Instituto Politécnico NacionalUnidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología

Métodos cuantitativos

Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC)Partes del equipo

Bernal Castañeda Bianca EdithDomínguez Gómez DanielEnríquez Cerda Noemí A.Guevara García Amaris

Abril 6, 2010

Equipo para Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC)

Recipientes inhertes que suelen ser botellas de vidrio y tubos de teflón provistos de aditamentos indispensables para eliminar los gases disueltos y

partículas que pudiera tener la fase movil

Depósitos para la fase movil

Elución isocrática: Separación con disolvente de composición constante

Elución con gradiente: Se utilizan dos o tres disolventes de distinta polaridad y se varía la composición de forma continua o mediante etapas escalonadas.

Tipos de elución

Elución: Arrastrar mediante un líquido (o fluido) o solvente sustancias adheridas o absorbidas

Eluyentes típicos

Son necesarios para conseguir y regular la presión y velocidad de flujo de la fase movil. Cuando la fase movil es una mezcla de solventes, la bomba se programa para tomar los diferentes solventes en una proporción determinada

Características–Generar presiones por encima de 6000 psi– Libre de pulsaciones– Intervalo de caudales de 0.1 a 10 mL/min.– Reproducible– Resistente a la corrosión

Tipos:• Bombas reciprocas• Bombas de desplazamiento• Bombas neumáticas

Sistemas de bombeo

Sistemas de inyección

Son válvulas dosificadoras que permiten regular la aplicación de la muestra en volumenes de 5 a 500 μl.

Columnas analíticas

Acero inoxidable (hasta 10000 psi) 10-30 cm longitud 4-10mm diámetro interno 1-10μm tamaño de partícula

Columna

Precolumnas

-Se colocan delante de la columna para eliminar la materia en suspensión ycontaminantes de las disolvente.

-La composición del relleno debe ser semejante a la columna analítica

Contiene a las partículas de la fase estacionaria

– Pelicular• Bolas de vidrio o polímero, no porosas y esféricas

• Sobre su superficie se deposita una capa delgada y porosa de sílice, alúmina o una resina de intercambio iónico

• Se utilizan ampliamente en las precolumnas

– Partícula porosa• Micro-partículas de sílice

Tipos de rellenos de la columna

Columnas de sílice

Responderán a una propiedad de la fase móvil

Características deseadas

Sensibilidad adecuadaEstabilidad y reproducibilidad buenasRespuesta lineal extendida a varios órdenes de magnitudTiempo de respuesta cortoRespuesta rápida e independiente del caudal Manejo sencilloRespuesta selectiva a algunos analitos

Tipos de detectores

• Detector de absorbancia• Detector de fluorescencia

• Detector de índice de refracción• Detector de dispersión de luz

• Detector electroquímico• Detector por espectroscopia de masas

Detectores

Detectores de absorbancia (UV-VIS)

Celda de flujo en forma de Z

Para minimizar el ensanchamiento debanda extra-columna, el volumen de lascubetas debe ser lo menor posible de 1 a

10 micrómetros

Espectro de absorción de un efluente que contiene una mezcla

de tres esteroides tomado a intervalos de 5 segundos mediante

un detector de series de diodos

Detectores de índice de refracción

El disolvente pasa a través de la mitad de una celda y el efluente de la columna pasa por la otra mitad.

Características•Los dos compartimentos están separados por una placa de vidrio montada a un

ángulo tal que si las dos disoluciones difieren en índice de refracción se produce una desviación del haz incidente.

• Responden a casi todos los solutos• Son muy sensibles a la temperatura

• Poco sensitivos.

Sistema para el tratamiento de datos

Es indispensable para registrar los cambios en alguna propiedad en función del tiempo. La representación gráfica de estos registros se llama crometograma.

En estos registros aparece una serie de picos simétricos sobre el eje de los tiempos para la identificación cuantitativa (área bajo los picos) y cualitativa (posición en el eje) de los componentes de una muestra.