Células inmunorreguladoras: implicación en la patogenia y en la...

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REVISTA ESPAÑOLA DE ESCLEROSIS MÚLTIPLE Nº 9 - Diciembre de 2008

reviSión

Tolerancia inmunológica, autoinmunidad y enfermedad autoinmune

La función fundamental del sistema inmunológico (SI) consiste en el reconocimiento y la defensa frente a las agresiones externas en forma de microorganis-mos y toxinas. La generación de una respuesta inmu-nológica eficiente frente a antígenos extraños debe acompañarse de una regulación rigurosa de la activa-ción inmunológica, y además prevenir las respuestas frente a lo propio, de forma que no se genere daño ti-sular directo, ni daños colaterales. A esta última pro-piedad fundamental del sistema inmunológico se de-nomina “tolerancia”. La principal característica de la respuesta inmunológica es su especificidad frente al antígeno, si bien la frontera que separa lo propio de

❑ lo extraño no siempre es nítida. Lo propio se define como aquellas moléculas de nuestro organismo que se generan de forma fisiológica a lo largo del desa-rrollo, aquello con lo que entramos en contacto cada día (alimentos, flora comensal, etc.), o bien antíge-nos propios modificados por infecciones o tumores1. Desde la definición de tolerancia inmunológica en 19�� por Owen hasta nuestros días, se han ido per-filando diferentes células inmunológicas y diferentes mecanismos de tolerancia, implicados en diversos es-cenarios clínicos, tales como las enfermedades auto-inmunes, las infecciones, los trasplantes de órganos, los cuadros alérgicos, las neoplasias y los síndromes paraneoplásicos2. La “tolerancia central” para los linfocitos T y B se genera muy temprano en el de-sarrollo en los órganos linfoides primarios, el timo y la médula ósea, eliminándose clones de linfocitos au-torreactivos. No obstante, se liberan a la circulación sanguínea clones de linfocitos T y B autorreactivos, cuya activación será regulada en los órganos linfoi-des secundarios, en la circulación sanguínea y en los

Células inmunorreguladoras: implicación en la patogenia y en la respuesta terapéutica de la esclerosis múltiple

Clara de andrés, silvia sánChez-ramónServicios de Neurología e Inmunología. Hospital General Universitario Gregorio Marañón.Madrid.

RESUMEN. Aunque la etiopatogenia de las enfermedades autoinmunes no se conoce bien, numerosos estudios sugieren que las diferen-tes enfermedades autoinmunes son consecuencia de la interrelación de factores desencadenantes intrínsecos (genéticos, inmunológicos y endocrinos), extrínsecos (ambientales) y fenómenos estocásticos. Los factores intrínsecos son complejos, habiéndose descrito múlti-ples polimorfismos genéticos en genes implicados en la respuesta inmunológica y/o en moléculas del tejido diana. Se han demostrado defectos de la inmunorregulación a varios niveles en las enfermedades autoinmunes, incluida la esclerosis múltiple (EM), que pueden revertir en determinadas situaciones o por el efecto de algunas terapias, incluidas las utilizadas en la EM. En concreto, la tolerancia espe-cífica frente a antígenos del sistema nervioso central (SNC) es fundamental para la prevención de la EM y/o de su actividad. En esta revi-sión se sintetizan los hallazgos recientes sobre las poblaciones de células reguladoras en la patogenia de la EM, los efectos sobre estas células de las diferentes terapias utilizadas en la EM y las posibles implicaciones de la terapia celular en esta enfermedad.Palabras clave: células T reguladoras, células dendríticas tolerogénicas, esclerosis múltiple, IL-10, TGF-beta.

SUMMARY. Although the etiology and pathogenesis of autoimmune diseases remains elusive, compelling evidence suggests that the different autoimmune diseases are a consequence of the interplay of multifactorial intrinsic (genetic, immunological and endocrine) and extrinsic (environmental) triggers and stochastic events, which make them unique to humans. Intrinsic factors are complex, with multiple genetic polymorphisms described for genes involved in the immune response and/or for genes at the target tissue level. Yet, a defective immunoregulation has been demonstrated at different levels in autoimmune disease and in multiple sclerosis (MS) in particular, defect that can be restored by some therapies used for MS. Tolerance specific for central nervous system antigens is a key factor for preventing MS. In the present review we summarize recent findings on the role of regulatory cell subsets in the pathogenesis of MS. We discuss the effects of the diverse MS therapies on these cells, and their implications in the cellular therapy of the disease.Key words: regulatory T cell, tolerogenic dendritic cell, multiple sclerosis, IL-10, TGF-beta.

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Nota de los autores: Nos hemos permitido la licencia de expresar algunos términos en inglés para que faci-lite la lectura de estos datos en la literatura inglesa.

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tejidos mediante diferentes mecanismos “tolerancia periférica”. Los mecanismos de tolerancia incluyen la delección (eliminación física de las células inmunes durante su proceso de maduración), la anergia clonal (inactivación clonal del linfocito maduro por ausencia de la señal coestimuldora), la ignorancia clonal (la no activación de clones de linfocitos porque el autantíge-no se encuentra en pequeñas cantidades o se encuen-tra secuestrado en órganos inmunológicamente privi-legiados), y el control homeostático y la regulación por células reguladoras. Además, muchos antígenos extraños pueden comportarse como inmunógenos o tolerógenos dependiendo de su forma físico-química (proteica, polisacárida o lipídica), de su dosis y fre-cuencia, del ambiente local y de la naturaleza de la célula presentadora de antígeno con la que entra en contacto, así como de la vía de administración.

Si bien la “autoinmunidad” es, en determinadas circunstancias, un fenómeno fisiológico protector, como en el caso de los anticuerpos naturales o los anticuerpos antiidiotipo, la “enfermedad autoinmu-ne” es un síndrome clínico multifactorial causado por la pérdida de la tolerancia inmunológica, y en la que linfocitos T y B autorreactivos activados producen un daño tisular anormal (patológico).

La autotolerancia se establece y se mantiene por la delección de las células autorreactivas efectoras (CD�+, CD8+, B), y activamente por una población específica de células inmunes con propiedades “regu-ladoras”, como linfocitos T CD�+CD2�+ (Treg), cé-lulas CD8 supresoras (CD8+CD28- y CD8+CD2�+), células T gamma-delta, células NK (natural killer o asesinas), células CD3+CD�–CD8–, o células NKT y las células dendríticas (CDs) tolerogénicas. Las cé-lulas Treg pueden actuar directamente sobre las efec-toras o compitiendo con éstas para acceder a las cé-lulas presentadoras de antígeno o bien directamente actuando sobre las CDs (Figura 1).

En esta revisión nos vamos a referir a la alte-ración de la tolerancia inmunológica mediada las células dendríticas tolerogénicas y por las células reguladoras CD�+CD2�+ (Treg), supresoras CD8+ (Ts), y reguladoras NK en la EM. El redescubri-miento de estas células y su papel en la respuesta inmunológica no sólo brinda explicaciones sobre la fisiopatología de esta enfermedad, sino que también las convierte en un blanco terapéutico muy atracti-vo para el tratamiento de otras enfermedades auto-inmunes e infecciosas.

Células dendríticas inmunogénicas versus reguladoras o tolerogénicas

Recientemente se ha descrito que las células dendríti-cas (CDs), las más potentes células presentadoras de

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antígeno (CPAs), contribuyen a la tolerancia periféri-ca sobre los linfocitos T mediante un diálogo bidirec-cional entre ambas subpoblaciones3, �.

Las CDs desempeñan, por tanto, un papel esen-cial en funciones contrapuestas de los linfocitos T, como son la inducción y la regulación de sus res-puestas inmunológicas. Esta plasticidad funcional las convierte en las células clave en la respuesta inmu-nológica, que conecta a los sistemas inmunológico innato y adaptativo. Las CDs son las únicas CPAs capaces de inducir respuestas inmunológicas prima-rias, es decir, de activar linfocitos T vírgenes�. La singularidad de las CDs radica, entre otros factores, en su gran capacidad de reconocimiento y captura de antígenos cuando son inmaduras, su capacidad migratoria estrechamente regulada y en su elevada expresión de moléculas del complejo mayor de his-tocompatibilidad (CMH) y coestimuladoras y la de secretar citocinas polarizadoras una vez alcanzada su madurez funcional�. Todo ello posibilita una interac-ción entre el CMH de la CD y el receptor clonotípico del linfocito T (TCR) y que, en un entorno molecular adecuado, conlleva a una eficiente activación y pola-rización de linfocitos T vírgenes. En humanos, pue-den aislarse en sangre periférica dos subpoblaciones principales de CDs: las CDs mieloides (mDCs) y las CDs plasmacitoides (pCDs). Ambas poblaciones ca-recen de marcadores específicos de otros linajes, lin-, muestran distinto fenotipo, vías de desarrollo, distri-bución tisular y función. Las mCDs (CD11c+CD123)

El destino de la respuesta inmunológica de-pende del equilibrio entre las respuestas linfocitarias T efectoras y reguladoras. La especilización y la plasticidad funcional de las subpoblaciones de las células dendríticas determina la adquisición de un estado inmunogénico o to-lerogénico en función de las señales externas. Adaptado de Reiner et al., Cell 2007.

Figura 1

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son excelentes CPA, que producen grandes cantida-des de IL-12 p�0 y generan potentes respuestas Th1 (proinflamatorias) y CTL (citotóxicas). Las pCDs (CD11c-CD123(IL-3R)+) son las principales células productoras de interferón de tipo I ante la infección de bacterias y de virus encapsulados, inducen res-puestas Th2, son tolerogénicas en respuesta a las mo-léculas CD�0 o IL-3, y tras su activación por virus o CD�0 pueden generar respuestas Th1�.

Durante la activación, los linfocitos T CD�+ ex-presan la molécula CTLA-�, que se une a la molécu-la B� de la DC, y genera señales que inhiben la pro-ducción de IL-2 y la progresión del ciclo celular del linfocito T. La CTLA-� ha demostrado desempeñar un papel fundamental en la inducción de anergia. De hecho, mutaciones en los genes que codifican CTLA-� o Fas (cuya expresión es esencial para la inducción de apoptosis), se asocian con la aparición de enfer-medades autoinmunes8.

La capacidad de inducir tolerancia de las CDs depende de su estado de maduración funcional. Las CDs inmaduras inducen tolerancia por presentación del autoantígeno sin coestimulación en la sinapsis in-munológica (Figura 1)9. Las CDs tolerogénicas, pro-ducen la enzima indolamina-2,3dioxigenasa (IDO), responsable de la degradación del triptófano. Al ser el triptófano esencial para el desarrollo de los patóge-nos, hace que los patógenos dispongan de menor can-tidad. La expresión de IDO se ha detectado de manera constitutiva en las pCDs CD123+ reguladoras huma-nas, y puede ser inducida por estímulos de madura-ción clásicos de las CDs, como el IFN-γ y los LPS. En ratones se ha demostrado que las Treg pueden condicionar a las CDs a expresar actividad funcional de la IDO y tener capacidad inmunosupresora10, 11.

Las pCDs autólogas en presencia de secuencias repetitivas de CpG (secuencias 5′-purina-purina-CG-pirimidina-pirimidina-3′ sin metilar), inducen la transformación de los linfocitos T vírgenes en linfo-citos Treg citoquina-dependientes, que son anérgicos in vitro y expresan CTLA-�, CD2� y Foxp312.

Células T reguladoras: naturales versus inducidas

La diferenciación de las células reguladoras Tregs se origina en el timo durante el proceso de maduración normal del timo tras la inducción de la expresión de FoxP3 en un subtipo de timocitos TCRalfa-beta, poseen elevada afinidad por los complejos autoantí-geno-MHC. Estas células se conocen como células timo-derivadas o Treg “naturales” (nTreg). Las célu-las reguladoras Treg pueden “ser inducidas” (células iTreg) como consecuencia de la activación inmune periférica o bien mediante antígenos específicos en

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condiciones específicas (las cuales pueden o no ex-presar Foxp3), estas incluyen a los linfocitos regula-dores T helper tipo 3 o Th3 y reguladores tipo 1 o Tr1, Ts y a los CD� anérgicos. Estos linfocitos de-rivados extra-tímicamente se transforman en células Tregs tras la presentación del antígeno por células dendríticas plasmocitoides en presencia de IL-2 y TGF-beta, de vitamina D3, de dexametasona o de es-tradiol (Tabla I)13, 1�.

Las células reguladoras CD�+CD2�+ Treg son las mejor caracterizadas y estudiadas, constituyen aproximadamente el �-1�% de los linfocitos T CD�+ de la sangre periférica1�. Un subset de linfocitos T CD�+CD2�+, los que exhiben más la intensidad de fluorescencia CD4+CD2�+high, constituyen el 1-�% de las Treg, se ha visto que contienen la mayor actividad reguladora/supresora in vitro, inhiben totalmente la proliferación y secreción de citoquinas por las células CD�+ T efectoras, y expresan gran número de recep-tores IL-21�. Los linfocitos CD�+CD2�highFoxP3+ (conocidas como células Treg), poseen un gran po-tencial en el establecimiento de tolerancia en los pro-cesos autoinmunes, al haberse demostrado su capaci-dad de controlar las respuestas inmunológicas frente a autoantígenos.

Células CD4+CD25+FoxP3 naturales (nTreg)

Las nTreg inhiben la actividad citotóxica de los lin-focitos CD8+ y células NK1�, 18 mediante interacción directa célula-célula19. Se ha observado que en un sín-drome ligado al cromosoma X (IPEX), caracterizado por disfunción inmunológica, poliendocrinopatía, y enteropatía, hay una disrupción en la función del gen FoxP3 en las Treg. Estudios recientes han revelado que Foxp3, tanto en humanos como en ratones, es un regulador negativo de la activación de los linfocitos T, probablemente a través de la supresión de citoci-nas como la IL-2. En sangre periférica humana, la expresión de FoxP3 no es, sin embargo, específica de las Treg, también puede verse expresada en las CDs, en los linfocitos activados CD�+CD2�- e incluso en los linfocitos T CD8+20. Otros receptores caracterís-ticos de superficie celular de las nTreg incluyen el receptor del factor de de necrosis tumoral inducido por glucocorticoides (GITR), CTLA-� (CD1�2), ga-lectina-1, CD38, CD�2L, OX-�0L, CD103, TNFR2, y TGF-βR1, todos ellos expresados en las células T activadas convencionales, con excepción de CD103 (Tabla I). La neuropilina-1, receptor involucrado en la conducción del axón, la angiogénesis y la activa-ción de las células T, y el gen 3 de activación linfo-citaria (LAG-3), se han descrito recientemente como marcadores específicos de los nTreg.

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Las células CD�+CD2�+ Treg son típicamen-te hiporreactivas tras estimulación antigénica in vitro, pero pueden proliferar en vivo, e inhibir la trascripción de IL-2 por los linfocitos efectores CD�+ y CD8+ T21, 22. Sin embargo, in vivo los nTreg sufren una expansión clonal tras exposición a an-tígenos, manteniendo no obstante sus propiedades supresoras.

Linfocitos T CD4+ reguladores inducidos (iTreg)

Los iTreg comprenden al menos dos subpoblaciones de linfocitos T reguladores denominados Th3 y Tr1. A diferencia de las nTreg, la mayoría de los iTreg median la supresión principalmente por medio de la secreción de citocinas.

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Tr1: linfocitos T reguladores inducidos productores de IL-10

La producción de IL-10 es la característica fun-damental de los Tr1 (Tabla I). Se han descrito Tr1 específicos para una gran variedad de antígenos. Los Tr1 pueden ser inducidos in vitro mediante diferen-ciación de linfocitos T CD�+ en reposo o vírgenes en presencia de IL-10 (con estímulo sinérgico por IFNα, estimulación repetitiva con CDs inmaduras, activa-ción con anticuerpos monoclonales anti-CD3 y anti-CD46, o por nTreg que expresan la integrina α4β723. Fenotípicamente, los Tr1 se parecen a los nTreg en que ambos son anérgicos in vitro y expresan CTLA-�. Una diferencia con los nTreg es que los Tr1 no ex-presan niveles elevados de CD2� o Foxp3 y no rea-lizan la supresión por contacto celular. Sin embargo, un estudio demostró que los Tr1 inducidos por anti-

Características de los principales linfocitos T CD4+ reguladores

nTreg Tr1 Th3

Expresión de marcadores

IL-2Rα (CD25) ++++ +/- +++

IL2β y γε ++++ ++++ ?

FoxP3 ++++ - +++

LAG-3 ++++ ? ?

GITR ++ - ?

CTLA-4 +++ + ++

Nrp1 ++ ? ?

Producción de citoquinas

IL-10 +/- ++++ +/-

TGF-β +/- ++ ++++

IFN-γ +/- ++ +/-

IL-4 +/- - +/-

IL-5 - ++ ?

IL-2 - +/- -

Reconocimiento de autoantígenos ++++ +? +

Cooperación B - - IgA

Respuesta proliferativa a anti-CD3 -(salvo en presencia de IL2, IL-15)

-(salvo en presencia de IL-15)

?

Factores de crecimiento y diferenciación Interacciones en timo, CD28, IL-2, FoxP3, TGFb

IL-10/IFN-α (CD3/ CD46, inducción por CDs y nTregα4β7+)

TGF-β/IL-4 (IL-10, αIL-12, inducción por CDs y nTregα4β1+)

Mecanismo de supresión

In vitro Contacto intercelular IL-10, TGF-b TGF-b

In vivo Contacto intercelular, IL-10, TGF-b

IL-10, TGF-b TGF-b

Tabla I

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CD3/CD�� presentan función citotóxica, induciendo apoptosis en las células diana por medio de granzima B y perforina, de forma dependiente de la molécula CD18. El perfil de citocinas de los Tr1 incluye nive-les más altos de IL-10 y más bajos de TGF-β e IFN-γ2�. La IL-10 y el TGF-β son fundamentales para la supresión mediada por los Tr1 en la proliferación y liberación de citoquinas por los linfocitos T vírgenes CD�+CD2�- y linfocitos Th1 y Th2. Algunos estu-dios, han revelado que los Tr1 humanos también su-primen la producción de inmunoglobulinas por los linfocitos B y modulan la capacidad presentadora de antígenos de los monocitos y las CDs2�.

Linfocitos T reguladores inducidos Th3Los iTreg Th3, caracterizados por la produc-

ción de TGF-β (Tabla I), se originan tras la ingestión de antígenos extraños por vía oral. La presencia de TGF-β, que se encuentra en niveles elevados en el in-testino, ayuda a inducir la diferenciación de los linfo-citos T vírgenes a linfocitos Th3. La IL-10, asociada a inhibición de la IL-12, pueden también aumentar su expansión. Los iTreg Th3 pueden ser expandidos por las CDs, y por las nTreg que expresan la integrina α4β1. Al igual que los nTreg, los iTreg Th3 expresan CTLA-4 en su superficie, que favorece la secreción de TGF-β. La expresión de Foxp3 y CD25 también se ve aumentada tras re-estimulación de las células Th3 inducidas por TGF-β. A diferencia de los nTreg, los Th3 suprimen la proliferación de las células Th1 y Th2, por un mecanismo dependiente de la produc-ción de TGF-β. También los Th3 estimulan la secre-ción de inmunoglobulinas IgA en las células plasmá-ticas. Recientemente Zheng S y cols.2� sugieren que en el medio inflamatorio la IL-2 en combinación con TGF-β juegan un papel central en el mantenimiento de la homeostasis.

Linfocitos T CD8+ supresores

Las primeras células sospechosas de ejercer una fun-ción inmunosupresora fueron los linfocitos T CD8, y acusados como supresores/citotóxicos2�, si bien estudios posteriores no consiguieron definir el feno-tipo de esta subpoblación. En los últimos años se han ido definiendo poblaciones de linfocitos T CD8 su-presores (Ts) antígeno-específicos, con una función relevante en el mantenimiento de la tolerancia inmu-nológica en el hombre y en modelos murinos28, 29. La característica fenotípica fundamental es la ausencia de expresión de la molécula coestimuladora CD28 en la sinapsis inmunológica, lo que sugiere, según algu-nos autores, que estas células no requieren el reco-nocimiento de antígenos presentados a través de una CPA para ejercer su función supresora30. Nuestro gru-

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po y otros autores hemos descrito una población re-guladora que expresa la molécula de superficie CD25 de manera análoga a los linfocitos T CD� Treg31, 32.

En el hombre se han descrito al menos tres subpoblaciones de Ts funcionalmente diferentes. Los linfocitos Ts CD8 tipo 1 que inhiben las res-puestas T CD4 antígeno-específicas en respuestas a alo-antígenos y xenoantígenos33 3�, y reconocen com-plejos péptidos/MHC-I en las CDs, convirtiéndolas en tolerogénicas mediante la expresión de molécu-las inhibidoras como ILT3 o ILT� (immunoglobulin like transcripts) e inhibiendo la sobreexpresión de CD�0 y de moléculas coestimuladoras como CD80 y CD8�. ILT3 e ILT�, que interferirían con la induc-ción de moléculas coestimuladoras en las células presentadoras de antígeno y tolerizarían a las células T CD�+ helper.

Los linfocitos Ts CD8 tipo 2 ejercen su función supresora independientemente de su interacción con la CPAs (es decir, no restringidas por HLA-I)3�, en cuyo mecanismo de supresión parecen implicadas el IFN-gamma y la IL-�. También ejercen su función supresora mediante la secreción de IL-103�. Nuestro grupo ha descrito una expansión en la población Ts CD8+CD2�+ tras tratamiento con metilprednisonolo-na en el brote de EM, y una subpoblación de potente función supresora Ts CD8+CD2�+CD28- que se co-rrelaciona inversamente con los linfocitos T CD�+ y CD8+ activados3�.

Células Natural-Killer reguladoras

Las NK presentan dos tipos de receptores, de activa-ción y de inhibición; que están en equilibrio, así si expresan más receptores de activación que de inhi-bición indica que la célula NK va a actuar, y si por el contrario están sobreexpresados los de inhibición, indica que estas células no son capaces de actuar. Lo normal es que domine la señal de inhibición. El receptor Killer cell Ig-like receptor (KIR) juega un importante papel en la discriminación de las NK citotóxicas, se une a la molécula HLA clase I de la superficie de la célula diana, y confiere señales in-hibitorias a las células NK, que ejerce a través del receptor-inmune-tiroxina. Por otra parte, las células NK también pueden reconocer a las células diana ci-totóxicas que no expresan moléculas HLA clase I38. Entre los receptores inhibitorios, algunos son espe-cíficos para diferentes grupos de alelos específicos MHC clase I, mientras otros son receptores huérfa-nos. No obstante, se han descrito otros receptores, en las que la citocina IL-10 por las NK juega un pa-pel39. Recientemente se ha demostrado la existencia de células NK reguladoras (NKr) productoras de IL-10, citocina que suprime la proliferación de linfoci-

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tos Th1 y Th2�0. Estas células (NKr1)-CD��bright y CD��dim NKr están expandidas en el embarazo nor-mal en comparación con mujeres que sufren abortos espontáneos que están disminuidas�1. Veenstra van Nieuwenhowen y cols.�2 han demostrado un incre-mento en la producción de IL-10 por células NK cir-culantes durante la gestación, sugiriendo que durante las primeras fases de la gestación, que las NKr circu-lantes y en la decidua juegan un papel en el manteni-miento del embarazo mediante la regulación inmuno-lógica materna.

Aunque los mecanismos mediante los que las cé-lulas NK-T (células que expresan receptores propios de células NK y el TCRalfa-beta, el cual reconoce los complejos CD1d/glicolípidos) regulan la inducción de tolerancia son complejos, parece interaccionan con las células CD�+ y CD8+ reguladoras y actúan mediante la secreción de citoquinas supresoras IL-�, IL-10 y TGF-beta.

Mecanismos de acción de las células reguladoras Tregs: licencia para matar

Las células reguladoras y las células efectoras, junto con otros factores inmunológicos, operan en concier-to en la modulación de la reacción inmunológica. Las células reguladoras juegan un papel fundamental en la tolerancia a autoantígenos y aloantígenos, el con-trol de las infecciones, respuestas anti-tumorales, y en síndromes neurológicos paraneoplásicos.

Los linfocitos Tregs parecen modular gran varie-dad de funciones inmunológicas desde la activación celular T y B hasta la función efectora en el tejido diana. Parece que tres mecanismos distintos median el efecto supresor de las Treg, con contribución va-riable dependiendo de las condiciones y los ambien-tes inflamatorios. Todos los mecanismos requieren la proximidad espacial entre las células supresoras y las suprimidas, bien en los tejidos o bien en los nódulos linfáticos regionales (Figura 2).

1.- El primer mecanismo implica la eliminación física de las células citotóxicas, en el lugar de la in-flamación o en los nódulos regionales, bien mediante contacto directo intercelular, mediante secreción por las nTreg de perforina/granzima o de Fas-ligando (FasL); expresión de LAG3 y de CTLA-�/B� por las Tregs adaptativas. Este último mecanismo puede ser el dominante en situaciones en las que la inducción de tolerancia depende de vías funcionales de apopto-sis, mediante el que se eliminan los linfocitos efecto-res antígeno-reactivos.

2.- Un segundo mecanismo, modulando en el lugar de la inflamación el ambiente de citocinas me-diante la secreción de citoquinas inhibidoras. Las CD�+CD2�+Treg producen moléculas inmunomo-

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duladoras tales como IL-10 y TGF-, que directamen-te afectan a la actividad de las células citotóxicas y a las células presentadoras de antígenos (APC), inclui-das las células dendríticas (CDs), es decir, alteran la composición del ambiente inflamatorio. El TGF- β, en el ambiente inflamatorio reduce la secreción de citocinas por las CD�+ activadas. La IL-10 y TGF- β inhiben la actividad de los linfocitos T efectores y modulan la conducta de las APC (en estas disminu-yen la secreción de IL-12). También la IL-3� parece contribuir a la supresión de las Tregs.

3.- Un tercer mecanismo implica la inhibición de la proliferación, y/o la producción de citoquinas por las células T patógenas implicadas en la perpe-tuación de la reacción inmunológica por competición por factores de crecimiento. La alta expresión consti-tutiva de CD2� (cadena alfa del receptor de la IL-2) por las Treg les confiere una ventaja competitiva para el consumo de IL-2 sobre los linfocitos T vírgenes, que expresan CD2� de baja intensidad al activarse. Las Tregs, después de la sensibilización antígeno-específica, pueden reprimir la capacidad citolítica de las T efectoras, disminuyendo la secreción de ci-

Mecanismos de supresión de los linfocitos T reguladores (Treg). 1) Por contacto intercelular directo con la célula diana; liberación de factores supresores a través de las uniones gap, incluyendo la adenosina monofosfa-to cíclico (cAMP); citolisis directa; citoquinas supresoras unidas a la membrana como el factor de transformación del crecimiento (TGF-β); y/o indirectamente modulando la célula dendrítica u otra célula presentadora de antígeno, posiblemene a través de la molécula CTL-4. 2) Factores supresores solubles. Las Treg secretan directamente IL-10, TGF-β e IL-35 o inducir la secreción de dichas cito-quinas por las células dendríticas. 3) Competición. Las Treg pueden competir por determinadas citoquinas que señalizan a través de receptores que presentan la cadena gamma (IL-2, IL-4 e IL-7). Además pueden competir por la coestimulación de la célula dendrítica a través de la ex-presión constitutiva de CTL-4. Adaptado de Sojka et al., Immunology 2008.

Figura 2

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toquinas en las células efectoras (interferón gamma (IFN-γ–dependiente de CXCR3 receptor de quimio-quinas), sin afectar a su proliferación, o bien inhibir la producción de la IL-2 en los estadios precoces de la activación de las células T efectoras, de lo que re-sulta la anergia, o bien mediante la inhibición de la proliferación de las células T efectoras.

Las CD�+CD2�+ Tregs pueden atenuar/alterar homeostasis de la citoquina IL-2 por dos vías; por inhibición de la producción y/o por la excesiva con-sumición por las Tregs innatas, lo que impide que esta citocina esté disponible para la expansión de las T efectoras. Las células CD�+ activadas contribuyen indirectamente a su propia regulación, proveen la IL-2 a las Tregs requerida para ejercer la función regu-ladora.

Un estudio reciente realizado por Ito T y cols.�3, bajo la premisa de que no se conoce bien el mecanis-mo por el que las células Tregs FoxP3 median la in-munosupresión, identifica dos subsets de Treg FoxP3 naturales “generadas en el timo” de acuerdo con la expresión de la molécula coestimuladora ICOS y las llama ICOS+ e ICOS-. Encuentra en sangre periféri-ca que las Treg FoxP3 ICOS+ (2,��%) estas expre-san más CTLA� y CD38, y que suprimen la función de las CDs mediante IL10 y la función de las T efec-toras mediante TGF-β. Mientras que las Treg FoxP3 ICOS- (3,�9% en sangre periférica) preferentemente lo realizan mediante contacto célula-célula y utilizan TGF-β principalmente. La supervivencia y la proli-feración de ambas poblaciones de Treg está regulada por señalización a través de ICOS o CD28, respecti-vamente. Además, las Treg FoxP3 ICOS+ utilizan la citosina IL-10 para inhibir la maduración de las CDs. Señala que el timo adulto reduce la capacidad de for-ma selectiva para generar Treg FoxP3 ICOS+, lo que podría ser de importancia para explicar algunos acon-tecimientos inmunes que ocurren con la edad. ICOS+ similar a CTLA� es un marcador de activación T. Posiblemente, estas dos subpoblaciones de Tregs han sido seleccionadas y educadas en el timo por diferen-te población de células presentadoras de antígenos.

Por tanto, el desarrollo de respuestas proinflama-torias efectoras de tipo Th1 y las respuestas por las Treg están también guiadas por las CDs. Las CDs capturan eficientemente y procesan los antígenos y los presentan a los linfocitos efectores o a las Treg, dependiendo de su fenotipo funcional, o del estado de maduración de las CDs, entre otros factores. Las CDs y los Linfocitos CD�+Tregs controlan a los lin-focitos autorreactivos. En definitiva, las células CDs y Treg son centrales en el mantenimiento de la tole-rancia inmunológica y en la iniciación y regulación de las respuestas inmunes, y juegan un papel primor-dial en las enfermedades autoinmunes��.

En resumen, las células reguladoras son funda-mentales en el control de la autoinmunidad patógena y en el mantenimiento de la homeostasis inmunológi-ca normal. Asumen puntualmente y eficientemente la inmunomodulación en múltiples niveles dependiendo del estado de inflamación, de la coestimulación y de la localización anatómica. La correcta proporción y función son críticas en limitar las respuestas a au-toantígenos al comienzo o durante la actividad de las enfermedades autoinmunes��. Diversos mecanismos, muchos de los cuales estudiados a nivel experimen-tal, indican su papel en la modulación de la cantidad y cualidad de las respuestas inmunológicas. La tabla I muestra los factores solubles que modulan dichas respuestas.

Implicación de las células reguladoras en la patogenia de la EM

Se considera que la EM es una enfermedad inflama-toria multifocal, crónica, que afecta preferentemen-te a la mielina del sistema nervioso central (SNC), cuya patofisología es mediada por el sistema inmu-nológico. La hipótesis es que las células dendríticas (CDs)��, las células T autorreactivas activadas y los linfocitos B, pero también las células T reguladoras (Treg) invaden el SNC a través de la barrera hemato-encefálica (BHE) y junto con la microglía residente local inducen una respuesta inmunológica que causa la desmielinización, daña a los oligodendrocitos, y al axón/neurona��, �8. La disregulación de las respuestas inflamatorias y la autotolerancia se consideran ele-mentos claves en la respuesta autorreactiva inmune en la esclerosis múltiple. Es importante conocer el papel de las células reguladoras en el control de la in-flamación en el SNC en respuesta a autantígenos y a antígenos no propios, ya que conceptualmente, estas células, dentro del SNC tendrían funciones anti-in-flamatorias o neuroprotectoras. De acuerdo con estos hallazgos, en nuestro grupo, hemos observado lin-focitos Treg y células dendríticas (CDs) mieloides y plasmacitoides activadas en el LCR en pacientes con síndrome clínico aislado (CIS), y durante el brote en pacientes con EM recurrente-remitente (EMRR)�9. Se ha observado que la molécula MHC clase I está so-breregulada en los axones y neuronas dentro de las lesiones activas de la EM, y que en las lesiones in-flamatorias del SNC los linfocitos CD8+ predominan en los infiltrados inflamatorios de las lesiones�0, �1. Malmeström C y cols.�2 observaron clones de linfo-citos CD8+ citotóxicos expandidos en el LCR y en la sangre de pacientes con EM durante el brote, pero únicamente los niveles de granzima A y B en LCR producida por los linfocitos CD8+ citotóxicos esta-ban elevados durante el brote, al compararlos con

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los niveles en la remisión y con los controles, lo que indicaría que la citotoxicidad mediada por los linfo-citos CD8+ está confinada a los compartimentos del LCR/SNC en la EM. El incremento de los niveles en el LCR de proteínas de neurofilamentos ligeros durante el brote, observado por los mismos autores, abogaría a su participación en la lesión axonal. Nues-tro grupo ha descrito que durante el brote, el incre-mento de estos linfocitos reguladores/supresores T CD8+CD2�+CD28- y que estos se correlacionan de forma inversa con los linfocitos CD�+ activados31. Recientemente Correale J y cols.�3 han encontrado en muestras pareadas de sangre y LCR linfocitos T CD8+CD28- reguladoras en pacientes con EM en brote y fuera del brote, y que clones de estos linfoci-tos en cultivo reconocen a péptidos de la mielina en los linfocitos CD�+ y que producen lisis de los linfo-citos CD�+ efectores.

Respecto a los linfocitos CD�+CD2�+ Treg, es-tudios recientes y nuestro grupo han encontrado que durante la actividad clínica de la enfermedad (duran-te el brote) y/o cuando hay actividad en las imágenes de resonancia magnética craneal (MRI) se observa un incremento en los linfocitos TReg hi+. en sangre periférica. Otros autores han demostrado que duran-te los síntomas del CIS�� la proporción de linfocitos Treg en el LCR se correlaciona negativamente con la concentración en el LCR de proteína básica de la mielina y la presencia de bandas oligoclonales de IgG, apoyando su papel neuroinmunoprotector.

En cambio, en los pacientes con EM RR no ac-tivos clínicamente, no hemos encontrado incremento de la proporción de Treg respecto a controles sanos. Sin embargo, sí hemos observado, al igual que otros autores, que las Treg (CD�+CD2�+high) presentan un déficit funcional, en términos de su capacidad ex vivo de suprimir la proliferación de los linfocitos T CD�+CD2�- efectores tras la estimulación del re-ceptor TCR��, ��, ��. Recientemente se ha escrito que el marcador CD12� (implicado en la formación del receptor de la IL-� de las células T) y que la expre-sión de FoxP3 está subexpresado en las CD�+CD2� higth FoxP3 Treg, en los linfocitos CD8+CD28- y en los CD3+CD��+ NK-T en sangre periférica de los pacientes con EM primariamente progresivas�8, lo que sugiere su implicación en la patogenia de esta forma clínica. El mecanismo que subyace en la dis-función de las Treg no se conoce bien, Haas J et al.�9

han mostrado evidencia de que hay una alteración de la generación de las células Tregs (que coexpresan CD31) en el timo de los pacientes con EM, y que es-tán reducidas en la sangre de los pacientes con EM, que se compensa con incremento de las Tregs de memoria, lo que resulta una población total de Tregs normal.

Por otra parte, se ha observado que las células activadas NK pueden ser citotóxicas para los oligo-dendrocitos autólogos in vitro�0, y se han detectado estas células en lesiones agudas inflamatorias SNC lesiones�1. Sin embargo, con la depleción de las cé-lulas en NK en EAE se observa un incremento de su severidad, lo que sugiere su papel regulador�2. Taka-hashi ha encontrado en sangre periférica de pacientes con EM en remisión aumento de la proporción de cé-lulas NK que expresan altos niveles de CD9� (Fas), un receptor que puede inducir apoptosis�3. Por tanto, las células NK, al igual que las CD8, son potencial-mente citotóxicas y reguladoras.

Aunque las bases moleculares responsables de la pérdida de tolerancia a los antígenos de la mielina del SNC que conducen al desarrollo de la esclerosis múl-tiple (EM) no son bien conocidos, sin embargo estos datos abogan a que los linfocitos reguladores están implicados en la patogenia y en el control de la in-flamación de la EM. La susceptibilidad a padecer las distintas formas clínicas de la enfermedad y el con-trol de su actividad serían, en parte, debidos al fallo en los mecanismos homeostáticos de inmunorregula-ción mediado por estas células��. Por ello, es crítico determinar cómo está gobernada la inmunidad dentro y fuera del SNC, ya que hasta el momento actual no es claro que ninguna de las terapias disponibles actúe directamente a nivel del SNC.

Efecto de los tratamientos utilizados en EM sobre las células reguladoras

Entre los fármacos clínicamente relevantes en el tra-tamiento de la EM, los corticosteroides han demostra-do bloquear la maduración de las células dendríticas derivadas de monocitos2� y suprimir la diferenciación de CDs derivadas de células madre CD3�+ de la dermis sin afectar la diferenciación de las células de Langerhans. Hemos observado que el tratamiento del brote de EM con 1g diario de metilprednisolona in-travenosa durante 5 días induce un descenso signifi-cativo de las subpoblaciones circulantes de las CDs y un incremento en la proporción de ambos subsets de los linfocitos T CD�+ Treg y de CD8+ Ts en sangre periférica de los pacientes con EM3�, ��.

Respecto al tratamiento con los inmunomodu-ladores, nuestro grupo ha demostrado que el IFNβ-1a (Rebif ®, Merck-Serono) restaura in vivo e in vitro la alteración de la función supresora de los CD�+CD2�+high a los 3, � y 12 meses de tratamien-to��, incrementa los linfocitos CD8+ reguladores y eleva los niveles en sangre periférica de IL-10 en los pacientes respondedores��.

Otros autores��, �8 han observado que también el acetato de glatirámero (Copaxone) tiene efecto sobre

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Efectos de diferentes fármacos y agentes biológicos sobre células dendríticas, linfocitos T CD4+ reguladores y CD8 supresores

Maduración CDs Moléculas coestimuladoras Inducción de Treg Inducción de Ts

Corticoides (-)(-) (-) ++ ++

IFN-beta (-) (-) ++ +

Copaxone ? ? +

GGIV (-)(-) (-)(-) + ?

Vitamina D (-) (-) ++ ?

Micofenolato mofetilo (-) (-) ? ?

IL-10 (-)(-)(-) (-)(-)(-) (-) ?

IL-7 ++ + ++ ?

Tabla II

las células reguladoras CD�+CD2� high T y aumenta la respuesta supresora T CD8 Ts�9. Respecto al tra-tamiento con inmunoglobulinas IV, se ha propuesto que algunas IgG de las inmunoglobulinas IV, y que el suero normal contiene anticuerpos naturales contra el receptor de las células T (TCR) que sirve de re-gulador de las células T, posiblemente a través de la inhibición de la producción de IL-2�0.

Las gammaglobulinas policlonales intravenosas (GGIV) a altas dosis inducen una modulación de las propiedades de las células dendríticas. Diversos es-tudios recientes han demostrado que las GGIV pro-ducen una inhibición de la diferenciación y madura-ción de las CDs in vitro, con regulación a la baja de la expresión de moléculas coestimuladoras, afectan-do la capacidad de la CD madura de producir Il-12 y aumentando su capacidad de producir Il-10. Como consecuencia de ello, se produce la inhibición de la activación y proliferación linfocitaria T auto- y alo-rreactiva�1, �2. Además, se ha demostrado que las GGIV a las dosis sustitutivas empleadas en las inmunodefi-ciencias primarias expanden las Treg in vitro e in vivo en el modelo murino de la esclerosis múltiple�3.

La 1α, 25(OH)2-D3, metabolito activo de la vita-mina D3, inhibe la diferenciación de las mCD CD1a+ derivadas de monocitos, e induce la diferenciación de

Treg productoras de IL-10 cuando se emplea combi-nada con dexametasona y en ausencia de citoquinas polarizadoras Th1 y Th2��. La tabla II resume los me-canismos implicados en la respuesta inmune de los diversos tratamientos utilizados en los pacientes con esclerosis múltiple.

Conclusiones y proyección futura

Un mejor conocimiento de los factores que modulan la activación y/o la función de estas células a nivel periférico y dentro del SNC es de suma importancia. Estudios genéticos en curso sobre las Treg podrán contribuir a clarificar la etiología de la EM y de otras enfermedades autoinmunes��. Diversos tratamientos modificadores del curso de la enfermedad han de-mostrado favorecer la inducción y mantenimiento de las células inmunorreguladoras. Más aún, en la actualidad se considera factible la posibilidad de em-plearlas como una nueva estrategia de inmunoterapia celular individualizada. Quedan muchas cuestiones abiertas aún sin resolver, incluyendo el tipo de célu-la reguladora más útil; los métodos de generación y expansión más fiables, eficaces y seguros; el momen-to idóneo para iniciar esta inmunoterapia y el tipo de pacientes susceptibles de ser tratados.

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AgradecimientosEste trabajo ha sido financiado por ayudas del Fondo de Investigación Sanitaria (proyecto FIS #PI040468), de la

Comunidad de Madrid (proyecto #GR/SAL/0053/2004) y de la Fundación Salud 2000.

(-) inhibe; + induce, Treg; Ts, GGIV: Gammaglobulina intravenosa.

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Células inmunorreguladoras: implicación en la patogenia y en la...

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