Charla HPLC

.USO Y CUIDADO DE COLUMNAS CROMATOGRAFICAS (HPLC)

HPLC

Definición de la Cromatografía

Teoría Cromatográfica

Divisiones de la Cromatografía

Columnas HPL-Uso-Selección-Cuidados

• La Cromatografía es una Técnica de separación .

• El propósito de la Cromatografía es “Separar y Cuantificar” analitos en mezcla (por lo general en matrices complejas).

• Se basa en la partición de solutos entre dos fases: la fase estacionaria y la fase móvil.

DEFINICION

Que es la Cromatografia?

Cómo es que ocurre la separación en Cromatografia?

• La separación ocurre por migración de los analitos en mezcla a diferentes velocidades.

• La velocidad de migración esta gobernada por diferentes interacciones entre un Soluto (conducido por un líquido en movimiento) y el Absorbente (sólido o líquido).

Solventes para HPLC

Columnas

y

Fases

Estacionarias


La Fase Estacionaria.- Se empaca o deposita en la columna.Por lo general esta constituida por un sólido poroso, con un tamaño de partícula muy pequeño, de superficie inerte. Este sólido esta recubierto por una pequeña capa o película de un líquido.La Fase Móvil.- Pasa a través de la columna a una velocidad determinada y transporta la muestra.Es un solvente de alto grado de pureza o una mezcla de ellos.

SoporteFase

Estacionaria

Fase Móvil


Representación de una separación Cromatográfica

Fase Estacionaria

Fase Móvil

Analito A

Analito B

¿Cómo es que ocurre la separación en Cromatografía?

La migración depende de la solubilidad de los solutos en fase estacionaria y en fase móvil.

A) Si el soluto es altamente soluble en

la fase móvil y poco soluble en la

fase estacionaria, entonces---------¿?

B) Si el soluto es mas soluble en la fase

estacionaria, el compuesto migrará

entonces--------------------------------¿?

C) Si cada soluto viaja a través de la

columna a una velocidad diferente,

entonces------------------------------¿?

Inyección EluciónMigración

= compuesto A

= compuesto B

La Separación Cromatográfica

Cuando la muestra y la Fase Móvil atraviesan la fase estacionaria, entran en juego distintos tipos

de interacción: hidrofóbicas, puentes de hidrógeno, interacciones dipolares y

electrostáticas.

El Componente más afín a la fase estacionaria se retiene más y tarda en eluir.

El tamaño de la molécula en disolución determina el tamaño de poro de la columna (100Å,300Å)

Ventajas de la Cromatografia:

1. Análisis Simultáneos.2. Alta Resolución.3. Alta Sensibilidad (rangos

de concentraciones a niveles de ppm - ppb)

4. Pequeños Volúmenes de Inyección (de 1 a 100 uL).

Tipos de Cromatografía:

Tipos de Cromatografía:

- DE ADSORCIÓN: FE= Sólido y FM= Líquido o gas. Los solutos se adsorven temporalmente.

- DE PARTICION: FE= Líquido y FM= Líquido o gas. Los solutos se separan por la solubilidad relativa en los solventes empleados.

- DE INTERCAMBIO IONICO: FE= Sólido con grupos funcionales iónicos y FM= Líquido (Buffers).

- DE EXCLUSIÓN DE TAMAÑO: FE= Polímero con poros de dimensión molecular. FM= Líquida ó gaseosa.

Divisiones de la Cromatografía

Técnicas cromatográficas

Se diferencian por la fase móvil y la fase estacionaria que se utilizan para la separación

Clasificación Fase Móvil Fase Estacionaria

Mecanismo de Separación

Sólido-Líquido No-Polar Polar (sólido) Adsorción Partición: Fase Reversa

Polar No-Polar (líquido enlazado)

Interacción Hidrofóbica

Partición: Fase Normal

Solvente No-Polar

No-Polar (líquido enlazado)

Interacción Polar

Exclusión por Tamaño

No interactua Gel de Polímero Filtración por Tamaño

Intercambio Iónico

Buffer / Reactivo de Par Iónico

Mecanismos de Separación de HPLC

La fase reversa es el mecanismo de separación más empleado en HPLC

TIPOS DE CL:

1.- CROMATOGRAFIA DE REPARTO:

Soporte básicamente por Sílice, la superficie de la sílice totalmente hidrolizada por grupos SIOH Q. Reactivos. Recubrimientos de fase enlazada: Siloxanos (Cadena C8 o C18).

RELLENOS DE FASE INVERSA Y FASE NORMAL:

Fase Inversa: FE = No Polar (HC), FM = Polar (agua, MeOH, Acn).

En FI: R del siloxano = C18, C8

Fase Normal: FE = Polar( Sílice), FM = Apolar ( Hexano, CHCl3 ).

En FN: R del siloxano = CN, DIOL, NH2 (de menos a más polar)

2.- CROMATOGRAFIA DE ADSORCION:

Líquido - Sólido. Únicas fases en HPLC son: Sílice y la alúmina.

(Experimentar: CCF, COMPUESTOS NO POLARES)

3.- CROMATOGRAFIA IÓNICA:

Separación y determinaciones de iones que se basan en el uso de las resinas de intercambio iónico.(Aminoácidos).

4.- CROMATOGRAFIA DE EXCLUSIÓN POR TAMAÑOS:

CROMATOGRAFIA EN GELES PERMEABLES ó de filtración en geles, para especies de alto peso molecular.

TIPOS DE CL:

COLUMNAS HPLC

-Características- Selección

Columnas Analíticas

MORFOLOGIA DE LAS SILICAS TAMAÑO DE PARTICULA Y DE PORO

Párametros de Selección de Columna

- Tamaño de Poro (80 Å;100 Å;300 Å) - Tamaño de Partícula (3; 5 y 10 um) - Longitud (35 mm; 75 mm; 125 mm) - Diámetro Interno (4 mm; 4,6 mm - Fase Estacionaria (L1; L3; L7; L9,…)

Tamaño de Partícula – Tamaño de Poro

80 Å PORO

3,5 um; 5um; 10 um PARTICULA


Tipo de Silice y Fase ligada – pH y Fase móvil• Analitos de interés• pH

Ejm:

AGILENT (Zorbax) MERCK (Lichrospher)

SB Purospher (pH 1,5 – 10,5)

Eclipse XDB Select B (C8 modificado,)

Extend C18 Purospher(e) (pH 1,5 – 10,5)

Bonus-RP Lichrospher (pH 2,5 – 7,0)


Preparación de Fase Ligada

Selección de Columnas – Fase Estacionaria

Columnas Analíticas - Cartuchos


- Características comunes: Longitud entre 10 y 30 cm, d.i.= 4 a 10 mm, tamaño de particula del relleno: 3 a 10 um

- Los rellenos de fase enlazada se clasifican como de fase inversa cuando el recubrimiento unido Qx. Carácter NO POLAR y de fase Normal el recubrimiento grupos funcionales: POLARES.

- Un recubrimiento enlazado se puede tratar como si fuera un líquido convencional retenido físicamente.

- pH > 7,5 = Hidrólisis del Siloxano. - pH < 2,5 = Destrucción del relleno.

NON-POLAR PHASES

C18 OctadecylC2 EthylCH CyclohexylPH Phenyl

POLAR PHASES

CN Cyanopropyl2OH DiolNH2 AminopropylSI Silica

ION-EXCHANGE PHASES

SCX Strong cation exchangerCBA Weak cation exchangerSAX Strong anion exchangerNH2 Weak anion exchanger

SPECIALTY PHASES

PBACERTIFYENVIRELUTACCUCAT

Incr

ea

sing

pol

arit

y

CLASSES OF SILICA-BASED BONDED PHASES

MATERIAL

DE RELLENO

TIPOS DE

ANALITOS

NATURALEZA DE LA

MATRIZ

ACTIVACION DE LA

COLUMNA

SOLVENTE DE

ELUCION C18/C8 Sustancias no

polares Sustancias ionizables, en su forma no ionizada

Acuosa Metanol MeOH/AcN o mezclas de éstos con agua o buffers de pH adecuado

Sílice Diol CN

Sustancias polares

Solución en solventes no polares Acciles

Cloroformo Hexano

Solventes polares IPA, McOH

Aniónico Aniones Carboxilatos/Sulfonatos

Soluciones acuosas de baja fuerza iónica

Metanol Buffer

Buffer de alta fuerza iónica y pH adecuado. Sólo o en mezclas con McOH o AcN

Catiónico Cationes Aminas

Soluciones Acuosas de Baja I

Metanol Buffer

Buffers de alta De pH adecuado sólo o en mezclas con McOH o AcN

Tabla 9.IV Solventes más comunes y sistemas de preparación


SYSTEM SUITABILITY TESTPlatos teóricos:

Relacionado con el ancho del pico, mide la eficiencia de la columna. Relaciona el tiempo de retención y el ancho de pico.

Afectado por el factor de cola

SYSTEM SUITABILITY TESTFactor de Capacidad (k’)

Inje

cció

n

1 2 3 4

V0

Vr

Vok´ = 0

kt t

tr' 0

0

tr = tiempo de Retención del Pico de un Soluto.

t0 = tiempo del Solvente (Pico no retenido)

El tiempo de Retención puede utilizarse para fijar el Volumen de

Retención.

SYSTEM SUITABILITY TESTRESOLUCION (R)

La Resolución es un índice numérico que nos indica el grado de separación de dos compuestos. Esta puede

expresarse utilizando los siguientes parámetros:

Rs =2(V2 – V1)(W1 + W2)

Matemáticamente esta se expresa como:

BUEN USO Y MANTENIMIENTO DE LA COLUMNA CROMATOG.

Lavarla correctamente después de su uso

Agua 1,0 -1,5 ml/min x 30 min

Metanol:Agua ó ACN: Agua 60:40

Circular periódicamente ACN o Metanol puro


Filtrar la fase móvil y las muestras

Evitar partículas — taponamiento No utilizar elevadas temperaturas (< 60ºC) Enfriar en forma gradual Tapar los extremos


Seguir la dirección de flujo Cambiar el flujo <0,5 ml/min

Volumen muerto Usar dentro del rango especificado de pH Presión máx. de uso: 250 bar en cartuchos y

300 bar en columnas Evitar impactos fuertes


Destinar una columna para cada tipo de FM y Forma Farmacéutica

Verificar existencia de línea base

Equilibrio de FM y columna

Depende de tipo de FM

10 volúmenes de columna (25 ml de FM) para columnas de 125mm

USO Y CUIDADO DE COLUMNAS CROMATOGRAFICAS

GRACIAS

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