AbstractoInducida por tumor-osteomalacia (TIO) es un sndrome paraneoplsico rara de los seres humanos. Algunos tumores mesenquimales (a menudo se asemejan a haemangiopericytomas) molculas expresas que normalmente regular el metabolismo de fsforo; con mayor frecuencia, factor de crecimiento de fibroblastos 23. Los pacientes desarrollan prdida renal de fosfato y concentraciones inadecuadamente bajos sricos de 1, 25 (OH) 2 vitamina D3, que conduce a la osteomalacia. La extirpacin quirrgica del tumor es curativa. Los autores examinaron la expresin del factor de crecimiento de fibroblastos canino 23 en 49 sarcomas de tejidos blandos, y de control de tejidos de perros adultos normales. ARN extrado de tejidos, incluidos en parafina de hueso o fijado en formol fue analizada por punto final y reaccin inversa cuantitativa cadena de la polimerasa con transcriptasa. Fibroblastos factor de crecimiento 23 se detect expresin en hueso, pulmn, rin, ganglios linfticos y el timo. Quince de 49 sarcomas (31%) expresaron el factor de crecimiento de fibroblastos 23, tres de ellos tenan alta expresin relativa y algunas de las caractersticas que se asemeja tumores mesenquimales que expresan fosfatonina de los seres humanos. Adicional se requiere trabajo para determinar si TIO puede ocurrir en perros.

IntroduccinEl raquitismo y la osteomalacia son enfermedades metablicas oseas poco frecuentes que afectan a los seres humanos y animales. Fracaso de la mineralizacin normal en la fisis o articular el cartlago de crecimiento de los nios o animales cables al raquitismo; el mismo proceso en la remodelacin sea de los adultos lleva a osteomalacia.1 El raquitismo es ms comn debido a la vitamina D o fsforo deficiency.1 casos raros de trastornos metablicos hereditarios y sndromes paraneoplsicos son reportados para causar raquitismo u osteomalacia en los seres humanos. Estos han sido variablemente relacionado con defectos bien descritos de cualquiera de vitamina D3 o fsforo metabolism.1 A pequeo nmero de casos bien fundamentadas de canino raquitismo heredadas han sido reported2; sin embargo, estas enfermedades parecen ser muy raro en el canino poblacin. Inducida por tumor-osteomalacia (TIO) es una rara sndrome paraneoplsico de los seres humanos con los pacientes mostrando reducida reabsorcin renal de fosfato, inapropiadamente bajos niveles de vitamina D3 activa y osteomalacia.3 Los tumores son responsables por lo general pequeos y ubicados en zonas oscuras como el sinuses4 paranasales o dentro bone 3,5,6 aunque que en ocasiones se encuentran subcutaneously.7,8A menudo son difciles de diagnosticar y resecar proyeccin de imagen avanzada completely.3 (como la gammagrafa, imgenes de resonancia magntica o de positronesLa tomografa por emisin / tomografa computarizada escanear) ha sido necesaria para identificar los sitios de osteomalacia y localizar el tumor causante, 6,9-11 que sin embargo puede desafiar identificacin en algunos los pacientes afectados a pesar de tales measures.12 Temprana los investigadores observaron que la eliminacin de la causante tumor condujo a la resolucin de osteomalacia.3,5,13,14La mayora de los tumores que causan TIO se designan fosfatrica mesenquimales tumor-mezclado variante del tejido conectivo (PMT-MCT), y tienen una apariencia morfolgica consistente similar a haemangiopericytomas. 5,15 En trminos generales, PMT-MCT se compone de un gran nmero de clulas estrelladas vagamente en forma de huso a densamente poblado al incrustados dentro de un mixoide altamente vascular estroma condroide, que se describe con frecuencia como 'Grungy'15 debido a difundir la mineralizacin. Inmunohistoqumica perfilado de PMT-MCT muestra escasa tincin de actina muscular especfica suave, y tincin negativa para S-100, CD34, desmina y cytokeratin.15 Predominantemente expresado por el hueso, pero se encontr en otros rganos, factor de crecimiento de fibroblastos 23 16-18 (FGF23) tiene un papel fisiolgico y patolgico en la homeostasis del fosfato, causando la disminucin renal la reabsorcin de fosfato y reduccin de la activacin de FGF23 vitamina D3.19 ejerce estos efectos a travs la reduccin de 25 (OH) vitamina D3 1--hidroxilasa, y reducir el nmero de renal membrana de la clula epitelial de sodio-fosfato co-transportadores. Esto ha llevado a su denominacin como 'phosphatonin'.20 Cuando se trasplantan en ratones desnudos, clulas de ovario de hmster chino que expresan FGF23 humana causada hipofosfatemia, fosfaturia, alta srica de fosfatasa alcalina, baja 1,25 (OH) 2 vitamina D3, deformidad sea y rickets.21 FGF23 es la ms importante en fosfatonina TIO pacientes22 hibridacin in situ, inmunohistoqumica, reaccin en cadena de la polimerasa, occidental Blot y analysis21,23,24 transferencia northern han demostrado Protena FGF23 y ARNm para estar presentes y sobreexpresado en las clulas tumorales de pacientes TIO; en Adems, las concentraciones sricas elevadas de FGF23 se oftendetected ligado a enzimas inTIOpatientsby b ensayo de inmunoabsorcin (ELISA), y estos rpidamente vuelven a la normalidad despus de los tumores causantes son removed.25 investigacin paralela, ha revelado que FGF23 tambin juega un papel clave en la mayora heredado trastornos de metabolism.19,26-28 fsforo Aunque los modelos murinos de FGF23 desordenada el metabolismo estn bien establecidos, 29,30 su fisiologa y trastornos en los animales de origen natural son poco explorado. Manipulacin FGF23 ha sido considerado como un medio de mejorar el fsforo eficiencia de utilizacin en los animales de produccin, 31,32 y ha sido evaluado en los gatos con enfermedades crnicas enfermedad renal y / o hyperthyroidism.33-36Para conocimiento de los autores, TIO no ha sido reportado en perros, o cualquier otra especie animal; Adems, el sistema es completamente fosfatonina inexplorada en los perros. A continuacin, describimos investigacin ou en la expresin de FGF23 por canina Los sarcomas de tejido blando y una gama de otros tejidos.

Materiales y Metodos

Muestras de seleccin y de casos y controles Incluido en parafina Cincuenta y uno fijado en formoltumores fueron seleccionados de las bases de datos de Nueva Zelanda Patologa Veterinaria (Palmerston Norte, Nueva Zelanda) y el servicio necropsia, Departamento de Biopatologa (Instituto de Veterinaria, Animal y Ciencias Biomdicas de la Universidad de Massey, Palmerston North, Nueva Zelanda). La tumores seleccionados fueron los tumores mesenquimales diversamente diagnosticado en hematoxilina y eosina (H & E) morfologa como tumor de clulas fusiformes (5), hemangiopericitoma (6), el sarcoma de tejidos blandos (2), eje Tumor de clulas / hemangiopericitoma (5), de clulas fusiformes tumor / sarcoma de tejidos blandos / hemangiopericitoma (17), fibrosarcoma (4), dermatofibroma (1), perifrico tumor vaina nerviosa / schwannoma (5), mezclado sarcoma (1), sarcoma (3) o pobremente diferenciado sarcoma (2). Especial atencin en la seleccin de casos se le dio a los rasgos histricos o clnicos sugerente de los tumores que causan TIO (por ejemplo, ubicacin dentro de un msculo). Ninguno se asoci con una diagnstico de osteomalacia. Para establecer la distribucin en el tejido normal deLa expresin de FGF23 en los perros, controlar los tejidos blandos fueron tomadas de tres clnicamente sanos, aproximadamente 6 meses de edad dogs.These mestizas femeninos perros (designadas como A, B y C) eran humanamente sacrificados con pentobarbital por va intravenosa y necropsia inmediatamente. No hay anormalidades graves fueron identificados. Las muestras de piel, msculo esqueltico, grasa y fascia de las extremidades distales, msculo cardiaco, arterias y venas, nervios perifricos, el hgado, el bazo, rin y pulmn fueron tomadas de cada perro dentro de 60minof muerte; adems, tendonwas tomado de perros B y C, los ganglios linfticos andmesenteric, timo, ovario, ploro y el intestino delgado del perro C. Estos tejidos se fijaron inmediatamente en punto muerto 10% de formalina tamponada y, a continuacin, recortado en el tejido cassettes despus de 24 h de tejidos fixation. The eran deshidrataron en alcoholes graduados, y embebidos en parafina. Secciones cortadas en 3 mwere tieron con H & E y se examinaron para la adecuacin de la fijacin, la preservacin de tejidos y lesiones microscpicas. Muestras de pulmn contena pequeos focos dispersos de intersticial eosinoflica o inflamacin granulomatosa coherentes con la migracin de las larvas de Toxocara canis. Se tomaron muestras de hueso de la proximal hmero y el fmur de un saludable 6 meses de edad perro macho que haban sido sacrificados humanitariamente con pentobarbital por va intravenosa y necropsia inmediatamente (Hueso 1), y el perro C (hueso 2), snap-congelado en nitrgeno lquido y luego ya sea sometida inmediatamente a la extraccin de ARN o se almacena a -80 C hasta su transformacin. La extraccin de RNA ARN total fue extrado de embebido en parafina muestras de tejido blando utilizando el Roche alta Pure FFPE Kit Micro RNA (versin diciembre de 2008, Gato. N 04-823-125-001, Roche Ciencias Aplicadas, Mannheim, Alemania) de acuerdo con el fabricante de instrucciones, con algunas modificaciones (Solucin DNAsa fue formulado antes de la adicin a la columna, y una aplicacin adicional de DNAsa y se utilizaron enjuague tampn de lavado). Las muestras fueron almacenado inmediatamente a -80 C para su posterior anlisis, exceptuando una alcuota de 2-l que fue probado para el ARN cantidad con un Nanodrop 1000 espectrofotmetro (Thermo Scientific, Wilmington, DE, EE.UU.). ARN fue extrado de los huesos de control utilizando el siguiente protocolo. Hueso congelado-Snap fue mantenido en nitrgeno lquido pulverizado, mientras a un polvo fino usando un mortero y mano de mortero. La polvo congelado fue transferido a un tubo de 15 mL que contiene bolas de acero inoxidable y el TRI reactivo (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.) en una proporcin de 2 ml por cada 100 mg de tejido. Los tubos fueron entonces vrtex durante 4-15 min. El homogeneizado se transferido a un tubo de 15 ml y se centrifug a 12 000 g durante 5-10min.The claro (que contiene ARN) sobrenadante se transfiri a un tubo de 15 ml fresco y luego se dej reposar durante 5 min a temperatura ambiente. A continuacin, el ARN total fue extrado de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La resultante sedimento se sec al aire durante 5-10 min y despus se resuspendi en 50-200 l de pirocarbonato de dietilo (DEPC) de agua tratada (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). Las muestras se almacenaron inmediatamente a -80 C para su posterior anlisis, exceptuando una alcuota de 2-l que fue probado por la cantidad de ARN con una Nanodrop ND-1000 espectrofotmetro (Thermo Scientific). Cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa reaccin Los cebadores (Tabla 1) fueron diseados utilizando el Herramienta de nucletidos Basic Local Alignment Search [BLASTn, Centro Nacional de Informacin sobre Biotecnologa (NCBI), Bethesda, MD, EE.UU.; http: // explosin. ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi] para que coincida con referencia secuencias de ARN caninos para FGF23 (XM_849487.1), protena relacionada con frizzled secretada 4 (SFRP4)(XM_851504.1) y gliceraldehdo 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) (XM_534639.2) y para cruz lmites exn-exn. Potencial no deseado Tambin se examin la homologa con objetivos extraos. Aprotocol para detectar la expresin de FGF23, SFRP4 y GAPDH mRNAwas validados en el control muestras de hueso (como la expresin de FGF23 se informa ser ms alta en los huesos de otros species17), con la purificacin y la secuenciacin de los amplicones confirmando su 100% de identidad con las secuencias de referencia (datos no mostrada). GAPDH y SFRP4 fueron seleccionados para amplificacin de genes como 'casa de mantenimiento "para confirmar la presencia de RNA detectable de un similar o mayor longitud amplicn a la meta FGF23. Reaccin en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) se realiz usando el Superndice One-Step RT-PCR con Platinum Taq Kit (Invitrogen) de acuerdo con el fabricante instrucciones. Una mezcla de PCR que contena 1 reaccin mezclar, 0,2 M de cada cebador, 1L de RT / Platinum Mezcla de Taq, plantilla de ARN (19,4 a 518,99 ng de ARN) y agua PCR grado esta en paredes delgadas 0,2 ml tubos de PCR a un volumen final de 25 mL. En todas las reacciones de control negativo se incluy para prueba para la presencia de contaminantes. Muestras se mezclaron suavemente y se someti a la siguiente Las condiciones de PCR: 55 C durante 30 min, 94 para C 2 min, 40 ciclos de 95C durante 30 s, 58 C de 30 s, 72 C durante 1 min y finalmente 72C durante 10 min. Los productos de PCR se analizaron en un etidio bromuro de marcado con 1,33% (w / v) de agarosa UltraPure gel (Invitrogen) y se visualizaron bajo transiluminador Luz UV. Artculos seleccionados fueron purificados, secuenciado y analizado para confirmar el xito demostracin de la expresin gnica. Las muestras positivas

fueron reexaminados hasta cinco veces para asegurarse de que positivoresultados eran repetibles. En varios casos (por ejemplo,tumor 5) muestras frescas fueron re-extrajeron detejidos incluidos en parafina fijado en formol antesrepetir PCR.TheRNA concentracin de la muestra en el lmite inferiorde deteccin para el ensayo de FGF23 PCR se determina ser 15 ng l-1. Los tejidos de concentracin suficientepara amplificar FGF23 mRNA, pero negativo,se ensayaron usando el protocolo de un solo paso para la expresinde GAPDH o SFRP4 como se describi previamentepara FGF23, salvo por el uso de 63 Cas el recocidola temperatura. A fibrosarcoma y un haemangiopericytomawerenegativo expresin forGAPDHor SFRP4;stos fueron excluidos del estudio adicional.En tiempo real cadena de la polimerasa cuantitativareaccinLos tumores que fueron positivos para la expresin FGF23utilizando RT-PCR convencional, y el controltejidos de perros fueron analizados utilizando cuantitativa en tiempo realreaccin en cadena de la polimerasa (qPCR). Lareferencia genes seleccionados fueron la protena ribosomalL13a (RPL13A) y sintasa hidroximetilbilano(HMBS). RPL13A en particular, se ha demostrado quetener expresin estable en la piel canina, conectivotejidos y hueso, mientras que 37,38 HMBS tiene relativamentela expresin estable en un nmero de tissues.39 caninoEl primer secuencias para RPL13A tienen previamentereported.38 sido HMBS y nuevos cebadores de FGF23fueron ideado especficamente para PCR en tiempo real utilizandonucletido BLASTn (NCBI) para que coincida con la referenciasecuencias de ARN caninos para FGF23 (XM_849487.1)y HMBS (XM_546491.3). Los cebadores fuerondiseado para un producto de menos de 120 pb en tamao,para abarcar un lmite exn-exn y carecercomplementariedad a los objetivos extraos. Cartillasecuencias para qPCR se reportan en la Tabla 2.El ARN extrado anteriormente (vase ms arriba) fueconvertido a cDNA utilizando la Roche TranscriptorKit de sntesis de ADNc (Roche Applied Science)segn las instrucciones del fabricante. ARN para serutilizado en PCR en tiempo real tena la concentracin determinadautilizando un fluormetro Qubit 2,0 (Life Technologies,Carlsbard, CA, EE.UU.), ya que tiene pocoha demostrado que bemore preciso que un espectrofotmetropara determinar la concentracin de ARN a partir deFFPE secciones. 40 Amix de 2,5 Moligo (dT), 60 Mhexmeros aleatorios, 1 mM de cada dNTP, 20 U RNasaInhibidor, 10 U de RT, 5 x tampn de reaccin, el ARN 4 l(25-300 ng de ARN) y agua, hasta un volumen finalde 20 l, se aadi a cada tubo. Las muestras fueron suavementemezclaron e incubaron a 25 C durante 10 min, 55 Cdurante 30 min y 85 C durante 5 min. Para qPCR, 2 lde cDNA producto fue utilizado en una mezcla de reaccin con5 l de mezcla maestra FastSYBR (Applied Biosystems,Life Technologies, Foster City, CA, EE.UU.), variablesconcentraciones de avance y retroceso primers (segnTabla 2) y agua, hasta un volumen final de 10L.En tiempo real qPCR se realiz utilizando el StepOnePlus en tiempo real de la mquina PCR (Applied Biosystems,Life Technologies) y las condiciones eran qPCRcomo sigue: 95 C durante 20 s, seguido por 40 ciclosde 95 C de 3s y 60C de 30 aos. Una curva de fusinse llev a cabo al final de cada ejecucin de qPCR acomprobar para la amplificacin no especfica. Los controles negativosde agua, y la mezcla de reaccin sin RT eranincluido en cada carrera qPCR. Se llevaron a cabo todas las muestrasen duplicado. Se produjeron curvas patrn de cinco puntospara cada objetivo utilizando hueso 2 y la muestra5 para determinar la precisin (R2) y la eficiencia(%) De las reacciones de PCR en tiempo real (Tabla 2). Ladatos en tiempo real se analizaron utilizando el comparativo2-? CMtodo de T y la media aritmtica delos genes de referencia por parte de la StepOne ms el software(Applied Biosystems, Life Technologies) para producirexpresin ratios relativos. Amplicones seleccionados para