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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA
INFORME FINAL DEL PROYECTO DE INVESTIGACIÓN Y PROPUESTA DE ESTUDIO
PROYECTO No. 20070120.
“EEVVAALLUUAACCIIOONN DDEE LLAA TTOOXXIICCIIDDAADD DDEE CCEEPPAASS DDEE BBaacciilllluuss tthhuurriinnggiieennssiiss
SSOOMMEETTIIDDAASS AA UUNN PPRROOCCEESSOO DDEE MMUUTTAAGGEENNEESSIISS AALL AAZZAARR.” Reynosa, Tamaulipas, a 28 de Enero del 2007.
“EEVVAALLUUAACCIIOONN DDEE LLAA TTOOXXIICCIIDDAADD DDEE CCEEPPAASS DDEE BBaacciilllluuss tthhuurriinnggiieennssiiss
SSOOMMEETTIIDDAASS AA UUNN PPRROOCCEESSOO DDEE MMUUTTAAGGEENNEESSIISS AALL AAZZAARR.. ””
RESUMEN:
El objetivo principal del proyecto fue evaluar el efecto de la radiación ultravioleta sobre las
esporas de Bacillus thuringiensis con la finalidad de visualizar el efecto fenotípico de las células
bacterianas y la acción bioinsecticida de las inclusiones proteicas producidas bajo esta
condición. La bacteria Bacillus thuringiensis (Bth) es una alternativa ecológica para reducir el
daño de insectos plaga través de un metabolito producido al final de su ciclo de vida. El
complejo espora y cristal ó δ-endotoxina presenta un efecto toxico contra insectos plaga de
diversos ordenes. Estos productos bacterianos son aplicados en campo mediante aspersiones
foliares sobre las áreas a proteger, factor que hace que el complejo sea expuesto a la radiación
solar. Diversos trabajos establecen que los cristales proteicos son inactivados bajo esta
condición disminuyendo o cesando la actividad bioinsecticida. Existe muy poca información
publicada acerca del efecto biológico de la radiación UVC sobre las esporas de este
microorganismo. Esta información es gran importancia dentro del control de insectos plaga
mediante el uso de entomopatógenos microbianos, debido a que estos agentes deben de cumplir
ciertas características para que sean considerados efectivos, y una de ellas es que sea capaz de
causar epizootias entre la población de insectos plaga, por lo que deben ser ambientalmente
mas estables. Nosotros nos enfocamos a evaluar la toxicidad de la cepa 4L1 de B. thuringienis
sujeta a un proceso de mutagénesis por acción de la LUV, evaluándola contra una colonia de
insectos bajo condiciones de laboratorio tomando como referencia de comparación a la cepa
nativa. Dentro de los resultados obtenidos observamos un incremento en la biomasa celular
húmeda y el complejo espora cristal obtenido en los cultivos expuestos a la LUV,
incrementándose de en comparación con la cepa nativa un 21 a un 111% dependiendo del
tiempo de exposición a la fuente de luz. Los extractos espora cristal fueron incorporados a la
dieta artificial del insectos a dosis de 50g/ ml de dieta. La cepa nativa ocasiono un 85% de
mortalidad de la colonia de insectos, mientas que las cepas expuestas a una fuente de LUV en
intervalos de 10, 20, 30, 40, 50 y 60 minutos ocasionaron una mortalidad del 60, 63, 50, 35 65 y
38% respectivamente. Mediante este estudio se aprecia que la exposición de las esporas a una
fuente de LUV tiene un efecto positivo en el desarrollo celular de las células de Bacillus
thuringiensis reflejado en una mayor cantidad del complejo espora cristal obtenido, sin embargo
la toxicidad de las proteínas cristalinas de Bacillus thuringiensis se ve afectada disminuyendo la
mortalidad en un orden del 25 al 47% de mortalidad en relación a la cepa nativa
INTRODUCCIÓN:
Desde los inicios de la agricultura las civilizaciones sufrieron frecuentemente la devastación de
sus cosechas por los ataques de las plagas de insectos. Ante esta situación, el hombre fue
desarrollando algunas estrategias para su control y es así que desde hace algunos siglos los
chinos utilizaron hormigas para proteger sus huertas de cítricos contra gusanos, avispas y otros
insectos. Ya en el siglo XIX, científicos europeos y norteamericanos emplearon depredadores
naturales (catarinas y avispas) y patógenos (hongos) para proteger cultivos y bosques,
obteniendo resultados muy alentadores. Estas investigaciones perdieron importancia entre 1930
y 1940 al descubrirse los insecticidas químicos: compuestos que originalmente fueron
concebidos como armas químicas; como resultaron ser mucho más rápidos, baratos y con un
espectro de acción más amplio que los enemigos naturales de los insectos, su uso se extendió
rápidamente hasta llegar ha constituirse en una herramienta imprescindible de la agricultura
moderna. Si bien los insecticidas químicos han permitido un control eficaz de las plagas, se ha
establecido que estos compuestos son altamente perjudiciales para la salud humana y los
ecosistemas; además, por su persistencia en el medio ambiente, favorecen la selección de
insectos plaga resistentes a ellos, lo que ha motivado el uso de dosis cada vez mayores o de
productos cada vez más tóxicos. Esto ha generado mucha preocupación en el ámbito mundial y
actualmente se trabaja para limitar la aplicación de los insecticidas químicos y promover el
manejo integrado de plagas que incluye otras formas de control, efectivas y menos
contaminantes, tales como trampas, plásticos y el control biológico. Existen diferentes
alternativas a los métodos químicos, como por ejemplo el uso de biopesticidas, enmiendas
orgánicas, plantas resistentes a determinados patógenos, plantas micorrizadas, rotación de
cultivos, entre otras Dichas alternativas no son excluyentes, por el contrario, una combinación de
ellas de manera correcta podría llevar a un control económicamente aceptable para la mayoría
de los cultivos.
Los biopesticidas son productos que contienen un microorganismo como ingrediente activo o
bien se extraen de un ser vivo mediante procedimientos que no alteran su composición química.
Pueden estar constituidos por toda o una parte de la sustancia extraída, concentrada o no,
adicionada o no a sustancias coadyuvantes (DE LIÑAN, 2001). Esta estrategia de control
contempla la manipulación intencional de las poblaciones de los enemigos naturales de los
insectos plaga para limitar su población, así como el uso de algunos agentes microbianos
entomopatógenos.
La biotecnología ofrece varias alternativas para el control biológico, que van desde el uso de
reactores para la producción masiva de microorganismos silvestres y modificados
genéticamente, con un margen más amplio o mayor virulencia que los silvestres, hasta el uso de
plantas modificadas genéticamente y resistentes al ataque de algunos insectos. Dentro de los
productos biotecnológicos de este tipo, están las formulaciones comerciales de algunos
microorganismos conocidos como bioinsecticidas e incluyen a diferentes géneros y especies de
bacterias, hongos, nemátodos y virus. Estos microorganismos, denominados entomopatógenos,
son específicos: afectan sólo a determinados grupos de insectos y son inofensivos para insectos
benéficos, humanos y otros organismos superiores.
Un requisito importante para el uso de un microorganismo como agente de control es su
producción masiva a bajo costo, llevar a cabo la búsqueda de cepas nativas mas potentes y con
mayor estabilidad a las factores bióticos del campo una vez aplicadas las formulaciones del
biopesticida.
Los Agentes Microbianos de Control Plagas, como los productos de varias subespecies Bacillus
thuringiensis, cada vez más son usados en programas control de insectos plaga de importancia
agrícola, forestal y medica.
Bacillus thuringiensis Bacillus thuringiensis (Bt) representa el mayor volumen de los
bioinsecticidas producidos en el ámbito mundial.
Bacillus thuringiensis produce una serie de proteínas cristalíferas la cuales presentan un efecto
toxico contra la mayoría de los ordenes de la clase Insecta en la etapa larval, tales como
lepidópteros, dípteros y coleópteros. Los cristales son protoxinas que al ser ingeridas por el
insecto son solubilizadas y procesadas por proteasas en el tracto digestivo. Las proteínas
procesadas son toxinas que se unen a receptores específicos en el epitelio del intestino y actúan
como otras enterotoxinas.
Las proteínas cristalíferas, llamadas Cry, están codificadas en plásmidos y se producen durante
el proceso de esporulación. Los plásmidos pueden perderse por el efecto de las condiciones del
proceso, en particular algunos genes Cry, lo que modificaría a su vez la proporción de las
diferentes proteínas que forman el cristal y por lo tanto su solubilidad y toxicidad. Las esporas de
Bacillus thuringiensis no están directamente involucradas en la toxicidad, pero contribuyen a la
mortandad del insecto, por lo que la mayoría de las preparaciones comerciales de Bacillus
thuringiensis incluyen proteínas Cry y esporas.
A escala industrial el método de producción de Bacillus thuringiensis involucra el cultivo por lote.
Experimentalmente, en cultivo por lote alimentado o en cultivo continuo, se ha logrado un
incremento considerable de biomasa y esporas; sin embargo, la actividad insecticida obtenida,
normalizada por la biomasa, es baja comparada con los cultivos en lote, lo que ha demostrado
que no existe una relación directa entre la cuenta total de esporas y la producción de Cry. Otro
de los problemas relacionados a este microorganismo y que disminuyen la efectividad de de esta
bacteria en campo son falta de adherencia de la bacteria sobre el cultivo a proteger debido a la
perdida por lavado (lluvia) y la inactivación de las toxinas por acción de la radiación ultravioleta
de la radiación solar. Se ha reportado la disminución o in inactivación de las proteínas cry por
acción de la luz solar. Sin embargo no se ha reportado el efecto que provoca la radiación solar
sobre las esporas de Bacillus thuringiensis. Esto es una información relevante que tendrá que
ser objeto de estudio debido a que para llevar a cabo la aplicaron de esta clase de productos en
campo para llevar a cabo su protección contra insectos plaga se lleva acabo la aplicación de
complejos espora cristal de B.t. Por lo que seria importante ver el efecto biológico que provoca la
radiación Ultravioleta sobre las esporas,, ya que se encontrar alguna variante de esta cepa con
esporas resistentes a este tipo de radiación, podremos llevar a cabo la protección del cultivo una
vez que estas esporas sean ingeridas y sean capaces de germinar en el interior del intestino el
insecto, por lo que una vez pasado del estadio de resistencia(espora) al estadio vegetativo, este
será capaz de llevar a cabo la síntesis de novo de proteínas cry para de esta manera poder
controlar a la colonia de insectos plaga.
Bajo este contexto, nos enfocamos a estudiar el efecto biológico de la radiación UV sobre las
esporas (cuerpos de resistencia) de esta bacteria y ver si es posible encontrar una variante
resistente a este tipo de radiación y ver si además presenta un efecto positivo con relación a su
entopatogencidad para de esta manera seleccionar alguna cepa con un elevado potencial para
llevar cabo el control de insectos plaga.
HIPOTESIS:
La exposición de esporas de Bacillus thuringiensis a una fuente de radiación Ultravioleta induce
un efecto biológico positivo sobre el microorganismo, incrementando la toxicidad contra una
colonia de insecto plaga
OBJETIVO GENERAL: . Evaluar la toxicidad de un cepa de Bacillus thuringiensis sometida a un proceso de mutagénesis
clásica sobre una colonia de insectos plaga criados bajo condiciones de laboratorio.
OBJETIVO ESPECIFICOS:
1. Evaluar la productividad de la biomasa y del complejo espora cristal obtenido a partir de
las células tratadas con respecto a la cepa nativa.
2. Evaluar la entotoxicidad de las células tratadas con una fuente de radiación ultravioleta
con respecto a la cepa nativa contra una colonia de insectos.
METODOLOGIA: Activación de las Cepas.- Las cepa 4L1 de B. thuringiensis fue reactivada sembrándola sobre placas de agar nutritivo
mediante el estriado cerrado en tamiz con la finalidad de cubrir toda la superficie del agar y
generar lo máximo de biomasa celular por unidad de superficie. Las placas fueron incubadas a
30ºc por espacio de 120 horas hasta obtener un cultivo cien porciento esporulado.
Inducción de la Mutagénesis.-
Una vez teniendo el material biológico (cepa 4L1 de B.th) en la fase esporulada, se inocularon 14
placas de agar nutritivo en cuatro cuadrantes. Los tratamientos a evaluar fueron 7 tiempos de
exposición (por duplicado) a la fuente de radiación UVC (0, 10, 20, 30, 40, 50 y 60 minutos). En
el interior de una campana de flujo laminar, las placas fueron expuestas de manera directa a la
fuente de UVC (265 nm) de manera directa a una distancia de 10 centímetros y dosificando cada
tratamiento con intervalos de 10 minutos entre un tratamiento y otro. Las placas fueron
incubadas a 30ºc durante 24 horas. Transcurrido el tiempo de incubación, las colonias
desarrolladas fueron resembradas de manera individual en placas con agar nutritivo y tres tubos
con agar nutritivo inclinado, para monitorear la formación de esporas y cristales, así como para
mantener un cepario de trabajo. De cada tratamiento se selecciono un ejemplar tomando como
parámetro de selección el tiempo de producción de las inclusiones cristalinas y de la espora. El
stock de cepas fue almacenado a 4ºc hasta el momento de la evaluación biológica.
Propagación de las variantes desarrolladas.
Posteriormente cada una de las cepas a evaluar fue activada en un tubo con agar inclinado e
incubado a 30ºc por 18 horas. Transcurrido el tiempo de incubación, el material biológico se
utilizo como semilla de inoculación de tubos con 10 ml de caldo triptosa fosfato, los cuales se
incubaron 30ºc por espacio de 18hr agitando el cultivo a 200 rpm (Lab-Line® Incubator-Shaker).
Finalmente el cultivo obtenido fue utilizado para inocular al 1%, un litro del caldo melaza- harina
de soya constituido de 20g de harina de soya, 10 ml de melaza, 10 ml de líquido de remojo de
maíz y 1gr de carbonato de calcio ajustado a un pH 7. Los cultivos fueron incubados a 30ºc
manteniendo una agitación de 200 rpm hasta obtener un cultivo en proceso de esporulación en
donde las células estén esporuladas en una proporción del 80%. Una vez que la cepa nativa (no
expuesta a la radiación UVC) alcanza esta condición, los cultivos son sacados del proceso de
incubación para finalmente ajustar el pH del medio a 7. La biomasa fue cosechada mediante centrifugación a 4ºc y 10000 rpm por espacio de 30
minutos. El paquete obtenido fue pesado y se registró la biomasa obtenida por litro de medio de
cultivo.
Obtención del complejo espora-cristal
Las cepas de cada uno de los tratamientos se activaron durante 18 horas en tubos con agar
inclinado a un pH 7.0. Transcurrido el proceso de incubación se tomo una carga abundante para
inocular 50 ml de caldo triptosa fosfato (CTP) en matraces Erlen Meyer de 250 ml. Los matraces
se mantuvieron en agitación a 200 rpm., a 30ºC por 18 horas. Del medio CTP se tomó 10 ml
para realizar la inoculación de 1 lt. de medio base de melaza (melaza 20g/l, harina de soya 20g/l,
líquido de remojo de maíz 10 g/l y carbonato de calcio 1 g/l) a pH de 7.0-7.2, en matraces Erlen
Meyer de 1 litro con agitación a 200 rpm a 30ºC.
Para la recuperación del complejo espora-cristal, el medio de cultivo se sometió a centrifugación
a 10,000 rpm durante 30 min y se determinó el peso del precipitado mediante la siguiente
ecuación: PP= P1-P2 donde; P1 (peso 1) corresponde al peso del bote más el medio de cultivo, P2
(peso 2) corresponde al peso del precipitado en el bote y PP (peso del precipitado) corresponde
al peso del precipitado obtenido de la diferencia de los pesos.
Para obtener el complejo espora- cristal se realizo una co- precipitación Lactosa- Acetona
(Dulmage, 1970). Para obtener el volumen de lactosa al 5% necesario para la co-precipitación,
se realizó mediante el uso de factores ya determinados de la siguiente manera: el PP se
multiplicó por un factor de 1.71 y al volumen obtenido de lactosa se le sumó el PP. De esta
manera, se obtuvo el volumen total, esta cantidad se multiplicó por un factor de 3.34 para
obtener el volumen de lactosa (Dulmage, 1970). El precipitado (PP) se colocó en un vaso de
precipitado con el volumen calculado de lactosa y se mantuvo en agitación durante 30 min.
Transcurrido el tiempo de adiciono lentamente el volumen de acetona calculado y se continuo el
proceso de agitación por 30 minutos mas. Posteriormente se dejó reposar por 10 min. Toda la
mezcla se filtró al vacío en un matraz Kitasato utilizando papel Whatman #1, el precipitado se
lavó con tres volúmenes de acetona. El filtrado se dejó secar y se trituró finamente con un
mortero y se guardó en frascos herméticos hasta su utilización.
Bioensayos de toxicidad contra larvas de Spodoptera frugiperda.
Una vez obtenido el complejo espora-cristal de cada una de las colonias de B. thuringiensis, se
realizaron bioensayos en el laboratorio para verificar si esta bacteria entomopatógena mostraba
algún efecto tóxico contra larvas neonatas de Spodoptera frugiperda, del pie de cría establecida
en el laboratorio de Biotecnología Ambiental, del CBG.
Para los ensayos se utilizó una concentración baja de 50 µg/ml y una concentración alta de 500
µg/ml del extracto de B. thuringiensis. Se preparó una solución stock utilizando 250 mg de
extracto y se aforo a un volumen de 50 ml con agua destilada para obtener una solución
concentrada de 5000 µg/ml. De la solución stock se tomaron 12.5 ml los cuales se incorporaron
a 112.5 ml de dieta para obtener una concentración de 500 µg/ml de dieta y 1.25 ml más 11.25
ml de agua destilada se incorporaron a 112.5 ml de dieta para obtener la concentración de 50
µg/ml de dieta. Se utilizaron copas del número cero con dieta artificial para cada una de las
concentraciones, en las cuales se colocó una larva neonata, las copas fueron cerradas con tapas
de plástico y colocadas en bolsas de papel y se incubaron a 28ºC y 65±5% de H. R. Se probaron
un total de 75 larvas para cada concentración y extracto de B. thuringiensis. Como testigo
negativo se utilizaron copas con dieta sin extracto de B. thuringiensis y se registró la mortalidad
al termino de 7 días.
RESULTADOS Y DISCUSIONES. Activación de las Cepas
La cepa 4L1 de Bacillus thuringiensis fue utilizada para evaluar el efecto de la radiación
ultravioleta sobre las esporas. El cultivo fue inoculado en placas de agar nutritivo sembradas en
forma de tamiz. Las cepas fueron incubadas en una atmósfera de 30ºc hasta obtener un cultivo
100% esporulado.
Inducción de la Mutagénesis.-
Obtenido el material de partida para realizar los bioensayos, se evaluaron 7 tratamientos
diferentes de exposición a la radiación ultravioleta del rango de 265nm por duplicado. Las
esporas del microorganismo fueron sembradas por estriado en 3 cuadrantes y fueron expuestas
a la fuente de radiación de manera directa a 30 centímetros de distancia a dosis de 0, 10, 20, 30,
40, 50 y 60 minutos. Los tratamientos fueron incubados a 30ºc durante 24 horas.
Selección de Cepas Sobreproductoras Quitinasas.-
Transcurrido el tiempo de incubación 3 clonas fueron seleccionadas y resembradas en una placa
y en un tubo con agar nutritivo como fuente de trabajo y de mantenimiento del cepario. Los
cultivos fueron nuevamente incubados bajo las misma condiciones hasta la obtención del cultivo
esporulado. Para ello fue monitoreado el proceso de esporulación y de la síntesis de las
inclusiones cristalinas de proteínas cry, observando que al cabo de las 48 horas la totalidad de
los tratamientos iniciaron el proceso de esporulación celular y síntesis de producción del se
presento a las 78 horas posterior a la incubación de las placas. Un total de dieciocho variantes y
3 cepas nativas conformo el stock biológico de estudio.
Obtención del complejo espora-cristal
Para llevar a cabo la obtención del complejo espora- cristal de la cepa nativa y de los diferentes
tratamientos las cepas fueron activadas en tubos con agar inclinado e incubadas a 30ºc por
espacio de 18 horas. Transcurrido el tiempo de incubación, se escalo el proceso mediante la
inoculación de medio de cultivo líquido (Caldo Triptosa Fosfato) atizando el cultivo anterior como
fuente de inoculo. Los caldos fueron incubados a 30ºc, y 200 r.p.m. por un periodo de 18 horas.
Posteriormente esta cultivo se utilizad con semilla para llevar a cabo la inoculación del cultivo de
obtención del complejo espora cristal. Un litro de medio de melaza fue utilizado para llevar a
cabo la obtención del complejo. Inoculados los medios, estos fueron incubados a 30ºc y 200 rpm
hasta la obtención del complejo espora cristal. El proceso de fermentación a nivel matraz fue
monitoreado cada 6 horas sobre el tratamiento de la cepa nativa (0 horas) con la finalidad de
observar el proceso de esporulación. Una vez iniciado el proceso de esporulación, los tiempos
de monitoreo fueron acortados a 3 horas. Una vez observado el 80% de las células en proceso
de esporulación y antes de que se de la lisis de estas. El proceso de incubación es detenido con
la finalidad de obtener la biomasa microbiana y obtener el extracto del complejo espora cristal.
EL pH del medio de cultivo es ajustado a 7.0 y el material es centrifugado a 10,000 rpm a 4ºC
por espacio de 30 minutos. La biomasa del paquete celular obtenido y la productividad se
encuentra registrada en la tabla No. 1.
Tabla No. 1.- Biomasa y Rendimiento celular obtenido por litro de cultivo.
BBiioommaassaa ((ggrr)) RReennddiimmiieennttoo ((%%))
0 29.43 100
10 58.87 200.03 20 56.02 190.35 30 59.69 202.82 40 62.23 211.45 50 35.76 121.51 60 54.36 184.71 70 55.42 188.31 80 52.61 178.76
Analizando los resultados concentrados en la tabla No. 1, se de manera general se pudo
observar que la exposición de las esporas a la fuente de radiación ultravioleta del rango de los
265 nm, indujo un efecto positivo en las células de Bacillus thuringiensis, incrementando el
volumen de biomasa celular obtenido en comparación con la cepa nativa (tiempo 0 min.) en un
rango que oscila del 21.51 al111.45 % mas.
Una vez obtenido la biomasa, se procedió a obtener los complejos espora cristal mediante el
protocolo descrito por Dulmage (1970). La cantidad del extracto espora- cristal obtenido se
concentra en la Tabla No. 2.
Tabla No. 2.- Cantidad y Rendimiento del extracto obtenido por litro de cultivo.
EExxttrraaccttoo ((ggrr)) RReennddiimmiieennttoo ((%%))
0 6.15 100
10 10.12 164.59 20 10.00 162.64 30 10.18 165.53 40 10.47 170.28 50 8.89 144.55 60 10.91 177.39 70 10.77 175.18 80 9.93 161.56
El efecto positivo que se observo en los datos concentrados en la tabla 1, se reproduce en los
datos concentrados en la tabla dos, incrementándose el rendimiento del extracto obtenido en
relación a la cepa nativa (tiempo de exposición de 0 min.) en un rango del 44.55% al 77.39%
Bioensayos de toxicidad contra larvas de Spodoptera frugiperda.
La evaluación biológica de cada uno de los 7 tratamientos fue evaluada mediante la
incorporación de cada extracto en la dieta merídica del Insecto. Los extractos fueron
incorporados a dos dosis diferentes, una dosis alta (500 g/ml) y una dosis baja (50g/ml) y la
mortalidad fue registrada a las 24 horas y 7 días después de iniciado el bioensayo.
La cepa nativa origino una mortalidad del 85% a los 7 días de exposición, la mortalidad generada
por las cepas irradiadas decreció en un orden del 22 al 50 porciento cuando fueron sometidas a
la dosis de 50g/ml.
Los datos de la mortalidad ocasionada para cada una de las cepas y para cada dosis se
concentran en la tabla No. 3.
Tabla No. 3.- Evaluación del efecto toxico de la cepa nativa y las variantes de Bacillus
thuringiensis contra Spodoptera frugiperda bajo condiciones de laboratorio.
50 g/ml 500 g/ml
MMoorrttaalliiddaadd aa llaass 2244
hhrrss ((%%))
MMoorrttaalliiddaadd aa llooss 77
ddííaass ((%%))
MMoorrttaalliiddaadd aa llaass 2244 hhrrss
((%%))
MMoorrttaalliiddaadd aa llooss 77
ddííaass ((%%))
00 53 85 100 100
1100 32 60 89 100
2200 28 63 93 100
3300 22 50 84 93
4400 13 35 75 89
5500 35 65 92 100
6600 37 38 90 100
De los datos concentrados en la tabla No.3, podemos apreciar que la mortalidad generada por
cada uno de los tratamientos que la mortalidad se incrementa generada por la dosis de 500g/ml
es elevada con relación a la mortalidad provocada a una dosis de 50g/ ml, además de que la
mortalidad generada a las 24 horas como a los 7 días es muy cercana al 100% excepto para la
variante sometida a una exposición a la fuente de luz ultravioleta de 40 minutos.
Con relación a la mortalidad generada a ua dosis del 50g/ml, se puede apreciar que la
mortalidad generada por la cepa nativa (0 min.) es mayormente mas elevada que la generada
por las variantes irradiadas, disminuyendo la mortalidad provocada por estas ultimas en un orden
del 15 al 47 porciento a los siete días de evaluación. Así también se pudo observar que la
mortalidad generada a las 24 horas es significativamente inferior a la obtenida a los 7 días de
evaluación. En relación a la toxicidad, de manera general podemos apreciar que la exposición
de las esporas a una fuente de radiación ultravioleta de 265 nm de longitud de onda tiene un
efecto ligeramente negativo sobre la toxicidad generada contra Spodoptera frugiperda a una
dosis baja.
CONCLUSIONES.
Al terminar la parte experimental del presente proyecto pudimos concluir:
1. La acción de la Luz ultravioleta presenta un efecto positivo sobre el rendimiento y
producción de biomasa húmeda y del extracto de la cepa 4L1 de Bacillus thuringiensis
incrementándose la cantidad de cada uno de los productos
2. Sin embargo tuvo un ligero efecto negativo en relación a la toxicidad generada sobre una
colonia de Spodoptera frugiperda a una dosis de 50g/ml y bajo condiciones de
laboratorio.
3. Aunque la mortalidad de la cepa nativa como de las variantes irradiadas es cercana al
100% a la dosis de 500 g/ml, esto no es indicador que las cepas de Bacillus
thuringiensis efectivas como agentes de biocontrol, ya que operacionalmente la
concentración es muy elevada y los costos de producción del ingrediente activo serian
elevados.
LITERATURA CONSULTADA:
1. Alekseev, A.N., L.N. Karabanova., and Shevtsov, V.V. 1982 Initiators and inhibitors of
Bacillus thuringiensis spore germination. Mikrobiologiya. 51:780-783.
2. Aronson, A.I., D.J. Tyrell., P.C Fitz-James, and Bulla L. A., Jr. 1982 Relationship of the
synthesis of spore coat protein and parasporal crystal protein in Bacillus thuringiensis J.
Bacteriol. 151:399-410.
3. Aronson, A.I. Beckman, W and Dunn P. 1986 Bacillus thuringiensis and related insect
pathogens. Microbial Rev. 50:1-24.
4. Bulla. L.A. Jr. D.B. Bechtel., K. J. Kramer., Y.I. Shethna., and Fitz-James P.C. 1980
Utrastructura, physiology and biochemistry of Bacillus thuringiensis. Crit. Rev. Microbiol.
8:399-410.
5. Burges, H.D., and Hurts, J.A. 1977. Ecology of Bacillus thuringiensis in storage moths. J.
Invertebr. Pathol. 30:134-139
6. Cano, R.J., M.K. Boruca., M. H. Schweitzer., H.N. Poinar., G.O. Poinar, Jr., and Pollad
K.J. 1994. Bacillus DNA in fósil bees: an ancient simbiosis Appl. Environ. Microbiol.
60:2164-2167.
7. Crickmore, N., Zeigler, D.R, Feitelson, J., Schnepf, E., VanRie, J., Lereclus, D., Baum, J,
and Dean, D.H. 1998 Revision of the nomenclatura for the Bacillus thuringiensis
pesticidal crystal proteins. Microbiol Mol. Biol. Rev. 62:807-813.
8. Chiang, A.S., D.F. Yen, and Peng, W.K. 1986. Germination and proliferation of Bacillus
thuringiensis, in the gut of rice month larva Corcyca cephalica. J. Investebr. Pathol.
48:96-99.
9. Dickenson, C.H., and Precce, T.F. (ed). 1976. Microbiology of aerial plant surface
Academic Press Inc., New York, USA.
10. Delmas M J y Sánchez-Yañez, J.M. 2006. Respuesta de Bacillus thuringiensis .al
enriquecimiento de un suelo agrícola. http://www.monografias.com
11. Donnellan, J.E. and R.S. Stafford. 1968. The ultraviolet photochemistry and photobiology
of vegetative cells and spore of Bacillus megaterium. Biophy. J. 8:17-27.
12. Dulmage, H.T. 1970. Production of d-endotoxin complex by variants of Bacillus
thuringiensis in two fermentation media. J. Invertebr. Pathol. 16:385-389.
13. Dulmage, H.T., and Aizawa, K. 1982 Distribution of Bacillus thuringiensis in nature in
Microbial and Viral Pesticide. Ed B. Kurstaki M.D. New York. USA pp 209-237.
14. Fonda, M.S, Salama, H.S., and Selim, M. 1985 Factors affecting the growth physiology of
Bacillus thuringiensis. Appl. Microbiol. Biotechnol. 22:50-52.
15. Madani, F., Morel, P., and Kaelin, P. 1994 Isolation of Bacillus thuringiensis from stored
tobacco and Lasioderma serricorne (f) Appl. Environ. Microbiol. 60:19-25.
16. Galan-Wong, L.J., Rodríguez-Padilla, C., Tamez-Reyes, R., Gómez-Treviño, M., and
Dulmage, H., 1990 GM-2 a new subspecies of Bacillus thuringiensis (n. Subsp.
Coahuilensis) with an unusual for paraesporal inclusion body. Publ. Biol. 4:53-58.
17. Sánchez-Yáñez J.M. 2005 Producción de bioinsecticida a base de Bacillus thuringiensis:
Minirevisión. http:www.monografias.com
18. Germanine, G.R. and Murrell, W.G. 1973. Effect of dipicolinic acid on the ultraviolet
radiation resistence of Bacillus cereus spores. Photochem. Photobiol. 17:145-154.
19. Griego, V.M., and Spence, K.D. 1978. Inactivation of crystalline inclusions of Bacillus
thuringiensis by ultraviolet and visible light. Appl. Environ, Microbiol. 35:906-910.
20. Ignoffo, C.M., and García, C. 1978. U.V. Photorectivation of cell and spores of Bacillus
thuringiensis effects of peroxidase of inactivation. Environ. Entomol. 7:270-272.
21. Johnson, D.E., Oppert, B., and McGaughey, W.H. 1998. Spore coat synergizes Bacillus
thuringiensis crystal toxicity for Indianmeal moth. Curr. Microbiol. 36:278-282.
22. Li, J., Carroll, and Ellar, D.J. 1991. Crystal structures of insecticidal endotoxina from
Bacillus thuringiensis at 2.5 A resolution Nature. 353:815-821.
23. Medrano-González, M.A., Luna-Olvera, H.A., Peña-Cabriales, J.J., y Sánchez-Yáñez,
J.M. 2000. Supervivencia de células vegetativas de Bacillus thuringiensis en la
espermosfera-rizosfera de fríjol. TERRA. 18:333-337.
24. Núñez-Ramos C. 1979. Patógenos naturales de gusano collero (Spodoptera fugiperda L)
en maíz en el estado de Nuevo León. Facultad de Agronomía, Universidad Autónoma de
Nuevo León, Monterrey, N.L, México (Tesis inédita).
25. Reardon, R.C. & K, Hassig 1984. Efficacy and field persistence of Bacillus thuringiensis
afthe ground application to balsam fire and white spruce in Wisconsin. Can. Etomol.
116:153-158.
26. Sánchez-Yáñez, J.M., y Peña-Cabriales, J.J. 2000. Persistente of Bacillus thuringiensis
en hojas de maíz, de fríjol y en suelo. TERRA. 18:325-331.
27. Schenepf, E., Crickmore, N., Van Rie, J.D., Lereclus, J., Baum, J., Feitelson, D., Zeigler,
R., and Dean, D.H. 1998 Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins.
Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:775-806.
28. Sthaly, D.p., D.W. Dingman., L.A. Bulla, Jr., and Aronsosn, A. I. 1978. Possible origin and
function of the parasporal crystal in Bacillus thuringiensis Biochem. Biophys. Res.
Común. 84:581-588.
29. Valadares, G., Whittome, B., Shore, B., and David, B. 2001. Identification of Bacillus
thuringiensis subsp. Kurstaki strain HD-1 like bacteria from environmental and human
samples after aerial spraying of Victoria British Columbia, Canada, with foray 48B. Appl.
Environ Micribol. 67:1035-1043.
30. Wirth, M.C., Delecluse, A., and Walton, W.E. 2000. Lack of cross-resistence to cry 19A
from Bacillus thuringiensis subsp. Jegathesan in culex quinquefasciatus
(Diptera:Culicidae) resistant to cry toxins from Bacillus thuringiensis subsp. Israelensis
Appl. Environ. Microbiol. 67:1956-1958