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Universidad Nacional de la Patagonia San Juan Bosco Facultad de Ciencias Naturales y Ciencias de la Salud.
Cátedra: Química Biológica I Año 2017
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CARPETA DE TRABAJOS
PRÁCTICOS
Departamento de Bioquímica
Facultad de Ciencias Naturales y
Ciencias de la Salud.
UNPSJB
Año 2017
Universidad Nacional de la Patagonia San Juan Bosco Facultad de Ciencias Naturales y Ciencias de la Salud.
Cátedra: Química Biológica I Año 2017
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Bienvenido a este fascinante y poco conocido, mundo de la química de la
vida. Aquí los esperan nuevos desafíos, pero con la ventaja de que muchas
herramientas ya las poseen. El estudio de la química lo han comenzado un
tiempo atrás, retomaran conceptos vistos y construirán una integración
que les permitirá desde lo simple a lo complejo entender el
funcionamiento de la vida a nivel molecular.
El equipo que los acompañara en este
camino está integrado por:
Profesora adjunta: Dra. Crovetto, Cecilia.
Jefa de Trabajos Prácticos: Bqca. Álvarez, Vanesa.
Auxiliar de 1°: Bqco. Castillo, Marcelo.
Auxiliares alumnos: Figueroa, Maximiliano y Huentemilla Cecilia.
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Conceptos en Bioseguridad
El primer paso antes de entrar en un laboratorio debe ser tomar conciencia con la realidad
que representa. Se trata de un lugar para aprender, descubrir y enseñar, pero al mismo tiempo
es un lugar que, como casi todos, puede presentar peligros para la vida y salud de las personas.
Los accidentes pueden ser causados por:
Agentes físicos y mecánicos: Efectos traumáticos quemaduras por exposición a muy
altas/bajas temperaturas, cortaduras por vidrios o recipientes rotos, malas instalaciones que
generan posturas inadecuadas, caídas por pisos resbalosos, riesgo de incendios, inundaciones,
instalaciones eléctricas inadecuadas, etc.
Agentes químicos: Exposición a productos corrosivos, tóxicos, irritantes o cancerígenos por
inhalación, contacto con la piel o mucosas, por heridas o ingestión. Exposición a agentes
inflamables o explosivos.
Agentes biológicos: El riesgo dependerá de la naturaleza del agente, su patogenicidad,
virulencia, modo de transmisión y la vía de entrada natural al organismo (inhalación de
aerosoles, inyección por pinchazos con agentes punzantes, contacto).
El Riesgo químico es aquel riesgo susceptible de ser producido por una exposición no
controlada a agentes químicos la cual puede producir efectos agudos o crónicos. Los productos
químicos también pueden provocar consecuencias locales y sistémicas según la naturaleza del
producto y la vía de exposición.
Los agentes químicos pueden ingresar al organismo a través de diferentes vías:
Vía inhalatoria: el ingreso de un agente químico, a través de esta vía es muy
frecuente, ya que los vapores o gases se mezclan con el aire que se respira. Es
importante considerar que no necesariamente debe tratarse de un gas, sino que los
líquidos pueden mezclarse con el aire en forma de aerosoles, así como los sólidos
pueden incorporarse y trasladarse por el aire en forma de polvo muy fino en
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suspensión. Ejemplos de compuestos químicos que actúan por esta vía son: monóxido
de carbono, ácido cianhídrico, sulfuro de hidrógeno, vapores de mercurio, benceno,
metanol, nitrobenceno.
Vía digestiva: la intoxicación a través de esta vía se produce no sólo por la ingesta
directa del producto, sino también por elementos (entre los más frecuentes se
encuentran los lápices, biromes, etc.) o manos contaminadas que son llevados a la
boca. Algunas sustancias tóxicas, actúan de forma inmediata, como por ejemplo las
que ejercen una acción mecánica (tal sería el caso de los corrosivos); otras lo hacen
después de su absorción y luego de ser metabolizadas por el organismo, por lo que
pueden “parecer” inocuas en un primer momento.
Vía dérmica: algunos contaminantes producen intoxicación por absorción cutánea. Los
tóxicos liposolubles se caracterizan por su toxicidad. La exposición puede suceder por
contacto directo, por deposición (por ejemplo cuando el aerosol o el vapor impactan
con la piel) o bien por contacto con superficies en las que se encuentra depositado el
contaminante (tal como sucede durante el mantenimiento o limpieza de equipos, tras
la aplicación de productos fitosanitarios, etc.). Debe tenerse presente que algunos
contaminantes provocan diferentes efectos y que distintos contaminantes pueden
estar presentes en un mismo ambiente al mismo tiempo. No probar ni oler, bajo
circunstancia alguna, productos químicos con vistas a su identificación.
Clasificación de los agentes químicos según su peligrosidad
Explosivos: son aquéllas sustancias y/o preparaciones que pueden explotar bajo
efecto de una llama o que son sensibles a los choques o fricciones. Ejemplo:
nitroglicerina.
Inflamables: son líquidos, mezcla de líquidos, o líquidos que contienen sustancias
sólidas, en solución o suspensión, que despiden vapores inflamables a una
temperatura no mayor de 135ºC, en vaso abierto.
Sólidos inflamables: son sustancias sólidas no consideradas como explosivos que son
capaces, espontáneamente o bajo condiciones accidentales, de causar incendio por
fricción, por absorción de humedad, por cambios químicos o físicos espontáneos o
como resultado del calor retenido durante su elaboración. Ejemplo: metaldehído.
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Espontáneamente inflamables: son sólidos inflamables que pueden calentarse de
manera espontánea al contacto con el aire o por fricción. Ejemplo: fósforo blanco.
Reactivos con el agua o la humedad: son sólidos que, bajo la acción del agua o la
humedad se transforman espontáneamente en inflamables o bien despiden gases
inflamables. Ejemplo: carburo de calcio que al contacto con el agua genera acetileno.
Gases inflamables: son sustancias gaseosas que forman una mezcla inflamable
cuando se mezclan con el aire en la proporción mínima del 13%. Ejemplos: butano,
propano.
Sustancias comburentes: son sustancias habitualmente incombustibles capaces de
liberar fácilmente oxígeno, activando la combustión de otros materiales e
intensificando la violencia de la misma. Es importante evitar su contacto con
materiales combustibles. Ejemplo: oxígeno, nitrato de potasio, peróxido de
hidrógeno.
Corrosivos: son productos químicos que causan destrucción de tejidos vivos y/o
materiales inertes. Ejemplos: ácido clorhídrico, ácido fluorhídrico.
Radiactivos: son sustancias que emiten radiaciones nocivas para la salud.
Peligroso para el medio ambiente: son sustancias provocan daños al ecosistema a
corto o largo plazo.
Se sugiere leer las fichas de seguridad química internacional de ciertas sustancias a ser
utilizadas en distintos Trabajos Prácticos, con el fin de una correcta manipulación de los
mismos y minimización de posibles accidentes en el área de trabajo.
Las reglas básicas de seguridad que se establecen a continuación tienen como objetivo
proteger la salud de todos aquellos que trabajen dentro de un laboratorio y a evitar
accidentes y contaminaciones.
Un elemento clave de la seguridad es la información que permita prevenir, reconocer y
minimizar los riesgos presentes en una institución y, en particular, en un laboratorio.
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EQUIPOS DE SEGURIDAD (Barreras primarias)
Guardapolvo: para no llevar ni traer contaminantes del medio ambiente y
como barrera de contención de las proyecciones o salpicaduras de elementos
corrosivos. Debe quitarse al retirarse del laboratorio.
Guantes: para proteger las manos en el caso de que se usen elementos
cáusticos, tóxicos o patológicos.
Barbijos: para evitar la entrada de polvos a las vías respiratorias.
Anteojos de seguridad: para proteger los ojos de las proyecciones y
salpicaduras
Pro pipetas: para evitar respirar los vapores y posible ingestión de distintas
sustancias. Jamás pipetear con la boca
SEGURIDAD EN EL LABORATORIO
Usted debe saber
1- Localización dentro del edificio.
2- Ubicación a la llave de agua, gas, interruptores de corriente y desagüe.
3- Identificación de los recipientes adecuados para los residuos patológicos y residuos no
patológicos.
4- Localización de matafuegos: identificar la ubicación de los extintores (Ver Anexo: Uso de
Extintores).
5- Localización de puertas de salida: identificar todas las posibles puertas de emergencias
cercanas al laboratorio en el cual trabaja.
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Hábitos personales para trabajar con seguridad
Usar todos los elementos de seguridad en todo momento en que este realizando una
experiencia.
Lavarse las manos todas las veces que sea necesario, luego de manipular materiales
viables, luego de quitarse los guantes y antes de retirarse del laboratorio.
Prohibido comer, beber, fumar, almacenar alimentos para uso humano en áreas de
trabajo.
Evitar el uso de accesorios colgantes (aros, pulseras, collares).
Trabajar con el cabello recogido.
Lavar todo el material de vidrio antes y después de las experiencias.
Cuando en alguna etapa de la experiencia puedan producirse vapores irritantes o
tóxicos, debe trabajar bajo campana.
No realice experiencias no indicadas en el trabajo práctico sin consular con el docente.
No use material de vidrio rajado o roto.
Cuando caliente un tubo de ensayo u otro elemento no dirija la boca del mismo al
rostro de sus compañeros o suyo propio.
Consulte si tiene que eliminar algún producto químico.
Evite derrames al trasvasar líquidos.
Cuando finalice su trabajo deje todo su material limpio y ordenado, mesada limpia y
controle que las llaves de gas estén cerradas y los equipos eléctricos apagados.
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Pautas para la aprobación del cursado de la asignatura
La asistencia al 85 % de los Trabajos Prácticos y con la aprobación del 75% de los mismos; la
aprobación de cada Trabajo Práctico se obtendrá con la aprobación de un cuestionario sobre el
mismo y su respectivo informe.
Aprobar los exámenes parciales o sus respectivos recupera torios. En caso de no lograrlo,
podrá rendir un recupera torio final que abarque los contenidos del o de los parciales
desaprobados siempre y cuando haya aprobado por lo menos un parcial o su recupera torio. La
asignatura tiene previstos tres exámenes parciales. (Reglamento de Alumnos de la FCN y CS de
la UNPSJB).
Condiciones para la aprobación de la asignatura
El examen final es oral. La asignatura tiene régimen promocional. Los alumnos deberán
obtener nota 7 o más en cada parcial, aprobar el 100 % de los Trabajos Prácticos y un coloquio
final oral integrador. El examen libre se realizará en un lapso de dos días. (Reglamento de
Alumnos de la FCN y CS de la UNPSJB).
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Ruta de aprendizaje
A continuación se establecen pautas que los ayudara a ir formando orden y criterio en
el trabajo individual y en equipo…………….animo que todo es posible con esfuerzo,
compromiso y perseverancia.
Previo al seminario y trabajo Práctico
Individual
Lectura de la bibliografía sugerida en el programa de estudio, para la comprensión del
Tema a desarrollar en el Trabajo Práctico.
Lectura interpretativa de la experiencia de laboratorio.
Construcción de un glosario de términos desconocidos.
Lectura comprensiva de la guía de funcionamiento del instrumental de laboratorio,
fichas de seguridad de los diferentes reactivos.
Resolución de la guía de estudio del trabajo práctico (obligatoria).
Grupal
Resolución de problemas teóricos-prácticos.
Discusión grupal de las inquietudes que surjan a lo largo de la cursada.
Investigación de datos desconocidos y no aportados por la cátedra. (valores de
referencia, valores normales, etc.).
Construcción de un diagrama de flujo de la actividad práctica, con el objetivo de
optimizar el tiempo de trabajo grupal. Para el desarrollo del mismo, tener en cuenta la
preparación de reactivos, extracción de muestras, tiempos y condición de reacciones,
estabilización de equipos.
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Día de Seminario
Individual
Entrega de la guía de estudio correspondiente al trabajo práctico a desarrollar.
Puesta en común de las diferentes dudas que surjan.
Instrucción docente para el desarrollo de la actividad práctica.
Grupal
Contextualización (en el caso de ser posible) del problema a resolver en el trabajo practico.
Entrega del diagrama de flujo.
Día de la Actividad Práctica de Laboratorio
Entrega de la guía de estudio correspondiente al trabajo practico a desarrollar.
Desarrollo de la experiencia
Discusión de resultados obtenidos.
Entrega de pre informe con los resultados obtenidos.
Próximo encuentro
Grupal
Entrega de informe según guía de elaboración de informe de laboratorio.
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Guía para la elaboración de informe de la práctica de laboratorio
Encabezado
Nombre de la asignatura
Nombre de los alumnos
Fecha
Trabajo Práctico
Nombre del tema, ej. : Lípidos.
Título……………………………………………………………………………………………..
Debe reflejar el tema, ámbito o asunto que compete desarrollar. El título no debe ser
muy extenso. Su lectura debe dar la idea general de lo que tratara la práctica.
Objetivos
Los objetivos se definen según el tema de laboratorio y reflejan lo que se espera
lograr al final del trabajo.
La forma de escribir un objetivo es con un verbo en infinitivo, por ejemplo: Describir,
Realizar, Demostrar, Verificar, Medir, Calcular, Contrastar, Conocer, etc.
Marco teórico
Síntesis de los conceptos que se relacionan con el tema. Una extensión limitada
requiere que el estudiante sintetice las ideas adquiridas de la investigación del
material bibliográfico que se contrastara con lo aprendido en las clases y en el
laboratorio. El proceso de redacción implicará discernir lo esencial de lo
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complementario, o de lo no importante para el desarrollo de la práctica. Aquí es
importante plantearse inquietudes: ¿Por qué? ¿Cómo? ¿Para qué? ¿Cuándo? ¿Qué?
Lista de materiales, equipos y reactivos.
Escribir una lista simple con los materiales esenciales usados, las herramientas
requeridas y los equipos necesarios.
Desarrollo de la práctica
Aquí se describirán en forma breve los procesos que requiere la ejecución de la
práctica.
El desarrollo de la práctica contendrá las explicaciones de todo aquello que surja y no
estaba detallado explícitamente en las indicaciones del trabajo práctico.
Resultados
Datos de medias.
Cálculos
Esquemas
Gráficos
Tablas
Fotos
Análisis de resultados
Luego de realizar las mediciones y cálculos correspondientes estos deben ser
analizados por el equipo de trabajo. Se debe centrar en interpretar los datos,
contrastarlos con los cálculos, con los valores de referencia. Aquí inicia una puesta en
común, de intercambio y construcción de criterio, de supuestos colectivos referentes
a un mismo problema.
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Conclusiones y recomendaciones
Comprendidos y analizados los resultados de la práctica, el estudiante puede ahora
emitir un juicio sobre ellos. No solo indicar si fueron o no correctos, sino indicar el por
qué se dieron esos resultados. Aquí también deben indicarse si se cumplieron o no los
objetivos de la práctica.
Bibliografía
Citas bibliográficas para describir e identificar fácilmente las fuentes de las cuales se
extrajo la información utilizada para la construcción del informe
Existen diferentes normas para la elaboración de una bibliografía, la cátedra sugiere
las que se conocen como normas de Vancouver (ver anexo al final de la carpeta).
Indicaciones generales
Redacción: Esta debe ser en un estilo simple y descriptivo, cuidando la gramática y la
ortografía. Las referencias bibliográficas serán de utilidad para evitar el plagio y
deberán manejarse según las normas para citas bibliográficas.
Formato del texto: El tipo de letra, tamaño y márgenes pueden ser los que WORD
tiene por defecto al crear un documento nuevo. Se recomienda utilizar tipos de letras
simples como la CALIBRI, con tamaños de 12 para el texto principal, 10 para las notas
al pie y 14 para títulos. Párrafo interlineado 1,5. Justificado.
Imágenes, figuras y fotografías: estas deben ser claras y de fácil comprensión, dado
que darán soporte a las ideas presentadas en el texto. Si las imágenes se obtienen de
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páginas web o de bases de datos, debe indicarse su procedencia por medio de una cita
bibliográfica. Si las fotos no son realizadas por el autor del informe, debe indicarse
también su procedencia. Debe incluirse un pie de imagen o de foto según
corresponda, para referenciarla en el texto.
Tablas: son un recurso para mostrar datos o información en forma resumida. El
significado de las filas y columnas debe explicarse ya sea con títulos o en el pie de
tabla. Las tablas en el texto no deben ser largas y abarcar muchas hojas, de ser este el
caso podrían colocarse como anexo.
Cálculos y procesos matemáticos: los cálculos y procesos matemáticos en general
deben empezar con un planteamiento, y luego indicar de forma explícita (con texto
que acompañe a la formula) los pasos entre una formula a otra. Numerar las
ecuaciones permite no repetirla varias veces.
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Lista de Trabajos Prácticos
Trabajo Práctico: Espectrofotometría
Trabajo Práctico: Glúcido
Trabajo Práctico: Lípidos
Trabajo Práctico: Cuantificación de Proteínas.
Separación electroforética
Trabajo Práctico: Enzimas
Trabajo Práctico: Cinética enzimática
Trabajo Práctico: Cromatografía I
Trabajo Práctico: Cromatografía II
Trabajo Práctico: Cromatografía III
Trabajo Práctico: Integrador
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Trabajo Práctico de Laboratorio: ESPECTROFOTOMETRÍA
Objetivos
- Reforzar el aprendizaje del uso del espectrofotómetro.
- Realizar el espectro de absorción de sustancias puras: soluciones de dicromato de potasio.
- Realizar una curva de absorbancia vs concentración.
- Determinar la concentración de una muestra problema de dicromato de potasio.
Fundamento teórico
La espectrofotometría comprende una serie de técnicas analíticas usadas para análisis cuali y
cuantitativo.
Una radiación electromagnética se puede describir como un flujo de partículas llamadas
fotones, o bien como una onda propagándose en el espacio. De esta última descripción se
toma el concepto de longitud de onda, definiéndolo como la distancia entre dos máximos
consecutivos de la onda.
Figura 1: Naturaleza de una onda
Esta es inversamente proporcional a la energía de la misma, de tal manera que el espectro de
radiaciones electromagnéticas abarca un amplio rango de energías, las de menor energía son
las ondas de radio y las de mayor energía son las llamadas radiación gamma.
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Figura 2: Espectro electromagnético
Figura 3: Regiones del espectro electromagnético
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La región UV se define como el rango de longitudes de onda de 195 a 400 nm. Es una región
de energía muy alta. Provoca daño al ojo humano así como quemadura común. Los
compuestos con dobles enlaces aislados, triples enlaces, enlaces peptídicos, sistemas
aromáticos, grupos carbonilos tienen su máxima absorbancia en la región UV, por lo que ésta
es muy importante para la determinación cualitativa y cuantitativa de compuestos orgánicos.
Diversos factores -como pH, concentración de sal y el disolvente- que alteran la carga de las
moléculas, provocan desplazamientos de los espectros UV. La fuente de radiación ultravioleta
es una lámpara de deuterio.
En la región visible apreciamos el color visible de una solución y que corresponde a las
longitudes de onda de luz que transmite, no que absorbe. El color que absorbe es el
complementario del color que transmite. Por tanto, para realizar mediciones de absorción es
necesario utilizar la longitud de onda en la que absorbe luz la solución coloreada. La fuente de
radiación visible suele ser una lámpara de tungsteno y no proporciona suficiente energía por
debajo de 320 nm.
Las principales ventajas de la espectrofotometría son:
Sensibilidad relativa elevada.
Facilidad para realizar mediciones rápidas.
Grado de especificidad relativamente elevado.
Para obtener la máxima sensibilidad en una determinación debe conocerse la longitud
de onda de mayor absorción de la sustancia analizada, que no deberá coincidir con una
alta absorción de otras sustancias presentes en la reacción.
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Intervalo de longitudes de
onda (nm)
Color de luz absorbida Color complementario
transmitido
400-435 Violeta Amarillo verdoso
435-480 Azul Amarillo
480-490 Azul verdoso Anaranjado
490-500 Verde azulado Rojo
500-560 Verde Purpura
560-580 Amarillo verdoso Violeta
580-595 Amarillo Azul
595-650 Anaranjado Azul verdoso
650-750 Rojo Verde azulado
El análisis cuantitativo por absorción, se basa en la absorción selectiva de radiación en la zona
visible del espectro electromagnético que se produce cuando dicha radiación, atraviesa una
solución coloreada que contiene al analito de interés y que se coloca en una celda, dando lugar
a que el rayo emergente difiera del
incidente. Es así, que el proceso de
absorción disminuye el poder
radiante (intensidad) de la radiación
transmitida desde un valor Io
(correspondiente al haz incidente)
hasta un valor I (correspondiente al
haz que emerge de la solución). La
absorción no es el único proceso por
el cual se reduce el poder de
radiación de la luz que atraviesa la
solución. Las reflexiones en la Figura 4: Perdidas por reflexión y dispersión
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superficie de la celda, así como la dispersión causada por partículas en suspensión también
contribuyen a esa disminución. Para compensar estas pérdidas, se coloca primero en la celda
una solución "en blanco" constituida por el disolvente y todos los constituyentes del sistema
investigado, menos el que quiere determinarse. Así el poder radiante de la radiación
transmitida corresponde al poder radiante incidente original, menos las pérdidas por reflexión,
dispersión, etc. Se designa a este poder radiante como Io y es igual al poder radiante incidente
"corregido", cuando el "blanco" se reemplaza por la muestra. La radiación que absorbe la
muestra se determina entonces, comparando la intensidad del haz transmitido cuando no hay
muestra (Io) con la del haz transmitido cuando hay muestra (I).
La transmitancia (T) de una sustancia en solución es la relación entre la cantidad de luz
transmitida que llega al detector una vez que ha atravesado la muestra, It, y la cantidad de luz
que incidió sobre ella, Io, y se representa normalmente en tanto por ciento: % T = It/Io x 100
La transmitancia nos da una medida física de la relación de intensidad incidente y transmitida
al pasar por la muestra. La relación entre %T y la concentración no es lineal, pero asume una
relación logarítmica inversa.
La absorbancia (A) es un concepto más relacionado con la muestra puesto que nos indica la
cantidad de luz absorbida por la misma, y se define como el logaritmo de 1/T, en
consecuencia: A = log 1/T = -log T = -log It/ Io. Cuando la intensidad incidente y transmitida
son iguales (Io = It), la transmitancia es del 100% e indica que la muestra no absorbe a una
determinada longitud de onda, y entonces A vale log 1 = 0.
La ley de Lambert-Beer, rige los cálculos cuantitativos, Esta ley expresa la relación entre
absorbancia de luz monocromática (de longitud de onda fija) y concentración de un cromóforo
en solución: relacionada con la longitud de paso óptico b (en cm) a través de la solución y la
concentración c (moles/l) del soluto absorbente de la solución en la siguiente forma:
A = log I/Io = ε·b·c
Donde ε es la absortividad molar, característica de la especie absorbente y función de la
longitud de onda de la luz. Al término -log I/Io se lo denomina absorbancia, A, entonces
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A= ε b c ó A= a b c
La expresión anterior, es la forma más conveniente de la ley de Beer para fines analíticos,
pues la absorbancia es directamente proporcional a la concentración del analito absorbente de
interés (a mayor número de moléculas mayor interacción de la luz con ellas) cuando la
absortividad y el camino óptico se mantienen constantes.; también depende de la distancia
que recorre la luz por la solución –a igual concentración, cuanto mayor distancia recorre la luz
por la muestra más moléculas se encontrará. Como A es adimensional, las dimensiones de ε
dependen de las de b y c. La segunda magnitud (b) se expresa siempre en cm mientras que la
primera (c) se hace, siempre que sea posible, en M, con lo que las dimensiones de ε resultan
ser M-1·cm-1. Este coeficiente así expresado, en términos de unidades de concentración molar
(o un submúltiplo apropiado), se denomina coeficiente de extinción molar (εM). Cuando, por
desconocerse el peso molecular del soluto, la concentración de la disolución se expresa en
otras unidades distintas de M, por ejemplo g·L-1, las dimensiones de ε resultan ser distintas,
por ejemplo g-1·L·cm-1, y al coeficiente así expresado se denomina coeficiente de extinción
específico (εs).
La ley de Lambert-Beer se cumple para soluciones diluidas; para valores de c altos, ε varía con
la concentración, debido a fenómenos de dispersión de la luz, agregación de moléculas,
cambios del medio, etc.
En el proceso de una determinación fotométrica, uno de los aspectos más importantes es la
selección de la longitud de onda apropiada para las mediciones de absorbancias. Esta selección
se realiza sobre una curva obtenida con la absorbancia de una solución del analito
(cromóforo) investigado, obtenida a varías longitudes de onda, es decir una curva de la A
(ordenadas) en función de λ (abscisas). La gráfica así obtenida se designa como el espectro de
absorción del analito. A
partir del espectro de
absorción se obtendrá el
valor de λ al que el
compuesto presenta la
mayor absorbancia
(λmax). Dicho λ se
utilizará a la hora de
Figura 5: Espectro de absorción del permanganato de potasio a diferentes concentraciones
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hacer determinaciones cualitativas y cuantitativas del compuesto. El espectro de absorción de
un cromóforo depende, fundamentalmente, de la estructura química de la molécula. No
obstante, hay una gran cantidad de factores que originan variaciones en los valores de λmax y
εM, entre los que se incluye el pH, la polaridad del solvente o moléculas vecinas y la
orientación de los cromóforos vecinos; y cada uno afecta de forma particular. Por ejemplo,
variaciones originadas por cambios de pH son debidas al efecto de éste sobre la ionización del
compuesto.
Una técnica experimental de amplia difusión en espectrofotometría visible es el uso de una
curva de calibrado. Para su construcción se preparan soluciones de un compuesto de
diferentes concentraciones del mismo, determinándose para cada una de ellas el valor de
absorbancia a λmax. Estos valores de absorbancia se representan en el eje de abscisas (eje de
x) y los de concentración en el eje de ordenadas (eje de y). Se observará que, a bajas
concentraciones, el aumento de concentración se corresponde con un incremento lineal en la
absorbancia (zona de cumplimiento de la ley de Lambert-Beer). A concentraciones altas la
linealidad se pierde y se observa que la línea se aplana, por lo que las medidas son poco
fiables.
La representación de Lambert-Beer, A = ε·b·c, nos permitirá calcular el valor del coeficiente de
extinción molar, que corresponde a la pendiente de la recta. A continuación se mide la
absorbancia de la solución problema y la concentración de la especie absorbente se lee en la
curva de calibrado. Si el sistema en estudio cumple con la ley de Beer la curva de calibrado será
una línea recta que pasa por el origen . Sin embargo en la práctica, la línea es recta sólo hasta
un cierto límite de concentración, y después de este aparecen desviaciones de la ley causadas
por factores tanto químicos como instrumentales. Si las desviaciones de la curva no son
considerables, las determinaciones cuantitativas son factibles.
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1. Trazado de la curva espectral (Espectro de absorción del compuesto).
1.a. Preparar a partir de una droga patrón una solución del componente que se desea
determinar en una concentración estipulada y trazar la curva espectral, realizando para ello
una serie de medidas de absorbancia a distintas longitudes de onda y [c] constante.
Prender el equipo y dejar estabilizar.
Seleccionar la longitud de onda.
Ajustar 100 % T o 0 % A con el Blanco de reactivos.
Reemplazar el blanco por la muestra y leer absorbancia.
Seleccionar una nueva longitud de onda y repetir las operaciones.
1.b construcción de la curva espectral graficando: Absorbancia vs longitud de onda y
seleccionar aquella donde la A sea máxima. Se logra así máxima sensibilidad y
reproducibilidad.
2. Curva de calibración Absorbancia vs Concentración
Seleccionar la longitud de onda de máxima absorbancia obtenida en la curva espectral.
Preparar una soluciones patrones de concentraciones crecientes y perfectamente
conocidas en el componente determinar
Medir la absorbancia de la muestra problema.
Graficar Absorbancia vs concentración.
Si la sustancia cumple con la Ley el gráfico será una recta y será posible sacar un factor ya que
la pendiente de la recta será la misma en todos los puntos. Así se podrá calcular la
concentración de la muestra problema.
Si la sustancia no cumple la Ley, el gráfico será una curva y se extrapolará dentro de un
rango apropiado para calcular el valor de la muestra problema.
Instrumentación para la medición de absorbancias de la luz visible y ultravioleta:
espectrofotómetro UV-visible
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La medición de absorbancia de la luz por las moléculas se realiza en unos aparatos llamados
espectrofotómetros. Aunque pueden variar en diseño, en especial con la incorporación de
ordenadores para el análisis de datos, todos los espectrofotómetros constan:
1. Una fuente de energía radiante: lámpara de deuterio y tungsteno.
2. Un monocromador para la selección de radiaciones de una determinada longitud de onda:
filtros, prismas, redes de difracción.
3. Un compartimento donde se aloja un recipiente transparente (cubetas o tubos) que
contenga la muestra Pueden ser de vidrio, cuarzo o plástico transparente. Para medir en UV se
deben usar las de cuarzo o sílice fundido, porque el vidrio no transmite la radiación UV.
4. Un detector de luz y un amplificador convertidor de las señales luminosas en señales
eléctricas.
5. Un registrador o sistema de lectura de datos.
Desde el punto de vista operativo, el primer paso es seleccionar la fuente de luz y longitud de
onda a la que se va a realizar la medida. Hay espectrofotómetros de un solo haz (con una sola
celdilla para alojar la cubeta con la muestra) y de doble haz (con dos celdillas para dos
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cubetas); en nuestro caso se trabajará con los de un solo haz. Se mide primero la absorbancia
del disolvente (conocido como blanco) y al que se le asigna el valor de cero mediante el ajuste
del mando, de forma que la intensidad incidente y transmitida sean iguales (Io = It), y por tanto
la absorbancia es cero. A continuación se pone en la celdilla la cubeta con la muestra y se lee la
absorbancia de ésta.
Calibración del espectrofotómetro
Prender el equipo llevando la llave hacia arriba. Esperar 15 minutos para que los
circuitos alcancen temperatura.
Elegir la longitud de onda deseada con el selector.
Verificar 0% de T. Se realiza en modo transmitancia y colocando un cuerpo negro en
reemplazo del tubo
Ajustar con el blanco el 0% de absorbancia trabajando con la tapa cerrada.
Reemplazar el blanco de reactivos por la muestra a analizar y leer el valor
correspondiente de absorbancia.
PARTE EXPERIMENTAL
1- Espectro de absorción de solución de DICROMATO DE POTASIO para determinar la longitud
de onda a la cual presenta su máxima absorción.
Preparar solución 0,5 x10-3 M
Llevar a cero con agua antes de realizar cada lectura. Medir las absorbancias a distintas
longitudes de onda, con intervalos de 20 nm, desde 340 nm hasta 600 nm.
Graficar curva de absorbancia versus longitud de onda.
Observar cuál es la longitud de onda de mayor absorción que se utilizará para realizar
la curva de calibración y determinar la concentración de una muestra problema.
2- Confección de la curva absorbancia versus concentración:
A partir de la solución patrón realizar cinco diluciones: 1/2; 1/4; 1/6; 1/8; 1/10; 1/20
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Medir sus absorbancias a la longitud de onda determinada anteriormente y graficar
absorbancia versus concentración.
3- Determinar si cumple o no con la ley de Lambert y Beer.
4- Determinar con la gráfica anterior la concentración de la muestra problema.
Problemas de entrega obligatoria (individual).
1- Al realizar un espectro de absorción de proteínas, se encontraron las siguientes
absorbancias:
Longitud de onda (nm) Abs
240 0,100
250 0,099
260 0,170
270 0,245
280 0,290
290 0,198
300 0,171
310 0,115
Graficar y determinar la longitud de onda que utilizaría para medir proteínas. Justificar.
2- En una muestra de suelo se determinó nitritos por un método colorimétrico. La
absorbancia de la muestra a 540 nm fue de 0,52. En la curva de calibración se
encontraron los siguientes valores:
Absorbancia Concentración ( ug/ ml)
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0,23 0,20
0,47 0,40
0,65 0,60
0,90 0,80
Determinar la concentración de nitritos en la muestra. ¿Es posible sacar un factor para
determinar nitritos en próximas muestras? Justificar.
Bibliografía
Holme, D.J. Peck H. Espectroscopía en: “Bioquímica Analítica”. Teoría y práctica de
las técnicas espectroscópicas Zaragoza , España. Editorial Acribia. 2007: p.34-83.
Skoog D., West D.Fundamentos de química analítica. 8°ed. Thomson. México.2005:
p.719-728.