en la entrada de MLM a los macrófagos

murinos.

Nicolle y col (2004) por su parte, reportaron que M. bovis BCG infecta a los macrófagos derivados

de monocitos de medula ósea, sin tener preferencia por TLR2, 4 ó 6. En este trabajo se emplearon

ratones KO para estos receptores y en todos los casos la formación del granuloma, la activación

celular y el control de la enfermedad, fueron todos semejantes. Los autores concluyeron que la

infección por M. bovis BCG ocurre independientemente de la expresión de estos receptores y que,

en todo caso, estos receptores tienen participación redundante. Tampoco hay que olvidar que in

vitro e in vivo, más de un receptor puede participar en la entrada de los microorganismos a las

células fagocíticas.

La participación de los receptores TLR en la entrada de M. leprae a su hospedero celular es un

aspecto poco conocido, se sabe que participa TLR2 (Krutzik et al, 2003), y una vez más, para el

caso de M. lepraemurium no hay información publicada (Tabla 2).

13

Tabla 2 Ligandos micobacterianos reconocidos por TLRs de macrófagos (Jo y col., 2007).

Cascadas de señalización dependientes de TLRs

Como resultado del contacto ligando-receptor se generan señales fisicoquímicas que luego se

transducen al interior de las células y tienen efectos en el citoplasma y en el núcleo celular. Estas

señales que se transducen a manera de cascadas comprenden la participación de diversas

proteínas “transductoras de señales” que incluyen proteínas G (GTPAsas) monoméricas y

poliméricas, proteínas adaptadoras, proteín-cinasas, fosfatasas, y factores de transcripción, entre

otros participantes. Para el caso de las cascadas de señalización que se activan a través de TLRs,

existen 2 vías principales de activación: la vía dependiente de MyD88 y la vía independiente de

MyD88, con moléculas comunes en ambas vías. Hasta el momento, existe información incompleta

sobre la cascada de señalización iniciada por TLR6, quizá porque este receptor no se ha implicado

en la entrada de micobacterias patógenas para el humano. Debido a que nuestros resultados

preliminares (no publicados) sugieren que TLR6 participa en la entrada de MLM a los macrófagos

murinos, en el presente proyecto nos proponemos estudiar la participación de MyD88 (una

molécula de activación temprana), de TRAF-6 (una molécula de activación intermedia), y de NKκB

(una molécula de activación tardía), todas ellas identificadas en la activación celular dependiente

de TLR6. En la Figura 2 se ilustran las cascadas de señalización dependientes de TLR2, TLR4 y

TLR1/6, donde se muestran las proteínas transductoras de señales identificadas hasta ahora.

La figura 3, omitida por motivos de tamaño del archivo, se incluye en el informe impreso

14

Figura 2. Señalización de TLRs inducida por ligandos micobacterianos en la cual se pueden

observar las diferentes moléculas que se activan en respuesta al reconocimiento de la micobacteria

(Jo y col, 2007).

OBSERVACIONES DEL LABORATORIO

A diferencia de Mycobacterium lepraemurium, Mycobacterium bovis BCG es un microorganismo no

patógeno para los ratones inmunocompetentes. Penetra a los macrófagos despertando en ellos

una respuesta microbicida eficiente, caracterizada por la producción de niveles elevados de

radicales libre del oxígeno (ROI), del nitrógeno (.NO) y de TNFα (Rojas-Espinosa et al, 1988;

Rojas-Espinosa et al, 2002). Se interioriza en los macrófagos de manera desordenada en la forma

de pequeños grumos que luego son destruidos por los mecanismos microbicidas de las células.

Mycobacterium lepraemurium por su parte, es un microorganismo no toxigénico pero patógeno

para el ratón. Penetra a los macrófagos en forma discreta, sin despertar en ellos la producción

importante de radicales libres del oxígeno (ROI), y sólo estimula la producción limitada de óxido

nítrico (Rojas-Espinosa et al, 1988; Rojas-Espinosa et al, 2002). Se interioriza en los macrófagos

en una forma ordenada, principalmente a través de los extremos apicales de las prolongaciones

citoplásmicas de las células. Dentro de los macrófagos los bacilos muestran una disposición radial

lo que sugiere un ordenamiento particular del citoesqueleto. La replicación de los bacilos dentro de

los macrófagos es continua pero los bacilos no parecen causar daño a sus hospederos, excepto

cuando las células estallan por no poder contener más bacilos.

Con estos antecedentes, enseguida se describen las características del proyecto propuesto.

HIPOTESIS

Mycobacterium lepraemurium, Mycobacterium bovis BCG, y Mycobacterium tuberculosis H37Rv

penetran a sus hospederos celulares utilizando diferentes vías de entrada donde participan

diferentes receptores y se generan diferentes cascadas de señalización. Sus fagosomas maduran

de manera diferencial y de esto depende la actividad microbicida de las células, el ordenamiento

intracelular de los microorganismos, y el destino de los mismos.

OBJETIVO GENERAL

Identificar los receptores membranales que participan en la entrada de Mycobacterium

lepraemurium a los macrófagos murinos.

OBJETIVOS ESPECIFICOS

v Analizar la participación de los receptores para manosa (MR)

v Analizar la participación de los receptores para complemento (CR3,CD35)

v Analizar la participación de los receptores DC-SIGN

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v Analizar la participación de los receptores para inmunoglobulinas (FcgammaRIII/II: CD16/32)

v Analizar la participación de los receptores CD14

v Analizar la participación del receptor TLR-2

v Analizar la participación del receptor TLR-4

v Analizar la participación del receptor TLR-6

v Relacionar la participación de estos receptores con la entrada de MLM y BCG

MATERIAL Y MÉTODOS

A.- Cultivo de macrófagos peritoneales

Para los cultivos se contó con ratones NIH hembras, de 25 gramos aproximadamente, mantenidas

bajo condiciones higiénicas de bioterio.

1.- Los animales se sacrificaron por inhalación de cloroformo y se prepararon para la extracción de

células de la cavidad peritoneal. El lavado peritoneal se hará con solución de Alsever (3 lavados) y

los lavados se juntaron para producir una sola suspensión celular.

3.- Esta suspensión se centrifugo a 240 g durante 3 minutos a 4ºC y se lavo 3 veces con la

solución de Alsever.

4.- La suspensión celular lavada se colecto por centrifugación y se resuspendió en medio de cultivo

(DMEM adicionado con 10 % de suero fetal de ternera) para proceder a determinar el número de

células. Las células se diluyeron con líquido de Türk y se contaron en una cámara de Neubawer.

5.- Se sembraron 3 X 106 células en cajas de Petri (30 mm de diámetro) las cuales contenían un

cubreobjetos perfectamente limpio y estéril.

6.- Los cultivos se incubaron durante una semana a 37º C con 5% de CO2, realizando cambios

periódicos de medio de cultivo (2 días) y vigilando la morfología de las células.

B.- Purificación de Mycobacterium lepraemurim

MLM se aisló y purificó de ratones con 5 a 6 meses de infección mediante una combinación de las

técnicas de Prabhakharan (1976) y Draper (1980), y la cantidad de micobacterias se cuantificó

utilizando una curva de calibración que relaciona número de bacterias por ml, con unidades de

absorbancia a 480 nm. Una vez determinada la concentración bacteriana se prepararon alícuotas

de la suspensión en medio 7H9 enriquecido con 10% de OADC, las cuales se mantuvieron

congeladas a -70º C hasta su utilización.

C.- Infección de los macrófagos peritoneales con Mycobacterium lepraemurim Los

macrófagos de ratón se obtuvieron de ratones sanos intactos o de ratones inoculados con aceite

mineral ligero por la vía intraperitoneal Los cultivos de macrófagos se hicieron a la densidad de

3X106 en placas de cultivo de 30 mm de diámetro, utilizando medio de cultivo DMEM

suplementado con 10% de suero fetal de ternera, aminoácidos esenciales y no esenciales, y

antibióticos (gentamicina y penicilina) (Rojas-Espinosa O y col, 1998).

16

1.- Los cultivos celulares se infectaron con diferentes dosis de bacterias (MOIs: 5:1, 10:1 y 50:1) y

se mantuvieron en incubación (37ºC, 5% CO2) durante 15, 30, 60, 120, 240 minutos y 24 horas.

2.- Una vez transcurrido el tiempo de infección los cultivos se lavaron con PBS 1X, y se fijaron con

formol al 4% en PBS durante 5 minutos.

3.- Los cultivos se lavaron y se tiñeron con fucsina fenicada calentada a emisión de vapores y se

decoloraron con etanol (70%)-ácido clorhídrico (1%) para eliminar el exceso de colorante.

4.- Los cultivos celulares teñidos con fucsina fenicada se contrastaron con Azul de Toluidina.

5.- Se dejaron secar al aire y se montaron con resina sintética (SIGMA) entre cubreobjeto y

portaobjeto.

D.- Microscopia electrónica de transmisión

La metodología seguida consistió en:

1. Infección de los cultivos de macrófagos con MLM y MTB H37Rv a una MOI de 50:1 durante 30,

60, 120, 240 minutos, 24 horas, 2, 7 y 14 días.

2.- Lavado 1X con PBS a 1500 rpm por 5 min para eliminar las bacterias no fagocitadas.

3. Fijación con glutaraldehido al 2.5% en cacodilato de sodio 0.1M, pH 7.4, durante 2 horas a 4° C.

4. Separación mecánica de las células y colección en un tubo Eppendorf.

5.- Lavado 3X (1500 rpm/ 5 min) con cacodilato de sodio 0.1 M

6.- Suspensión en una mezcla de tetróxido de osmio (OsO4) al 2% (1 volumen) y cacodilato de

sodio 0.2M (1 volumen). Mantener en agitación por 1 hora.

7.- Lavado 3X (1500 rpm/ 5 min) con cacodilato de sodio 0.1M.

8.- Deshidratación con soluciones de alcohol al 70%, 80%, 90%, 100% y 100% (15 min en cada

una).

9.- Deshidratación en óxido de propileno 2 veces, 20-30 minutos cada vez.

8.- Centrifugación a 10000 rpm y suspensión del paquete celular en una mezcla de resina Spurr y

óxido de propileno (1:1). Mantener en agitación durante 30 minutos.

9.- Centrifugación a 10000 rpm y suspensión del paquete celular en una mezcla de resina Spurr y

óxido de propileno (3:1). Mantener en agitación por 30 minutos.

10.- Centrifugación a 10000 rpm y suspensión del paquete celular en resina Spurr pura. Mantener

en agitación por 4 horas. Hacer 2 cambios más de resina pura de 4 horas cada uno.

11.- Polimerización de la muestra a 58°C por 48 horas.

12.- Preparación de “las pirámides” con las muestras polimerizadas para su corte en microtomo.

13.- Contrastar con acetato de uranilo (6%) durante 25 minutos y con nitrato de plomo (stock

comercial) durante 2 minutos para su observación en el microscopio electrónico de transmisión.

E.- Tránsito de Mycobacterium lepraemurim en macrófagos murinos

El procedimiento consiste en:

17

1.- Infección de los cultivos de macrófagos con las micobacterias a una relación (MOI) de 50:1

durante 30 min a 37ºC, en atmósfera húmeda y 5% de CO2.

2. Lavado 1X con PBS para eliminar las bacterias no ingeridas.

3. Incubación de los cultivos durante 15, 30, 60, 120 y 240 minutos.

4.- Lavado 1X con PBS y tinción por la técnica de Zihel-Neelsen (coloración con fucsina fenicada

calentada a emisión de vapores, lavado con alcohol ácido y contra-tinción con azul de toluidina).

5.- Montaje de las preparaciones con resina sintética sobre laminillas de vidrio.

5.- Examen al microscopio de luz de tungsteno.

F.- Infección de macrófagos peritoneales con MLM y MTB

1.- Se prepararon cultivos de macrófagos y se infectaron con micobacterias teñidas con rojo Texas,

a una MOI de 50:1, durante 15, 30, 60, 120, 240 minutos y 24 horas.

2.- Para teñir con rojo Texas, la suspensión bacteriana (MLM o Mtb) se incubó durante 30 minutos

con una solución de rojo Texas en PBS, a 37 ºC. Una vez transcurrido el período de incubación la

suspensión se lavo con PBS, hasta eliminar completamente el colorante en exceso.

3.- Transcurrido el tiempo de infección los cultivos se lavarán con PBS 1X, y se fijarán con una

solución de glutaraldehido al 0.7% en PBS 1X.

4.- Los cubreobjetos se recuperaron y se lavaron con PBS 1X para luego montarse sobre

portaobjetos con glicerol y propilgalato o Vecta shield.

5.- Las imágenes se analizaron por microscopía de fluorescencia y por microscopía confocal.

G.- Bloqueo de receptores en macrófagos murinos

Con la finalidad de determinar cual o cuales receptores utiliza MLM para su ingreso a los

macrófagos peritoneales del ratón, recurrimos al bloqueo de los mismos con anticuerpos

específicos. Los anticuerpos que empleamos fueron anti-FcγRIII/IIR (PharMingen) anti-CD16/32,

anti-CD35, anti-TLR2, anti-TLR4, anti-TLR6 (Santa Cruz Biotechonology), anti-CD14 (PharMingen),

anti-DC-SIGN (CIRE) (eBiosciences), y mananas acopladas a BSA y FITC (SIGMA).

1.- Los cultivos de macrófagos (sobre cubreobjetos) se incubaron durante 30 minutos a 4º C con

cada uno de los anticuerpos mencionados a una concentración de 1 a 10 µg /millón de células.

2.- Una vez transcurrido este período los cultivos pre-tratados con los anticuerpos se infectaron con

MLM y BCG a una MOI de 50:1, durante 30 minutos a 37°C.

3.- Pasado el tiempo de infección, las preparaciones de macrófagos infectados se lavaron con

PBS y se fijaron con formaldehído al 2% en PBS durante 30 min.

4.- Las preparaciones se lavaron y se dejaron secar al aire.

5.- Los bacilos contenidos en los macrófagos se teñirán con Fucsina Fenicada, se contra-tiñeron

con azul de toluidina, y se montaron sobre portaobjetos con resina sintética para su observación.

18

6.- Se determinó el número de bacterias fagocitadas con cada tratamiento y se comparó con el

número de bacterias fagocitadas en ausencia de bloqueo de receptores.

7.- También se realizaron incubaciones con mezclas de todos los anticuerpos en un solo cultivo.

* Para visualizar el bloqueo de CD35 y CD 16/32 se utilizaron bacterias incubadas con

complemento de cobayo y anticuerpos de ratón leproso, respectivamente.

H.- Análisis de bloqueo de receptores mediante citometría de flujo

Usando el Clitómetro de Flujo (FACScalibur) analizamos el efecto del bloqueo de los receptores

fagocíticos en macrófagos murinos.

1. Se administró 1.0 ml de aceite mineral ligero por vía intraperitoneal a ratones de la cepa NIH.

Después de 4 días se procedió a la colección de células por lavado peritoneal como ya se ha

descrito antes.

2. Se incubaron 1X106 células por tubo (polivinilo) y se mantuvieron en condiciones fisiológicas

(37°C y 5% CO2) durante 30 min.

3. Posteriormente se hicieron los bloqueos de los receptores de manera independiente con

anticuerpos o con ligandos específicos de los receptores. La incubación se realizó a 4°C

durante 30 min (con la finalidad de evitar la endocitosis del anticuerpo). La concentración de

cada anticuerpo fue de 1 µg/ml (de acuerdo a observaciones previas del laboratorio).

4. Una vez transcurrido el tiempo de incubación, las células se lavaron por centrifugación a 1500

rpm. Se adicionó medio fresco con la cantidad de bacterias (MLM o MTB) previamente

establecida (MOI 50:1). Las bacterias se teñirán previamente con Rojo Texas.

5. Se permitió la fagocitosis de las micobacterias por 30 min a 37°C. Posteriormente las células

se lavaron para eliminar las bacterias no fagocitadas y se adicionaron a los tubos con las

células, 500 µl de paraformaldehido al 1%.

6. Las células se conservaron hasta su adquisición en el citómetro a 4°C, protegidas de la luz.

7. El análisis se llevo a cabo en un Citómetro FACScalibur con los controles apropiados de tinción

e isotipo, seleccionando la ventana de las células CD11b positivas.

8. El análisis de los resultados obtenidos se realizó con el uso del Programa CellQuestPro.

I.- Papel de “lipid rafts” en la entrada de MLM en macrófagos murinos

9. Los cultivos de macrófagos se infectaron con MLM o Brucella abortus (control positivo del

fenómeno) a diferentes tiempos. Las bacterias se pre-tiñeron con rojo Texas. Como controles

del sistema las células se incubaron con ciclodextrina 10mM, una molécula que secuestra e

inmoviliza colesterol de la membrana celular, por 1 hora previo a la infección.

10. Una vez llevado a cabo el proceso de fagocitosis los cultivos celulares se lavaron con PBS y se

fijaron con paraformaldehído al 2% en PBS durante 30 min.

11. Después de 3 lavados las células se incubaron con suero de ratón al 2% durante 30 min.

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12. Los cultivos celulares se lavaron 1X con PBS y se incubarán con la fracción β de la toxina

colérica acoplada a FITC a una concentración de 0.5 µg/ml, durante 1 hora a TA.

13. Finalmente, las preparaciones celulares se lavaron y se montaron sobre portaobjetos con

glicerol y propilgalato para su observación por microscopia de fluorescencia y confocal.

RESULTADOS Y DISCUSION

Durante mucho tiempo hemos estudiado a la lepra murina como modelo de una enfermedad

micobacteriana causada por un patógeno intracelular pero hasta ahora no habíamos estudiado la

interacción de la micobacteria con su célula hospedera, el macrófago. En este trabajo estudiamos

tal interacción y las consecuencias derivadas de ella. El primer aspecto estudiado fueron las

modificaciones celulares estructurales en los macrófagos inducidas por la fagocitosis de la bacteria.

Posteriormente analizamos el papel de los receptores membranales del macrófago involucrados en

el reconocimiento (e ingestión) de la micobacteria.

A.- Cultivo de macrófagos

Se lograron obtener cultivos celulares de macrófagos peritoneales en buenas condiciones hasta 3

semanas después de haberlos obtenido. La morfología de estas células fue la de células en

reposo durante todo el tiempo de cultivo. Se evitó el uso de citocinas exógenas para activación

debido a que nuestra intención era caracterizar el proceso de la fagocitosis en las células

residentes, como ocurriría en el ratón intacto. La figura 3 muestra la apariencia saludable de los

macrófagos murinos mantenidos en cultivo durante 5 días. Esta morfología se mantiene en los

cultivos de 12 días.

La figura 3, omitida por motivos de tamaño del archivo, se incluye en el informe impreso

Figura 3. La figura muestra dos tipos morfológicos de los macrófagos del peritoneo de ratón

cultivados in Vitro durante 5 días

B.- Purificación de Mycobacterium lepraemurim

Esta metodología ha sido ampliamente usada en nuestro laboratorio. Partimos de 10 ratones

inoculados con 50x106 bacilos por la vía intraperitoneal con aproximadamente 6 meses de

infección. Se obtuvieron bacilos íntegros, con una viabilidad de 98% mediante la técnica de

Jarganin. Se cuantificó la cantidad de bacilos en la suspensión usando una curva de calibración

preparada previamente en el laboratorio (DO 480 nm vs No. de bacilos). Una vez determinada la

integridad y viabilidad de MLM las bacterias se centrifugaron y se suspendieron en medio 7H9-10%

OADC. La suspensión se repartió en alícuotas que se mantuvieron congeladas a -70°C.

20

C.- Infección de los macrófagos peritoneales con Mycobacterium lepraemurim

Se infectaron cultivos de macrófagos peritoneales de 5 días de cultivo in Vitro. Se determinó que

para estudiar el proceso de fagocitosis lo más recomendable era usar una MOI de 50:1 ya que este

índice de infección nos permitía observar mejor el proceso y podíamos lograr que los cultivos se

mantuvieran íntegros por varios días después de la infección. Observamos que la fagocitosis de

MLM por los macrófagos peritoneales se presenta desde los 15 minutos, sin embargo a los 30

minutos ya se tiene un % de infección adecuado para el estudio de otros fenómenos considerados

en el presente proyecto. Cabe mencionar que la fagocitosis de MLM es un evento de uno por uno,

es decir, se fagocitan micobacterias aisladas y no “agregados o grumos” de bacterias.

Posteriormente la bacteria migra o es llevada hacia el interior de las células hasta ubicarse

alrededor del núcleo, ordenándose de manera radial. Este proceso no se observa con

Mycobacterium bovis BCG ya que la bacteria se ingiere en forma de grumos o se agrega una vez

fagocitada presentando una distribución desordenada dentro del macrófago. La apariencia de los

cultivos de macrófagos infectados con MLM se muestra en la Figura 4.

Figura 4. Apariencia general de los cultivos de macrófagos infectados con MLM y mantenidos en

cultivo por 12 días.

Los macrófagos infectados hasta por 12 días: 1) pueden “soportar” una gran carga micobacteriana

sin presentar señales de activación celular, 2) no presentan signos de apoptosis (muerte celular);

las células mantienen su integridad celular y no hay cuerpos apoptóticos, 3) aún infectados se

mantienen adheridos a los recipientes de cultivo. La figura 5 muestra un macrófago del peritoneo

de ratón infectado con MLM con las características aquí señaladas.

Fig. 5.- Macrófago peritoneal infectado con Mycobacterium lepraemurium. La infección se realizó

con una MOI 1:50 durante 12 días. La célula se tiñó con Hematoxilína férrica y la bacteria con

fucsina fenicada. La célula muestra un aspecto “saludable” y un núcleo íntegro, sin evidencias de

apoptosis (100X).

En algunos experimentos, los macrófagos se co-infectaron con levaduras, observándose que la

infección de MLM no imposibilita la infección con otro tipo de microorganismos. La capacidad de

La figura 4, omitida por motivos de tamaño del archivo, se incluye en el informe impreso

La figura 5, omitida por motivos de tamaño del archivo, se incluye en el informe impreso

21

infección por otros microorganismos aún cuando las células están repletas de MLM sugiere que

cada microorganismo utiliza diferentes vías para interiorizarse en los macrófagos (Fig. 6).

Fig. 6. Coinfección de macrófagos murinos con MLM y levaduras. Se observa que a pesar de que

los macrófagos están saturados de bacilos todavía tienen la capacidad de ingerir otros

microorganismos lo que indica que cada microorganismo se interioriza utilizando diferentes

receptores o que las células sintetizan nuevos receptores comunes a ambos microorganismos.

Replicación de MLM

Los experimentos sobre la replicación de MLM dentro de los macrófagos murinos a diferentes

tiempos de cultivo (de 0 a 12 días) indican que MLM se duplica aproximadamente cada 24 horas.

Este tiempo de replicación de 1 día, es mucho más corto que el reportado por otros investigadores,

de 11 días.

D.- Microscopia electrónica de transmisión

Los estudios por microscopía electrónica de los cultivos de macrófagos infectados por MLM

mostraron que la fagocitosis de MLM no induce cambios morfológicos ni en el exterior ni en el

interior de las células, el contacto de la micobacteria con la célula no propicia la formación de

prolongaciones citoplásmicas características de las células activadas, las bacterias se ingieren

como unidades individuales manteniéndose en fagosomas aislados que con el tiempo pueden

llegar a fusionarse formando fagosomas gigantes. La gran mayoría de las bacterias muestran

buena integridad estructural y siempre se observan rodeadas por un material electrotransparente

que ahora se sabe son lípidos de origen micobacteriano (Fig. 7).

Fig 7.-Microfotografía obtenida por Microscopia Electrónica de un macrófago peritoneal infectado

con MLM. En la imagen se puede observar que MLM reside tanto en vacuolas únicas como en

vacuolas fusionadas, siempre rodeado de un material electrotransparente.

E.- Transito de Mycobacterium lepraemurim en macrófagos murinos

La figura 6, omitida por motivos de tamaño del archivo, se incluye en el informe impreso

La figura 7, omitida por motivos de tamaño del archivo, se incluye en el informe impreso

22

Mycobacterium lepraemurium parece penetrar a los macrófagos murinos a través de estructuras

(receptores) presentes en la membrana celular, particularmente en los extremos apicales de las

prolongaciones citoplásmicas de las células. Inmediatamente después de ingerirse, las bacterias o

los fagosomas que las contienen son transportados ordenadamente a través del citoplasma celular

hasta localizarse ordenadamente alrededor del núcleo, respetando un área que todavía no

podemos definir que contiene. Por lo ordenado de su transporte intracelular es seguro que las

bacterias utilicen el citoesqueleto para su transporte, particularmente los filamentos de tubulina

(microtúbulos).

G.- Bloqueo de receptores en macrófagos murinos

Análisis de bloqueo de receptores mediante citometría de flujo

Para este experimento se utilizaron macrófagos peritoneales inducidos con aceite mineral ligero y

mantenidos en suspensión en tubos de nalgeno. Cada 1 x 106 células se incubaron con 1 µg de

anticuerpo contra el receptor de interés. Las suspensiones de macrófagos preincubadas con

anticuerpo y las suspensiones control (no tratadas) se infectaron con MLM a la proporción de 1:50

durante 30 min y luego se tiñeron con un anticuerpo fluorescente anti-CD11b, un marcador de

macrófagos. Las bacterias usadas para la infección se tiñeron previamente con un colorante rojo

fluorescente que interacciona con los lípidos de la bacteria sin afectar ni su viabilidad ni su

capacidad infectante. Las suspensiones celulares se lavaron y se sometieron a análisis por

citofluorometría. La Figura 8 muestra la distribución de las células CD11b y se señala la región

seleccionada para el estudio de macrófagos.

Fig. 8. Distribución de la población celular obtenida de ratones preinoculados intraperitonealmente

con 1.0 ml de aceite mineral cinco días antes de la colección de células. La imagen generada en el

citofluorómetro muestra la región seleccionada para el estudio de macrófagos (círculo) y

corresponde a la población CD11b+.

Las siguientes figuras muestran el efecto que tuvo el bloqueo de diferentes receptores fagocíticos

(con anticuerpos específicos) sobre la ingestión de ML.

La figura 8, omitida por motivos de tamaño del archivo, se incluye en el informe impreso

La figura 9, omitida por motivos de tamaño del archivo, se incluye en el informe impreso

23

Figura 9.- Histograma que ilustra el efecto del bloqueo de receptores de macrófagos sobre la

ingestión de MLM. El control negativo corresponde a macrófagos intactos. El control positivo son

macrófagos infectados con MLM a una MOI 1:50 durante 30 min. En el histograma se muestra el

efecto de los dos receptores que tuvieron un efecto bloqueador del ingreso de MLM a los

macrófagos murinos.

Figura 10.- Bloqueo de receptores involucrados en la fagocitosis de Mycobacterium lepraemurium.

La fagocitosis de MLM fue analizada por ensayos de citometría de flujo. El control representa los

macrófagos infectados con MLM-rojo-fluorescente durante 30 min. Los resultados muestran el

promedio ± DEM de cuatro experimentos independientes. El bloqueo de los receptores TLR6 y

MR condujo a una disminución significativa en la cantidad de bacterias ingeridas (t de Student, p<

0.05). El bloqueo de los otros receptores no afectó la ingestión de los microorganismos.

Figura 11.- Bloqueo de receptores involucrados en la fagocitosis de Mycobacterium tuberculosis.

La fagocitosis de MTB fue analizada por ensayos de citometría de flujo. El control representa los

macrófagos infectados con MTB-rojo fluorescente durante 30 min. Los resultados muestran el

promedio ± DEM de cuatro experimentos independientes (t de Student p< 0.05). En el caso de

MTB, el bloqueo de los receptores TLR2 y RM redujo considerablemente la ingestión de esta

bacteria. Los receptores TLR2 y RM ya se han identificado como receptores relevantes para MTB.

El análisis los resultados se hizo tomando como 100% de infección la “señal” dada por los

macrófagos (células CD11b+) infectados durante 30 minutos con MLM o con MTB.

En el caso de Mycobacterium tuberculosis aunque se observa disminución en algunos de los

bloqueos de receptores, ninguno de ellos mostró una disminución tan marcada y evidente como en

el caso de MLM. Por ello y dado que MTB es una micobacteria que tiende a formar agregados

bacterianos consideramos que no es tan confiable reportar estos hallazgos como ciertos.

La Fig. 10, omitida por motivos de tamaño del archivo, se incluye en el informe impreso

La Fig. 11, omitida por motivos de tamaño del archivo, se incluye en el informe impreso

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Consideramos de interés estudiar con más detalle la participación de TLR6 en la fagocitosis de

MLM ya que los estudios de microscopia óptica y de fluorescencia realizados indican que el

bloqueo de este receptor tiene un efecto negativo en la fagocitosis de MLM. Además, los TLR son

receptores a los cuales se les ha atribuido un efecto positivo en la inducción de inmunidad celular y

en nuestro modelo de la lepra murina esta forma de inmunidad se encuentra deprimida lo cual hace

mas interesante el estudio de este TLR.

I.- Papel de “lipid rafts” en la entrada de MLM en macrófagos murinos

La participación de las balsas lipídicas (lipid rafts) en la fagocitosis de MLM es, hasta ahora, un

aspecto que no se ha estudiado en lepra y menos en lepra murina. Se sabe que los lipid rafts

juegan un papel muy importante en la ingestión de Brucella y otros microorganismos. Nuestros

resultados indican que estas estructuras no participan en la entrada de MLM a los macrófagos

murinos porque los estudios de colocación nunca mostraron asociación entre estas moléculas y

MLM, cosa que sí ocurrió en el caso de Brucella. El bloqueo de lipid rafts con ciclodextrina no

impidió la entrada del microorganismo a los macrófagos. La Figura 12 ilustra estos resultados para

el caso de MLM.

Fig 12.- Los “Lipid rafts” no participan en la fagocitosis de Mycobacterium lepraemurium. MLM fue

teñida con rojo-fluorescente y los “lipid rafts” fueron teñidos con la fracción β de la toxina del cólera-FITC (verde). A.-Distribución normal de los “lipid rafts” en una célula no infectada. B.-MLM. C.- Distribución de los “lipid rafts” en un macrófago infectado con MLM (30 min). D-sobreposición de B y C donde se muestra ambas marcas.

BIBLIOGRAFÍA

1. Abbas KA, Lichtman AH and Pillai S. Cellular and Molecular Immunology. 6th edition. Saunders

Elsevier. 35-37:2006.

2. Aderem A y Underhill D. Mechanisms of phagocytosis in macrophages. Ann Rev Immunol. 17,

593-623:1999.

3. Astarie-Dequeker C, N´Diaye EN, Le Cabec V, Ritting MG, Prandi J, Maridonneau-Parini I. The

mannose receptor mediates uptake of pathogenic and nonpathogenic mycobacteria and

bypases bactericidal responses in human macrophages. Infect Immun. 67, 469-477:1999.

4. Azuma I, Yamamura Y, Tanaka Y, Kohsaka K , Mori T and Itoh T. Cell Wall of Mycobacterium

lepraemurium Strain Hawai. J Bacteriol. 113 (1), 515-518:1973.

AA

CC

AA

DD

La Fig. 12, omitida por motivos de tamaño del archivo, se incluye en el informe impreso

25

5. Bhatt K, Salgame P. Host innate immune response to Mycobacterium tuberculosis. J Clin

Immunol. 27(4), 347-62: 2007.

6. Bochud,PY, Hawn TR y Aderem A. Cutting edge: a toll-like receptor 2 polymorphism that is

associated with lepromatous leprosy is unable to mediate mycobacterial signaling. J Immunol.

170(7), 3451-4:2003.

7. Brett SJ. T-Cell responsiveness in Mycobacterium lepraemurium infections in a “resistant”

(CBA) and a “susceptible” (BALB/c) mouse strain. Cel Imnunol. 89, 132-143:1984.

8. Brown IN, Glynn AA and Plant J. Inbred mouse strain resistance to Mycobacterium

lepraemurium follows the Ity/Lsh pattern. Immunol. 47, 149-156:1982.

9. Desjardins, M. Biogenesis of phagolysosomes: the “kiss-and-run hypothesis”. Trends Cell Biol.

5, 183-186:1995.

10. DesJardin LE, Kaufman TM, Brian Potts, Beth Kutzbach, Hong Yi and Schlesinger LS.

Mycobacterium tuberculosis-infected human macrophages exhibit enhanced cellular adhesion

with increased expression of LFA-1 and ICAM-1 and reduced expression and/or function of

complement receptors, FccRII and the mannose receptor. Microbiol .148, 3161–3171:2002.

11. Draper P. Purification of Mycobacterium leprae. Report of the fifth meeting of the Scientific

Working Group on the Immunology of Leprosy. Geneva, 1980. TDR/IMMLEP-SWG 5/80.3

12. Gatfield J and Pieters J. Essential role for cholesterol in entry mycobacteria into macrophages.

Science. 288, 1647–1650:2000.

13. Gaylord H, Brennan PJ. Leprosy and the leprosy bacillus: recent devolepments in

characterization of antigens and immunology of the disease. Annu Rev Microbiol. 41, 645-

75:1987.

14. Garin J, Diez R, Kieffer S, Dermine JK, Duclos S, Gagnon E, Sadoul R, Rondeau C y

Desjardins M. The phagosome proteome: insight into phagosome functions. J Cell Biol. 152,

165 – 180:2001.

15. Hart P, Dárcy JA, Armstrong CA, Brown and P. Draper. Ultraestructural study of the behavior of

macrophages towards parasitic mycobacteria. Infect and Immunity. 5, 803:1972.

16. Hirsch C, Ellner J, Russell D y Rich E. Complement receptor-mediated uptake and tumor

necrosis factor-O-mediated growth inhibition of Mycobacterium tuberculosis by human alveolar

macrophages. J Immunol. 152, 743-753:1994.

17. Hu C, Mayadas-Norton T, Tanaka T, Chan J y Salgame P. Mycobacterium tuberculosis

Infection in Complement Receptor 3-Deficient Mice1. The J Immunol. 165, 2596–2602:2000.

18. Janeway CAJ. The immune system envolved to discriminate infectious nonself from

noninfectious self. Immunol Today. 13, 11-16:1992.

19. Jarnagin JL, Luchsinger DW. The use of fuorescein diacetato and ethidium bromide as stain for

evaluating viability of mycobacteria. Stain Technol. 55, 253: 1980.

26

20. Jo EK, Yang CS, Choi CH and Harding CV. Intracellular signaling cascades regulating innate

immune responses to Mycobacteria: branching out from Toll-like receptors. Cel Microbiol. 9(5),

1087-1098:2007.

21. Kawaguchi Y. Classification of mouse leprosy. Jpn J Experim Med. 29, 651-663: 1959.

22. Lafont F and Van der Goot G. Bacterial invasion via lipid rafts. Cel Microbiol. 7(5), 613-

620:2005.

23. Lapaque N, Forquet F, De Chastellier C, Mishal Z, Jolly G, Moreno E, Morrión I, Heuser J, He

Hai-Tao and Gorvel JP. Characterization of Brucella abortus lipopolysaccharide macrodomains

as mega rafts. Cel Microbiol. 8(2), 197-206:2006.

24. Luna-Herrera J. Tesis Doctorado. Lípidos del Mycobacterium lepraemurium aspectos químicos

y biológicos. ENCB. IPN. Marzo 1991.

25. Maldonado-García G, Chico-Ortiz M, López-Marín LM and Sánchez-García FJ. High polarity

Mycobacterium avium-Derived lipids interact with murine macrophages lipid rafts.Scan J

Immunol. 60, 463-470:2004.

26. Maslov AK and Kalyanina OV. Effect of peroxidase on the development of experimental leprosy

in mice after intraplantar infection. Bull Exp Biol Med. 129(5), 484-6:2000a.

27. Maslov AK and Luzhnova SA. Effects of peroxidase therapy on functional state of the liver and

phagocytes and blood cell counts in mice with experimental leprosy. Bull Exp Biol Med.

130(7), 682-6:2000b.

28. Means TK, Wang S, Lien E, Yoshimura A, Golenbock DT, Fenton MJ. Human toll-like receptors

mediate cellular activation by Mycobacterium tuberculosis. J Immunol. 163(7), 3920-7:1999.

29. Mori T, Study of a growth factor for Mycobacterium lepraemurium. I. Minimal medium. Int J Lepr

Other Mycobact Dis. 46(2), 125-32:1978.

30. Moura ACN, Modollel M y Mariano M. Down-regulatory effect of Mycobacterium leprae cell wall

lipids on phagocytosis, oxidative respiratory burst and tumour cell killing by mouse bone

marrow derived macrophages. Scan J Immunol. 46, 500-505:1997.

31. Palomino-Leao-Ritacco. Tuberculosis. BourcillierKamps.com. Primera Edición. 2007.

32. Prabhakaran K, Harris EB, Kirchheimer WF. Binding of 14C-labeled DOPA by Mycobacterium

leprae in vitro. Int J Lepr. 44, 58-64: 1976.

33. Rink J, Ghigo E, Kalaidzidis Y y Zerial M. Rab conversion as a mechanism of progression from

early to late endosomes. Cell. 122, 735 – 749:2005.

34. Rojas-Espinosa O, Reyes Maldonado E. Renal alterations in murine leprosy. Int J Lepr Other

Mycobact Dis. 59(4), 652-5: 1991a.

35. Rojas-Espinosa O, Oltra A, Arce P, Mendez P.Inhibition of complement activity in murine

leprosy. Int J Lepr Other Mycobact Dis. 59(4), 605-12:1991b.

36. Rojas-Espinosa O, Camarena-Servin V, Estrada-Garcia I, Arce-Paredes P, Wek-Rodriguez K.

Mycobacterium lepraemurium, a well-adapted parasite of macrophages: I. Oxygen

metabolites.Int. J. Lepr and other Mycobact. Dis. 66 (3), 365-73:1998.

27

37. Rojas-Espinosa O, Løvik M. Mycobacterium leprae and Mycobacterium lepraemurium

infections in domestic and wild animals. Rev Sci Tech. 20(1), 219-51:2001.

38. Rojas-Espinosa O, Wek-Rodriguez K, Arce-Paredes P, Aguilar-Torrentera F, Truyens C y

Carlier Y. Contrary to BCG, MLM fails to induce the production of TNF-O and NO by

macrophages. Int. J. Lepr. 70 (2), 111-118:2002.

39. Rojas-Espinosa O, Wek-Rodriguez K, Arce-Paredes P. The effect of exogenous peroxidase on

the evolution of murine leprosy. Int J Lepr Other Mycobact Dis. 70(3), 191-200:2002b.

40. Rojas- Espinosa O y Arce-Paredes P. Fagocitosis: mecanismos y consecuencias. Primera

parte. Bioquimía. Vol 28 (4), 19-30:Octubre-Diciembre 2003.

41. Rojas-Espinosa O. Anergia en lepra ¿Dónde esta el defecto?. Fontilles, Rev Leprol. 26 (2),

121-142: 2007.

42. Schlesinger LS, Horwitz MA. Phagocytosis of leprosy bacilli is mediated by complement

receptors CR1 and CR3 on human monocytes and complement component C3 in serum. J Clin

Invest. Apr; 85(4), 1304-14:1990.

43. Schlesinger LS, Horwitz MA. Phenolic glycolipid-1 of Mycobacterium leprae binds complement

component C3 in serum and mediates phagocytosis by human monocytes. J Exp Med. Nov 1;

174(5), 1031:1991.

44. Schlesinger LS. Macrophage phagocytosis of virulent but not attenuated strains of

Mycobacterium tuberculosis is mediated by mannose receptors in addition to complement

receptors. J Immunol. 50(7), 2920-30:1993.

45. Silva Miranda M, Rodríguez KW, Martínez Cordero E and Rojas-Espinosa O. Expression of

cyclooxygenase-2, alpha 1-acid-glycoprotein and inducible nitric oxide synthase in the

developing lesions of murine leprosy. Int J Exp Pathol. Dec 87(6), 485-94:2006.

46. Soilleux EJ, Sarno EN, Hernandez MO, Moseley E, Horsley, J, Lopes UG, Goddard MJ,

Vowler SL, Coleman O, Shattock RJ, and Sampaio EP. DC-SIGN association with the Th2

environment of lepromatous lesions: cause or effect?. J Pathol. 209, 182-189:2006.

47. Sugawara I, Yamada H, Li C, Mizuno S, Takeuchi O and Akira S. Mycobacteriial infection in

TLR2 and TLR6 knockout mice. Microbiol Immunol. 47(5), 327-336:2003.

48. Tailleux L, Pham-Thi N, Bergeron-Lafaurie A, Herrmann JL, Charles P, Schwartz O,

Scheinmann P, Lagrange PH, Jacques de Blic , Tazi A, Gicquel B and Neyrolles O. DC-SIGN

Induction in alveolar macrophages definen privileged target host cells for mycobacteria in

patients with tuberculosis. 2 (12), 1269-1279:2005.

49. Vergne I, Chua J, Singh S and Deretic V. Cell Biology af Mycobacterium tuberculosos

Phagosome. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 20, 367 – 394: 2004.

50. Vieira O, Botelho R y Grinstein S. Phagosoma maduration: aging gracefully. Biochem J. 366,

689-704:2002.

51. Zaas DW, Duncan M, Wright JR and Abraham SR. The role of lipid rafts in the pathogenesis of

bacterial infection. Biochimica et Biophysic Acta. 1476, 305-311:2005.

28

52. Zimmerli S, Edwards S, Ernst JD. Selective receptor blockade during phagocytosis does not

alter the survival and growth of Mycobacterium tuberculosis in human macrophages. Am J

Respir Cell Mol Biol. 15(6), 760-70:1996.