Informe de Técnica de

Inmunofluorecencia

Inirecta (IFI)

por

Miguel Angel Figueroa Núñez

Inmunología Clínica

TM. Marcelo Ramirez Sandoval

1

TABLA DE CONTENIDO

INTRODUCCIÓN 2

¿QUÉ ES LA INMUNOFLUORECENCIA INDIRECTA? 2

¿PRINCIPIO DE LA TECNICA? 2

SU UTILIDAD EN LA INMUNOLOGÍA CLÍNICA 3

OBJETIVOS 3

MATERIALES Y METODOS 4

MATERIALES UTILIZADOS 4

METODO OCUPADO 4

DESARROLLO DEL PASO PRÁCTICO 4

PROCEDIMIENTOS 5

CONTROL DE CALIDAD 6

INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS 7

RESUMEN DE LA TECNICA 7

INTERPRETACIÓN 8

RESULTADOS OBTENIDOS 8

LECTURA DE LOS RESULTADOS 13

VALORES DE REFERENCIA 13

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS 14

SIGNIFICADOS CLÍNICOS 14

DISCUSIÓN Y CONCLUCIÓN 15

BIBLIOGRAFÍA 16

2

INTRODUCCION

¿QUE ES LA INMUNOFLUORECENCIA INDIRECTA?

La inmunofluorecencia indirecta es un examen que se realiza a travez de la capacidad de

poder ver por medio de un microscopio UV la estimulación de un anticuerpo marcado con

un fluorocromo.

Se realiza mediante la técnica de Inmunofluorescencia Indirecta, que es la técnica de

elección para el screening de detección de estos autoanticuerpos debido a su alta

sensibilidad cuando el resultado es positivo con un título alto (1/160). Sin embargo presenta

una baja especificidad, por lo cual, su resultado siempre debe ser interpretado dentro del

contexto clínico del paciente. Ante un resultado positivo, y dependiendo del patrón

obtenido, generalmente es necesario continuar los estudios serológicos en busca de los

antígenos específicos asociados, para lo cual se utilizan inmunoensayos de mayor

especificidad, como el ELISA.

PRINCIPIO DE LA TECNICA

Para la detección de AAN se emplea la técnica de inmunofluorescencia indirecta IFI,

utilizando como sustrato laminas de monocapas de la línea celular HEp-2 (Human

Epithelioma type - 2,) esta línea celular deriva de carcinoma laríngeo humano), utilizando

como conjugado un antisuero (anti-inmunoglobulina G humana) conjugado con

fluoresceína isotiocianato (FITC) la cual emite fluorescencia color verde al observarse bajo

luz ultravioleta de alta energía (495 nm). Beck observo en 1961, que los sueros positivos

muestran patrones muy diferentes de fluorescencia nuclear, los que se describen como

Homogéneo, Periférico, Nucleolar, Moteado y centrómero. Actualmente ha cobrado gran

importancia la incorporación en los informes de la presencia de patrón citoplasmático

cuando éste es observado, debido a la gran ayuda en el diagnóstico, cuando se trata de

anticuerpos anti-mitocondrias o anticuerpos anti-músculo liso. Otro punto importante es la

información de patrones mixtos

3

SU UTILIDAD EN LA INMUNOLOGÍA CLÍNICA

La detección de autoanticuerpos en el diagnóstico de diferentes enfermedades

autoinmunes como:

Lupus Eritematoso Sistémico.

Enfermedad Mixta del Tejido Conectivo.

Síndrome de Sjogren.

Esclerosis Sistemática Progresiva.

Síndrome de CREST.

Cirrosis Biliar Primaria.

Artritis Reumatoide

OBJETIVOS

1. Detectar la presencia de anticuerpos circulantes contra:

a. Antígenos tisulares, como anticuerpos antinucleares (ANA),

antimitocondriales (AMA), antimúsculo liso (ASMA), anti-DNA,

antiendomisio (AAE) y anticuerpos anticitoplasma de neutrófilos

(ANCA) mediante el método de inmunofluorescencia indirecta (IFI).

2. Identificar los diferentes patrones y sustratos utilizados.

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MATERIALES Y MÉTODOS

MATERIALES UTILIZADOS

INSUMOS

PBS (Solución Buffer Fosfato) preparado 4 Placas Anticuerpos antinucleares.

Conjugado anti-inmunoglobulina G humana Universal (FITC) 5.0 ml. Inc.

Medio de montaje

Kit de detección Anticuerpos Antinucleares.

Micropipeta de 100 ul, 200ul, 1000ul

Puntas para Micropipetas (amarillas 200 ul. Azules 1000 ul.)

Tubos de Khan 75x13 mm

Cámara Húmeda de Incubación

Papel Filtro

Porta objetos 26x76 mm

Cubre objetos 24x50 mm

Cronómetro

Guantes

EQUIPOS

Microscopio para inmunofluorescencia

Vortex

DESARROLLO DEL PASO PRÁCTICO

Para la detección de autoanticuerpos presentes en muestras de sueros, se emplea la técnica

de inmunofluorescencia indirecta IFI, utilizando como sustrato:

Para ANA, láminas de monocapas de la línea celular HEp-2 (Human

Epithelioma type-2, derivado de carcinoma laríngeo humano).

Para ANCA, láminas de células polimorfos nucleares.

Para ASMA corte de tejido de hígado de rata.

Para AMA corte de tejido de riñón de rata.

Para Antiendomisio corte de tejido de esófago de mono.

Se agrega sobre estos sustratos el suero del paciente en estudio a una determinada dilución

dependiendo del autoanticuerpo específico que se busca. La unión antígeno-anticuerpo se

evidencia utilizando como conjugado un antisuero (anti-inmunoglobulina humana)

conjugado con fluoresceína isotiocianato (FITC) la cual emite fluorescencia color verde al

5

observarse bajo luz ultravioleta de alta energía (495 nm) en un microscopio de

fluorescencia con luz incidente.

PROCEDIMIENTO

1 Retirar del refrigerador el número de placas o pocillos de células HEp-2 y el

Conjugado anti-inmunoglobulina G Humana Universal FITC. Dejar que todos

los reactivos se estabilicen a la temperatura ambiente por 20 minutos.

2 Preparar solución PBS pH 7.2

3 Dejar que las muestras se descongelen a temperatura ambiente por 20 minutos.

4 Diluir las muestras de suero con PBS según la siguiente tabla con PBS, mezclar.

Examen AAN ADNA ASMA AMA ANCA EMA

Sustrato HEp-2 C.luciliae Riñón/Estom. Riñón/Estom. P.M.N. Esof./mono

Conjugado AntiIGG h. Immco 2100

AntiIGG h.

Immco 2100

AntiIGG .h.

Immco 2100

AntiIGG h.

Bindig Site

AntiIGG h.

Mico 2113

AntiGAMh

Dilución 1/40 1/10 1/20 1/20 1/20 1/2.5

Vol.Mx ul. 25 25 25 25 25 100

Vol.PBS ul 1000 250 500 500 500 150

5 Preparar cámara húmeda, se debe mojar el papel filtro que está en ella con PBS

y eliminar el excedente

6 Extraer el número de placas según el examen a realizar y colocarlas en la cámara

húmeda.

7 Enumerar las placas

8 Utilizar en los 2 primeros pocillos de las placas, control positivo, negativo cada

vez que se realice la técnica

9 Colocar 30 ul de Control negativo en el primer pocillo, 30 ul de control positivo

en el segundo pocillo.

10 Colocar 30 ul de las muestras diluidas en los siguientes pocillos dependiendo del

número de muestras a analizar, verificar que los pocillos queden completamente

cubiertos

11 Tapar la cámara húmeda con las placas en su interior. Incube por 30 minutos a

temperatura ambiente. No mover la cámara.

12 Hacer un esquema de las placas en el cuaderno de registros de IFI dibujando

exactamente el número de placas ocupadas y poniendo en cada cuadro que

representa un pocillo en número de la muestra procesada.

6

13 Lavar las placas durante 10 minutos en la misma cámara húmeda de incubación,

agregando PBS hasta cubrirlas.

14 Eliminar el PBS y lavar nuevamente por 10 minutos.

15 Eliminar nuevamente el PBS y secar las placas con papel absorbente evitando que

los pocillos entren en contacto con éste

16 Colocar las placas en la cámara húmeda y agregar 30 ul. de conjugado

correspondiente según el sustrato utilizado a cada pocillo.

17 Tapar la cámara húmeda e incubar 30 minutos a temperatura ambiente y oscuridad

18 Lavar nuevamente 2 veces por 10 minutos con PBS en oscuridad.

19 Secar las placas con papel absorbente y agregar medio de montaje a cada pocillo

de la placa.

20 Leer con microscopio de fluorescencia en habitación oscura.

21 Determinar el patrón de fluorescencia nuclear y registrar las lecturas de exámenes

en registro de IFI.

22 Si la muestra es positiva en la dilución de detección, determinar el valor realizando

diluciones múltiplo de 2 Ej. 1/80(Que no se tomara en cuenta en esta ocasión)-

1/160, hasta 1/640, si él título de la muestra en estudio es mayor informar titular

hasta punto final.

CONTROL DE CALIDAD

Como anteriormente hemos realizado los controles de calidad se deben colocar a principio

de los pocillos de reacción siendo primero en control negativo y segundo el control

positivo.

El Control Positivo debe proporcionar el marcaje específico descrito en el apartado

anterior.

El Control Negativo no debe proporcionar marcaje específico alguno.

Cada laboratorio debe establecer su propio programa de Control de

Calidad interno, así como procedimientos de corrección en el caso de que los controles no

cumplan con las tolerancias aceptables.

También es importante considerar estos puntos:

• Capacidad para revelar la presencia de anticuerpos.

• Ser metódico en el uso de los materiales para esta técnica y así

observar una buena corrida electroforética.

• Seguir las instrucciones de la técnica.

7

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

Informar Resultado (negativo ó positivo), patrón nuclear y título obtenido.

RESUMEN DE LA TECNICA

Después de colocar las muestras en cada placa seguir el siguiente esquema.

INCUBAR 30 MINUTOS A 20 -25 °C

LAVAR 2 VECES POR 10 MINUTOS CON PBS pH 7.25

AGREGAR CONJUGADO E INCUBAR 30 MIN.A 20-25 °C EN OSCURIDAD

LAVAR 2 VECES POR 10 MINUTOS CON PBS pH 7.25

AGREGAR MEDIO DE MONTAJE Y LEER EN MICROSCOPIO DE IFI

INFORMAR PATRON Y TITULO OBSERVADO

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INTERPRETACIÓN

RESULTADOS OBTENIDOS

Los dos primeros 2 pocillos son los controles positivo y negativo respectivamente, mientras

el control positivo presento un marcaje especifico, el control negativo mostro un marcaje

inespecífico, suave y homogéneo.

Luego en el pocillo 1 se coloca el control de patrón homogéneo (H), este se puede observar

en la imagen 2 que se muestra como ejemplo a continuación.

IMAGEN 2

9

A continuación en el pocillo 2 se coloca el control Moteado (M) se presentan en la imagen

3 que proponemos como ejemplo de enseguida.

IMAGEN 3

Después en el pocillo 3 se coloca el control Nuclear (N) que se expone en la Imagen 4 que

sigue a continuación.

IMAGEN 4

Y por último en el pocillo numero 4 colocamos el control del patrón centromérico (C) que

está en la presente imagen 5.

IMAGEN 5

10

Luego después de los controles pasamos las muestras las cuales dan negativas hasta el

suero 42 el cual resulta positivo y se realizan 3 diluciones, de las cuales solo usaremos

1/160 y 1/320. Las imágenes obtenidas se muestran a continuación.

SUERO 12, NEGATIVO, HOMOGENEO INESPECIFICO (IMAGEN 6)

SUERO 22, NEGATIVO, HOMOGENEO INESPECIFICO (IMAGEN 7)

11

SUERO 32, NEGATIVO, HOMOGENEO INESPECIFICO (IMAGEN 8)

SUERO 42, POSITIVO, MOTEADO (IMAGEN 9)

12

SUERO 42, DILUCIÓN 1/160, POSITIVO, MOTEADO (IMAGEN 10)

SUERO 42, DILUCIÓN 1/320, POSITIVO, MOTEADO (IMAGEN 11)

13

LECTURA DE LOS RESULTADOS

Imagen 12.

La observación de marcaje fluorescente específico descrito a continuación indica un

resultado positivo a la dilución recomendada.

ANA: Existen diferentes patrones de fluorescencia nuclear que pueden coexistir en un

mismo suero e incluso modificarse con la dilución del mismo. Los principales patrones

anti-nucleares son:

Homogéneo: Fluorescencia uniforme y homogénea en todo el interior del

núcleo de la célula en interfase. Fluorescencia intensa en las células en

mitosis.

Periférico: Marcaje en la periferia del núcleo, de mayor intensidad en el

perímetro interior, y marcaje homogéneo en el resto del núcleo.

Moteado: Marcaje fluorescente en forma de granulado grueso. Los nucléolos

no están marcados. Los gránulos pueden tener tamaños y formas diversas

dependiendo del antígeno que reacciona.

Nucleolar: Existen dos patrones nucleolares:

o Marcaje nucleolar de patrón homogéneo. A menudo acompañado de

un débil marcaje homogéneo en el resto del núcleo.

o Marcaje moteado de los nucléolos en células en interfase. Marcaje

puntual de las regiones organizadoras de los cromosomas mitóticos.

Centromérico: Punteado discreto en las células en interfase (46 puntos o

múltiples). Los puntos se alinean con los cromosomas en las células en

metafase.

Las muestras positivas pueden titularse. Se define el título como la dilución mayor que da

resultado positivo.

Cuando no se observa ninguno de los marcajes específicos descritos, el resultado es

negativo para los autoanticuerpos indicados.

VALORES DE REFERENCIA

Los valores de referencia indican negatividad he inespecificidad del marcaje de la de las

células HEp-2 en los pocillos.

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INTERPRETACIÓN Y ANALISIS DE LOS RESULTADOS

Como se describe anteriormente, los sueros, 12, 22, 32 resultaron ser negativas, las cuales

presentaron un patrón homogéneo e inespecífico en todas las células.

Sin embargo en el suero 42 se observa positividad así como en sus posteriores diluciones,

delas cuales podemos decir que tienen un patrón moteado.

SIGNIFICADOS CLÍNICOS

ANA: La determinación de anticuerpos anti-nucleares tiene una sensibilidad superior al

95% para el lupus eritematoso sistémico, y una baja especificidad2.

Homogéneo: Indicativo de lupus eritematoso sistémico.

Periférico: En pacientes con enfermedades del tejido conectivo.

Moteado: Asociado al lupus eritematoso sistémico, enfermedad mixta del tejido conectivo,

síndrome de Sjögren, polimiositis o escleroderma.

Nucleolar: En aproximadamente un 50-70% de pacientes con solapamiento de

escleroderma y polimiositis/dermatomiositis. Se presenta en hasta un 33% de pacientes con

escleroderma sistémica, especialmente con complicaciones renales2.

Centromérico: En pacientes con esclerosis sistémica, especialmente en la forma de la

enfermedad con implicación cutánea (80%). Ocasionalmente, en otras enfermedades

conectivas3.

El diagnóstico clínico no debe basarse exclusivamente en el resultado de este ensayo, sino

que debe integrar los datos clínicos y de laboratorio.

DISCUSIÓN Y CONCLUSIÓN

Como se menciona anteriormente, el suero 42 es el único que presenta positividad nuclear,

con un patrón moteado. Este patrón esta asociado al lupus eritematoso sistémico,

enfermedad mixta del tejido conectivo, síndrome de Sjögren, polimiositis o escleroderma.

El experimento se realizó con normalidad y no presento mayores dificultades, sin embargo

solo fue posible fotografiar las muestras debido al tiempo que llevaba ver y analizar cada

uno de los sueros, para ver su patrón he indicar el resultado.

Debido a los antecedentes podemos decir que la se describieron anteriormente, puedo decir

que el suero 42 es positivo, con una concentración de anticuerpos mayor a 1/320,

probablemente con Lupus Eritematoso Sistémico, pero debe ser confirmado con otros

análisis y con la clínica del paciente.

Esto también es un antecedente de cómo podemos utilizar la capacidad de fijación de las

células a un portaobjetos (HEp-2) y ver como se unen los anticuerpos presentes en los

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sueros problemas, los cuales se conjugan con Anticuerpos marcados con FITC, lo que dará

como resultado un color verde como respuesta a la estimulación con luz ultravioleta.

Esta tecnología resulta de vital importancia y hoy está en gran parte de los laboratorios y

campos clínicos de Chile, pero es un análisis caro y requiere de entrenamiento por parte de

los que lo manipulan y observan. Por lo que se convierte en una herramienta de gran ayuda

aprenderla, reconocerla y ponerla en práctica para salir altamente preparados para enfrentar

la labor clínica.

REFERENCIAS

1) Ramirez, Marcelo. Manual de Laboratorio de Inmunología

Clínica. Edición 2013. Santiago, Chile. Pags. 3-6.

2) Figueroa, Miguel. Fotografías prueba Inmunofluorecencia

Indirecta. 2013. 6-11. Universidad Iberoamericana de Ciencias y

Tecnología, Ramo Inmunología Clínica.

3) Imágenes obtenidas en google (obtenidas bajo es buscador de

imágenes (1-5). 2013.

https://www.google.cl/search?q=inmunofluorescencia+indirecta+en+celulas+he

p-2&espv=210&es_sm=93&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ei=eb-

GUq2AGdWq4APOv4HoDQ&ved=0CAkQ_AUoAQ&biw=1137&bih=595&d

pr=0.9#es_sm=93&espv=210&q=inmunofluorescencia+indirecta+en+celulas+h

ep-2+patron+centromerico&tbm=isch&imgdii=_

4) Imagen 12 obtenida del inserto: ” ANTI-NUCLEAR ANTIBODIES

hep-2 (ANA-hep-2)”. BioSystem. 2006.

5) Robles Marhuenda, A. Ramos-Casals, M. “Significado clínico de

los anticuerpos antinucleares”. 2005. Doyma.es.