buap_Manual de Inmunologia

BENÉMERITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA VICERRECTORÍA DE DOCENCIA

DIRECCIÓN GENERAL DE EDUCACIÓN SUPERIOR FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

M.C. Alma López García

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LICENCIATURA EN QUÍMICO FARMACOBIÓLOGO

AREA MICROBIOLOGÍA

ASIGNATURA

LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA

CÓDIGO

LQF 306L

M.C. ALMA LÓPEZ GARCÍA

VERANO 2010




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OBJETIVOS: a. Educacional: Los alumnos egresados de la carrera de Químico

Farmacobiólogo serán poseedores de conocimientos, habilidades y actitudes

valorativas que le permitirán comprometerse con el desarrollo responsable de

la nación y su cambiante realidad. Para lo cual contará con las herramientas

como son aptitudes y un pensamiento reflexivo, crítico y científico que le

permitirán ser un profesionista de alto desempeño laboral con un espíritu

emprendedor, innovador y propositivo. Por lo que el egresado pondrá en uso

las herramienta y el conocimiento obtenido a lo largo de su estancia en la

universidad.

b. General:

Es una materia práctica que tiene como finalidad proporcionar un

panorama general del laboratorio de inmunología. Revisar de manera general

la importancia de las reacciones antígeno-anticuerpo en el diagnóstico de

determinadas enfermedades infecciosas, y su aplicación como métodos

inmunológicos cualitativos y cuantitativos con el fin de obtener información

diagnóstica-clínica y pronostica de los pacientes.

c. Específicos:

• Definir la terminología empleada comúnmente en laboratorio de

Inmunología.

• Aplicar las medidas de seguridad en el laboratorio clínico.

• Adquirir destreza manual para desarrollar las metodologías básicas

aplicadas en Inmunología

• Aplicar medidas de seguridad en el trabajo con muestras biológicas

como sangre y suero humanos.

• Comprender la importancia del laboratorio de Inmunología para su

formación profesional.

• Motivar en el alumno su interés por la búsqueda de información

actualizada sobre el área de conocimiento y desarrollar en él su

capacidad para la interpretación, discusión y síntesis

• Desarrollar en el alumno la capacidad de trabajo en equipo y liderazgo.

• Desarrollar la capacidad de auto-aprendizaje, a través de lectura,

comprensión y discusión de artículos




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• Desarrollar en el alumno valores éticos profesionales acerca del

conocimiento y aplicación de los mismos en la manipulación de las

formas farmacéuticas en los pacientes.

• Desarrollar en el alumno una actitud crítica, constructiva, propositiva y

responsable.

• Desarrollar capacidad de observación y una actitud abierta a la

búsqueda del conocimiento, consciente de la continua evolución de la

ciencia.

• Contribuir a los cambios de hábitos de higiene en el alumno.




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PRACTICA 1 SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

INTRODUCCIÓN: Los laboratorios de Inmunología son ambientes especiales, las muestras clínicas de pacientes recibidas para su estudio significan un riesgo para el personal debido a los agentes infecciosos que pueden contener. La educación del personal que manipula a diario las muestras, potencialmente infecciosas y la educación por medio de avisos sobre riesgos biológicos, así como instrucciones escritas y verbales de aquellos que solo tienen una exposición limitada al ambiente del laboratorio son las medidas disponibles más importantes para prevenir las infecciones adquiridas en el laboratorio, los riesgos de un laboratorio de Inmunología pueden extenderse a laboratorios adyacentes. Además del riesgo por infección los laboratorios de Inmunología, también están expuestos a todos los riesgos asociados a cualquier ambiente de laboratorio como incendio, riesgos eléctricos, químicos, materiales radiactivos, mal funcionamiento de los equipos, peligros dependientes de desastres naturales, situaciones ambientales como pisos deslizantes, sistemas de circulación de aire deficiente. Se debe poseer un manual de seguridad que contenga información sobre la conducta a seguir en caso de una contingencia OBJETIVO: El alumno de habituara a las medidas de seguridad necesarias en el laboratorio. DESARROLLO: El conocimiento de las propiedades fisicoquímicas y de la infecto-contagiosidad de los microorganismos, permite definir las normas que en materia de seguridad, son necesarias para no correr ningún riesgo de adquirir aún en forma accidental, una infección por este tipo de partículas. Con base en lo anterior, se enlistan a continuación los reglamentos y normas que habrán de seguirse en el Laboratorio del área de Microbiología, con la finalidad de asegurar la integridad física de los alumnos, así como para mantener una organización adecuada para el desarrollo de las prácticas correspondientes.

� La hora de entrada tiene 10 minutos de tolerancia, pasado este tiempo, no se permitirá el acceso al laboratorio.

� Entrar al laboratorio con la bata puesta y abotonada. � Colocar todo los artículos personales en la zona lateral o en los cajones de las

mesa de trabajo. � Al iniciar y finalizar las prácticas, lavarse las manos con agua y jabón

desinfectante. � Queda estrictamente prohibido comer, beber o fumar en el laboratorio, así

como introducir algún objeto en la boca. � La puerta del laboratorio debe mantenerse cerrada. � Limpiar y desinfectar el área de trabajo antes y después de utilizarla. � Permanecer en la zona de trabajo asignada para cada equipo. � Comunicarse con sus compañeros solo en la medida indispensable. � Antes de iniciar la práctica, leer y recordar la metodología a seguir de acuerdo

con las indicaciones del profesor. Si se tienen dudas, es el momento para aclararlas.




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� Informe al profesor de cualquier accidente que ocurra (rotura de material, derramamiento de suspensiones virales, etc.).

� Todo el material que se va a incubar o desechar, deberá colocarse en el sitio indicado por el profesor.

� Sea cuidadoso con el material y equipo que se le proporciona; el material de desecho no contaminado deberá depositarse en los contenedores correspondientes.

� En forma previa a su lavado, siempre se deberá desinfectar el material que se le proporcione en el laboratorio.

� Rotule todo el material que se va a incubar, con los siguientes datos: grupo, sección, equipo, nombre del alumno, así como fecha de entrada y salida.

En general, las disposiciones anteriores tienden al cumplimiento de la Norma Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-1995, en la cual se establecen los requisitos para la separación, envasado, almacenamiento, recolección, transporte, tratamiento y disposición final de los Residuos Peligrosos biológico-infecciosos que se generan en establecimientos e instituciones relacionadas con el sector salud. En la NOM referida, se establecen además definiciones de interés para los laboratorios y áreas de microbiología, tales como: Desinfección: Destrucción de microorganismos patógenos en todos los ambientes, materias o partes que pueden ser nocivos, por los distintos medios mecánicos, físicos o químicos contrarios a su vida o desarrollo, con el fin de reducir el riesgo de transmisión de enfermedades. Residuo peligroso biológico-infeccioso: El que contiene bacterias, virus u otros microorganismos con capacidad de causar infección o que contiene o puede contener toxinas producidas por microorganismos que causan efectos nocivos a seres vivos y al ambiente, que se generan en hospitales y establecimientos de atención médica. En adición, se consideran residuos peligrosos biológico-infecciosos los siguientes:

� La sangre � Los cultivos y cepas almacenadas de agentes infecciosos � Los cultivos generados en los procedimientos de diagnóstico e investigación,

así como los generados en la producción de biológicos � Los instrumentos y aparatos para transferir, inocular y mezclar cultivos � Las muestras biológicas para análisis químico, microbiológico, citológico e

histológico � Los residuos anatómicos derivados de la atención a pacientes de los

laboratorios � Los equipos y dispositivos desechables utilizados para la exploración y toma de

muestras � Los objetos punzo cortantes usados o sin usar � Los que han estado en contacto con pacientes o sus muestras clínicas durante

el diagnóstico y tratamiento, incluyendo navajas, lancetas, jeringas, pipetas Pasteur, agujas hipodérmicas, de acupuntura y para tatuaje, bisturíes, cajas de Petri, cristalería entera o rota, porta y cubreobjetos, tubos de ensayo y similares.




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Con base en lo anterior, los residuos peligrosos infecto-contagiosos, deberán ser tratados por métodos físicos o químicos, los cuales: � Deberán garantizar la eliminación de microorganismos patógenos � Deberán volver irreconocibles a los residuos peligrosos biológico-infecciosos � Deberán ser cremados, si se trata de residuos patológicos.

El cumplimiento de las consideraciones señaladas con anterioridad, garantiza la seguridad que deberá observarse tanto para alcanzar los objetivos de las prácticas, como para su desarrollo en condiciones asépticas.




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PRACTICA 2 DILUCIONES

INTRODUCCIÓN: Se les llama diluciones a las soluciones con concentración menor obtenidas al agregar volúmenes conocidos de diluyente a una solución de concentración conocida. Las diluciones se expresan en forma de una proporción, por ejemplo 1/10 (1:10) donde la primera cifra o numerador (1) corresponde al volumen de lo que se está diluyendo y la segunda cifra o denominador (10) al volumen total en que se encuentra. OBJETIVO: El alumno aprenderá a calcular diluciones en forma directa o en serie. DESARROLLO: Así, una dilución 1/10 indica que se tiene un volumen de la solución original contenido o diluido en 10 volúmenes totales, de los cuales 9 corresponden al diluyente. Dado que en una dilución lo que se indica es la relación entre el volumen de la solución original y el volumen total en que se encuentra, una dilución 1/10 puede prepararse de diferentes maneras: Por ejemplo: 1 ml de muestra en 9 ml de diluyente

0.1 ml de muestra en 0.9 ml de diluyente 0.5 ml de muestra en 4.5 ml de diluyente

En la práctica el cálculo de las diluciones se puede efectuar de dos maneras diferentes que cumplen ciertas expectativas, la dilución directa y la dilución en serie. Dilución directa. Para realizar una dilución directa se puede hacer uso de la siguiente expresión: 1/d=Vm/Vt donde 1/d= dilución

Vm= volumen de muestra Vt= volumen total (volumen de diluyente + volumen de muestra)

Ejemplo N°1 Lleve 5 ml de muestra a una dilución 1/10. Sustituyendo los valores conocidos tenemos: 1/d=1/10 Vm=5 ml Vt= ? Así: 1/10=5 ml/Vt despejando Vt tenemos que Vt=10 x 5/1=50 ml volumen de diluyente = volumen total-volumen de muestra volumen de muestra = 50-5 = 45 ml Ejemplo N°2 Prepare exactamente 200 ml de una dilución 1/50. Sustituyendo los valores conocidos tenemos: 1/d=1/50




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Vm=? Vt= 200 ml Así: 1/50=Vm/200 Despejando Vm tenemos que Vm=200 x 1/50=4 ml Volumen de diluyente = volumen total-volumen de muestra Volumen de diluyente = 200-4=196 ml Sin embargo, las diluciones directas tienen el inconveniente de que cuando es necesario hacer una dilución alta por ejemplo 1/ 10 000, se desperdicia mucho reactivo o se incurre en un error de medición. Así, una dilución 1/ 10 000 se prepararía con 1 ml de muestra y 9 999 ml de diluyente o bien 9.999 ml de diluyente y 0.001 ml de muestra. Dilución seriada Este tipo de dilución soluciona los inconvenientes que presenta el calculo directo de las diluciones altas. Además, en microbiología permite el calculo de la población microbiana en la muestra de estudio, de la cual se toma una alícuota que se diluye en varios tubos y se siembra por vertido en placa. La diferencia entre la dilución de dos tubos consecutivo se conoce como factor de dilución, siendo 2, 4 y 10 los más usados. En el ejemplo de la dilución 1/ 10 000, la muestra se puede diluir 1/ 100 (Vm= 0.1 ml + Vt= 10 ml) en un primer tubo y colocar 0.1 ml de esta dilución en un segundo tubo con 9.9 de diluyente. El segundo tubo tendrá una dilución 1/ 100, sin embargo como la muestra ya se encuentra diluida previamente 1/ 100, multiplicando sus denominadores tenemos:

1/ 100 x 1/ 100= 1/ 10 000 En este caso el factor de dilución es de 100. Debe insistirse en que solo el primer tubo lleva la alícuota de la muestra sin diluir, los demás tubos toman la alícuota ya diluida del tubo previo. El número de tubos y las diluciones intermedias se plantean considerando el volumen de los tubos así como el volumen mínimo que se puede medir fácil y exactamente con las pipetas disponibles.




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PRACTICA 3 TOMA DE MUESTRA

INTRODUCCIÓN: En el laboratorio de inmunología la muestra a estudiar es principalmente

sangre y sus derivados suero o plasma. En el plasma o suero se determina principalmente la presencia de anticuerpos, los cuales desde el descubrimiento de la alta especificidad de las reacciones antígeno-anticuerpo (Ag-Ac), se comprueban con propósitos de diagnóstico (inmunodiagnóstico). Inicialmente los investigadores se dedicaron a la detección de anticuerpos en el suero del paciente como un signo de infección y así a la identificación serológica del microorganismo. Sin embargo, hoy en día la sensibilidad y especificidad de los inmunoensayos permiten no solo la detección de anticuerpos contra una amplia variedad de organismos infecciosos incluyendo bacterias, parásitos, hongos y virus sino a la identificación del propio microorganismo. Aún más, proporcionan un medio para la detección y cuantificación de antígenos no infecciosos y anticuerpos de importancia clínica tales como la determinación del grupo sanguíneo, el VDRL, la determinación de la proteína C-reactiva, una prueba que señala un proceso inflamatorio agudo, la detección de antígenos asociados a tumores y la demostración de la hormona gonadotropina coriónica, una prueba diagnóstica del embarazo. OBJETIVO: Aprender el procedimiento apropiado para la obtención de sangre venosa de las venas del dobles del codo. DESARROLLO:

Obtención de Muestra de Sangre. Para efectuar análisis serológicos, las muestras de sangre pueden ser de sangre capilar o periférica y de sangre venosa.

Sangre capilar o periférica. La sangre capilar o periférica es la que fluye después de aplicar una punción superficial cutánea. Se puede obtener de la yema del dedo. Algunas pruebas pueden realizarse con sangre capilar o periférica y se aconseja cuando no es posible obtener una muestra de sangre venosa o no se desea puncionar la vena.

Sangre venosa. Esta muestra se obtiene por punción de una de las tres venas del pliegue del codo: la basílica, la cefálica o la mediana cubital. Se emplean jeringas desechables con agujas de tipo 21x32, 20x32 o el sistema para la extracción de sangre intravenosa al vacío Vacuntainer . Previamente se realiza la limpieza del área elegida con torunda y alcohol. Antes de puncionar se coloca el torniquete aproximadamente a 8 cm de distancia arriba del pliegue del codo. No debe olvidar soltarlo tan pronto empiece a obtenerse la muestra. La cantidad máxima de sangre a extraer será estrictamente la necesaria para las pruebas.

Anticoagulantes. Los anticoagulantes más usados son el citrato de sodio, oxalato de sodio y EDTA. El citrato de sodio se emplea al 3.8% y el oxalato de sodio al 1.4%. Se usan en relación de una parte de anticoagulante por cada nueve partes de sangre, habitualmente se usan 0.25ml de la solución para completar a 2.5ml de volumen total con la muestra de sangre. El EDTA (ácido etilen-diamino-tetra-acético) se utiliza al 10% y es uno de los anticoagulantes de elección para el trabajo de rutina.




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Manejo y conservación de la muestra. La muestra debe rotularse correctamente y separase según el caso en plasma o suero, y dependiendo del tipo de análisis debe analizarse inmediatamente o puede conservarse adecuadamente refrigerada entre 4 y 8ºC para el análisis posterior.




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PRACTICA 4 OBSERVACION DE LEUCOCITOS

(CUENTA DIFERENCIAL)

INTRODUCCIÓN: Los cinco principales tipos de leucocitos son los neutrófilos (50-70%), los eosinófilos (1-5%), basófilos (0.5-1.0%), linfocitos (20-30%), y monocitos (2 –6%). Por cuenta diferencial se entiende la determinación del porcentaje relativo de cada tipo de leucocito en una muestra de sangre. Se realiza en extendidos (frotis) preparados cuidadosamente y teñidos con colorantes tales como Wright, el cual tiñe el núcleo de los leucocitos de un color púrpura que facilita la diferenciación. OBJETIVO: Identificar los diferentes tipos de leucocitos en un frote teñido MATERIAL Y EQUIPO Portaobjetos Lancetas desechables Algodón Colorante de Wright Solución reguladora pH 6.4 Microscopio DESARROLLO:

1. A partir de la muestra de sangre preparar 2 extendidos (frotis) siguiendo las indicaciones del instructor.

2. Dejar secar completamente los frotis, colocar en un puente de tinción y cubrirlos (contar el número de gotas) con colorante de Wright. Dejar el colorante 1 minuto y añadir el mismo número de gotas de solución reguladora pH 6.4 durante 8 minutos.

3. Lavar suavemente la preparación por 30 segundos y secar el exceso de agua. 4. Cuando la preparación esté completamente seca, colocar una gota de aceite

de inmersión y observar al microscopio. 5. Para facilitar la identificación consultar las láminas a color que ilustran los

diferentes leucocitos.




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PRACTICA 5 DETERMINACIÓN DEL GRUPO SANGUÍNEO

INTRODUCCIÓN: Alrededor de 1900 Karl Landsteiner descubrió que en el humano existen cuatro tipos de sangres con respecto a la presencia o ausencia de dos antígenos específicos denominados A y B. Estos cuatro grupos se conocen actualmente como tipos A, B, AB y O. Este último se caracteriza por la ausencia de los antígenos A y B. En 1940 Landsteiner y Wiener reportaron que el suero de conejo producido contra eritrocitos de mono Rhesus podía aglutinar los eritrocitos del 85% de una población caucásica. Este antígeno se designó inicialmente como factor Rh, posteriormente se encontró que existe como seis antígenos a los cuales Fisher y Race designaron con letras C, D, E, c, d, e. Uno de estos antígenos, el D es responsable de la condición Rh positivo. La tipificación de eritrocitos en el laboratorio se realiza con antisueros específicos contra los antígenos A, B y D, y puede realizarse por métodos en tubo o en portaobjetos. OBJETIVO: Demostrar por medio de una reacción de aglutinación la presencia de los Ag eritrocitarios A, B y D. MATERIALES Y EQUIPO

1. Muestras de sangre con anticoagulante 2. Pipetas graduadas de 1 y 5 ml 3. Tubos de ensayo de 10 X 75 mm 4. Solución salina isotónica 5. Lancetas desechable 6. Aplicadores de madera o palillos 7. Sueros tipificadores anti-A

anti-B anti-D (Rh)

8. Placa oscilatoria DESARROLLO: Método en tubo

1. Se obtiene aproximadamente 5 ml de sangre venosa y se colocan en un tubo con EDTA (0.1 ml de EDTA al 1% por cada ml de sangre). Se centrífuga por 2 min. a 2000 r.p.m. para separar el plasma del paquete celular.

2. Se toman 0.1 ml del paquete celular y se resuspenden en 1.9 ml de solución salina para una suspensión aproximada del 5%.

3. Se marcan tres tubos de la siguiente manera: anti-A, anti-B y anti-D, y se agrega una gota del suero tipificador según corresponda.

4. Se agregan 4 gotas de la suspensión de eritrocitos a cada tubo y se agitan suavemente.

5. Los tubos se centrifugan 1 min a 2000 r.p.m. 6. Se busca la presencia de aglutinación agitando suavemente los tubos. La

aglutinación se reconoce por la formación de grumos. 7. Si la prueba en el tubo anti-D es negativa se realiza el siguiente procedimiento. 8. Se incuba a 37°C por 30 minutos, se centrífuga y se busca la aglutinación. 9. Si persiste la negatividad se lavan los eritrocitos 3 veces con 0.5 ml de solución

salina y se elimina perfectamente el sobrenadante.




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10. Se agrega una gota del suero de Coombs y se agita suavemente, se centrífuga y se busca la aglutinación

Interpretación: Si aglutina en el paso 6 es Rh positivo Si aglutina en el paso 10 es Du Si persiste la negatividad es Rh negativo.

Método en portaobjetos

1. Depositar 2 gotas de sangre en tres diferentes divisiones de un portaobjetos. 2. Agregar de izquierda a derecha una gota del antisuero anti-A, una gota de

anti-B y una gota de anti-D respectivamente. 3. Mezclar los reactivos con un aplicador de madera diferente para cada gota. 4. Agitar suavemente en la placa oscilatoria. 5. Buscar la presencia de aglutinación.




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PRACTICA 6 DETERMINACIÓN DEL TITULO DE ANTICUERPOS ABO DEL SUERO.

INTRODUCCIÓN: El sistema de grupo sanguíneo ABO posee una

característica única; la presencia de anticuerpos fuertemente reactivos en el suero de los que carecen de los antígenos correspondientes. Estos anticuerpos pertenecen a la clase IgM y son producidos en respuesta a una inmunización. Se dice que estos anticuerpos se producen de manera “natural” en base a que los inmunógenos son probablemente de origen bacteriano, dado que algunas bacterias presentan sustancias similares a los antígenos A o B.

El “título” es una medida relativa de anticuerpos o antígenos en una reacción serológica. Se determina realizando a partir del suero problema diluciones seriadas. El título del anticuerpos A o B del suero se reporta como el recíproco de la máxima dilución en la cual es posible observar eritrocitos aglutinados. OBJETIVO: Establecer a través de diluciones seriadas el concepto de título aplicado en las reacciones serológicas MATERIAL

Suspensión de eritrocitos de grupo A o B al 5 % en SSI Suero (plasma) de grupo O Pipetas graduadas de 1 y 5 ml Tubos de ensayo de 10 X 75 mm Solución salina isotónica Lancetas desechable Aplicadores de madera o palillos Sueros tipificadores anti-A

anti-B DESARROLLO:

1. Colocar en una gradilla una serie de 6 tubos rotulados del 1 al 6 y se agregar 0.1 ml de solución salina cada uno de ellos.

2. Agregar 0.1 ml del suero problema al tubo n° 1, mezclar bien y transferir 0.1 ml al tubo n° 2 y así sucesivamente hasta el tubo n° 6 del cual se desechan 0.1 ml.

3. Agregar 4 gotas de la suspensión de eritrocitos a cada tubo y mezclar. 4. Incubar a 37°C por 15 minutos, mezclan suavemente y centrifugar a 1000

r.p.m. durante 1 minuto. 5. Desprender el botón suavemente y buscar la presencia de aglutinación.

INTERPRETACIÓN 1. El título de anticuerpos en el suero problema se determina como el recíproco

de la dilución máxima en la que se observa aglutinación. 2. Además de la aglutinación se puede observar hemólisis, por lo que se debe

comprobar la presencia de hemoglobina libre




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PRACTICA 7 PRUEBAS CRUZADAS

INTRODUCCIÓN:

El objetivo de una transfusión es el proporcionar al paciente (receptor) el tipo preciso de sangre. Por supuesto este objetivo es difícil de lograr, pero es posible aproximarse mucho si se realizan las pruebas correctas de hemaglutinación. En primer lugar, deben determinarse con exactitud los anfígenos de los grupos sanguíneos principales: el grupo ABO y el Rh del paciente, sobre la base de estos grupos se selecciona la unidad de sangre de grupo ABO y Rh compatible y se procede a efectuar las denominadas pruebas cruzadas mayor y menor. La prueba cruzada mayor, denominada prueba de compatibilidad, se realiza mezclando el suero del receptor con los eritrocitos del donador. Si se produce hemaglutinación, esta sangre no puede darse al receptor porque tiene anticuerpos capaces de reaccionar y destruir la sangre administrada. En la prueba cruzada menor, los eritrocitos del receptor son incubados con suero del donador y se observa si hay aglutinación. Si se produce hemaglutinación, la sangre del donador no debe administrase. En ambas pruebas una suspensión de los eritrocitos respectivos se mezclan con el suero y la mezcla se incuba a 37°C durante unos 30-60 minutos. Después del periodo de incubación los eritrocitos se lavan para eliminar los anticuerpos que no se han fijado a los eritrocitos, y se añade el reactivo de Coombs (anti-globulina).

OBJETIVO: Realizar las pruebas de compatibilidad sanguínea denominadas “Pruebas Cruzadas” MATERIAL Y EQUIPO Muestras de sangre con y sin anticoagulante Pipetas graduadas de 1 ml y 5 ml 8 tubos de ensaye de 10 X 75 mm Solución salina isotónica. Baño serológico Centrífuga Solución de albúmina bovina al 10% DESARROLLO:

1. Se obtiene una muestra de sangre del donador y receptor y se procede igual a lo descrito en los incisos 1 y 2 de la práctica anterior.

2. Se disponen 4 tubos etiquetados como sigue: PM/S =Prueba Mayor en solución salina pm/s =Prueba Menor en solución salina PM/A =Prueba Mayor en albúmina pm/a =Prueba Menor en albúmina

3. Se agregan a cada tubo los siguientes reactivos en el orden indicado: PM/S. 2 gotas del suero del receptor + 4 gotas de eritrocitos (al 5%) del donador pm/s. 2 gotas del suero del donador + 4 gotas de eritrocitos (al 5%) del receptor




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PM/A. 2 gotas del suero del receptor + 4 gotas de albúmina + 1 gota de

eritrocitos (al 5%) del donador pm/a. 2 gotas del suero del donador + 4 gotas de albúmina + 1 gota de

eritrocitos (al 5%) del receptor 4. Se mezclan bien y se incuban a 37°C por 30 minutos. 5. Se centrifugan 1 minuto a 2000 r.p.m. y se busca la presencia de aglutinación. 6. En caso de que no se presente la aglutinación, los tubos se centrifugan

nuevamente y se descarta el sobrenadante. Se lava el paquete celular de cada tubo con 1 ml de solución salina y se centrifuga nuevamente descartando el sobrenadante. Repetir el lavado 2 veces.

7. Al paquete celular se le agrega un agota del suero de Coombs y se busca la presencia de hemaglutinación.

Interpretación: Si hay aglutinación en cualquiera de los tubos, será indicativo de que hay incompatibilidad entre el posible donador y el receptor (paciente). Si no la hay, las sangres son compatibles.




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PRACTICA 8 DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE INFECCIÓNES BACTERIANAS

(REACCIONES FEBRILES)

INTRODUCCIÓN: La aglutinación de células bacterianas con antisueros es una de las pruebas serológicas mas antiguas de la inmunología práctica. Se inició como un método para el diagnóstico de las infecciones bacterianas y fue propuesta por Widal en 1896. La pruebas de aglutinación bacteriana tienen dos aplicaciones principales en el diagnóstico; las células bacterianas desconocidas pueden identificarse por medio de anticuerpos conocidos, o bien utilizando bacterias conocidas pueden identificarse los anticuerpos en el suero del paciente. La identificación bacteriológica completa del agente patógeno es un proceso que lleva tiempo (3 o más días), mientras se intenta el reconocimiento del agente es posible la identificación serológica. En la aglutinación de los antígenos bacterianos con sus anticuerpos portaobjetos produce un agregado macroscópico.

OBJETIVO: Demostrar en el suero problema anticuerpos contra los antígenos bacterianos. MATERIAL Y EQUIPO

1. Muestras de sueros problema 2. Placa de vidrio marcada en 6 cuadros 3. Pipetas graduadas de 1 y 0.2 mL 4. Pipeta Pasteur 5. Placa oscilatoria 6. Equipo con antígenos: “O” de Salmonella typhi

“H” de Salmonella typhi “H” de Salmonella enteritidis paratyphi A “H” de Salmonella enteritidis paratyphi B Brucella abortus Proteus OX-19 DESARROLLO:

1. En una placa de vidrio perfectamente limpia se depositan 0.08 ml del suero problema en cada una de las seis divisiones.

2. Se agrega una gota de cada antígeno comenzando por la izquierda arriba, respetando el orden establecido.

3. Se mezclan las gotas con palillos diferentes y se agita suavemente en la placa de rotación durante dos minutos.

4. La lectura se hace observando la aglutinación macroscópica. 5. Si aparece aglutinación con alguno de los antígenos, continuar con el siguiente

paso. 6. Se toma otra placa y se depositan 0.08, 0.04, 0.02, 0.01, y 0.005 ml del suero

problema. 7. Se agrega una gota del antígeno seleccionado, se mezclan con un palillo y se

revisa la presencia de aglutinación. INTERPRETACIÓN:




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1. Los volúmenes de suero empleados corresponden respectivamente a diluciones 1/20, 1/40, 1/80, 1/160 y 1/320.

2. El titulo de anticuerpos del suero problema se reporta como el recíproco de la máxima dilución que muestra aglutinación.

3. La mayoría de los títulos mayores de 160 son presuntivos de infección. 4. La mejor indicación de una infección activa es un aumento en el título de dos

determinaciones sucesivas con una diferencia de 5-7 días concomitantes a la infección.




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PRACTICA 9 DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE INFECCIÓNES BACTERIANAS

(Prueba Rápida de Reagina, RPR)

INTRODUCCIÓN: La prueba de RPR es una prueba de floculación no treponémica macroscópica que es utilizada para detectar y cuantificar reaginas, un anticuerpo anti-lipídico encontrado en el suero o plasma de personas con sífilis y ocasionalmente en personas con infecciones agudas o crónicas en otras condiciones aparte de la sífilis. El antígeno utilizado en el equipo es una modificación del antígeno VDRL que contiene micropartículas de carbón para realzar la diferencia entre un resultado positivo y negativo. Si una muestra contiene reaginas, ocurre la floculación con las partículas de carbón contenidas en la suspensión del antígeno, la cual aparece como un cúmulo negro. Las muestras no reactivas se observan con un ligero color gris. OBJETIVO: Demostrar en el suero problema anticuerpos anti-lipídicos de personas con sífilis. MATERIAL Y EQUIPO

1. Muestras de sueros problema 2. Tarjetas de Prueba (círculos de aproximadamente de 18 mm) 3. Pipetas graduadas de 1 y 0.2 mL 4. Equipo con antígeno: Suspensión de Antígeno RPR conteniendo

micropartículas de carbón activado. Control Positivo RPR. Control Negativo RPR.

5. Rotador mecánico 6. Lámpara

DESARROLLO: Procedimiento cualitativo 1. Lleve a temperatura ambiente la suspensión del antígeno de RPR, los controles y las muestras. 2. Tome la pipeta/agitador del extremo sellado. Al tiempo que oprime y mantiene presionado dicho extremo, coloque la pipeta dentro de la muestra. Suelte para permitir que la pipeta aspire un poco de muestra. 3. Sostenga en posición vertical la pipeta/agitador directamente sobre un círculo de la tarjeta de prueba y coloque una gota de muestra sobre esta área. 4. Utilizando el extremo plano de la pipeta/agitador, extienda la muestra para cubrir el total de la superficie del círculo. Deseche la pipeta/agitador. Repita el mismo procedimiento para cada muestra. 5. Agite el frasco de la suspensión del antígeno antes de utilizarlo. Sosténgalo en posición vertical y dispense varias gotas en la tapa del frasco para asegurarse de que el paso por la aguja es correcto. No limpie la aguja. Coloque una gota de la suspensión del antígeno sobre cada muestra. NO EXTIENDA!




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6. Agite por 8 minutos a 100 rpm en un rotador mecánico. 7. Transcurrido este tiempo retire la tarjeta del rotador y agítela breve y suavemente. 8. Lea macroscópicamente bajo una lámpara de luz intensa. INTERPRETACIÓN: Reactivo: Presencia de flóculos grandes o pequeños en el centro o la periferia del círculo de prueba. Débil reactivo: Presencia de flóculos pequeños pero definidos. No reactivo: Apariencia lisa, uniforme pero sin flóculos visibles. Los resultados positivos deben ser confirmados mediante pruebas de las muestras utilizando procedimientos cuantitativos. Se recomiendan pruebas serológicas confirmativas como el ensayo de microhemaglutinación para anticuerpos treponémicos (MHA-TP). El diagnóstico final debe estar en base a la correlación de los resultados de prueba junto con otros hallazgos clínicos. Procedimiento cuantitativo 1. Seleccione los sueros positivos obtenidos en la prueba cualitativa. 2. Colocar en una gradilla cuatro tubos 12 x 75 mm y numerarlos. 3. Agregar a cada uno de ellos 0.5 mL de solución salina. 4. Depositar 0.5 mL de suero problema en el tubo No. 1 y mezclar. 5. Pasar 0.5 mL del tubo No. 1 al tubo No. 2 y mezclar. 6. Continuar esta operación hasta el tubo No. 4. 7. Depositar 0.05 mL de cada una de las diluciones sobre anillos diferentes de la placa de reacción. Extienda sobre el total de la superficie de cada círculo donde se colocaron las diluciones. 8. Añadir una gota de la suspensión del antígeno previamente resuspendido, exactamente sobre cada una de las gotas de las diluciones anteriores utilizando el frasco gotero al cual se le ha insertado la aguja No. 18 sin bisel. 9. Agite por 8 minutos a 100 rpm en un rotador mecánico. 10. Transcurrido este tiempo retire la tarjeta del rotador y agítela breve y suavemente. 11. Leer el resultado macroscópicamente. INTERPRETACIÓN: La última dilución que contenga agregados macroscópicos indica el título de la muestra. Ejemplo:

Número de tubo Dilución del suero Resultado 1 1:2 Positivo

2 1:4 Positivo

3 1:8 Positivo

4 1:16 Negativo

. El título del suero problema será: 1:8.




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LIMITACIONES DE LA PRUEBA El diagnóstico de la sífilis no debe ser hecho basado en un resultado positivo único de una prueba no treponémica, sin el soporte de una historia positiva o evidencia clínica. Las muestras de suero que son reactivas en pruebas cualitativas deben ser cuantificadas para establecer un tratamiento en el cual los cambios de título puedan ser determinados como un indicador de la respuesta al mismo. Las muestras de plasma no deben ser utilizadas para pruebas cuantitativas. Las muestras que son no-reactivas pero dudosas, se deben de repetir y cuantificar ya que se pueden detectar reacciones poco frecuentes de prozona.




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PRACTICA 10 FACTOR REUMATOIDE Y PROTEINA C REACTIVA

INTRODUCCIÓN: Los factores reumatoides son anticuerpos dirigidos contra los determinantes antigénicos de la región Fc de las IgG. En personas sanas, estos anticuerpos pueden hallarse en baja concentración, sin embargo se encuentra aumentado en la mayoría de los pacientes con artritis reumatoide. La determinación del factor reumatoide se lleva a cabo con partículas de latex cubiertas de IgG. La Proteína C Reactiva forma parte de las proteínas de fase aguda, un conjunto de proteínas del suero cuya concentración aumenta de manera drástica durante el daño tisular, la infección o el estrés. No es específica de una enfermedad sino que es un indicador del proceso inflamatorio. OBJETIVO: Realizar la determinación del Factor Reumatoide y la Proteina C Reactiva por aglutinación en placa. MATERIAL Y EQUIPO

1. Muestras de sueros 2. Placa de vidrio oscuro marcada 3. Pipetas graduadas de 1 y 0.2 ml 4. Aplicadores de madera o palillos 5. Pipeta Pasteur 6. Reactivo de latex-FR 7. Reactivo de latex- Proteína C Reactiva 8. Solución amortiguadora de glicina-cloruro de sodio pH 8.2 9. Solución salina isotónica 10. Placa rotatoria

DESARROLLO: Factor Reumatoide (FR). Por el método de aglutinación en latex en placa, utiliza una suspensión estabilizada de partículas de latex sensibilizadas con IgG humana.

1. El suero se inactiva previamente calentando en baño serológico a 56°C por 15 min o 60°C por 1 min. Ya inactivado se diluye 1:20 con amortiguador de glicina-cloruro de sodio colocando 0.1 ml de suero y 1.9 ml del amortiguador.

2. Se coloca una gota de la dilución en la placa de vidrio oscura y se añade una gota del reactivo latex-FR.

3. Se mezcla y se agita suavemente en la placa rotatoria durante dos minutos. 4. Se busca la aglutinación macroscópica. 5. La prueba semicuantitativa utiliza diluciones del suero 1/20, 1/40, 1/80, 1/160,

1/320 y 1/640, las cuales se preparan con 0.5 ml de la dilución 1/20 en 0.5 ml del amortiguador para una dilución 1/40 y así consecutivamente.

Proteína C Reactiva (PCR). Por el método de aglutinación en latex en placa. Utiliza una suspensión acuosa de partículas de latex recubiertas de anticuerpos específicos anti- Proteína C Reactiva.

1. El suero problema se diluye 1/5, 1/40 con solución salina isotónica y se coloca una gota de la dilución en una placa de vidrio oscuro.




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2. Se añade una gota del reactivo latex-PCR se mezcla bien y se agita suavemente en la placa rotatoria por 3 min.

3. Se busca la aglutinación macroscópica. 4. La prueba semicuantitativa utiliza diluciones del suero a partir de 1/80.




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PRACTICA 11 DETERMINACIÓN DE ANTIESTREPTOLISINAS

INTRODUCCIÓN: Las estreptolisinas son enzimas hemolíticas producidas por la mayoría de los estreptococos del grupo A, destruyen la membrana de los eritrocitos ocasionando la hemólisis. Este producto bacteriano es una de las muchas toxinas extracelulares y enzimas producidas por los estreptococos. En particular, la estreptolisina O recibe este nombre debido a que sensible al oxígeno, solo posee actividad en estado reducido, razón por la cual se le incorpora un reductor (el hidrosulfito de sodio) inmediatamente antes de usarla. En el laboratorio las ASO pueden determinarse por una reacción serológica de neutralización, en la cual si el suero del paciente contiene anticuerpos contra la enzima (antiestreptolisinas) neutralizarán su capacidad hemolítica y ocurrirá inhibición de la hemólisis. OBJETIVO: Determinar el titulo de anticuerpos contra la estreptolisina “O” en el suero problema MATERIAL Y EQUIPO Muestras de suero Suspensión de eritrocitos al 5% Amortiguador para ASO (fosfatos pH 6.5) Estreptolisina O Baño serológico Centrífuga Pipetas graduadas de 1 ml y 5 ml 15 tubos de ensaye de 10 X 75 mm DESARROLLO: 1. Preparar a partir del suero problema las siguientes diluciones iniciales:

a) 1:10 con 0.2 ml del suero problema + 1.8 ml de solución amortiguadora b) 1:100 con 0.3 ml de la dilución 1:10 + 2.7 ml de solución amortiguadora c) 1:500 con 0.6 ml de la dilución 1:100 + 2.4 ml de solución amortiguadora

2. Rotular los tubos de ensaye con números del 1 al 12 y dos más como control (+) y control (-). 3. Preparar diluciones secundarias añadiendo primero el volumen de solución amortiguadora y posteriormente el volumen del suero diluido según se indica a continuación: Tubos N° 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 (+) (-) ml amortiguador

0.1

0.4

--- 0.1 0.2 0.3 0.35

--- 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

0.75

Dilución 1:10 1:100 1:500 ml suero diluido

0.4

0.1

0.5 0.4 0.3 0.2 0.15

0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 --- ---

Unidades Todd

12 50 100

125

166

250

333 500

625

833

1250

2500

4. Mezclar suavemente y añadir a cada tubo 0.25 ml de estreptolisina, EXCEPTO al tubo control (-).




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5. Mezclar por agitación e incubar a 37°C por 15 min. 6. Añadir a cada tubo 0.25 ml de una suspensión de eritrocitos al 5%., mezclar e incubar a 37°C por 30 min. 7. Centrifugar los tubos a 2500 rpm por 2 min. 8. Comprobar la presencia de hemólisis completa en el tubo control (+) y la ausencia de hemólisis en el tubo control (-) 9. Determinar el título de antiestreptolisinas (unidades Todd) como el de la máxima dilución que no presenta hemólisis.




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PRACTICA 12 DETERMINACIÓN DE LA HORMONA GONADOTROPINA CORIONICA HUMANA

INTRODUCCIÓN: Las pruebas de laboratorio para el diagnóstico del embarazo se basan en la determinación de la gonadotropina coriónica humana (hGC), hormona producida por la placenta y que puede detectarse tanto en el suero como en la orina. La excreción de hGC alcanza su máximo durante la duodécima a decimocuarta semana de gestación y a partir de entonces desciende de nivel. Hasta los años 60, las pruebas de embarazo eran bioensayos en los cuales la presencia de la hGC en el suero o en la orina se demostraba por su efecto en animales. Las primeras pruebas utilizaban ratones y conejos, las pruebas ulteriores ratas hembra o ranas. Actualmente estas pruebas han sido sustituidas por pruebas inmunológicas. Las pruebas inmunológicas dependen del anticuerpo anti-hGC. La presencia de hGC en el suero u orina se demuestra por un sistema indicador. Los ensayo de aglutinación denominados de “inhibición de la aglutinación” consisten de eritrocitos de conejo o partículas de látex recubiertas con hGC. Cuando se realiza la prueba, el suero u orina de la paciente se incuban con el anticuerpo. Si existe hGC en la muestra, el anticuerpo es inactivado y los eritrocitos o partículas de látex no aglutinan. Si la muestra no contiene hGC, el anticuerpo permanece activo y se produce la aglutinación.

Además de la aglutinación, existen otras técnicas inmunológicas para la determinación de la hGC, tales como los inmunoensayos enzimáticos (ELISA) y el radioinmunoanálisis (RIA), el cual requiere de equipo especial para su realización. Esta técnicas varían en su sensibilidad, esto es las pruebas inmunológicas son, más sensibles al detectar concentraciones menores de hGC, por ejemplo las pruebas con eritrocitos tienden a ser más sensibles que la que emplean partículas de látex. OBJETIVO: Determinar la presencia de la hormona Gonadotropina Coriónica Humana en una muestra de orina. MATERIAL Orina del Paciente (10 ml) Solución salina isotónica (SSI) Equipo de diagnostico de hGC Pipetas serológicas de 1 ml DESARROLLO:

1. Se filtran unos 5 ml de orina o se centrifuga a 3000 r.p.m. 5 minutos para precipitar el material insoluble. Se usa el filtrado o el liquido sobrenadante

2. Se diluye un volumen de orina en dos volúmenes de solución salina, por ejemplo 0.5 ml de orina y 1.0 ml de solución salina.

3. Se colocan en el tubo apropiado 0.25 ml de antisuero anti-hGC, se agregan 0.25 ml de la orina diluida y se agita suavemente.

4. Se agrega una gota de la suspensión de eritrocitos sensibilizados y se agita suavemente hasta lograr una suspensión homogénea.

5. Se coloca en una superficie libre de vibraciones o del calor. De preferencia en una gradilla con el espejo adecuado.

6. Efectuar la lectura 2 horas después.




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RECOMENDACIONES 1. Los residuos de orinas anteriores falsearan la prueba. 2. Tubos diferentes a los apropiados distorsionan la lectura 3. No deben mezclarse los goteros o tocar con ellos los tubos de ensayo. 4. Los reactivos deben agregarse en el orden establecido.

INTERPRETACION

Para la lectura se interpretan los esquemas celulares en el fondo del tubo de ensayo Prueba positiva = un botón claramente definido Prueba negativa = un tapiz difuso de células

PRUEBA NEGATIVA PRUEBA POSITIVA




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PRACTICA 13 PRUEBA DE COOMBS

La prueba de Coombs se emplea para poner de manifiesto los anticuerpos que

no provocan una aglutinación visible. Para ello se utiliza el llamado suero de Coombs obtenido en conejos inmunizados con Ig humana. Éste funciona como anti-Ig que se enlaza con los Ac que hayan reaccionado con los determinantes antigénicos de los eritrocitos. Existen dos Pruebas de Coombs: la directa que demuestra Ac adheridos a eritrocitos, y la indirecta que demuestra la presencia de Ac en el suero. En esta practica se empleará para poner de manifiesto los Ac anti-Rh en el suero de la madre en la incompatibilidad materno-fetal. MATERIAL

Suero problema Suspensión de glóbulos rojos Rh + al 5% Pipetas graduadas de 1 y 5 ml Tubos de ensayo de 10 X 75 mm Solución salina isotónica Suero de Coombs

1. Colocar en una gradilla una serie de 6 tubos rotulados del 1 al 6 y se agregar 0.1 ml de solución salina cada uno de ellos.

2. Agregar 0.1 ml del suero problema al tubo n° 1, mezclar bien y transferir 0.1 ml al tubo n° 2 y así sucesivamente hasta el tubo n° 6 del cual se desechan 0.1 ml.

3. Añadir 2 gotas de la suspensión de eritrocitos a cada tubo y mezclar. 4. Agregar 1 gota del Suero de Coombs. 5. Incubar a 37°C por 30 minutos, mezclan suavemente y centrifugar a 1000

r.p.m. durante 1 minuto. 6. Desprender el botón suavemente y buscar la presencia de aglutinación.




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BIBLIOGRAFÍA

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2. JANEWAY, CHARLES A. Y TRAVERS PAUL. 1996. IMMUNOBIOLOGY THE

IMMUNE SYSTEM IN HEALTH AND DISEASE. 2ª EDICIÓN. CURRENT BIOLOGY-GARLAND.

3. ROITT, IVAN. 1994. ESSENTIAL IMMUNOLOGY. 8ª EDICIÓN. BLACKWELL

SCIENTIFIC PUBLICATIONS.

4. ROITT, IVAN. 1998. IMUNOLOGIA FUNDAMENTOS. 9ª EDICIÓN. PANAMERICANA.

5. ROITT, IVAN. BROSTOFF JONATHAN Y MALE DAVID. 1996. IMMUNOLOGY

4ª EDICIÓN. MOSBY.

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7. ABBAS, A. K. LICHTMAN A. H. Y POBER J. S. 1999. INMUNOLOGÍA

CELULAR Y MOLECULAR. 3ª EDICIÓN. INTERAMERICANA- McGRAW-HILL.

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