Plantas transgnicasDr. Mauricio Gonzlez AgeroDepartamento de Mejoramiento y BiotecnologaLaboratorio de PostcosechaInstituto de Investigaciones Agropecuarias (INIA) La Platina

Comparacin entre hibridizacin clsica y la transgnesis

Puntos de comparacinHibridizacin ClsicaTransgnesisNmero de genestransferidosUna docena de millares de genes para encontrar el gen de intersUno o varios genes de inters en una construccin genticaEleccin de la caracterstica a transmitirSe limita a la compatibilidad sexual (confinada al interior de una especie)En principio ilimitada (franquea la barrera de las especies)Tiempo para estabilizar la nueva variedad10-20 aos o ms3 - 4 aos

Logros de la hibridizacin clsicaTeosinteCobMazTomate silvestre (Lycopersicon pimpinellifolium )D = 1 cm.

Organismo genticamente modificado (GMO): es un organismo al que se le ha introducido uno o ms genes utilizando tcnicas de ingeniera gentica o del DNA recombinante BacteriaClula donanteDNA plasmidialGen de intersPlsmido portando el gen de intersClula vegetalClula vegetal transformadaPlanta transgnica

Plsmido portando el gen de intersClula vegetalClula vegetal transformadaMtodos de transformacin: permite introducir el DNA dentro de la clulaDirectos: Biobalstica Electroporacin Whiskers de carburo de silicio Microinyeccin.Indirectos:- Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium rhizogenes Sistemas basados en virus vegetales.

Transformacin directa: Biobalstica Se busca penetrar las clulas vegetales con el DNA adherido a micro esferas (oro o tungsteno). Ampliamente usada en monocotiledoneas (maiz, arroz, trigo, excepcin: soya); permite la introduccin de mltiples genes e insertos grandes (> 20 kb)Partculas de oro o tungstenoDNA+Microcarriers cubiertos por DNADesventajas: No se puede controlar el nmero de copias integradas y su numero es alto. Se pueden integrar como repeticiones en tandem generando inestabilidad y silenciamiento de genes.Proyectiles conteniendo DNA

Transformacin directa: Biobalstica

Transformacin indirecta: Agrobacterium tumefaciensTumor de tallo provocadopor Agrobacterium tumefaciensAgrobacterium tumefaciens Es una bacteria Gram negativa. Infecta plantas dicotiledneas (tomate, tabaco, soya, excepcin: arroz y maz), a travs de heridas, e induce la formacin de tumores. Las cepas virulentas contienen un plsmido, denominado Ti (Tumor-inducing). Su mecanismo de infeccin involucra la transferencia y la integracin de la regin T-DNA (Transfer-DNA) al genoma nuclear de la clula vegetal en un nmero reducido de copias.

Biologa de Agrobacterium tumefaciensA. tumefaciens vive alrededor de la superficie de las races (rizosfera) donde utiliza los nutrientes tomados de la raz.Infecta solamente a travs de sitios en la herida y activamente quimiotctico a ellos.El plsmido Ti produce receptores para acetosiringonaLa planta herida produce acetosiringona

Mapa gentico del plsmido Ti de octopinaEl plsmido Ti determina las caractersticas del tumor y la produccin de aminocidos poco comunes denominados opinas (nopalina, octopina). Una cepa de A. tumefaciens que produce la formacin de un tumor que sintetiza octopina, tiene tambin la capacidad de catabolizar octopina. Las plantas son incapaces de catabolizar stos aminocidos, por lo que A. tumefaciens puede desviar el metabolismo de la planta para producir compuestos que nicamente la bacteria puede utilizar.

Estructura de la regin T de un plsmido Ti de octopinaEl T-DNA contiene genes que codifican para algunas fitohormonas (auxinas y citoquininas) y para la sntesis de opinas. Estos genes se expresan nicamente al ser integrados al genoma.El T-DNA contiene genes que pueden ser sustituidos por genes de inters.El DNA entre los bordes I y D esTransferido a la planta como ssDNA.

Regin de virulencia: genes VirLos genes vir constituyen un reguln con 8 genes principales (virA, virB, virC, virD, virE, virF, virG y virH) regulados por una secuencia promotora que contiene 12 pares de bases conservadas a la que se une especficamente la protena VirG fosforilada.La protena de membrana VirA interacta de forma directa o indirecta con compuestos fenlicos producidos por las plantas como lignina, precursores de flavonoides y acetosiringona.La protena citoplasmtica VirG es fosforilada por VirA y permite la transduccin de seales que activan los genes vir.VirD2 y VirD1, actan como endonucleasas, unindose al plsmido Ti en los bordes del T-DNA liberandolo. La protena VirD2 se une covalentemente al extremo 5 del T-DNA hasta su transferencia a la planta y media la su integracin dentro del cromosoma de la planta.Las protenas VirE2 tambin se unen al T-DNA y posiblemente cubren la cadena formando junto con VirD2 un complejo de transferencia. 11 protenas VirB y al menos una protena VirD (VirD4) forman el complejo de secrecin (tipo conjugativo, T4SS).La funcin de VirC,VirF y VirH son an desconocidas.

Mecanismos moleculares implicados en la transformacinpor Agrobacterium tumefaciensTzfira y Citovsky, Trends in Cell Biology, 2002

Uso del plsmido Ti como vector de transformacinMediante la manipulacin del mecanismo natural de infeccin de A. tumefaciens se han podido generar una serie de vectores que permiten la introduccin de secuencias de DNA de inters a los genomas nucleares de varias plantas superiores.Vectores basados en plsmido TiEl sistema binario se ha podido desarrollar gracias a dos caractersticas del mecanismo de transferencia del T-DNA:1) Las secuencias necesarias para la integracin al genoma se encuentran en los bordes del T-DNA (secuencias repetidas terminales), pudiendo ser reemplazado el resto de la secuencia del T-DNA.2) Los genes de virulencia (vir) responsables de la transferencia del T-DNA, actan en trans, por lo que no tienen que estar situados en el mismo plsmido que el T-DNA.Sistema Binario: utiliza 2 vectoresVectores co-integrados poco utilizado(El gen de inters se encuentra en un plsmido intermediario)

Sistema binarioUna cepa de A. tumefaciens con un plsmido Ti helper. Este plsmido contiene todos los genes vir pero no contiene el T-DNA, por lo que no es oncognico pero es capaz de transferir el T-DNA presente en otro plsmido ms pequeo (plsmido desarmado). Plsmido desarmado: contiene los bordes del T-DNA, es pequeo y de fcil manipulacin en E. coli. No presenta los genes para la produccin de fitohormonas ni opinas. Presenta sitios de restriccin mltiples dentro de los bordes del T-DNA para el clonado de secuencias. Contiene tambin un marcador para la seleccin, por ejemplo resistencia a kanamicina.Plsmido Ti desarmadoPlsmido Helper

Expresin estable v/s transitoria: ventajas y desventajasExpresin gnica estable:Ventajas: Expresin gnica en todos los tejidos de la planta.Desventajas: Gran consumo de tiempo, labor intensiva, influenciada por efectos de posicin, grandes volmenes de produccin, requiere de un sistema de regeneracin, requiere de un grandes instalaciones de trabajo.

Expresin gnica transitoria:Ventajas: Rpida, flexible, no est influenciada por efecto de posicin, provee grandes cantidades de protena para una caracterizacin detallada, no requiere de un sistema de regeneracinDesventajas: Expresin gnica limitada a tejidos especficos de la planta (segn especie).

Expresin estable: transformacin mediante floral dippingLas plantas de Arabidopsis se crecen en maceteros hasta que comienzan a florecer. Plantas son crecidas por algunas semanas para permitir el desarrollo de la semilla. Se colectan las semillas.Las plantas se sumergen en el cultivo con Agrobacterium suplementado con sacarosa por hasta 3 minutos. Las semillas germinan en el medio que contena el agente de seleccin (ej: kanamicina)

Expresin transitoria: transformacin mediante infiltracinRBLBCaMV 35SPromotorFirefly luciferasaGen reporteroNostAgrobacteriaAgrobacteriumT-DNAVector BinarioInfiltracin~3 das1mM luciferinaluciferina + ATP + O2oxy-luciferina + CO2 + luzluciferasa1 Verificar la expresin de un gen de inters (o parte de l).

+InfiltracinE. coliA. tumefaciens Cepa GV3101A. tumefacienstransformacinAgrobacteriaExpresin transitoria: transformacin mediante infiltracinGFP/pBI121LEXa-GFP/pBI121PpCobra-GFP/pBI121pBI1212 Verificar la localizacin subcelular del producto de un gen de inters (o una parte de l). Visualizacin

Plsmido portando el gen de intersClula vegetalClula vegetal transformadaMtodos de transformacinMtodos de regeneracinMtodos de seleccin

Transformacin de plantas: RegeneracinRegeneracin: induccin del crecimiento y multiplicacin de las clulas transformadas, mediante la utilizacin de fitohormonas que estimulan la produccin de callos y brotes. Existen tres conceptos bsicos que fundamentan el cultivo in vitro de clulas y tejidos vegetales:1. Totipotencialidad celular: toda clula vegetal individual es capaz de regenerar una planta entera a partir de un cultivo in vitro sin importar el grado de diferenciacin alcanzado. Para ello se requieren condiciones especficas referidas al medio del cultivo, relaciones hormonales, temperatura, fotoperodo, etc.2. Desdiferenciacin: consiste en la transformacin y prdida de las caractersticas de especializacin de un tipo celular (ej: clulas epidrmicas) para dar lugar a clulas de tipo meristemtico. El siguiente paso involucrado en la regeneracin de una planta es la rediferenciacin de las clulas previamente desdiferenciadas.3. Balance entre reguladores del crecimiento: todo proceso de diferenciacin est regulado por el balance entre diferentes tipos de reguladores, fundamentalmente de auxinas y citocininas.auxinas < citocininas tallosauxinas > citocininas racesauxinas = citocininas Callo indiferenciado

Vas morfogenticas implicadas en la diferenciacin de novode brotes y/o plantas completas. Posibles vas morfogenticas:- Organognesis- Embriognesis

Diferencias entre las dos vas:La organognesis es de origen pluricelular. Un grupo de clulas del explante inicial se desdiferencia inicialmente para luego rediferenciarse dando lugar a un rgano vegetal. No se obtienen por esta va plantas completas.

- La embriognesis se presupone de origen unicelular. Una clula del explante se asla y constituye el punto de partida para la obtencin de un embrin somtico. Se diferencian embriones o estructuras bipolares que completan cada una de las etapas implicadas en la ontogenia de un embrin cigtico. El resultado es una planta completa.

Tcnicas de cultivo de clulas o tejidos vegetalesCultivos diferenciados: - races- tallos- embriones- races - tallos.

Cultivos indiferenciados:- callos- suspensiones de clulas vegetales- protoplastos.

Plsmido portando el gen de intersClula vegetalClula vegetal transformadaMtodos de transformacinMtodos de regeneracinMtodos de seleccin

Transformacin de plantas: SeleccinSeleccin mediante genes reporteros:La secuencia codificante de un gen cuya actividad es fcilmente medida (gen reportero, ej: GFP, GUS) es frecuentemente utilizada en plantas transgnicas donde se desea evaluar la expresin de un gen o la capacidad del promotor de controlar la expresin. Un gen frecuentemente utilizado es el gen GUS (gusA, uidA). Gen de origen bacteriano que codifica para la b-glucuronidasa. La actividad de esta enzima se detecta fcilmente utilizando sustratos cuyos productos pueden ser cuantificados por mtodos colorimtricos, espectrofotomtricos o fluorimtricos.Seleccin mediante antibiticos y/o herbicidas:Estos genes son tiles si se desea evaluar el mtodo de transformacin de plantas.Antibiticos: todas las clulas vegetales son sensibles a antibiticos por que estos inhiben la sntesis de protenas en los cloroplastos; las clulas transformadas con genes de resistencia a antibiticos pierden esta sensibilidad.Herbicidas: el gen incorporado elimina la sensibilidad al herbicida. Por ejemplo el gen Bar de Streptomices hygroscopicus codifica para la enzima fosfonotricina acetiltransferasa (PAT) que acetila al herbicida fosfonotrocina inactivndolo.

Aplicaciones

Organismos genticamente modificados de primera generacinLa casi totalidad (99%) de las plantas genticamente modificadas cultivadas en el mundo son de cuatro especies: soya, maz, algodn y canola; son de primera generacin, y fueron modificadas por motivos agronmicos, principalmente por su tolerancia a herbicidas y resistencia a plagas de insectos. Las cuatro especies se comenzaron a cultivar de forma intensiva a mediados de los 90 en algunos pases del mundo. Nmero TOTAL de liberaciones aprobadasOrganismos aprobados (fenotipos) ao 2002Tolerancia a herbicidas (2705)

Resistencia a insectos (2834)

Calidad del producto (1685)

Resistencia a virus (1187)

Propiedades agronmicas (664)

Resistencia a hongos (553)

Otros (444)

Gen marcador (376)

Resistencia a bacterias (98)

Resistencia a nemtodos(10)

Organismos genticamente modificados de primera generacinLos GMOs mas comnmente usados en el procesamiento de alimentos son la lnea Bt-176 de maz y la soya Roundup Ready (RRS). La lnea Bt-176 de maz contiene protena especfica de Bacillus thuringiensis para hacerlo resistente a insectos meta (larva de mariposas).Maz Bt:No es txico en humanos.40% de Semilla de maz Bt en EEUU.Reduccin potencial de uso de insecticidas.La soya Roundup Ready (RRS) que es Soya GTS40-3-2, lleva el gen que codifica para la enzima CP4 EPSPS (5-enolpyrovylshikimate-3-phospate sintetase de Agrobacterium sp. Cepa CP4), la cual le confiere tolerancia a herbicidas con el ingrediente activo glifosato.

Organismos genticamente modificados de segunda generacinEl arroz dorado (Golden Rice) es un arroz modificado genticamente para acumular en su embrin beta caroteno y que es precursor de la vitamina A. Este beta caroteno extra es el que le otorga un caracterstico y peculiar color dorado, y da origen a su nombre. Este arroz acumula 1.6 miligramos/kilogramo de pro vitamina A.Ruta de sntesis de beta carotenoIPP Geranilgeranil di-fosfatoFitoenoLicopeno - caroteno(precursor vitamina A )fitoeno sintasafitoeno desaturasaLicopeno-beta-ciclasacaroteno desaturasa El arroz normal no tiene estas enzimasGen de Daffodil (Narcissus pseudonarcissus)Gen bacteriano con ambas funcionesGenes insertados al arroz dorado:Gen de Daffodil (Narcissus pseudonarcissus)

Organismos genticamente modificados de segunda generacin:Expresin de protenas heterlogas en plantas(Molecular Farming)Tipos de protenas obtenidas :- Reactivos de diagnstico- Vacunas animales- Alimentos animales- Enzimas industriales- Productos farmacuticos para el hombre

Fidelidad en la expresin de protenas humanas o animales en plantas.

Producto

Uso

Planta husped

Integridad estructural

Actividad biolgica

Hemoglobina y

Sustituto de la sangre

tabaco

si

si, (unin a O2/CO2)

-interferon

Anti-cncer, antiviral

arroz

si

Actividad antiviral in vitro.

EPO

Estimulador del crecimiento de glbulos rojos

Clulas de tabaco

si, (glicanos)

Sin testear

Sero albumina humana

papa

si

Sin testear

Factor de crecimiento epidrmico

Mitgeno

tabaco

Sin testear

Glucocerebrosidasa

Enfermedad de Gaucher

tabaco

si, (glicanos)

si

Hirudina

Anticoagulante

canola

si

si

NPI Defensina

Antibitico

tabaco

si

Fin