Caracterización del perfil proteico de una cepa...
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Universidad de Granada Instituto de Biotecnología Trabajo de investigación tutelada para la obtención del título: “Máster en Biotecnología” Caracterización del perfil proteico de una cepa entomopatógena de Bacillus pumilus. Diana Carolina García Ramón Julio de 2011
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Universidad de Granada Instituto de Biotecnología
Trabajo de investigación tutelada para la obtención del título:
“Máster en Biotecnología”
Caracterización del perfil proteico de una cepa
entomopatógena de Bacillus pumilus.
Diana Carolina García Ramón
Julio de 2011
Universidad de Granada Instituto de Biotecnología
Trabajo de investigación tutelada para la obtención del título:
“Máster en Biotecnología”
Caracterización del perfil proteico de una cepa entomopatógena
de Bacillus pumilus.
Diana Carolina García Ramón
Julio de 2011
Tutora: Co-Tutor:
Dra. Susana Vílchez Tornero Dr. Antonio Osuna Carrillo de Albornoz
Profesora Contratada Doctor Catedrático Universidad de Granada
Departamento de Bioquímica Departamento de Parasitología
Instituto de Biotecnología Universidad de Granada
Universidad de Granada
Parte de los resultados de este trabajo de investigación han sido presentados en
el Congreso 13th European Meeting of the IOBC/WPRS Working Groups,
mediante presentación oral, con el título: “Understanding the toxicity of Bacillus
pumilus 15.1 toward the Mediterranean fruit fly (Ceratitis capitata)”.
Lugar de celebración: Innsbruck Austria
Fecha: 19-23 Junio 2011
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AGRADECIMIENTOS
Primero quiero agradecer a la SENESCYT-ECUADOR, por la concesión de mi beca y al
auspicio de la Escuela Politécnica del Ejército (Ecuador) que han permitido la realización
de mis estudios de postgrado en la Universidad de Granada.
A mi tutora, Dra. Susana Vílchez Tornero un gracias sincero por haberme dado la
oportunidad de realizar este trabajo de investigación, gracias por el tiempo dedicado a este
proyecto y por la enseñanza y orientación brindada en la realización del mismo, sin ella,
esto no hubiese sido posible. Así mismo tengo que agradecer a mi co-Tutor, Dr. Antonio
Osuna, por sus consejos y apertura al trabajo que realizo. A los dos, mil gracias por creer en
mí y permitirme ser parte de este grupo de investigación.
A mis compañeros de laboratorio, en especial a esas personas que han sabido darme su
apoyo cuando lo he necesitado, gracias por brindarme su mano amiga y hacer que mi
estancia aquí sea más fácil. Quiero nombrar a mi grupo de trabajo: Alfonso, Juanfran, Tania
y Alejandra, gracias por compartir este proyecto, por su ayuda y sus consejos.
Las gracias mayores se las debo a mis padres, Nancy y Pepe, no tengo palabras para
decirles lo agradecida que estoy por brindarme todo su amor, por apoyar mis decisiones
(aunque eso nos cueste la distancia) y por sacrificar tantas cosas por mí. Gracias papitos por
enseñarme a luchar por lo que quiero. A mis hermanas Gaby y Josesita y mis sobrinas
Paulita y Samy, por su amor, su apoyo y su confianza. Gracias familia por ser el eje de mi
vida, por darme las fuerzas que necesito cuando he sentido flaquear y por su apoyo
constante a pesar de la distancia. Porque los siento a mi lado todos los días…
Un gracias especial a Víctor, por tener siempre las palabras adecuadas, por no soltar mi
mano y caminar junto a mí. Las cosas a tu lado son más fáciles.
Gracias totales a MI GENTE por estar siempre conmigo.
Diana
ÍNDICE
AGRADECIMIENTOS .......................................................................................................... I
ÍNDICE ..................................................................................................................................V
RESUMEN ............................................................................................................................. 1
ABREVIATURAS ................................................................................................................. 5
1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................ 9
1.1 Microorganismos entomopatógenos ............................................................................. 11 1.2 Bacterias entomopatógenas .......................................................................................... 13
1.2.1 El género Bacillus ................................................................................................ 14
1.2.2 Bacillus thuringiensis ........................................................................................... 15
1.2.2.1 Factores de Virulencia: Toxinas Cry y Cyt .................................................... 17
1.2.2.2 Otros factores de virulencia ........................................................................... 19
1.2.2.3 Aplicaciones biotecnológicas ........................................................................ 21
1.3 Bacillus pumilus .......................................................................................................... 22
1.3.1 Biología ............................................................................................................... 22
1.3.2 Aplicaciones Biotecnológicas ............................................................................... 24
1.3.2.1 Producción de Enzimas ................................................................................. 24
1.3.2.2 Producción de Antibióticos ........................................................................... 26
1.3.2.3 Control Biológico ......................................................................................... 27 1.3.2.3.1 Control de Hongos y Bacterias en plantas .............................................. 27
1.3.2.3.2 Control de Insectos ................................................................................ 30
1.3.2.4 Otras Aplicaciones ........................................................................................ 32
1.4 Bacillus pumilus 15.1................................................................................................... 32
2. OBJETIVOS ................................................................................................................... 37
3. MATERIALES Y MÉTODOS ....................................................................................... 43
3.1 Condiciones de cultivo de cepas bacterianas ................................................................. 45
3.1.1 Cepas bacterianas y su conservación ..................................................................... 45
3.1.2 Medios de cultivo ................................................................................................. 46 3.1.2.1 Medio rico .................................................................................................... 46
3.1.2.2 Medio de esporulación .................................................................................. 46
3.1.3 Condiciones de cultivo ......................................................................................... 47
3.2 Análisis de proteínas .................................................................................................... 47
3.2.1 Tratamiento de muestras proteicas ........................................................................ 47
3.2.2 Electroforesis de proteínas. SDS-PAGE ................................................................ 49
3.2.3 Separación de Proteínas mediante Gradiente de Sacarosa ...................................... 50
3.2.4 Microscopía ......................................................................................................... 51
3.2.4.1 Microscopía óptica ....................................................................................... 51
3.2.4.2 Microscopía electrónica de transmisión ......................................................... 52
3.2.5 Inmunoblots ......................................................................................................... 52
3.2.6 Solubilización de Proteínas ................................................................................... 54
3.2.7 Análisis e identificación de proteínas por MALDI-TOF......................................... 56
3.2.8 Bioensayos con C. capitata .................................................................................. 56
3.2.8.1 Mantenimiento de la Colonia de moscas de la fruta del Mediterráneo ............. 56
3.2.8.2 Bioensayos con larvas ................................................................................... 58
4. RESULTADOS ............................................................................................................... 63
4.1 Perfil proteico de la cepa B. pumilus 15.1 ..................................................................... 65
4.1.1 Perfil proteico de un cultivo vegetativo ................................................................. 66
4.1.2 Perfil proteico de un cultivo esporulado ................................................................ 67 4.2 Separación de proteínas mediante Gradientes de Sacarosa............................................. 70
4.3 Observación de B. pumilus 15.1 mediante microscopía ................................................. 79
4.4 Análisis de las fracciones de un cultivo de B. pumilus 15.1 mediante Inmunoblot .......... 85
4.5 Solubilización de proteínas ........................................................................................... 88
4.6 Identificación de proteínas mediante análisis de huella peptídica o finger printing. ........ 92
4.7 Actividad de las proteínas aisladas en los gradientes de sacarosa frente larvas de C.
capitata ............................................................................................................................. 95
5. DISCUSIÓN .................................................................................................................... 99
6. CONCLUSIONES ........................................................................................................ 109
7. TRABAJO FUTURO .................................................................................................... 115
8. BIBLIOGRAFÍA .......................................................................................................... 121
ANEXOS ............................................................................................................................ 141
Análisis e identificación de proteínas por MALDI-TOF .................................................... 143
Proteína de 37 kDa ...................................................................................................... 143
Proteína de 17 kDa ...................................................................................................... 144
Proteína de 45 kDa ...................................................................................................... 145
Proteína de 60 kDa ...................................................................................................... 146
Proteína de 250 kDa .................................................................................................... 147
1
RESUMEN
Nuestro grupo de investigación ha descrito el aislamiento de la cepa Bacillus
pumilus 15.1 como una cepa entomopatógena, activa frente a larvas de la
mosca de la fruta del Mediterráneo (Ceratitis capitata). No se conoce el
factor o factores de virulencia de esta cepa, pero la evidencia de nuestro
grupo sugiere que probablemente sea de origen proteico. Aquí radica el
interés de caracterizar el perfil proteico de la cepa.
En este trabajo se presentan el perfil proteico de la cepa B. pumilus 15.1,
tanto en fase vegetativa como en fase de esporulación bajo condiciones de
cultivo donde la cepa ha mostrado actividad frente a larvas de C. capitata.
Además se realizó la comparación del perfil proteico de la cepa silvestre con
una cepa curada de plásmidos y con una cepa control M1 de la misma
especie.
El perfil proteico de la cepa no mostró diferencias significativas cuando el
cultivo fue sometido al tratamiento con frio durante 96 horas a 4 ºC con
respecto a los cultivos sin tratamiento, ni tampoco entre la cepa silvestre y la
curada de plásmidos. La técnica de gradiente de sacarosa permitió separar
proteínas insolubles excretadas durante la fase de esporulación de la cepa.
Las proteínas mayoritarias fueron analizadas mediante técnica de huella
peptídica y MS-MS y dos de ellas (17 kDa y 45 kDa) bioensayadas de
manera individual frente a larvas de C. capitata. Los resultados de los
bioensayos indicaron que las proteínas no son tóxicas en las condiciones
ensayadas en este trabajo. No hemos relacionado ninguna de las proteínas
mayoritarias como responsables de la muerte de las larvas de C. capitata.
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3
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5
ABREVIATURAS
(p/p) Relación peso/peso
(p/v) Relación peso/volumen
(v/v) Relación volumen/volumen
~ aproximado
°C Grados Celcius
µg Micro gramos
µL Micro litros
µm Micro metro
16S Molécula de ARNr de la subunidad menor del ribosoma de
procariotas
ADN Acido desoxirribonucleico
APS Persulfato amónico
ARN Acido ribonucleico
ARNr ARN ribosómico
ATP Adenosín trifosfato
Bt. Bacillus thuringiensis
cm Centímetro
Cry Proteína formadora de cristal, del inglés Crystal protein
Cyt Proteína citolítica, del inglés Cytolitic protein
Da Daltons
DNAsa Desoxirribonucleasa
DTT Ditriotreitol
EDTA Ácido Etilendiaminotetraacetico
g Gramos
H2O2 Peróxido de hidrógeno
HCl Ácido clorhídrico
K2MnO4 Manganato de potasio
kb Kilo bases
6
kDa Kilo Daltons
L Litro
M Concentración molar
mA Mili amperios
mg Mili gramos
mL Mili litros
mm Mili metros
mM Mili Molar
MS - MS Método de fragmentación de péptidos en espectrometría de masas
PBS Tampón Fosfato salino
pH Potencial de Hidrógeno
PMSF Fluoruro de fenilmetilsulfonilo
ARNasa Ribonucleasa
rpm Revoluciones por minuto
SDS Dodecil sulfato sódico
SDS-PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida con Dodecilsultafo sódico
TEMED N, N, N’, N’-tetrametiletilenodiamina
UFC Unidades formadoras de colonias
V Voltios
Vh Voltaje de hall
W Watt o Vatio
x g Fuerza relativa de centrifugación, del inglés Relative Centrifugal
Force (RCF)
7
8
9
1. INTRODUCCIÓN
10
Introducción
11
1.1 Microorganismos entomopatógenos
Los insectos son el grupo más diverso de animales sobre la tierra, con más de
un millón de especies descritas, y cuya diversidad y adaptación a los
ambientes los han convertido en hospederos o fuente de alimento de muchos
parásitos (Bode 2009). Los microorganismos entomopatógenos son
microorganismos parasíticos que causan la muerte al insecto huésped y
posteriormente son dispersados por el agua, viento u otros insectos (Nicholls-
Estrada 2008). Representan una alternativa sostenible de control a largo plazo
comparados con los productos químicos cuyo espectro de especificidad es
muy bajo y por lo general son de larga acción residual.
Estos microorganismos han sido utilizados para el control biológico de plagas
y vectores, reduciendo una población de plaga específica, con el objeto de
que sea menos abundante y por lo tanto menos perjudicial.
Se considera que un entomopatógeno es exitoso cuando sus niveles de
infectividad, virulencia, patogenicidad, capacidad para sobrevivir, capacidad
de dispersase y su capacidad reproductiva son altos (Nicholls-Estrada 2008).
Los grupos más importantes de entomopatógenos son: bacterias, virus,
hongos, nemátodos y protozoos. Los principales microorganismos
entomopatógenos que han sido utilizados exitosamente para el control de
plagas se muestran en la Tabla 1.1.
12
Tabla 1.1 Principales microorganismos entomopatógenos desarrollados y utilizados
como agente de control biológico.
Entomopatógeno Plaga principal
Virus
Baculovirus
Virus de la poliedrosis nuclear Larvas de lepidópteros, larvas de
Hymenoptera (Tenthredinidae)
Virus de la granulosis Larvas de lepidópteros
Virus no ocluido (Oryctes) Larvas de Scarabaeidae
Virus de la poliedrosis citoplásmica Larvas de lepidópteros
Entomopoxvirus Orthoptera, larvas de Scarabaeidae
Inidovirus Mosquitos
Bacterias
Bacillus popilliae Larvas de Scarabaeidae
Bt. var. thuringiensis Larvas de lepidópteros
Bt. var. israelensis Larvas de mosquitos y otros dípteros
Bacillus sphaericus Larvas de coleópteros y mosquitos
Hongos
Mastigomycotina
Coelomomyces spp. Larvas de mosquito
Lagenidium giganteum Larvas de mosquito
Zygomycotina
Entomophthoraceous Áfidos, larvas de lepidópteros,
coleópteros, Orthoptera
Deuteromycotina
Beauveria bassiana Larvas de coleópteros, lepidópteros,
Orthoptera
Metarhizium anisopliae Larvas de coleópteros, cicadélidos,
cercopidos, cucarachas
Verticillium lecanii Áfidos, moscas blancas
Microsporidia
Nosema spp. Orthoptera, larva de mosquito,
coleoptera
Vairimorpha necatrix Larvas de lepidopteros
Nematodos
Mermithidae Larvas de mosquito
Steinernematidae y
Heterorhabditidae
Larvas de lepidópteros, larvas de
coleópteros y Gryllotalpidae
Fuente: Adaptado de (Nicholls-Estrada 2008).
Introducción
13
1.2 Bacterias entomopatógenas
Los insectos normalmente contienen un gran número de bacterias. La
mayoría son saprofitas y comensales, y algunas son simbióticas.
Relativamente pocas especies bacterianas han sido descritas como patógenas
de insectos, sin embargo estas han recibido gran atención debido a su
potencial para el control de plagas en la agricultura y el control de vectores
en enfermedades (van Emden and Service 2004).
Más de 90 especies de bacterias entomopatógenas han sido aisladas de
insectos, plantas y suelo, pero sólo unas pocas se han estudiando
intensivamente (Nicholls-Estrada 2008). Algunos miembros de la familia
Enterobacteriaceae son reconocidos como especies muy patógenas para
insectos (Priest 2000), entre las que se encuentra Serratia entomophila,
causante de la muerte del escarabajo de pastizal en Nueva Zelanda y que
destaca por ser la bacteria no esporulante que provoca mayor mortalidad
(Jackson et al. 1992). Otras especies de Enterobacteriaceae con actividad
entomopatógena incluyen a Photorhabdus luminescens, Xenorhabdus
nematophilus (Forst and Nealson 1996), y Yersinia enterocolitica (Bresolin et
al. 2006).
Fuera de esta familia, otras de las bacterias entomopatógenas son:
Pseudomonas entomophila (Grimont et al. 1988), Erwinia carotovora
(Basset et al. 2000) y Dickeya dadantii (Grenier et al. 2006).
Las bacterias entomopatógenas más conocidas y utilizadas son las
formadoras de esporas de la familia Bacillaceae, en especial algunas especies
del género Bacillus (Priest 2000; Nicholls-Estrada 2008). El interés por este
género bacteriano se debe a la aptitud de sus cepas para ser tratadas
14
industrialmente para la producción masiva y la aplicación en el campo como
insecticida microbiológico (van Emden and Service 2004).
1.2.1 El género Bacillus
Son bacterias Gram-positivas, buenas secretoras de proteínas y metabolitos,
fáciles de cultivar y altamente eficientes para el control de plagas y
enfermedades (Berg and Hallmann 2006). Poseen una morfología alargada
simulando un bastón, son aerobias estrictas o anaerobias facultativas, ubicuas
en la naturaleza; incluyen especies de vida libre, patógenas y varias especies
que forman parte natural de la flora intestinal humana (Todar 2006).
Una característica particular de este género es su habilidad para formar
endosporas bajo condiciones de estrés físico o químico, lo que le permite
sobrevivir y permanecer metabólicamente activas por largos períodos de
tiempo (Errington 2010), haciéndolos apropiados para la formulación de
productos viables y estables para el control biológico.
Existen otras bacterias capaces de producir endosporas, entre estas, bacterias
pertenecientes a los géneros Clostridium, Sporosarcina, Sporohalobacter,
Sporolactobacillus, Anaerobacter, Desulfotomaculum, Helicobacterium y
Heliophilum (Nicholson et al. 2000), siendo los más estudiados Bacillus y
Clostridium (Nicholson et al. 2000; Moller and Hederstedt 2006).
El género Bacillus ha cobrado importancia por su producción de toxinas, las
cuales pueden lisar eritrocitos de diferentes especies animales (hemolisinas) o
tener propiedades patógenas frente a insectos (Hoult and Tuxford 1991).
Las bacterias entomopatógenas pertenecientes a este género son agentes
naturales de control biológico de plagas de insectos y han sido utilizadas
como base de varios insecticidas biológicos comerciales. Las especies más
Introducción
15
relevantes son: B. thuringiensis que forma un cuerpo paraesporal tóxico para
insectos (Smirnova et al. 1996; Bravo 1997), Lysinibacillus sphaericus
(Ahmed et al. 2007; Jones et al. 2007), B. laterosporus (Shida et al. 1996),
Paenibacillus larvae (Evans 2004), P. lentimorbis, y P. popilliae (El-Borai et
al. 2005). Sin embargo, B. thuringiensis es la especie más usada en
programas a gran escala y de la que se tiene más conocimiento científico.
Coincidiendo con la esporulación, estas bacterias son capaces de formar
inclusiones cristalinas paraesporales, que muchas veces son las que contienen
una o más proteínas insecticidas. Estas proteínas son tóxicas para los insectos
por ingestión, cuya acción generalmente es sobre las células del epitelio del
intestino medio (de Maagd et al. 2003).
La ubicuidad en la naturaleza, la formación y resistencia de sus endosporas,
la producción de antibióticos, la toxicidad de sus esporas, y la producción de
cristales proteicos tóxicos para varios ordenes de insectos hacen del género
Bacillus importante en la medicina, la agricultura, la bioquímica y en la
empresa farmacéutica (Todar 2006).
1.2.2 Bacillus thuringiensis
Es una bacteria aerobia estricta, flagelada, esporulante y ubicua. Ha sido
aislada de todas partes del mundo y de muy diversos sitios como suelo
(Martin and Travers 1989; Carozzi et al. 1991), agua (Iriarte et al. 2000),
partes de plantas (Kaelin et al. 1994; Cinar et al. 2008), insectos muertos
(Carozzi et al. 1991; Kaelin et al. 1994) y granos almacenados (Schnepf et al.
1998); incluso ha sido aislado del intestino de pequeños roedores del orden
Rodentia e Insectivora (Swiecicka et al. 2002). Las cepas aisladas han
mostrado alto grado de especificidad frente a diferentes órdenes de insectos
16
como Lepidóptera, Díptera, Coleóptera, Himenóptera, Homóptera, Ortóptera,
Phthiraptera o Mallophaga y Acari; y en otros invertebrados como
Nemathelminthes, Platyhelminthes, y Sarcomastigorphora (Bravo 1997; de
Maagd et al. 2003).
Durante su ciclo de vida presenta dos fases principales, el crecimiento
vegetativo en el cual se duplica por bipartición y la fase de esporulación en la
cual la bacteria se diferencia en endospora (Itoua-Apoyolo et al. 1995). La
endospora se desarrolla en un esporangio formado por la célula madre y la
espora. Las proteínas insecticidas se acumulan en la célula madre durante el
proceso de esporulación. La fase de esporulación consta de siete estadios, los
cuales se inician cuando hay limitación de nutrientes y se cierra en la fase
lítica, en donde la endospora se lisa y tanto la exospora como los cristales son
liberados (Bravo et al. 1992; Soberon and Bravo 2009).
Los cristales paraesporales están constituidos fundamentalmente de proteínas
llamadas δ-endotoxinas. Varios factores condicionan la cristalización de las
δ-endotoxinas, entre estos están su estructura secundaria, la formación de
puentes disulfuro entre residuos cisteína y la presencia de componentes
adicionales en el cristal. Además, los mecanismos de cristalización pueden
variar entre las distintas δ-endotoxinas (Agaisse and Lereclus 1995; Baum
and Malvar 1995).
La morfología que adquieren los cristales puede ser muy diversa y
normalmente se la relaciona con el tipo de δ-endotoxina que lo componen. Se
han reportado cristales romboides, bipiramidales, heterogéneos (en una
misma cepa), esféricos, irregulares/amorfo y cúbicos (ver Figura 1.1).
Introducción
17
A B C
D EF
F
Figura 1.1 Diferente morfología de cristales paraesporales: romboides (A),
bipiramidales (B), heterogéneos (C) (Kaelin et al. 1994), esféricos (D), irregulares (E)
(Karamanlidou et al. 1991) y cúbicos (F) (Ramalakshmi and Udayasuriyan 2010).
1.2.2.1 Factores de Virulencia: Toxinas Cry y Cyt
El grupo de las δ-endotoxina está compuesto por dos grupos de proteínas que
no presentan homología de secuencia ni de estructura terciaria entre sí: las
proteínas Cry (del inglés “Crystal”) y las proteínas Cyt (del inglés
“Cytolitic”). Hasta la fecha se han clonado y secuenciado 572 genes cry
diferentes y 35 genes cyt (Crickmore et al. 2011).
Cada δ-endotoxina presenta un espectro de actividad insecticida
característico, con un rango de acción limitado a pocas especies,
generalmente de un mismo orden. Este espectro puede depender de la
combinación de δ-endotoxina que la cepa produzca. Se han descrito una gran
cantidad de combinaciones de genes de δ-endotoxinas, siendo las más
18
comunes de la familia cry1 y cry2 (Porcar and Juarez-Perez 2003) o la
combinación cry4, cry10, cry11, cyt1 y cyt2 (Berry et al. 2002). Estas
combinaciones se deben principalmente a que estos genes están situados en
plásmidos transmisibles por conjugación entre cepas y en general estas
secuencias se encuentran flanqueadas por elementos transponibles,
posibilitando la transmisión horizontal (Schnepf et al. 1998; de Maagd et al.
2001). Estas toxinas no son exclusivas de Bt, también han sido descritas en
otras bacterias esporulantes (Crickmore et al. 2011).
La principal diferencia entre las endotoxinas Cry y Cyt, es que las
endotoxinas Cry usan α-hélices para provocar poros en la membrana y las
endotoxinas Cyt utilizan láminas β (Bravo et al. 2007). La estructura de las
toxinas Cry es globular y presenta 3 dominios. Un prerrequisito para su
toxicidad insecticida es la unión a receptores de membrana,
fundamentalmente de tipo Aminopeptidasa N (APN) y proteínas similares a
Caderina (Li et al. 2001). Las toxinas Cyt tienen un único dominio, la
proteína receptora no ha sido identificada, pero se sabe que se insertan
rápidamente en membranas que contienen fosfolípidos con una cadena de
ácido graso no saturada en posición syn-2 (Schnepf et al. 1998; Li et al.
2001).
El mecanismo de acción de estas toxinas es un proceso complejo desarrollado
en varias etapas. Primero el insecto debe ingerir las bacterias, cuando esta
llega al intestino medio, las condiciones posibilitan la solubilización de los
cristales y la liberación de las protoxinas. Un factor determinante en esta
etapa es el pH; si el pH del lumen intestinal no es el adecuado los cristales no
se solubilizarán y por tanto no ejercerán su actividad (Bravo et al. 2007). Las
protoxinas liberadas al lumen intestinal no son tóxicas por sí misma, deben
ser activadas por la acción de enzimas proteolíticas del insecto. Las toxinas
activadas atraviesan la membrana peritrófica y alcanzan la pared intestinal
Introducción
19
donde causan la lisis osmótica de las células epiteliales. No obstante, el
mecanismo para realizar esta última fase difiere entre las toxinas Cry y Cyt.
Las toxinas Cry una vez activadas, se unen por su extremo C-terminal a una
caderina en el extremo apical de la membrana de las células epiteliales del
intestino, se produce una escisión de 28 residuos aminoacídicos del extremo
N-terminal y se establece una forma pre-poro, que incrementa su afinidad por
un receptor secundario que puede ser aminopeptidasa N o fosfatasa alcalina.
Esta última unión facilita la formación del poro en el epitelio intestinal,
provocando un desequilibrio osmótico y la posterior lisis celular (Bravo et al.
2004).
En cambio, las toxinas Cyt no precisan receptores proteicos, interactúan
directamente y de forma poco específica con la fracción lipídica de la
membrana. Para esto se han propuesto dos modos de acción: A) modelo de
formación de poro, en el cual las toxinas Cyt se insertan en la membrana
como monómeros y cuando alcanzan cierta densidad, éstos se oligomerizan
conformando poros de membrana (Promdonkoy and Ellar 2003) ; y B)
modelo de acción tipo detergente, en el cual las toxinas Cyt se agregan de
manera poco específica sobre la superficie de la membrana plasmática
alterando su estructura o destruyéndola, de forma similar a la acción de un
detergente (Butko 2003).
El resultado de todo este proceso es la muerte del insecto producida por
inanición y/o septicemia (Schnepf et al. 1998).
1.2.2.2 Otros factores de virulencia
Se conoce que Bt ha desarrollado un amplio arsenal de compuestos tóxicos,
algunos específicos contra insectos e invertebrados como es el caso de las δ-
20
endotoxinas, pero también se han reportado otros factores de virulencia, que
actúan solos o activando la acción de las δ-endotoxinas dependiendo de la
cepa bacteriana.
Se ha visto un efecto sinérgico entre las esporas y las δ-endotoxinas de
algunas cepas (Johnson and McGaughey 1996). El mecanismo por el cual la
espora tiene efecto potenciador no es bien conocido, pero se sabe que no solo
depende de la germinación de la espora sino también de las proteínas
presentes en su cubierta (Johnson et al. 1998).
Existen compuestos extracelulares tóxicos que pueden ser producidos antes
de la esporulación:
β-exotoxinas, conocidas como thuringiensina, se producen y son excretadas
al medio en la fase vegetativa de la bacteria. Son toxinas insecticidas
termoestables, solubles en agua y dializables. Es un análogo nucleotídico de
ADN a la cual se le atribuye acción insecticida sobre Lepidópteros, Dípteros,
Coleópteros, Hemípteros, además de ácaros, nematodos, protozoarios y
platelmintos (Hernandez et al. 2003). Se cree que la toxicidad de este
compuesto se debe a la inhibición de la enzima ARN polimerasa dirigida por
ADN, ya que la β-exotoxina podría competir con el ATP (Levinson et al.
1990). Su gran similitud con Adenosin monofosfato hace que esta toxina
muestre propiedades toxicas de amplio espectro, incluso sobre el hombre. Es
por esto, que el uso de cepas productoras de β-exotoxina están prohibidos en
la mayoría de los países (Joung and Côté 2000).
Las proteínas Vip, del inglés “vegetative insecticidal proteins”, son
sintetizadas y secretadas al medio en la fase de crecimiento vegetativo. Se
han descrito 3 grupos, Vip1, Vip2 y Vip3 que muestran actividad sobre
algunos lepidópteros y coleópteros (de Maagd et al. 2003).
Introducción
21
Además existen otros factores como fosfolipasas, proteasas, quitinasas y
exotoxinas alfa y gama (consideradas como fosfolipasa C y lecitina,
respectivamente). Se cree que todos estos factores ayudan a la bacteria en la
invasión del insecto.
1.2.2.3 Aplicaciones biotecnológicas
Bacillus thuringiensis es el insecticida biológico más utilizado
comercialmente, su uso tradicional ha sido el control de insectos plagas en la
agricultura y de mosquitos vectores de enfermedades como la malaria y el
dengue (Soberon et al. 2009). En el año 2007, se estimó que los productos de
Bt constituían alrededor de un 80% del mercado de bioinsecticidas, sin
embargo estos productos sólo representan el 2% del mercado global de
insecticidas (Roh et al. 2007).
Como insecticida ha mostrado eficacia en la protección de cultivos y
muestras ventajas frente a los insecticidas químicos. Su éxito se debe a la
especificidad y la inocuidad para mamíferos, otros vertebrados, plantas e
inclusive otros insectos benéficos (Schnepf et al. 1998). Además, su
producción es económicamente competitiva mediante el uso de
fermentadores a gran escala.
El conocimiento de las bases genéticas de la toxicidad de Bt, así como la
utilización de diferentes técnicas de transformación genética, han permitido
desarrollar productos modificados que han puesto en el mercado nuevas
toxinas. Además se han podido generar plantas transgénicas que solucionan
la baja persistencia en el medio ambiente de los productos Bt y han permitido
dirigir la toxicidad a órganos específicos de las plantas (Zaidi et al. 2005).
22
Todas estas características, hacen de los productos basados en las toxinas de
Bt sean una herramienta útil, ventajosa y muy aplicable para el control de
plagas y vectores de enfermedades.
1.3 Bacillus pumilus
1.3.1 Biología
Bacillus pumilus fue descrita por primera vez por Meyer y Gottheil en 1901.
Es conocida también por los nombres de Bacillus aminoglucosidicus o
Bacillus mesentericus. Taxonómicamente pertenece al dominio Bacteria, filo
Firmicutes, clase Bacilli, orden Bacillales, familia Bacillaceae, género
Bacillus (Skerman et al. 1989).
Se considera como una bacteria ubicua en la naturaleza, asociada a animales
(Shehata et al. 1983; Johnson et al. 2006; Coorevits et al. 2008; Hill et al.
2009; Porwal et al. 2009), a plantas y restos vegetales (Cottyn et al. 2001;
Choudhary and Johri 2009; Asraful Islam et al. 2010), específicamente
documentada como endofítica en cultivos in vitro (Thomas 2004) y plantas
como el algodón y maíz (McInroy and Kloepper 1995), cítricos (Araujo et
al. 2002), y epifita en arroz (Cao et al. 2001). Es comúnmente aislada de una
gran variedad de fuentes ambientales: suelo (Meyers et al. 1991; Garbeva et
al. 2003); mar y sedimentos marinos (Siefert et al. 2000; Banerjee et al.
2007; Inbakandan et al. 2010); alimentos fermentados (Ouoba et al. 2004;
From et al. 2007; Meerak et al. 2008); superficies ambientales (Pirttijarvi et
al. 1996; Silva et al. 2006; Porwal et al. 2009); además en sitios poco
comunes para el aislamiento de microorganismos como en el interior de
Introducción
23
basalto del desierto de Sonora (Benardini et al. 2003) o en una aeronave
espacial (Kempf et al. 2005).
Es una bacteria Gram-positiva, esporulante, de forma bacilar, aerobia o
anaerobia facultativa, con bajo contenido en Guaninas y Citocinas en su
genoma (aproximadamente 41%). Se la considera una especie mesófila
(Coorevits et al. 2008), aunque también existen cepas que pueden ser
termófilas y alcalófilas (Moallic et al. 2006). Crece como una colonia lisa
que se torna amarilla mientras aumenta el tiempo de incubación. Es una
especie móvil (posee flagelo), β- hemolítica en agar sangre, catalasa positiva,
tolerante a las sales y susceptible a la penicilina (Tena et al. 2007; Porwal et
al. 2009).
B. pumilus tiene propiedades tóxicas, efectos citopáticos en células Vero,
actividad hemolítica, producción de lectinasa y actividad proteolítica en
caseína (Hoult and Tuxford 1991). Es considerada una bacteria no patógena
para humanos, pero debido a su producción de hemolisinas se la considera
una bacteria patógena oportunista. La infección humana por B. pumilus es
excepcional (Porwal et al. 2009). From et al. (2007) la relaciona con
incidentes de contaminación alimentaria debido a la producción de un
complejo de lipoproteínas conocidas como pumilacidinas previamente
encontradas en otros Bacillus spp. causantes de contaminación alimentaria.
Ecológicamente, B. pumilus, al igual que otras bacterias de su género,
mantiene relación endofítica con ciertas plantas, favoreciendo el crecimiento
y desarrollo, y dando protección contra otros organismos del suelos que
causan enfermedades, como hogos del género Fusarium (Benhamou et al.
1996) y Rhizoctonia (Cottyn et al. 2009).
B. pumilus al ser una especie esporulante, puede permanecer en estado de
inactividad durante largos períodos de tiempo cuando las condiciones
24
ambientales son desfavorables y luego volver a germinan y a formar una
célula vegetativa (Nicholson et al. 2000).
Sus esporas son resistentes al calor, desecación, radiación UV, radiación γ,
H2O2 y a la escasez de nutrientes. Son más resistentes que otras bacterias de
su género, pudiendo sobrevivir incluso a las prácticas de esterilización
estándar (Gioia et al. 2007).
Actualmente, se conoce el genoma completo de la cepa B. pumilus SAFR-
032 (No. de acceso al GenBank: NC_009848), las secuencias del genoma de
B. pumilus ATCC 7061 (No. de acceso al GenBank: NZ_ABRX00000000),
y las secuencias completas de tres plásmidos: B. pumilus plásmido pPZZ84
(No. de acceso al GenBank: NC_ 013534), B. pumilus ATCC 12140
plásmido pPL10 (No. de acceso al GenBank: NC_001858) y B. pumilus
ATCC 7065 plásmido pPL7065 (No. de acceso al GenBank: NC_004932) .
Esta información es una potente herramienta para la caracterización
molecular de otras cepas.
1.3.2 Aplicaciones Biotecnológicas
1.3.2.1 Producción de Enzimas
B. pumilus es utilizada a nivel industrial por la gran cantidad de enzimas que
es capaz de producir. Las primeras enzimas descritas producidas
extracelularmente por esta bacteria fueron: celulasas, liquenasas, pectato
liasas, serin proteasas, serin-metal proteasas y deoxiribonucleasa-
ribonucleasa (Priest 1977).
Las proteasas microbianas constituyen aproximadamente el 40% de la
producción mundial de todas las enzimas. El género Bacillus produce las
Introducción
25
proteasas comerciales más utilizadas en la actualidad, siendo B.
licheniformis, B. subtilis y B. pumilus las especies más conocidas a nivel
industrial por la producción de proteasas alcalinas, usadas ampliamente en la
industria alimentaria, farmacéutica, producción de detergentes y tratamiento
del cuero (Jaouadi et al. 2008; Zhang et al. 2010).
Las proteasas alcalinas de B. pumilus han sido descritas para las siguientes
aplicaciones: inactivación de ARNasas durante la purificación de ARN de
células homogenizadas, coagulación de la leche de soja, limpieza de
membranas de ultrafiltración, depilación del cuero, producción de
hidrolizados de zeína, formulación de detergentes con subtilisina y otras
proteasas (Jaouadi et al. 2008).
Las proteasa de B. pumilus destacan por ser más eficientes que las de otras
bacterias, por ejemplo, se ha descrito que la proteasa alcalina de B. pumilus
CBS presenta mejor eficacia catalítica que la subtilisina, además mayor
estabilidad al pH, temperatura y desnaturalizantes químicos (Jaouadi et al.
2008); mayor eficiencia en la depilación de cuero (Wang et al. 2007);
keratinasa mas estable para la degradación de pelo de bovinos (Kumar et al.
2008); y colagenasa con alta especificidad (Wu et al. 2010).
Otra de las enzimas producidas por esta bacteria son las xilanasas,
ampliamente utilizadas en las industrias para blanquear la pulpa artesanal,
aumentar el brillo del papel, mejorar la digestibilidad de los piensos, aclarar
los zumos y procesar el alimento animal (Xu and Tao 2005; Kapoor and
Kuhad 2007).
Destacan las lacasas, por su versatilidad como biocatalizadores para
aplicaciones industriales. Catalizan la oxidación de sustancias orgánicas,
polimerización de monómeros, degradación de polímeros y la oxidación de
compuestos fenólicos. Industrialmente ha sido utilizada para la
26
deslignificación de pulpa, la oxidación de los contaminantes orgánicos, el
blanqueo de mezclilla y la decoloración y transformación de colorantes
textiles. La importancia de la lacasa de B. pumilus se caracteriza por su
tolerancia a altas temperaturas y actividad en condiciones neutras hasta
alcalinas, a diferencia de las lacasa de hongos que son activas solo a pH
ácidos (Naclerio et al. 2010; Reiss et al. 2011).
También se ha descrito la producción de esterasas (Rasool et al. 2005);
enzimas degradadoras de glúcidos como las endoglucanasas (Ariffin et al.
2008), quitinasas (Ahmadian et al. 2007; Dehestani et al. 2010), pectinasas
(Sharma and Satyanarayana 2006) y pectato liasa (Ouattara et al. 2011).
Otras cepas han sido descritas como degradadoras de compuestos
xenobióticos (Meyers et al. 1991; Calvo et al. 2004; Hayase et al. 2004;
Toledo et al. 2006; Hua et al. 2007).
1.3.2.2 Producción de Antibióticos
B. pumilus es conocida por la producción de antibióticos, como es el caso de
la pumilina (BHATE 1955), la pumilacidina (Naruse et al. 1990), la
pumicilina (Aunpad and Na-Bangchang 2007) y tetaína (Krynski et al. 1952).
También se ha descrito una cepa de B. pumilus que inhibe los factores de
virulencia de algunas bacterias Gram-negativas como Chromobacterium
violaceum ATCC 12472, C. violaceum CV026, Pseudomonas aeruginosa
PAO1 y Serratia marcescens, mediante la acción de una acilasa cuya
actividad inhibe el quorum sensing de estas bacterias (Nithya et al. 2010).
Introducción
27
1.3.2.3 Control Biológico
1.3.2.3.1 Control de Hongos y Bacterias en plantas
Algunas cepas de B. pumilus tienen actividad fungicida y han sido utilizadas
como agentes de control biológico de hongos fitopatógenos. La propiedad de
estas cepas para producir metabolitos extracelulares antifúngicos es una de
las más explotadas, ya que inhiben el crecimiento del micelio y la producción
de micotoxinas de muchas especies de hongos como Aspergillus, Penicillium
and Fusarium, causantes de grandes pérdidas económicas en los cultivos a
nivel mundial (Munimbazi and Bullerman 1998).
Se han descrito cepas de B. pumilus activas contra Mucoraceae y Aspergillus
(Bottone and Peluso 2003), Ascosphaera apis (Reynaldi et al. 2004),
Verticillium dahliae, Rhizoctonia solani, Phtophthora parasítica y Ralstonia
solanacearum (Mei et al. 2010).
En el 2001 se patentó una cepa de B. pumilus productora de metabolitos con
propiedades fungicidas contra ciertos patógenos específicos de plantas, pero
no contra bacterias. Esta cepa es capaz de proteger las raíces y las frutas de
varias especies de cultivos de infecciones de hongos (Lehman et al. 2001).
Hay cepas capaces de actuar contra hongos y/o bacterias en condiciones
adecuadas. Es así que, Bacillus pumilus SE34 está descrita como una
rizobacteria que induce sistemas de resistencia en Arabidopsis frente a
Pseudomonas syringae pv. maculicola (Ryu et al. 2003) y en plantas de
Tabaco frente a Peronospora tabacina (Zhang et al. 2002). Esta cepa activa
las defensa de la planta, vía inducción de la resistencia sistémica; este
proceso depende de la activación física o química de las barreras de la planta
y es característica de la cepa que se encuentra colonizando su raíz. Otra cepa
28
con las mismas características es B. pumilus T4, que induce resistencia en
Arabidopsis frente a Pseudomona syringae (Ryu et al. 2003).
El mecanismo de acción de algunas cepas de B. pumilus para inducir sistemas
de resistencia en plantas se conoce bastante bien. Por ejemplo, en remolacha
azucarera, B. pumilus 203-6 y 203-7 induce la resistencia sistémica por el
incremento de la producción de quitinasa y de β-1,3-glucanasa (Bargabus et
al. 2004); en tabaco, la resistencia mediada por B. pumilus SE34 es
determinada por el aumento de los niveles de ácido salicílico (Zhang et al.
2002), mientras que en guisantes, esta misma cepa induce la resistencia por el
fortalecimiento de las paredes celulares epidérmica y cortical mediante la
producción de calosa y compuestos fenólicos (Choudhary and Johri 2009).
Así, la inducción de resistencia sistémica en plantas por B. pumilus, al igual
que otras de su especie, depende de la cepa bacteriana, la planta huésped y en
algunos casos del patógeno (Choudhary and Johri 2009). Varios ejemplos
han sido descritos en la literatura (Tabla 1.2).
Esta aplicación ha sido industrialmente explotada y existen varios productos
a la venta, cuyo ingrediente activo es una cepa de B. pumilus (Tabla 1.3).
Introducción
29
Tabla 1.2 Uso de B. pumilus para el control biológico de patógenos de plantas.
Cepa de
Bacillus pumilus Planta Enfermedad Patógeno
203-6 y 203-7 Remolacha
azucarera
Mancha de la hoja
por Cercospora Cercospora beticola
SE34 y T4 Tabaco Moho azul Peronospora hyoscyami pv.
tabacina
INR7 Pepino Marchitez bacteriana Erwinia tracheiphila
SE34 Tomate Mancha de la hoja Virus mosaico del pepino
(CMv)
SE34 Tomate Tizón tardío Phytophthora infestans
INR7, SE34,
SE39, SE52
Pino de
incienso Roya fusiforme
Cronartium quercuum,
Miyabe exsirai f. sp.
Fusiforme
INR7 Pepino Mancha angular Pseudomona syringae
SE34 Tomate Mancha de la hoja Virus del moteado del
tomate (ToMov)
T4 Tabaco Fuego salvaje Pseudomona syringae pv.
tabaco
Fuente: (Choudhary and Johri 2009).
30
Tabla 1.3 Productos comerciales para control biológico en plantas basadas en B.
pumilus
Marca / nombre
del Producto Cepa de B. pumilus Patógeno / enfermedad
GB34 Biological
Fungicide GB34 Rhizoctonia y Fusarium
Ballad QST2808 Roya de la soya de Asia
Sonata B. pumilus
Oidio, mildiu, mancha de la hoja
causada por Cercospora, tizón
temprano, tizón tardío, podredumbre
parda, niebla del peral.
Yield Shield GB34 Hongos patógenos causantes de
enfermedades en raíces.
Fuente: APS Biological Control Committee (http://www.oardc.ohio-state.edu/apsbcc/)
1.3.2.3.2 Control de Insectos
Tradicionalmente, B. pumilus no ha sido considerada una especie
entomopatógena. A pesar de la gran diversidad de actividades biológicas
útiles que se han demostrado, sus aplicaciones se han centrado en el uso de
bioplagicidas para la prevención y tratamiento de enfermedades causadas por
hongos fitopatógenos, principalmente en las raíces de ciertos cultivos.
Sin embargo, estudios demuestran la patogenicidad de cepas de B. pumilus
contra insectos diana (Heins et al. 1999; Eryurk et al. 2008; Molina et al.
2010; Yaman et al. 2010).
Introducción
31
En 1999, Heins y colaboradores patentaron un método para proteger a las
plantas contra el gusano de las raíces del maíz (Diabrotica virgifera, D.
longicornis, D. undecimpunctata), la rosquilla verde o gusano de la
remolacha (Spodoptera exigua) y algunas especies de nematodos, mediante la
aplicación de una cantidad determinada del sobrenadante obtenido de un
cultivo completo de B. pumilus AQ717 sobre cualquier parte de la planta
incluida las raíces o aplicaciones al suelo que la rodean.
Dicha patente incluye la cepa B. pumilus AQ717, los metabolitos con
actividad pesticida que produce la cepa y varios métodos para proteger y
tratar a las plantas contra estos insectos, ya sea el uso de la suspensión del
cultivo bacteriano, el sobrenadante del cultivo o el metabolito purificado. La
patente describe la producción de un metabolito tóxico y soluble de bajo peso
molecular (<10.000 daltons), que se encuentra en el sobrenadante de un
cultivo completo tras un periodo de incubación y agitación (Heins et al.
1999).
En otro estudio, un Bacillus aislado del suelo e identificado como B. pumilus
por métodos bioquímicos, presentó actividad tóxica frente a el escarabajo de
la patata o dorífora (Leptinotarsa decemlineata), considerado como la plaga
más importante en patatas, berenjenas y tomates. Esta cepa alcanza niveles de
mortalidad de 95.7 y 26.7% en larvas y adultos, respectivamente, en ensayos
de laboratorio (Eryurk et al. 2008).
Otra cepa, aislada del escarabajo de la corteza del abeto (Dendroctonus
micans), fue identificada como B. pumilus por métodos bioquímicos, y
utilizada en bioensayos frente a insectos de la misma especie de la cual fue
aislada. Estas pruebas revelaron una toxicidad del 69.4 y 40.9% de
mortalidad en larvas y adultos, respectivamente de D. micans (Yaman et al.
2010).
32
Nuestro grupo de investigación, publicó el aislamiento y caracterización
mediante comparación de secuencias parciales del gen 16S ARNr, de una
cepa de B. pumilus entomopatógena activa frente a la mosca de la fruta del
Mediterráneo (Ceratitis capitata). La cepa B. pumilus 15.1 presentó rangos
de mortalidad del 68 al 94% en larvas de C. capitata, dependiendo de las
condiciones bajo las cuales se realizan los bioensayos (Molina et al. 2010).
1.3.2.4 Otras Aplicaciones
B. pumilus ha sido descrita como rizobacteria promotora del crecimiento
vegetal (Ryu et al. 2003; Thomas 2004; Choudhary and Johri 2009; Udaya
Shankar et al. 2009), como una herramienta potencial que proporciona
importantes beneficios a la agricultura por su capacidad de potenciar el
crecimiento de la planta y por tanto el rendimiento del cultivo.
Además, es considerado como un microorganismo que al ser administrado en
dosis adecuadas confiere beneficios en su huésped. Es así, que ha sido
utilizada comercialmente como probióticos en el producto Biosubtyl (Green
et al. 1999), y descrito con la capacidad de mejorar la respuesta inmune de
peces, lo cual lo hace un atractivo probiótico para la acuicultura (Sun et al.
2010).
1.4 Bacillus pumilus 15.1
La cepa B. pumilus 15.1 fue aislada de vegetación en descomposición de caña
silvestre (Phragmites australis) de la localidad agrícola de la Costa Tropical
de Granada (Almuñecar), al sur de España, en donde la mosca de la fruta del
Introducción
33
Mediterráneo es considerada la plaga económicamente más perjudicial de los
cultivos frutales de la zona. La cepa se identificó mediante secuenciación del
gen 16S ARNr, y su secuencia fue depositada en la base de datos GenBank,
bajo el número de acceso EU978469 (Molina et al. 2010).
Esta cepa ha cobrado importancia por presentar toxicidad frente a C.
capitata. Su identificación y caracterización indican que es posible encontrar
una cepa natural de Bacillus que sea tóxica para esta plaga y que cepas de B.
pumilus son entomopatógenas.
B. pumilus 15.1 es altamente tóxica para larvas de C. capitata, reportando
mortalidad máxima del 94% en bioensayos. La toxicidad está determinada
por las condiciones a las cuales el cultivo debe ser sometido. Así, la toxicidad
se manifiesta cuando el cultivo esporulado tiene un tiempo de incubación de
96 horas a 4 °C (Molina et al. 2010).
Nuestro grupo de investigación caracterizó esta cepa bioquímica y
fisiológicamente. Los resultados fueron presentados por el doctorando Juan
Francisco Caña Roca. En este trabajo se detallan algunas de las propiedades
de B. pumilus 15.1, como parte inicial de la búsqueda del factor de virulencia
de esta cepa (Caña-Roca 2009; Caña-Roca, J.F. et al., sin publicar).
B. pumilus 15.1 tiene alta capacidad de degradar proteínas, es catalasa
positiva, presenta actividad α y β hemolítica. En las pruebas de perfil
metabólico, se comporta como otras cepas de la misma especie, a excepción
del Ácido pirúvico, que solo es metabolizado por esta cepa. Es sensible a la
penicilina y poco sensible a cloramfenicol y estreptomicina.
Morfológicamente, la célula vegetativa tiene la forma típica bacilar, con un
eje de mayor de 1.8-1.95 µm y un eje menor de 0.5 µm. Son formadoras de
endosporas que se destaca por la ausencia de exosporio, característica de
34
otras especies de Bacillus. La endospora mide 1 µm en su eje mayor y 0.5 µm
en su eje menor.
Las endosporas son resistentes a agentes físicos (temperatura) y químicos
(Etanol, Cloruro de benzalconio, K2MnO4 y pH extremos). El Formaldehido,
Lejía y Peróxido de hidrógeno son letales para la cepa.
B. pumilus 15.1 produce cristales paraesporales parecidos estructuralmente a
los sintetizados por B. thuringiensis, estos cristales han sido observados tanto
en el interior de la célula como dispersas por el medio de cultivo.
El factor de virulencia de esta cepa no es conocido, pero la evidencia de
nuestro grupo de investigación nos sugiere que puede ser de origen proteico.
De aquí el interés por caracterizar el perfil proteico de esta nueva cepa, no
solo por su actividad entomopatógena sino también por conocer el
mecanismo de activación de dicha toxicidad.
35
36
37
2. OBJETIVOS
38
Objetivos
39
El objetivo general de este trabajo de investigación es la caracterización del
perfil proteico de la cepa Bacillus pumilus 15.1 bajo condiciones de cultivo
donde la cepa ha mostrado actividad frente a larvas de la Mosca de la fruta
del Mediterráneo C. capitata. Para lograr esto se plantean los siguientes
objetivos concretos:
1. Caracterizar el perfil proteico de la cepa 15.1 en fase vegetativa.
2. Caracterizar el perfil proteico de la cepa 15.1 en fase esporulada.
3. Separar y analizar las proteínas más relevantes de los perfiles
proteicos.
4. Bioensayar la actividad de las proteínas insolubles excretadas
mayoritarias producidas durante la esporulación de la bacteria B.
pumilus 15.1 frente a larvas de C. capitata.
40
41
42
43
3. MATERIALES Y MÉTODOS
44
Materiales y Métodos
45
3.1 Condiciones de cultivo de cepas bacterianas
3.1.1 Cepas bacterianas y su conservación
Las cepas bacterianas utilizadas en este trabajo, junto con sus genotipos o
características más relevantes se recogen en la Tabla 3.1
Tabla 3.1 Cepas bacterianas más relevantes utilizadas en este trabajo
Especie Cepa Genotipo/Características Referencia/Fuente
Bacillus pumilus
15.1 Cepa tóxica frente a larvas
de C. capitata (Molina et al. 2010)
15.1
Curado
Cepa curada de elementos
extracromosómicos
Sin publicar:
Proporcionado por
J.F. Caña-Roca (de
nuestro grupo de
investigación)
M1 Cepa degradadora de
compuestos aromáticos
Dr. Calvo,
Universidad de
Granada
La conservación de las cepas a corto plazo se realizó en cultivos en placa con
medio LB sólido a 4 °C. La conservación a largo plazo se hizo por
congelación de cultivos líquidos en 40% (v/v) de glicerol a -80 °C.
46
3.1.2 Medios de cultivo
Los medios utilizados para el cultivo de B. pumilus se describen a
continuación. Los medios fueron esterilizados en autoclave por calor húmedo
a 121 °C y una atmósfera de presión, antes de ser utilizados.
3.1.2.1 Medio rico
El medio utilizado rutinariamente para el crecimiento de las cepas de B.
pumilus 15.1, 15.1 Curado y M1, fue el medio rico Luria-Bertani (LB)
(Maniatis et al. 1982), cuya composición fue 10 g de Triptona, 5 g de
Extracto de Levadura, 10 g de NaCl (cuando se requirió medio sólido se
añadieron 15 g de Agar) por litro de agua destilada.
También se utilizo el medio TSB (Tryptic Soy Broth) (Scharlau), usando las
cantidades indicadas por la casa comercial (30 g por litro de agua destilada).
3.1.2.2 Medio de esporulación
Cuando se requirió la esporulación de las cepas, el medio utilizado fue el
medio T3, cuya composición fue 3 g de Triptona, 2 g de Triptosa, 1.5 g de
Extracto de Levadura, 0.05 M de NaH2PO4 pH 6.8 (preparado y esterilizado
previamente), 0.005 g de MnCl2 por litro de agua destilada (Travers et al.
1987).
Materiales y Métodos
47
3.1.3 Condiciones de cultivo
Las cepas de B. pumilus fueron cultivadas aeróbicamente en medio LB, TSB
o T3 a 30 °C en un incubador orbital (Lan Technics) a 240 rpm entre 12 y 72
horas en medio líquido o en un incubador sin agitación en medio sólido.
En el caso de cultivos líquidos, la relación entre el volumen del matraz
Erlenmeyer y el volumen del cultivo para el crecimiento de las bacterias fue
de 5:1.
Cuando el ensayo lo requirió, el cultivo fue incubado a 4°C durante 96 horas.
3.2 Análisis de proteínas
3.2.1 Tratamiento de muestras proteicas
El análisis de proteínas se realizó en la fracción sedimento y la fracción
sobrenadante de un cultivo bacteriano crecido durante 12 y/o 72 horas a 30°C
y 240 rpm de agitación en medio T3 o TSB.
Para la obtención de cada una de las fracciones el cultivo se centrifugó
durante 20 minutos a 20000 x g a 4 °C en un rotor JA-30.50, en una
centrífuga Beckman Coulter Avanti serie J-30 I.
El sobrenadante se transfirió a un tubo limpio por decantación, y se lo
concentró mediante liofilización y resuspensión en agua miliQ a una
concentración final de 100x. La muestra fue dializada frente a PBS durante
24 horas, utilizando una membrana de diálisis Spectra/Por® (Spectrum
Laboratories) con un tamaño de poro de 3500 Da, con objeto de eliminar las
48
sales del medio. Tras la diálisis las muestras estuvieron a una concentración
aproximada de 20x.
El sedimento del cultivo se lavó mediante resuspensión en 20 mL de PBS dos
veces y se concentró 250x.
Cuando se quiso analizar el contenido proteico de la célula bacteriana se
utilizó un cultivo de 12 horas a 30 °C a 240 rpm en medio T3 y TSB y se
realizó un tratamiento con lisozima antes de la electroforesis. Para ello el
cultivo se centrifugó a 20000 x g durante 15 minutos a 4 °C. Se eliminó el
sobrenadante y se resuspendió el sedimento en 20 mL de tampón TES frío
(0.36 g de Tris base, 0.146 g de EDTA, 0.292 g de NaCl en 100 mL de agua
destilada, pH 8 y esterilizado por autoclavado), se lavó dos veces más y por
último el sedimento se resuspendió en 5 mL de tampón de lisis (20% (p/v) de
Sacarosa, 20 mg/mL de lisozima, 1% (v/v) Tritón x-100, 1mM de PMSF, 10
µg/mL de ARNasa, 10 µg/mL de ADNasa en tampón TES). La suspensión
fue incubada durante 90 minutos a 37 °C. Posteriormente, la suspensión se
centrifugó bajo las condiciones anteriores, se eliminó el sobrenadante y el
sedimento se resuspendió en 4 mL de tampón de sonicación (DTT 1 mM,
PMSF 1 mM en tampón TES). La muestra fue transferida a tubos “Precellys
lysing kit VK01/VK05” de 7 mL para ser lisadas en el equipo Precellys 24 de
Bertin Technologies, utilizando un programa de 6500 rpm por 3 ciclos de 30
segundos cada uno con intervalo de 10 segundos entre cada ciclo y repitiendo
este programa 6 veces con intervalos de 1 minutos entre cada programa, en
donde la muestra se mantuvo en hielo.
La muestra fue transferida a tubos Eppendorf y centrifugada a 14000 rpm
durante 5 minutos, se eliminó el sobrenadante y se resuspendió el sedimento
en 500 µL de tampón TES.
Materiales y Métodos
49
Para comprobar que la lisis celular fue exitosa, se realizó la siembra en placa
de diluciones seriadas de distintos puntos del lisado.
3.2.2 Electroforesis de proteínas. SDS-PAGE
El análisis de proteínas se realizó mediante la técnica de electroforesis en
geles de poliacrilamida, en presencia de dodecil sulfato sódico (SDS-PAGE),
utilizando el equipo Mini-protean system (Biorad TM
). La composición del
gel separador fue de 7.5, 12 o 15% (v/v) de Acrilamida al 30% (dependiendo
del experimento) en Tris 0.375 M pH 8.8, SDS 0.1% (p/v), APS 0.2% (p/v) y
TEMED 0.1% (v/v). El gel concentrador tuvo una composición de 17.4%
(v/v) de Acrilamida al 30% en Tris 0.125 M pH 6.8, SDS 0.1% (p/v), APS
0.1% (p/v) y TEMED 0.4% (v/v). Siete microlitros de la muestra proteica se
mezclaron con otros 7 µL de tampón de carga 2x (Tris 0.1 M pH 6.8, SDS
2% (p/v), EDTA 4 mM pH 8, Glicerol 20% (v/v), Azul bromofenol 0.01%
(p/v) y 2% (v/v) de β-mercaptoetanol) y se calentaron durante 10 minutos a
95 °C antes de que fueran cargadas en el gel. El tampón de electroforesis
contuvo 3.02 g/L de Tris, 14.4 g/L de Glicina y 1 g/L de SDS. La
electroforesis se realizó a un voltaje constante de 120 V, durante 1 hora. El
marcador de peso molecular usado fue “Precision Plus ProteinTM
Standards”
de BIO-RAD.
El procedimiento de tinción consistió en sumergir el gel en una solución de
Azul de Coomassie 0.025% (p/v) en Metanol 40% (v/v) y Ácido Acético
10% (v/v) durante 45 minutos.
Para desteñir el gel se retiró la solución anterior y se sumergió en una
solución de Propanol 10% (v/v) y Ácido Acético 10% (v/v). El gel una vez
desteñido, se conservó en agua destilada.
50
3.2.3 Separación de Proteínas mediante Gradiente de Sacarosa
Un mililitro de precultivo (una colonia incubada en medio LB a 30 °C a 240
rpm toda la noche) se diluyó en 100 mL de medio T3 y se incubó a 30 °C a
240 rpm por el tiempo en que se quiso analizar la cepa.
El cultivo fue centrifugado a 20000 x g por 20 minutos a 4 °C en una
ultracentrífuga Beckman ™ serie J-30 I con un rotor JA-30.50, la fracción
sedimento fue lavada con PBS estéril frío y centrifugada en las mismas
condiciones anteriores, y el sedimento fue resuspendido en 2 mL de agua
miliQ. Esta muestra fue colocada en la parte superior de un gradiente
discontinuo de sacarosa formado por tres soluciones de 1.9, 2.1 y 2.3 M de
sacarosa tal como se muestra en la Figura 3.1.
Fig 3.1 Gradiente discontinuo de Sacarosa.
Materiales y Métodos
51
El gradiente fue centrifugado utilizando el rotor JS-24.38 a 53000 x g durante
16 horas a 4 °C. Las fases e interfases resultantes del gradiente se recogieron
en tubos diferentes para posteriormente lavarlas tres veces con PBS estéril
frío mediante centrifugación a 23730 x g durante 15 minutos a 4 °C. El
sedimento formado en cada una de las fracciones fue resuspendido en 1 mL
de agua miliQ. Cada fracción fue analizada mediante SDS-PAGE y
almacenadas a -20°C para su uso posterior.
3.2.4 Microscopía
3.2.4.1 Microscopía óptica
Las muestras observadas mediante microscopía óptica fueron tomadas de un
cultivo completo de B. pumilus 15.1 en medio T3 incubado a 30 °C durante
72 horas con agitación a 240 rpm, con el cual se realizó un gradiente de
sacarosa y cuyas fracciones resultantes fueron observadas al microscopio.
Las muestras se extendieron sobre un portaobjetos de vidrio formando un
frotis, que se fijó con calor, tras lo cual se tiñó con una solución 0.133% (p/v)
de Azul de Coomasie y 50% (v/v) de Ácido Acético (Ammons et al. 2002),
seguidamente el portaobjetos se lavó con agua destilada, se dejó secar y se le
colocó un cubreobjetos, para su posterior observación en el microscopio
óptico.
La observación de las muestras se realizó en el Centro de Instrumentación
Científica de la Universidad de Granada, en un microscopio óptico marca
OLYMPUS modelo BX51con un objetivo 100x.
52
3.2.4.2 Microscopía electrónica de transmisión
Cien microlitros de cada muestra, se centrifugaron a 14000 rpm durante 5
minutos, se eliminó el sobrenadante y se añadió solución fijadora
(Glutaraldehido 2.5% (v/v) y Paraformaldehido 4% (v/v) en un tampón
Cacodilato 0.05 M a pH 7.2). Las muestras se mantuvieron a 4 °C durante un
periodo máximo de 24 horas, tras el cual se lavaron tres veces siguiendo el
siguiente procedimiento: centrifugación a 14000 rpm durante 5 minutos,
eliminación del sobrenadante, adición de 1 mL solución de lavado (Tampón
Cacodilato 0.1 M a pH 7.2) e incubación en frío durante 20 minutos. Las
muestras se resuspendieron en solución de lavado y se mantuvieron a 4 °C
hasta ser procesadas y observadas en el Servicio de Microscopía del Centro
de Instrumentación Científica de la Universidad de Granada.
La observación de las muestras se realizó en un microscopio electrónico de
transmisión marca ZEISS modelo EM 902.
3.2.5 Inmunoblots
Un alícuota de 2 µL de las fracciones obtenidas en el Gradiente de Sacarosa
fue diluida en tampón de carga 2x (cuya composición ha sido descrita en el
apartado 3.2.1 de este capítulo), y sometidas a temperatura de 95 °C durante
10 minutos al igual que el marcador de peso molecular “Amersham Full-
Range Rainbow Molecular Weight Markers” de GE Healthcare. Las muestras
se cargaron con ayuda de un peine en un gel de poliacrilamida Phast GelTM
7.5% de GE Healthcare para realizar una electroforesis de proteínas en el
equipo Phast System usando el siguiente programa que consta de dos
pasoscuyas condiciones son: primero paso, 250 V, 10.0 mA, 3.0 W, 15 °C,
65 Vh; segundo paso 50 V, 0.1 mA, 0.5 W, 15 °C, 0 Vh.
Materiales y Métodos
53
Tras la electroforesis, el gel de poliacrilamida se sumergió en tampón de
transferencia transferencia (Tris base 25 mM, Glicina 192 mM y Metanol
20% (v/v), ajustado a pH a 8.3) durante 10 minutos, se cortó el gel y se
colocó sobre una membrana de nitrocelulosa, cubriendo ambos lados con
papeles filtro previamente sumergidos en tampón de transferencia. La
transferencia se realizó en u equipo Phast transfer bajo las siguientes
condiciones: 20 V, 25.0 mA, 1.0 W, 15 °C, 5 Vh durante 25 minutos.
La membrana de nitrocelulosa se incubó en agitación toda la noche a 4 °C en
solución de bloqueo cuya composición fue PBS con Tween al 0.1% (v/v) y
leche en polvo al 2% (p/v).
Tras ello, la solución de bloqueo se retiró y la membrana se lavó tres veces
con solución de lavado (PBS con Tween al 0.1% (v/v)) durante 10 minutos.
Los sueros se añadieron en una dilución 1:1000 (suero anti Cry1Aa1 y suero
preinmune), y se incubó a 37 °C durante 2 horas en agitación. Tras la
incubación con el anticuerpo, la membrana se lavó tres veces con solución de
lavado durante 10 minutos y se incubó en agitación durante 1 hora y 30
minutos a 37 °C con una solución 1:1000 de anticuerpo secundario IgG-Fab
de cabra anti–ratón conjugada con la peroxidasa de rábano HRP (Dakor) en
PBS. Posteriormente la membrana se lavó tres veces con solución de lavado.
Posteriormente se añadió solución Sustrato Peroxidasa cuya composición fue
Tris HCl 0.1 M pH 7.4, 3’-3’ Diaminobencidina Tetrahidroclorhídrico 0.05%
(p/v) y Peróxido de Hidrógeno 0.05% (v/v). Cuando apareció señal se detuvo
la reacción con agua ultra pura y se dejó secar la membrana al aire.
Cuando fue necesario la transferencia a la membrana fue realizada en el
quipo Mini Trans-Blot® Electrophoretic Transfer Cell de Bio Rad a 350 mA
durante 45 minutos en cámara fría. Como anticuerpo se utilizo el suero anti
Cry1Aa obtenido de conejo (cedido por el Dr. Colin Berry, Universidad de
54
Cardiff) a una dilución 1:2000. Como anticuerpo secundario se utilizó IgG-
Fab de cabra anti–conejo conjugada con la peroxidasa de rábano HRP
(Dakor) a una dilución 1:1000. La membrana se reveló con Sustrato
Peroxidasa, cuya composición ha sido anteriormente detallada.
3.2.6 Solubilización de Proteínas
Las fracciones 2 y 6 procedentes de un gradiente de sacarosa de un cultivo de
B. pumilus 15.1 en medio T3 incubado durante 72 horas a 30 °C con
agitación a 240 rpm, se solubilizaron en las condiciones detalladas en la
Tabla 3.2. Todos los tampones de solubilización fueron suplementados con
10 mM de DTT.
Diez microlitros de cada fracción se centrifugaron a 14000 x g durante 10
minutos a temperatura ambiente en el caso de la fracción de 2 y a 4 °C en el
caso de la fracción de 6. Tras la centrifugación se eliminó el sobrenadante y
el sedimento fue resuspendido en 10 µL del tampón de solubilización. Como
control se utilizó PBS estéril. Las muestras resuspendidas en cada tampón
fueron incubadas durante 1 hora a 37 °C en un baño. Posteriormente se
centrifugaron a 14000 x g durante 10 minutos y se separó el sobrenadante en
un tubo limpio. El sedimento fue resuspendido en 10 µL de PBS estéril.
Tanto el sedimento resuspendido como el sobrenadante fueron analizados en
geles de poliacrilamida mediante SDS-PAGE.
Materiales y Métodos
55
Tabla 3.2 Condiciones de solubilización ensayadas
TRATAMIENTOS
pH Tampón PMSF 1 mM Coctel inhibidor
de proteasa 1x
3 NaHCO3 50 mM
6 NaHCO3 50 mM
9 Na2CO3 50 mM
12 Na2CO3 50 mM
1 KCl 50 mM
HCl 134 mM
2 KCl 50 mM
HCl 13 mM
3 CH3COOH 98 mM
CH3COONa*3H2O 1.77 mM
4 CH3COOH 84.7 mM
CH3COONa*3H2O 15.4 mM
9 Na2HPO4 95.5 mM
HCl 4.5 mM X X
10 Na2HPO4 96.6 mM
NaOH 3.36 mM X X
11 Na2HPO4 96.53 mM
NaOH 3.47 mM X X
12 KCl 50 Mm
NaOH 12 mM X X
13 KCl 50 Mm
NaOH 132 mM X X
56
3.2.7 Análisis e identificación de proteínas por MALDI-TOF
El análisis de proteínas por MALDI TOF/TOF se realizó sobre proteínas
previamente separadas mediante SDS-PAGE. Las bandas de interés fueron
recortadas del gel utilizando un bisturí estéril, colocadas en tubos con agua
miliQ y enviadas al Centro de Investigación Príncipe Felipe en Valencia para
ser analizadas en un MALDI TOF/TOF 4700 PA tras realizar un digerido
proteico con tripsina. La huella peptídica determinada por MS-MS/MS fue
procesada por el servicio utilizando MASCOT como algoritmo de búsqueda.
Bajo las mismas condiciones una de las bandas fue analizada por el Servicio
de Proteómica del CBMSO, Madrid, el cual pertenece al Instituto Nacional
de Proteómica, ProteoRed.
3.2.8 Bioensayos con C. capitata
3.2.8.1 Mantenimiento de la Colonia de moscas de la fruta del
Mediterráneo
Para los ensayos realizados con larvas de Ceratitis capitata se contó con la
cría continua de una colonia en el laboratorio. La colonia fue establecida a
partir de una colonia mantenida en el Centro de Ecología Química Agrícola
(CEQA) de la Universidad Politécnica de Valencia, amablemente
proporcionada por el Dr. Navarro Llopis.
El mantenimiento de la colonia en el laboratorio se realizó siguiendo las
recomendaciones de Chapman et al. (1998), Jaldo et al. (2001) y González et
al. (2003). Los adultos se mantuvieron en una habitación “insectario” en
cajas de metacrilato (40 x 30 x 28 cm), bajo un fotoperíodo de 16 horas de
Materiales y Métodos
57
luz y 8 de oscuridad, con una humedad relativa de 50 ± 5% y temperatura
promedio de 25 ± 2 ºC.
Las moscas adultas fueron alimentadas con dieta artificial compuesta por
Autolisado de Levadura y Sacarosa, en relación de 1:4 (p/p), y se les
suministró agua a través de una esponja amarilla húmeda. La pared frontal de
las cajas estaba provista de una tela para simular la piel de las frutas, y ahí las
moscas depositen los huevos para ser recogidos en contenedores de plástico
con agua destilada.
Estos huevos fueron recogidos y colocados sobre una dieta artificial para
larvas compuesta por 200 g de Salvado de Trigo, 50 g de Sacarosa, 25 g de
Levadura de Cerveza, 2 g de Nipagin (Metil 4-hidroxibenzoato, Sigma), 2 g
de Nipasol (Propil 4-hidroxibenzoato, Sigma), 7.5 mL de HCl 37% y 500 mL
de agua destilada. Esta cantidad de dieta fue suficiente para alimentar las
larvas procedentes de 0.5 mL de huevos de C. capitata, las cuales fueron
colocadas en un ambiente de temperatura constante a 25 °C.
Las larvas se desarrollaron en condiciones de densidad relajada.
Aproximadamente entre 7 y 10 días después de haber recogido los huevos,
cuando las larvas alcanzaron el tercer estadio larvario (6 a 8 mm de longitud),
los contenedores donde se alimentaron fueron transferidos a cajas de
pupación, cuyo suelo estaba cubierto con arena tamizada y esterilizada, para
permitir que las larvas saltaran del contenedor donde crecieron, ingresaran en
la arena y puparan. Después de 7 a 10 días en la caja de pupación, y antes de
que emergieran los adultos, las pupas fueron recogidas en un tamiz, y
colocadas en placas Petri, dentro de una nueva caja de cría para adultos que
contuvo la dieta artificial y agua destilada para continuar con la colonia.
58
3.2.8.2 Bioensayos con larvas
Los bioensayos con larvas se llevaron a cabo utilizando individuos de primer
estadio, de tamaño uniforme, criados durante 72 horas en la dieta artificial
para larvas descrita en el apartado 3.2.8.1.
Las fracciones GA.1 y GA.5 procedentes de un gradiente de sacarosa de un
cultivo completo de B. pumilus 15.1 en medio T3 incubado durante 72 horas
a 30 °C en agitación a 240 rpm y activado durante 96 horas a 4 °C, fueron
bioensayadas frente a neonatos de C. capitata. De igual forma se utilizaron 2
de las fracciones equivalentes procedentes de un cultivo completo de B.
pumilus 15.1 curado crecido en medio T3 incubado durante 72 horas a 30°C
con agitación a 240 rpm, y denominadas como GC.2 y GC.5. Todas las
muestras bioensayadas estuvieron 75 veces concentradas con respecto al
cultivo original.
Cien microlitros de cada fracción concentrada se dispensaron en los pocillos
de una Microplaca Cellstar® (Greiner Bio-One) estéril de 48 pocillos libre de
ADNsas y ARNasas. Tras ello, se añadieron 500 μL de la dieta artificial
compuesta por las soluciones A y B, mezcladas inmediatamente antes de su
uso agregando 20 mL de agua destilada estéril (Molina et al. 2010).
La solución A tuvo la siguiente composición: 52 g de Salvado de Trigo de
grano fino, 20 g de Sacarosa, 10 g de Levadura de Cerveza, 1.58 mL de HCl
37% y 100 mL de agua destilada; mientras que la solución B fue una mezcla
homogénea de Agar a una concentración de 1.6 g en 100 mL de agua
destilada. Ambas suspensiones se autoclavaron previamente a su uso.
Mientras se manipuló y alicuotó, la dieta se la mantuvo en un baño de agua a
50 ºC para evitar su solidificación. Una vez colocada la dieta junto a las
muestras en los pocillos de la microplaca, se usó un palillo estéril para
Materiales y Métodos
59
homogeneizar la mezcla, y se dejo solidificar a temperatura ambiente, tras lo
cual se colocó una larva de primer estadio de C. capitata sobre la dieta de
cada pocillo tomada con la ayuda de un palillo estéril. Posteriormente, la
microplaca se selló con plástico transparente tensado, para evitar que las
larvas escapasen. Finalmente, usando un alfiler entomológico se hizo un
pequeño agujero sobre cada uno de los pocillos para proveer a las larvas de
suficiente aeración.
Los bioensayos se mantuvieron en un incubador a 25 ºC durante todo el
experimento. La mortalidad de las larvas se registró 4 y 10 días después de
haber iniciado el experimento.
60
61
62
63
4. RESULTADOS
64
Resultados
65
La cepa bacteriana Bacillus pumilus 15.1 fue seleccionada de muestras
recogidas en la Costa Tropical de la provincia de Granada, España, por
nuestro grupo de investigación. Esta cepa fue identificada y caracterizada por
presentar alta toxicidad frente a larvas de Ceratitis capitata, (Molina et al.
2010), díptero considerado como una de las plagas más dañinas de frutas
comestibles.
El agente o agentes causantes de la toxicidad no han sido descubiertos, ni
tampoco el mecanismo por el cual estos factores son activados, mostrando un
aumento de la toxicidad de la cepa frente a C. capitata cuando el cultivo
completo permanece durante 96 horas a 4 °C. Nuestro grupo de investigación
considera la posibilidad de que el o los agentes causales de la toxicidad
tienen origen proteico, de ahí la necesidad de realizar un análisis del perfil
proteico de la cepa B. pumilus 15.1, cuyos resultados son descritos en este
capítulo.
4.1 Perfil proteico de la cepa B. pumilus 15.1
Para la determinación de los perfiles proteicos se utilizó la electroforesis en
geles de poliacrilamida en presencia de dodecil sulfato sódico (SDS-PAGE),
considerado un método eficaz para la diferenciación de microorganismos
(Plikaytis et al. 1986; Costas et al. 1989) y una técnica fiable y comúnmente
usada para la separación, identificación y caracterización de proteínas (Wirth
and Romano 1995; Steinberg 2009).
Existen varios métodos para visualizar los resultados, en la bibliografía se
han descrito colorantes orgánicos e inorgánicos (Wirth and Romano 1995).
66
En este trabajo se utilizó Azul de Coomassie, comúnmente usado por su bajo
costo, fácil visualización, mejor cuantificación y su compatibilidad con
ensayos de espectrometría de masas (Westermeier 2006). Con esta técnica se
visualizaron los perfiles proteicos de la cepa B. pumilus 15.1 a diferentes
tiempos de incubación.
4.1.1 Perfil proteico de un cultivo vegetativo
Para el análisis de la cepa en estado vegetativo se partió de cultivos
incubados durante 12 horas bajo las condiciones descritas en el apartado
3.1.3 del capítulo de Materiales y Métodos, en medio T3 y TSB. El perfil
proteico de un cultivo de B. pumilus 15.1 en esta fase, cargado directamente
en el gel, mostró un reducido número de banda (Figura 4.1, carriles 1), siendo
la más intensa una proteína de tamaño ligeramente menor a 37 kDa, y
presentando más intensidad en el medio TSB que en el medio T3.Tras
realizar una lisis enzimática con lisozima, la cantidad de bandas proteicas
aumentaron, a la vez que disminuyó la intensidad de la banda de 37 kDa.
Esto fue debido a la liberación de proteínas intracelulares y de membrana tras
la formación de esferoplastos con el tratamiento de lisozima (carriles 2). El
perfil proteico de los esferoplastos lisados por movimientos vibratorios del
Precellys fue similar al obtenido con la lisis enzimática (carriles 3).
Para comprobar la extensión de la lisis bacteriana en cada uno de los
tratamientos se realizó recuento en placas de células viables, partiendo de 108
UFC/mL, tras la lisis enzimática se obtuvo 106 UFC/mL y después de la lisis
mecánica el conteo fue de 103 UFC/mL, probando que los métodos
empleados consiguieron lisar la mayoría de las células bacterianas.
Resultados
67
En la Figura 4.1 se puede observar que las proteínas no se degradan con este
proceso.
M 1 2 3 1 2 3
T3 TSB
kDa
250
150
100
75
50
37
25
20
15
Figura 4.1 SDS-PAGE al 12% de B. pumilus 15.1 en estado vegetativo crecido en medio
T3 y TSB. El carril 1 corresponde al sedimento del cultivo (10x), el carril 2 al sedimento
después del tratamiento con lisozima (10x) y el carril 3 al sedimento después de la lisis
mecánica (100x).
4.1.2 Perfil proteico de un cultivo esporulado
Para el análisis del perfil proteico de B. pumilus 15.1 en estado esporulado se
utilizó un cultivo incubado a 30 °C en agitación a 240 rpm durante 72 horas
(tratamiento B). Dado que la toxicidad de la cepa B. pumilus 15.1 se revela
sólo tras la incubación de dicho cultivo durante 96 horas a 4 °C se decidió
comparar el perfil proteico de un cultivo incubado bajo dichas condiciones
(tratamiento A).
68
La comparación del perfil proteico de los dos tratamientos se realizó con
objeto de determinar si durante la incubación en frio existieron grandes
cambios a nivel de proteínas debido a procesamientos, polimerizaciones o
degradaciones.
Los sobrenadantes liofilizados y dializados de la cepa B. pumilus 15.1 con los
tratamientos A y B, fueron analizados en geles de poliacrilamida. Los
resultados se muestran en la Figura 4.2. En general el número de proteínas
existentes en el sobrenadante de un cultivo esporulado resultó ser muy bajo,
incluso tras su concentración. No se observó ninguna diferencia significativa
en el patrón de bandas presentadas por la cepa bajo las condiciones de los
tratamientos A y B.
Las bandas que presentan mayor intensidad en el sobrenadante de los cultivos
fueron de tamaño 25 y 75 kDa (Figura 4.2).
M 1 2
kDa
250
150
100
75
50
37
25
20
15
Figura 4.2 SDS-PAGE al 12%del sobrenadante de un cultivo de B. pumilus 15.1 con el
tratamiento A (carril 1) y tratamiento B (carril 2).
Resultados
69
En paralelo, se comparó el perfil proteico de los sedimentos de la cepa B.
pumilus 15.1 con la cepa control M1 de la misma especie y sin ningún
tratamiento con frío. Los resultados de los perfiles proteicos se muestran en
la Figura 4.3.
M 1 M 2 M 3kDa
250
150
100
75
50
37
25
20
15
Figura 4.3 SDS-PAGE al 12% del sedimento de un cultivo de B. pumilus 15.1 con el
tratamiento A (carril 1), B (carril 2) y de un cultivo de la cepa M1 con el tratamiento B
(carril 3).
La Figura 4.3 muestra que el patrón de migración electroforético de las
proteínas del sedimento de la cepa B. pumilus 15.1 fue similar en los
tratamientos A y B. A su vez, el patrón proteico de la cepa M1 fue muy
distinto al de la cepa 15.1.
70
4.2 Separación de proteínas mediante Gradientes de Sacarosa
Los gradientes discontinuos de sacarosa son comúnmente utilizados para
separar células bacterianas de proteínas insolubles excretadas debido a que la
diferencia en sus tamaños es muy notable (Thomas and Ellar 1983). Esta
técnica (descrita en el apartado 3.2.3 del capítulo de Materiales y Métodos)
fue utilizada para separar las proteínas presentes en los sedimentos de los
cultivos de B. pumilus 15.1 obtenidos bajo diferentes condiciones de
incubación.
Al realizar un gradiente de sacarosa de un cultivo en estado vegetativo (12
horas de incubación) en medio TSB, tras la centrifugación toda la muestra
pasó al fondo del tubo y no se observó parte de muestra retenida en ninguna
de las fracciones del gradiente discontinuo de sacarosa. El análisis de
proteínas por SDS-PAGE de las fracciones de sacarosa y el sedimento
resultantes del gradiente se muestra en la Figura 4.4.
kDa
50
37
30
25
M 1 2 3 4 5
Figura 4.4 SDS-PAGE al 12% del gradiente de sacarosa de un cultivo de B. pumilus
15.1 en fase vegetativa. El carril 1 corresponde a la muestra antes del gradiente, el
carril 2 al sedimento formado en el gradiente, el carril 3, 4 y 5 a las fracciones
pertenecientes a las concentraciones 1.97 M, 2.10 M y 2.30 M respectivamente.
Resultados
71
La Figura 4.4 muestra que ninguna proteína fue retenida en las fases del
gradiente de sacarosa, posiblemente porque no existe síntesis importante de
proteínas insolubles en este estado celular. Todas las células sintetizadas que
se observan en el carril 1 forman parte constituyente de la célula y son
arrastradas con ellas hacia el sedimento.
El resultado fue muy distinto cuando se realizó un gradiente de sacarosa de
cultivos esporulados (72 horas de incubación) tratados con frio (tratamiento
A) o sin frio (tratamiento B). En estos cultivos, algunas de las proteínas
sintetizadas fueron retenidas en las diferentes fracciones de sacarosa (Figura
4.5). En los gradientes se observaron claramente 3 interfases (nombradas
como 1, 3 y 5), 3 fases (nombradas como 2, 4 y 6) y un sedimento (nombrado
como 7).
1
3
5
2
4
6
7
A B
Figura 4.5 Resultado del gradiente discontinuo de sacarosa, en donde se muestran las
fases (2, 4 y 6), las interfases (1, 3 y 5) y el sedimento formado (7) de un cultivo de B.
pumilus 15.1 con el tratamiento A y B respectivamente.
72
Cada una de estas fracciones, después de ser lavadas y resuspendidas a una
concentración 500x, fueron analizadas mediante electroforesis SDS-PAGE.
Para mejor visualización de las proteínas retenidas en cada fracción, el
análisis se realizó en geles con distinta concentración de poliacrilamida, al
7.5% (Figura 4.6), 12% (Figura 4.7) y 15% (Figura 4.8). En todos los geles
destaca la presencia de dos bandas de tamaños moleculares de ~ 45 kDa y
~17 kDa por la mayor intensidad que presentan en relación al resto de
bandas. El hecho de que las proteínas de 45 y 17 kDa no estén presentes en la
fracción pellet (carril 7), donde se encuentra la mayoría de las proteínas
celulares, indica que dichas proteínas han sido excretadas por la bacteria
durante el proceso de esporulación y que son insolubles, posiblemente porque
sean cuerpos de inclusión.
Resultados
73
A
kDa
250
150
100
75
50
37
M 0 1 2 3 4 5 6 7
B
M 0 1 2 3 4 5 6 7
kDa
250
150
100
75
50
37
Figura 4.6 SDS-PAGE al 7.5% del gradiente de sacarosa de un cultivo de B. pumilus
15.1 con el tratamiento A y B, en donde carril 0 corresponde a la muestra antes del
gradiente, y los carriles 1 al 7 a las diferentes fracciones resultantes del gradiente.
74
A
M 0 1 2 3 4 5 6 7 kDa
250
150
100
75
50
37
25
20
15
B
M 0 1 2 3 4 5 6 7 kDa
250
150
100
75
50
37
25
20
15
Figura 4.7 SDS-PAGE al 12% del gradiente de sacarosa de un cultivo de B. pumilus
15.1 con el tratamiento A y B, en donde carril 0 corresponde a la muestra antes del
gradiente, y los carriles 1 al 7 a las diferentes fracciones resultantes del gradiente.
Resultados
75
kDa
250
75
50
37
25
20
15
10
M 0 1 2 3 4 5 6 7
kDa
250
75
50
37
25
20
15
10
M 0 1 2 3 4 5 6 7
A
B
Figura 4.8 SDS-PAGE al 15% del gradiente de sacarosa de un cultivo de B. pumilus
15.1 con el tratamiento A y B, en donde carril 0 corresponde a la muestra antes del
gradiente, y los carriles 1 al 7 a las diferentes fracciones resultantes del gradiente.
La cepa B. pumilus 15.1 contiene al menos dos elementos
extracromosomales, un plásmido y un megaplásmido (Molina et al. 2009).
Previamente, en nuestro laboratorio, se ha conseguido eliminar dichos
elementos extracromosómicos de la cepa B. pumilus 15.1 mediante un
76
método modificado del protocolo descrito por González et al. (Gonzalez et
al. 1981; Caña-Roca, J.F. et al, sin publicar). Existen muchas bacterias en las
que genes responsables de los factores de virulencia tienen localización
plasmídica (Gitahy et al. 2007). La técnica de curado de plásmidos es
considerada como la metodología estándar para revelar si las proteínas
responsables de la toxicidad bacteriana son codificadas por plásmidos (Roh et
al. 2007).
Por esta razón, se analizó el perfil de proteínas mediante gradiente de
sacarosa de un cultivo esporulado de la cepa B. pumilus 15.1 curada. Las
bandas de 17 kDa y la de 45 kDa pudieron observarse en las distintas
fracciones del gradiente. Sin embargo, la banda de mayor intensidad en esta
cepa, bajo estas condiciones de cultivo, fue la de ~ 45 kDa tal y como se
muestra en la Figura 4.9.
Al compara el perfil proteico de esta cepa con la original de B. pumilus 15.1
silvestre, se observó que el patrón de proteínas de la cepa curada de
plásmidos es muy similar, y que no existen cambios significativos en la
expresión de las proteínas presentes en ninguna de las fracciones del
gradiente.
.
Resultados
77
M 0 1 2 3 4 5 6 7
M 0 1 2 3 4 5 6 7
12%
15%kDa
250
75
50
37
25
20
15
10
kDa
250
150
100
75
50
37
25
20
15
Figura 4.9 SDS-PAGE al 12 y 15% del gradiente de sacarosa de un cultivo con el
tratamiento B de la cepa B. pumilus 15.1 curada de elementos extracromosomales, en
donde carril 0 corresponde a la muestra antes del gradiente, y los carriles 1 al 7 a las
diferentes fracciones resultantes del gradiente.
La separación en gradiente de sacarosa y el análisis de cada una de las
fracción se realizó en la cepa control de nuestros estudios de toxicidad B.
78
pumilus M1. Una observación que se puedo hacer en el transcurso de la
realización del gradiente fue que tras la centrifugación bajo las mismas
condiciones que las usadas con la cepa B. pumilus 15.1, no hubo formación
de sedimento. La muestra no entró ni siquiera en la fracción más concentrada
de la sacarosa, la fracción de 2.3 M de sacarosa. Aún así, se recogieron las
fracciones y se analizaron en un gel de poliacrilamida. Como se observa en la
Figura 4.10, todas las fracciones (2, 3, 4 y 5) presentaron el mismo perfil
proteico, sin haber a penas proteínas en las fracciones 6 y 7.
M 0 1 2 3 4 5 6 7 kDa
250
150
100
75
50
37
25
20
15
Figura 4.10 SDS-PAGE al 12%. Gradiente de sacarosa de un cultivo de B. pumilus M1
con el tratamiento B, en donde carril 0 corresponde a la muestra antes del gradiente, y
los carriles 1 al 7 a las diferentes fracciones resultantes del gradiente.
En principio cabe pensar que el hecho de que todas las fracciones tengan el
mismo perfil indica que B. pumilus M1 no excreta proteínas insolubles como
lo hace B. pumilus 15.1, aunque para finalmente concluir esto haría falta
optimizar las condiciones del gradiente en cuanto a concentración de las
fracciones y las condiciones de la centrifugación.
Resultados
79
4.3 Observación de B. pumilus 15.1 mediante microscopía
Algunas bacterias esporulantes como B. thuringiensis, P. popilliae y algunas
especies de Clostridium son capaces de formar cristales proteicos en el
esporangio, simultáneamente a la formación de la endospora. La formación
es estos cuerpos paraesporales ha sido descrita con anterioridad en la cepa B.
pumilus 15.1 en nuestro grupo de investigación (Caña-Roca 2009).
Utilizando la técnica de tinción descrita en el apartado 3.2.4.1 de Materiales y
Métodos, se observaron las fracciones resultantes del gradiente de sacarosa
de un cultivo de B. pumilus 15.1 bajo las condiciones de un tratamiento B.
Estas muestras fueron observadas mediante microscopio óptico de contraste
de fase con un objetivo de 100x.
En la Figura 4.11 se muestra un cultivo completo B. pumilus 15.1 totalmente
esporulado, así como las fracciones resultantes de un gradiente de sacarosa.
En todas las fracciones se observó la presencia de esporas, siendo la fracción
7, correspondiente al sedimento, en donde se observó el mayor número de
esporas con relación al resto de las fracciones. Sin embargo, mediante esta
técnica, no fue posible distinguir de manera clara cristales teñidos, tanto en
las muestras de cultivo inicial como en las diferentes fracciones del gradiente.
La Figura 4.11 muestra varios campos observados en el microscopio óptico
de la cepa.
80
a b
dc
Figura 4.11 Microscopia óptica (100x). Campos generales de un cultivo de B. pumilus
15.1 (a) y diferentes fracciones resultantes de un gradiente de sacarosa, fracción 4 (b),
fracción 5 (c) y fracción 7 (d) tenidas con Azul de Coomassie.
Según las bases de la técnica de tinción empleada solo los cristales se tiñen
completamente, presentándose como cuerpos teñidos de azul obscuro
(Ammons et al. 2002), mientras que las esporas presentan un color azul más
claro. La definición de estas manchas no es clara, no se distinguen formas y
son de tamaño similar a las esporas. Hay predominancia de este tipo de
manchas en las fracciones 4 y 5 del gradiente de sacarosa.
Resultados
81
Para observar mejor las muestras y ver si hay diferencia en la producción de
cuerpos paraesporales entre los tratamientos A y B del cultivo y entre la cepa
silvestre y la cepa 15.1 curada de plásmidos, se llevó a cabo una observación
mediante microscopia electrónica de transmisión.
La presencia de cuerpos paraesporales se observó en los dos tratamientos de
la cepa 15.1 como se muestra en la Figura 4.12. Se observaron cuerpos
paraesporales de características similares a los cristales sintetizados por B.
thuringiensis durante la esporulación.
No se observó diferencia significativa en el número de cuerpos paraesporales
en los tratamientos.
82
A
B
Figura 4.12 Campos generales de un cultivo de B. pumilus 15.1 con el tratamiento A (A)
y B (B), las fechas blancas señalan las estructuras paraesporales cristalinas fuera de las
células.
Resultados
83
También se observó una muestra de un cultivo de la cepa B. pumilus 15.1
curada de sus plásmidos, en donde se pudo ver la presencia de cuerpos
paraesporales (Figura 4.13).
a b
Figura 4.13 Campos generales de un cultivo de B. pumilus 15.1 curado. Las flechas
blancas señalan los cristales paraesporales (a). La imagen ampliada muestra la
diversidad de formas de estos cristales (b).
En las Figuras 4.12 y 4.13 se puede observar la diversidad de tamaño y forma
que presentan los cuerpos paraesporales en las cepas 15.1, siendo la forma
predominante la cúbica. Se observa que los cristales se agrupan, formando
cuerpos paraesporales de tamaños superior a la de las esporas en algunas
ocasiones.
En la Figura 4.14 a se muestra la inclusión cristalinas dentro de la célula y en
la Figura 4.14 b y c un detalle de un de los cristales mostrando una estructura
en forma de rejilla, lo que recuerda la estructura de los cristales producidos
por B. thuringiensis y B. licheniformis (Yan et al. 2007).
84
a
b c
Figura 4.14 Detalle de los cuerpos paraesporales producidos por B. pumilus 15.1. (a)
muestra la estructura cristalina dentro de la célula. (b y c) muestra los detalles de las
inclusiones cristalinas en donde se aprecia un patrón de cuadriculas en el cristal.
Resultados
85
4.4 Análisis de las fracciones de un cultivo de B. pumilus 15.1
mediante Inmunoblot
Dado que en el cultivo de B. pumilus 15.1 se observaron mediante
microscopía la existencia de inclusiones similares a las producidas por B.
thuringiensis compuestas por toxinas Cry se decidió evaluar mediante
imnunodetección si esas inclusiones estaban compuestas por dichas toxinas.
La electroforesis se realizó en mini-geles de poliacrilamida al 7.5% y las
muestras analizadas fueron las correspondientes a la Figura 4.6 de este
capítulo. En la técnica de Inmunoblot o Western se utilizó como anticuerpo el
suero de ratón inmunizado con la proteína Cry1Aa1 inmunosuero obtenido en
nuestro laboratorio por T. Domínguez Flores. El anticuerpo se utilizó a una
dilución 1:1000. Todas las fracciones resultantes del los gradientes de
sacarosa de la cepa 15.1 con los tratamientos A y B se analizaron mediante
inmunoblot. Como control se utilizó el suero de ratón preinmune. Los
resultados obtenidos se muestran en la Figura 4.15.
86
Figura 4.15 Inmunoblot realizado utilizando antiCry1Aa como anticuerpo frente a las
muestras de B. pumilus 15.1 resultantes de gradientes de sacarosa con el tratamiento A
y B. El carril C+ muestra el control positivo para el anticuerpo utilizado. Las flechas
indican los carriles en donde se alguna señal.
Tanto las muestras del cultivo antes del gradiente (carril 0), como el
sedimento resultante del gradiente (carril 7) mostraron un rastro coloreado sin
ninguna banda definida (Figura 4.15).
Resultados
87
Para obtener un mejor resultado se realizó una electroforesis en geles de
mayor tamaño que los anteriores y al 12% de poliacrilamida. Para este
inmunoblot se utilizó como anticuerpo el suero de conejo inmunizado con la
proteína Cry1Aa, cedida gentilmente por el Dr. Colin Berry de la
Universidad de Cardiff, en una dilución 1:2000 y como control positivo una
muestra del sobrenadante solubilizado de una cepa de B. thuringiensis spp.
kurstaki obtenida por T. Domínguez Flores de nuestro grupo de
investigación. Las muestras utilizadas corresponden a las fracciones
resultantes del gradiente de sacarosa de un cultivo de la cepa 15.1 con el
tratamiento A (Figura 4.7, A). Los resultados se muestran en la Figura 4.16.
225
150
102
76
52
38
31
24
17
225
150
102
76
52
38
31
24
17
M 0 1 2 3 5 7 C+ M
Figura 4.16 Inmunoblot realizado utilizando Cry1Aa como anticuerpo frente a una
muestra de B. pumilus 15.1. Se analizan el cultivo antes del gradiente (carril 0) y cinco
de las fracciones resultantes de gradientes de sacarosa con el tratamiento A (carriles 1,
2, 3, 5 y 7). El carril C+ es el control positivo para el anticuerpo utilizado.
88
En la Figura 4.16 se muestra el resultado del imnumoblot realizado. Se pudo
observar la existencia de varias bandas tenues de ~17 kDa de tamaño en los
carriles 0 y 3, una banda de ~50 kDa en el carril 0, y una banda de ~31 kDa
en el carril 7. Las bandas de ~17 kDa correspondieron a una de las bandas de
mayor intensidad en los geles SDS-PAGE teñidos con Coomassie Blue, las
bandas de ~50 y 31 kDa son poco intensas en estos geles (Figura 4.7, A).
4.5 Solubilización de proteínas
Debido a la similitud observada entre los cristales producidos por esta cepa y
los cristales de δ-endotoxinas de B. thuringiensis intentó realizar una
solubilización in vitro de la misma forma que se realiza en las inclusiones de
B. thuringiensis (Li et al. 2004).
Las fracciones utilizadas en el ensayo de solubilización fueron la fracción 2 y
6 correspondientes principalmente a las proteínas de 17 y 45 kDa
respectivamente.
En primera instancia se ensayó la solubilización de estas proteínas insolubles
a pHs de 3, 6, 9 y 12. Los resultados se muestran en la Figura 4.17.
Resultados
89
P S 3P 3S 6P 6S 9P 9S 12P 12S
P S 3P 3S 6P 6S 9P 9S 12P 12S
17 kDa
42 kDa
Figura 4.17 SDS-PAGE al 15%. Ensayo de solubilización a diferentes pH de las
fracciones 2 y 6 de un gradiente de sacarosa de la cepa 15.1. Las letras P representan la
fracción del sedimento y las letras S la fracción sobrenadante. Los dos primeros carriles
de cada gel son el control sin solubilizar. El número inicial de cada letra corresponde al
pH ensayado (3, 6, 9 y 12).
La proteína de 17 kDa se solubilizó de forma casi total a pH 3 y mantuvo la
intensidad de la banda después del tratamiento, lo que indica que no hubo
problemas de degradación de la proteína tras la solubilización. La proteína
de 45 kDa perdió intensidad en el tratamiento, posiblemente por un problema
de degradación. De hecho, en los controles se observa, que la mera
incubación a 37 °C degrada la proteína. Dicha proteína se solubilizó
preferentemente a pHs 6, 9 y 12 (Figura 4.17).
90
Para estrechar el rango de solubilización óptimo para la proteína de 17 kDa,
se realizó un ensayo de solubilización a pHs 1, 2, 3 y 4. Los resultados
obtenidos se muestran en la Figura 4.18.
kDa
200
75
50
37
25
20
15
10
M F2 CP CS 1P 1S 2P 2S M 3P 3S 4P 4S kDa
200
75
50
37
25
20
15
10
Figura 4.18 SDS-PAGE en acrilamida al 15%. Ensayo de solubilización de la proteína
de 17 kDa a pH 1, 2, 3 y 4. El carril F2 es la muestra antes del tratamiento. La letra P
representa el sedimento, la letra S el sobrenadante, la letra C el control del tratamiento
y los números los diferentes pH ensayados.
La proteína de 17 kDa mostró alguna solubilización a pHs comprendidos
entre 1 y 3, siendo su pH óptimo 3 (Figura 4.18).
La proteína de 45 kDa se solubilizó sólo de manera parcial únicamente con el
tratamiento de incubación a 37ºC, aunque la solubilización fue más evidente
a pH básicos. En todos los ensayos de solubilización, la intensidad de las
bandas obtenidas fue muy inferior a las bandas de partida, lo que pareció
indicar que el proceso de solubilización venía acompañado de un proceso de
degradación proteico. Por esta razón se intentó realizar la solubilización en
presencia de un inhibidor de serín proteasas (PMSF) y en presencia de un
Resultados
91
coctel inhibidor de proteasas. La solubilización se realizó a pHs 9, 10, 11, 12
y 13. Los resultados se muestran en la Figura 4.19.
M F6 CP CS 9P 9S 10P 10S M 11P 11S 12P 12S 13P 13S
kDa
200
75
50
37
25
20
15
10
kDa
200
75
50
37
25
20
15
10
M F6 CP CS 9P 9S 10P 10S M 11P 11S 12P 12S 13P 13S kDa
200
75
50
37
25
20
15
10
kDa
200
75
50
37
25
20
15
10
M F6 CP CS 9P 9S 10P 10S M 11P 11S 12P 12S 13P 13S
kDa
200
75
50
37
25
20
15
10
kDa
200
75
50
37
25
20
15
10
A
B
C
Figura 4.19 SDS-PAGE en acrilamida al 15%. Ensayo de solubilización de la proteína
de 45 kDa a pH 9, 10, 11, 12 y 13. El carril F6 es la muestra antes del tratamiento. La
letra P representa la fracción del sedimento, la letra S el sobrenadante, la letra C el
control del tratamiento y los números los diferentes pH ensayados. (A) tampón de
solubilización, (B) tampón de solubilización con PMSF, y (C) tampón de solubilización
con coctel inhibidor de proteasas.
92
Los esfuerzos para inhibir la acción de las proteasas no consiguieron mejorar
el resultado, obteniéndose una proteína mucho menos intensa en todos los
sobrenadantes de todas las condiciones. Es interesante el resultado que se
observó en la solubilización realizada a pH 13, ya que fue la única muestra en
donde toda la proteína se solubilizó eliminándose por completo de la fracción
del sedimento (Figura 4.19).
4.6 Identificación de proteínas mediante análisis de huella
peptídica o finger printing.
Algunas de las proteínas resueltas por SDS-PAGE fueron extraídas del gel
para ser enviadas a al servicio de identificación por espectrometría tal y
como se explica en el apartado 3.2.7 de Materiales y Métodos. Las bandas
analizadas se muestran en la Figura 4.20.
La identificación peptídica de la proteína de 37 kDa fue llevada a cabo por el
Servicio de Proteómica del CBMSO, Madrid. Las proteínas de 17, 45, 60 y
250 kDa fueron analizadas en el Centro de Investigación Príncipe Felipe, de
Valencia.
La identificación se realizó mediante análisis de huella peptídica, que
consiste en la digestión por tripsinización del polipéptido a identificar y la
determinación del tamaño de los péptidos resultantes por espectrometría de
masas (MALDI-TOF); y la obtención del espectro de fragmentación de uno o
varios de los péptidos obtenidos en el paso anterior (técnica MS-MS)
mediante espectrometría de masas (MALDI-TOF-TOF).
Resultados
93
250
150
100
75
50
37
25
20
15
45
M GA.6 GA.3 GA.1
17
60
250250
150
100
75
50
37
25
20
M 1
37
Figura 4.20 SDS-PAGE en acrilamida al 12% de muestras de B. pumilus 15.1
analizadas mediante MALDI TOF/TOF. Carril 1 muestra de un cultivo en estado
vegetativo (12 horas), los carriles GA.6, GA.3 y GA.1 corresponden a las fracciones 6, 3
y 1 del gradiente de sacarosa con el tratamiento A.
Los resultados obtenidos se detallan en la Tabla 4.1.
Para todos los polipéptidos analizados se detectaron proteínas con una
fidelidad de identificación significativa. Sin embargo todas las proteínas
analizadas presentaron un porcentaje de identidad con la proteína con la que
se comparó inferior al 36%, llegando a valores más bajos que el 10 % para la
proteína de 250 kDa.
El porcentaje de identidad de estas proteínas con secuencias proteicas
presentes en las bases de datos fue muy bajo y las identidades se produjeron
no a lo largo de toda la proteína sino sólo en partes (Ver Anexos), lo cual nos
94
sugiere que no son proteínas homólogas con la del B. pumilus con el que se
las compara.
Tabla 4.1 Resultados de las búsquedas en base de datos utilizando el programa Mascot
a partir de los espectros obtenidos por el análisis de MALDI TOF/TOF de proteínas de
B. pumilus 15.1
nr. NCBI: Número de referencia en el Centro Nacional de Información sobre Biotecnología.
MS: Mascot Score, se calcula como MS = -10*log(P); donde P es la probabilidad de que la
identificación se produzca por azar. Es un indicador de la calidad de la identificación; un
valor por debajo de 83 (NCBIn) es considerado no significativo; (*) indica resultados
significativos.
SC: Sequence coverage, porcentaje de veces que un segmento de proteínas está representado en la secuencia proteica de la base de datos.
Muestra
kDa
Predicción
peso
Da
Proteína
(nr. NCBI) Especie Descripción MS SC
37 ---- 157691932 B. pumilus
SAFR-032 Flagelina 89* 35.4
17 19297 157692390 B. pumilus
SAFR-032
Proteína hipotética
BPUM_1610 143* 19
45 43580 194017930
B. pumilus
ATCC
7061
Oxalato descarboxilasa 275* 19
60 58882 157691334 B. pumilus SAFR-032
Proteína A de la cubierta externa de la
espora
191* 34
250 81260 194015823
B. pumilus
ATCC
7061
Repetición de
colágeno triple hélice 228* 9
Resultados
95
4.7 Actividad de las proteínas aisladas en los gradientes de sacarosa
frente larvas de C. capitata
La mayoría de los factores de virulencia expresados por bacterias
entomopatógenas esporulantes Gram-positivas son de naturaleza proteica.
Por esta razón se decidió analizar dos de las proteínas parcialmente
purificadas por el método de gradiente de sacarosa evaluándolas en
bioensayos con larvas de C. capitata bajo las condiciones estandarizadas por
nuestro laboratorio.
En los bioensayos se ensayaron las fracciones 1 y 5 de un gradiente de
sacarosa de la cepa 15.1 sometido al tratamiento A (GA) y las fracciones 2 y
5 de un gradiente de sacarosa de la cepa 15.1 curada (GC), ambas fracciones
correspondientes a las mismas bandas proteicas de 17 y 45 kDa
respectivamente. El porcentaje de mortalidad obtenido en los bioensayos se
muestra en la Figura 4.21. Se observó que la mortalidad en este bioensayo no
alcanzó niveles superiores al 15% con la fracción GC.2 y 8% con la fracción
GA.2, mortalidades extremadamente bajas comparadas con las obtenidas por
Molina et al. (2010), donde se alcanzó una mortalidad del 94% de la
población de larvas utilizando la cepa 15.1 con el tratamiento A. Parece ser
que las proteínas ensayadas por independiente bajo las condiciones del
ensayo, no son las responsables de dicha toxicidad.
96
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% d
e m
ort
ali
da
d
Control GA. 1 GA.5 GC.2 GC.5
Bioensayo
4 Dias
10 Dias
Figura 4.21 Porcentaje de mortalidad en larvas de C. capitata después de 4 días (barras
negras) y 10 días (barras grises) de bioensayo producidas por las fracciones GA.1,
GA.5, GC.2 y GC.5 y el control positivo obtenido de los datos de Molina et al. 2010.
97
98
99
5. DISCUSIÓN
100
Discusión
101
Bacillus pumilus 15.1 ha sido descrita, por nuestro grupo de investigación,
como una cepa activa frente a larvas de Ceratitis capitata (Molina et al.
2010). Esta cepa despierta un gran interés científico y biotecnológico, tanto
por los niveles de toxicidad que presenta para una de las plagas más
destructivas de cultivos frutales a nivel mundial, como por las evidencias de
que B. pumilus es un entomopatógeno, a pesar de las escasas publicaciones
que revelan sus propiedades insecticidas (Heins et al. 1999; Eryurk et al.
2008; Molina et al. 2010; Yaman et al. 2010).
No conocemos el factor o factores responsables de la toxicidad en la cepa
15.1, sin embargo, nuestro grupo ha obtenido evidencias de que el factor de
virulencia probablemente sea de naturaleza proteica (Molina et al. 2010;
Molina et al. 2011). Se sabe que la mayoría de bacterias entomopatógenas
esporulantes Gram-positivas expresan una gran variedad de factores de
virulencia de naturaleza proteica, las cuales son utilizadas por la bacteria para
invadir, infectar y finalmente matar al insecto hospedador (de Maagd et al.
2003). De aquí surge la necesidad de caracterizar el perfil proteico de la cepa
B. pumilus 15.1.
Para la caracterización, el primer paso fue realizar geles SDS-PAGE para
separar e identificar las proteínas presentes en el sobrenadante y sedimento
de un cultivo de la cepa 15.1, y posteriormente separar las proteínas
insolubles excretadas al medio de las células bacterianas mediante
centrifugación del cultivo en un gradiente de sacarosa.
En estado vegetativo, esta cepa presenta la producción de una banda
mayoritaria de 37 kDa y con la técnica empleada para la lisis (lisozima y
movimientos vibratorios) se observaron las proteínas intracelulares y de
membrana. La técnica de gradiente discontinuo de sacarosa empleada para la
cepa en esta fase, no sirvió para separar proteínas excretadas en ninguna de
102
las concentraciones de sacarosa empleadas (ver Figura 4.4), lo cual nos hace
pensar que las proteínas sintetizadas por la cepa en este punto forman parte
constituyente de las células y por eso son arrastradas con ellas al sedimento.
El perfil proteico de la cepa 15.1 una vez esporulada, fue analizado con el
tratamiento A y B para comparar las diferencias a nivel proteico que pueden
suceder en el periodo de incubación a 4 °C durante 96 horas (tratamiento A),
ya que es bajo estas condiciones donde se revela la toxicidad de la cepa
(Molina et al. 2010). Los resultados de estos ensayos indicaron que tanto la
fracción sobrenadante como el sedimento presentan perfiles proteicos
similares en los dos tratamientos. Al realizar el gradiente de sacarosa con el
sedimento, se logró la separación de diferentes proteínas en las fracciones de
sacarosa, destacando proteínas de 17 kDa y 45 kDa por su mayor intensidad.
Al analizar la cepa 15.1 bajo microscopia electrónica de transmisión, se
encontró cuerpos paraesporales anteriormente descritos en nuestro grupo de
investigación por J.F. Caña-Roca (Caña-Roca, J.F. et al, sin publicar) que
morfológicamente son similares a los secretados por B. thuringiensis y B.
licheniformis y que presentan una estructura en forma de rejilla muy
característica (Yan et al. 2007).
Las inclusiones cristalinas o cuerpos paraesporales no han sido descritas en
ningún otro B. pumilus, pero se sabe que esta es una característica distintiva
de muchas cepas del género Bacillus con actividad entomopatógena, además
se conoce que estos cristales son de naturaleza proteica (Baumann et al.
1991; Helgason et al. 2000; de Maagd et al. 2003). La formación de estos
cristales se debe a genes localizados comúnmente en plásmidos de alto peso
molecular (Gitahy et al. 2007).
Conocemos que la cepa 15.1 contiene por lo menos un plásmido de
aproximadamente 6-8 kb y un megaplásmido. Estos elementos
Discusión
103
extracromosómicos fueron eliminados en la cepa 15.1 curada (Caña-Roca,
J.F. et al, sin publicar). En este trabajo se ha descrito el perfil proteico de esta
cepa carente de plásmidos y la separación mediante gradiente de sacarosa de
las proteínas insolubles (ver Figura 4.9). Al comparar el perfil proteico de
esta cepa carente de plásmidos con la cepa silvestre, observamos que no
existieron diferencias significativas en cuanto a su perfil proteico. Esta cepa
fue también analizada mediante microscopía electrónica de transmisión, y se
pudo observar cristales paraesporales idénticos a los de la cepa silvestre (ver
Figura 4.13). Por esta razón creemos que la producción de cristales en la cepa
15.1 no está relacionada con elementos plasmídicos, sino más bien, que es
codificada por elementos cromosómicos. En el caso de los genes cry o cyt, la
literatura describe a la mayoría como elementos localizados en los plásmidos
pero también, aunque con menos frecuencia, insertados en el propio
cromosoma bacteriano (Lereclus et al. 1993).
La morfología de los cristales en las cepas 15.1 es variada, siendo la forma
predominante la cúbica. Hay que tener en cuenta que la diversidad de la
morfología de los cristales puede deberse a diferentes estados de crecimiento
de los cristales y también al ángulo seleccionado en el corte para ser
visualizado mediante microscopia (Yan et al. 2007), con lo cual se puede
explicar la diversidad de formas de los cristales de la cepa 15.1.
Al utilizar la técnica de tinción descrita en el apartado 3.2.4.1 de Materiales y
Métodos para visualización de cristales mediante microscopia óptica, no se
pudo distinguir los cristales, probablemente porque los cristales al agregarse
tienen un tamaño similar al de la espora. Sin embargo, si se puede decir que
predominan las manchas azules, posibles cristales teñidos según la técnica
(Ammons et al. 2002), en las fracciones de sacarosa 4 y 5 del gradiente.
104
Con la obtención de estos resultados barajamos la posibilidad de que el
agente tóxico de la cepa 15.1 sea una proteína similar a las δ-endotoxinas. El
espectro de toxicidad de algunas δ-endotoxinas puede ser más amplio de lo
comúnmente establecido, por ejemplo la toxina Cry1 usualmente activa
frente a lepidópteros es moderadamente tóxica para algunas especies de
dípteros (Hodgman et al. 1993).
Utilizando el antisuero Cry1Aa1 proporcionado por T. Domínguez-Flores de
nuestro grupo de investigación, se realizaron inmunoblots para detectar
proteínas Cry1Aa1 en las muestras de las fracciones de los gradientes de
sacarosa de la cepa 15.1 con el tratamiento A y B. El resultado mostrado en
la Figura 4.15 no evidencia bandas, sin embargo claramente se pudo ver que
en los carriles 0 y 7 para ambos tratamientos, existe una señal o rastro. Se
cree que al haber utilizado geles pequeños para la realización de este ensayo
(geles Phast GelTM
7.5% de GE Healthcare), la muestra no fue capaz de
entrar bien en los pocillos. Es por eso que se decidió probar con geles de
mayor tamaño y utilizar el antisuero Cry1Aa cedido gentilmente por el Dr.
Colin Berry de la Universidad de Cardiff. Los resultados obtenidos tras este
ensayo mostraron señales positivas de proteínas de 50, 31 y 17 kDa
aproximadamente en diferentes carriles del gel (ver Figura 4.16). Estas
bandas están presentes también en geles SDS-PAGE (ver Figura 4.7).
El tamaño de estas bandas no concuerda con las bandas esperadas para las
proteínas Cry1, que tienen un peso molecular aproximado a 130 kDa
(Soberon and Bravo 2009). Esto nos hace pensar que puede ser una δ-
endotoxina nueva. También se sabe que las protoxinas de Cry1Aa y Cry1Ab
(133 kDa) al ser sometidas a proteólisis in vitro producen hasta 7 proteínas
intermediarias, hasta dar lugar a la toxina activada (57 kDa) (Mohan and
Gujar 2003). Este ejemplo nos hace creer que dado que ni el cultivo ni el
sedimento tiene ningún inhibidor de proteasas, las bandas observadas en los
Discusión
105
inmunoblots pueden ser tanto protoxinas, toxinas activadas o intermediarios
de la proteólisis de una toxina similar a Cry1Aa.
Consideramos interesantes las proteínas de 17 y 45 kDa separadas mediante
gradientes de sacarosa de la cepa 15.1 (ver Figura 4.7), ya que al no aparecer
en la fracción sedimento son proteínas que han sido excretadas al medio por
las bacterias y que posiblemente sean o se comporten como δ-endotoxinas.
Considerando el mecanismo de acción de las toxinas Cry, el primer paso
necesario para ejercer su actividad es la solubilización del cristal por acción
del pH en el tracto intestinal del insecto. El pH del tracto intestinal de
algunos dípteros varía de 7 a 8 (Chilcott et al. 1998), por lo que se considera
que el pH óptimo para hacer solubilizaciones con tripsina de δ-endotoxinas es
neutro o ligeramente alcalino para este género.
Así, se intentó la solubilización in vitro de las proteínas de 17 y 45 kDa. La
proteína de 17 kDa se solubilizó a pH ácidos entre 1 y 3, siendo 3 su pH
óptimo. La proteína de 45 kDa se solubilizó con la acción de la temperatura,
pero su estabilidad fue muy baja. Incluso en presencia de inhibidores de
proteasas la proteína se degradó una vez fue solubilizada. Un pH extremo de
13 logró solubilizar completamente toda la proteína y eliminarla de la
fracción sedimento. Estos resultados, reflejan que dichas proteínas no actúan
de manera similar a las toxinas Cry descritas hasta hoy en la bibliografía.
Para identificar algunas de las proteínas obtenidas en los cultivos de la cepa
15.1 con el tratamiento A, se empleó el análisis de la huella peptídica y la
fragmentación MS-MS. El porcentaje de cobertura de las proteínas
seleccionadas con las comparadas existentes en otros B. pumilus fue muy
bajo (Secuence Coverage, ver Tabla 4.1). Esta técnica se sustenta en la
búsqueda de homología con otras proteínas existentes, que ya han sido
secuenciadas y publicadas en bases de datos. Esto representa un factor
106
limitante en la identificación de nuevas proteínas, es por eso que creemos que
estos resultados no representan alta fiabilidad en nuestro caso.
También, se bioensayó la toxicidad de las proteínas de 17 y 45 kDa frente a
larvas de C. capitata. Los resultados de mortalidad obtenidos fueron muy
bajos, 15 y 8% para las proteínas de 17 y 45 kDa, respectivamente; valores
que son obtenidos comúnmente en laboratorio utilizando únicamente el
medio de cultivo (control) (Molina et al. 2010).
No descartamos la posibilidad de que una de estas proteínas sea la
responsable de la toxicidad de la cepa 15.1, en combinación con otras o bajo
otras condiciones. En la bibliografía se han descrito sinergismos entre toxinas
Cry y Cyt, las cuales han incrementado la toxicidad de ciertas δ-endotoxina
por separado (Bravo et al. 2007). También se ha descrito que las toxinas Cry
y Cyt pueden ser moderadamente antagónicas (del Rincon-Castro et al. 1999;
Hughes et al. 2005). Estos ejemplos nos indican que no hay una regla general
de la acción única o conjunta de proteínas frente a insectos.
En este trabajo se ha caracterizado el perfil proteico de la cepa 15.1, pero no
se ha relacionado ninguna de las proteínas mayoritarias responsable de la
muerte de las larvas de C. capitata. Barajamos varias hipótesis por las cuales
no hemos podido descifrar cual es el factor proteico causante de la toxicidad
en esta cepa, la primera es que hemos centrado nuestro esfuerzo en
caracterizar las bandas de mayor intensidad presentadas en los geles, dejando
a un lado bandas poco intensas que pueden ser los verdaderos factores
tóxicos de la cepa; y la segunda es que el factor causante de la toxicidad sea
un factor nuevo, todavía no descrito en la bibliografía.
107
108
109
6. CONCLUSIONES
110
Conclusiones
111
De los resultados presentados en este trabajo de investigación se pueden
extraer las siguientes conclusiones:
1. La técnica SDS-PAGE 1D no muestra diferencias significativas en los
perfiles proteicos de la cepa 15.1 sometidas al tratamiento con frio
durante 96 horas a 4 °C con respecto a los cultivos sin tratamiento, ni
tampoco entre la cepa silvestre y la curada de plásmidos.
2. La técnica de gradiente de sacarosa permite separar proteínas
insolubles excretadas durante la fase de esporulación de la cepa 15.1.
3. B. pumilus 15.1 produce cristales paraesporales estructuralmente
similares a los producidos por las bacterias entomopatógenas Bacillus
thuringiensis y B. licheniformis.
4. Las proteínas de 17 y 45 kDa, separadas mediante gradiente de
sacarosa de un cultivo de B. pumilus 15.1 esporulado, no son tóxicas
para larvas de C. capitata, en las condiciones ensayadas en este
trabajo.
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115
7. TRABAJO FUTURO
116
Trabajo futuro
117
Este trabajo representa un avance en el estudio de la cepa Bacillus pumilus
15.1 a nivel proteico, mostrando la necesidad de seguir con la búsqueda del
factor o factores de toxicidad de esta cepa frente a larvas de C. capitata y el
análisis de propiedades que la hacen diferente al resto de B. pumilus
descritas.
Es necesario analizar en detalle los cristales producidos por esta cepa, para
esto, se recomienda analizar todas las fracciones de los gradientes de
sacarosa, para ver si esta técnica es capaz de retener esos cristales en alguna
de las fracciones y de esta manera enviar a secuenciar las proteínas que se
evidencien en esa fracción.
Una estrategia planteada para seguir con este trabajo consiste en la
secuenciación completa del genoma de la cepa y el análisis de las secuencias.
Este análisis, en primera instancia, se centrará en la búsqueda de secuencias
homólogas a toxinas ya descritas de bacterias entomopatógenas, como por
ejemplo toxinas Cry, Cyt, Mtx, Bin, Vip, Sip, entre otras.
Además es necesario enfocar el trabajo no solo a conocer el o los factores de
toxicidad sino también el mecanismo de activación de dicha toxicidad, que
hace de la cepa 15.1 una cepa con características únicas al resto de cepas
conocidas de su especie.
118
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8. BIBLIOGRAFÍA
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140
141
ANEXOS
Anexos
143
Análisis e identificación de proteínas por MALDI-TOF
Proteína de 37 kDa
Análisis realizado por el Servicio de Proteómica del CBMSO, Madrid.
Proteína de 17 kDa
Análisis realizado por el Centro de Investigación Príncipe Felipe, Valencia.
Anexos
145
Proteína de 45 kDa
Análisis realizado por el Centro de Investigación Príncipe Felipe, Valencia.
Proteína de 60 kDa
Análisis realizado por el Centro de Investigación Príncipe Felipe, Valencia.
Anexos
147
Proteína de 250 kDa
Análisis realizado por el Centro de Investigación Príncipe Felipe, Valencia.
