Prof.: Dr. Reinaldo de Armas PhD.

Biotecnología AnimalLCPA 425Módulo #2

Principios de determinación de genes de importancia en la producción animal

Técnicas de modificación genética en plantas y animales

Empleo en producción animal de organismos modificados genéticamente

Problemas éticos en la modificación genética

Módulo 2. Principios de modificación genética de los organismos vivos y su aplicación en la producción animal:

Síntesis del ADN

Síntesis del ARN (transcripción del ADN)

GENES Y POLIPEPTIDOS

Pasos del ADN a la proteína

Un gen es parte del ADN en un cromosoma.La información contenida en el gen y "escrita" en el código genético, es transcripta en el ARN mensajero.El ARN mensajero, con la información, forma una cabeza y una cola para dejar el núcleo.El código en el ARNm es "traducido" por una maquinaria molecular en el ribosoma, que construye las largas cadenas de aminoácidos "síntesis" que forman una proteína.La proteína finalmente se organiza tridimensionalmente en su forma funcional.

Pruebas de ADN

• Los principios de las pruebas de ADN son los mismos para identificación de progenie (descendencia-ascendencia), que para características relacionadas con factores hereditarios de producción, características fenotípicas o de salud. Estás técnicas son más seguras y acertadas que las pruebas serológicas de grupo sanguíneos u otros antígenos serológicos. Las pruebas de ADN son una herramienta indispensables para la clonación de genes, donde un gen desconocido es identificado encontrando conexiones o asociaciones entre marcadores de ADN y la característica buscada.

Capacidades, limitaciones y controversias sobre las pruebas de ADN.

Potencial discriminatorio: El grupo sanguíneo discrimina un individuo entre miles, las pruebas de antígenos de superficie celulares (hematíes o leucocitos), logran hasta uno entre millones, pero las de ADN permiten la exclusión de uno entre billones.

Nivel de sensibilidad: Las pruebas de ADN pueden desarrollarse hasta con células de la raíz de un pelo y en contraste con las proteínas el ADN puede ser amplificado con PCR y pueden producirse grandes cantidades de ADN de muestras muy pequeñas para repetir las pruebas las veces que sea necesario limitando las posibilidades de errores.

Aplicables a cualquier tejido corporal: Las pruebas serológicas necesitan muestras sanguíneas mientras las de ADN pueden realizarse sobre cualquier célula.

Estabilidad: El ADN es más estable que las proteínas y muy resistente a la degradación por los agentes que normalmente están en el medio.

FRECUENCIA ALÉLICA ?????????????

Todas las pruebas basadas en ADN parten de la base de que el genoma de cada individuo es único (gemelos idénticos).

La diferencia ya sea pequeña o grande entre las secuencias de nucleótidos entre individuos, es lo que se conoce como polimorfismo de ADN. En estas pruebas se evalúan tanto el polimorfismo por repeticiones de secuencias (tandem) o por longitud de fragmentos de restricción.

Polimor f ismo en ADN : Base de las determinaciones de ADN

ADN repetido en tandem

• El genoma eucariota esta densamente poblado por islas de secuencias cortas que son repetidas una y otra vez en pequeños o largos lazos llamados minisatélites o microsatélites.

• Para cada locus repetitivo, el número de repeticiones es muy variable entre individuos y la heterocigosis es alta (Ej. El número de repeticiones es usualmente diferente incluso entre el par de cromosomas homólogos en un mismo individuo). Analizando el número de repeticiones en uno o más locis nos dan una medida altamente confiable de la identidad individual y es la técnica mas empleada en los estudios de parentesco.

En la figura aparece un caso de segmentos de ADN donde aparecen 3 y 8 repeticiones. La digestión se realizó con la enzima de restricción Hinf1que hibridizan en la zonda (rojo)

Un cambio de bases simple frecuentemente introduce o cierra el sitio de entrada de una enzima de restricción. Por ejemplo una mutación que cambie la secuencia AGATCC A GGATCC va a introducir en un sitio del ADN la enzima BamH1. Esta variación de secuencia difícil de ocurrir, particularmente en regiones no codificantes y determinará o no un grupo particular de sitio de restricción en el ADN y consiste en un método de diferenciación individual muy eficaz.

Debido a que el polimorfismo en los sitios de restricción se traducen en variabilidad en el largo de los fragmentos después e la digestión del ADN con la enzima de restricción, ese marcador de ADN se conoce como polimorfismo de longitud de fragmento de restricción RFLPs.

Variabilidad en sitios de restricción

En la figura se muestra a un RFLPs con BamH1 en la cual la cadena de arriba tiene solo 2 sitios GGATCC mientras que la de abajo posee 3 . La digestión seguida de hibridización con la sonda (rojo) nos revela 2 fragmentos que difieren en tamaños.

ADN repetido en tandem

Hay una remarcada variabilidad en la talla genómica entre los eucariotas que tiene una pequeña relación con la complejidad de los organismos, ploidia o numero de genes codificadores . Por ejemplo hay plantas que tienen mas de 6 veces la cantidad de genes que el humano. Muchas de estas variaciones se deben a segmentos repetitivos en tándem de regiones no codificantes. De esta forma una fracción sustancial del genoma de muchos eucariotas está compuesto por cortas secuencia repetitivas en tandem en pequeñas y apretadas madejas. NVRT (número variable de repeticiones en tandem)

Las secuencias repetitivas en tandem se agrupan en:

Satélites: son altamente repetitivos con longitudes repetidas de una algunos miles de bases. Estas secuencias se organizan típicamente como largos conglomerados en las regiones heterocromáticas de los cromosomas, cerca de los centrómeros y telómeros, estos se encuentran abundantemente en el cromosoma Y.

Minisatélites son moderadamente repetitivos, tienen una talla moderada (9 – 100pb, usualmente alrededor de 15pb). Generalmente se encuentran en regiones eucromáticas de cromosomas de vertebrados n, hongos y plantas y poseen una talla muy variable (de 0.5 a 30kb).

Microsatélites son moderadamente repetitivos y compuestos por series cortas (2 a 6 pb) repetidas. Se encuentran en genomas de vertebrados, insectos y plantas. El genoma humano contiene al menos 30 000 microsatélites, localizados en la eucromatina. El número de copias son variables dentro de una misma población .

En general los satélites de ADN han mostrado una variabilidad excepcional entre individuos , particularmente en cuanto al número de repeticiones en un determinado locus. Los locus de los minisatélites son las secuencias mas altamente polimórficas descubiertas en el genoma hasta ahora.

Pruebas de ADN

Las técnicas de pruebas de ADN son la demostración de secuencias determinadas y de determinada longitud. Esto puede lograse por digestión del AND por enzimas de restricción, seguidas por hibridización (Southern blot) usando sondas específicas para los sitios polimórficos. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) son de gran importancia para estos trabajos y poseen ventajas sobre Southern blotting, ya que requieren mucha menos cantidad de ADN e incluso puede utilizar ADN parcialmente degradado. En el PCR los primers (moldes o lectores) están diseñados para flanquear el segmento del locus y la talla de los productos se corresponderá con el número de repeticiones. Generalmente el término de huellas digitales es usado para describir todos los procedimientos para caracterizar RFLPs, VNTRs y otras secuencias polimórficas

Conceptualmente hay dos diferentes t ipos de exámenes de huellas digitales (f ingerprinting) son comúnmente desarrol lados por VNTR (Variable Number Tandem Repeats) o RFLP(Restriction fragment length polymorphisms):

Fingerprinting de ADN en un locus simple: El Polimorfismo en un locus simple es caracterizado usualmente por medio de una sonda específica o un molde lector de PCR. Ya que el locus simple detectado por esta prueba caracteriza el genotipo de ADN.

Fingerprinting de ADN en locus multiples: El Polimorfismo en locus múltiples es simultáneamente identificado. Esto puede realizarse por una aplicación de una mezcla de sondas para locus simples o aplicación de una sonda simple que identifica múltiples secuencias polimórficas. En último caso, se detectan fragmentos no identificados de ADN y el resultado es de esta forma el fenotipo del ADN, más que el genotipo.

Cada uno de los métodos tienen ventajas sobre el otro. Por ejemplo el método de locus simple es usado cuando el ADN está degradado o mesclado. El multilocus generalmente provee más información por muestra (Ejemplos a continuación).

Ejemplo 1:Fingerprinting de Locus Simple:

Fingerprinting en Minisatélite para demostrar parentesco usando mezclas de dos o tres locus con sondas de locus simples.(sondas sets 1 y 2). El locus detectado en la progenie (C) es claramente compatible con la madre (M) y el padre (F)

Ejemplo 2: Fingerprinting en locus múltiples

Fingerprinting en Microsatélite para establecer parentesco.

La sonda, (CAG)51 reconoce una gran cantidad de locus. Examine las bandas que detectadas en el ADN de la cría que no aparecen en el ADN de la madre y determina cual es el padre biológico.

Ejemplo 3: Fingerprinting de locus múltiples

Fingerprinting de locus múltiples para encontrar evidencias de un crimen con varios sospechosos. Cual de los sospechosos estará implicado?

Pasos de la Ingeniería genética para modificar organismos vivos:

•Identificar un carácter deseable, pero que no pueda ser manejado por los métodos clásicos de mejoramiento.

•Encontrar el gen responsable del carácter deseado, en dicho organismo.

•Encontrar algún organismo que lo exprese.

•Combinar dicho gen con otros elementos necesarios para que éste sea funcional en la planta.

•Transferir los genes deseados a las células de la planta o animal.

•Encontrar las células modificadas exitosamente, y regenerarlas en plantas o animales completamente funcionales.

Década de los ‘90-En 1990 el gobierno de los Estados Unidos aprueba el primer producto alimenticio modificado a través de la biotecnología: Una enzima usada en la elaboración de queso.-En 1991 en muchos paises comienzan a generarse interés por parte de compañías internacionales y de grupos de investigación nacionales para la realización de ensayos con organismos genéticamente modificados. Es así como se crea una instancias de consulta y apoyo técnico para asesorar a los sectores de Agricultura, Ganadería, Pesca y Alimentación en la formulación e implementación de la regulación para la introducción y liberación al ambiente de materiales animales y vegetales obtenidos mediante Ingeniería Genética-En 1994, la soja RR, desarrollada a través de la biotecnología es aprobada por la USDA (Unites States Department of Agriculture) y la FDA (Food and Drug Administration).-La EPA (Environmental Protection Agency) lo aprueba en 1995.-Se lanzada al mercado en 1996.-En 1994 el primer producto alimenticio mejorado a través de la biotecnología es puesto en las góndolas de los supermercados, en norteamérica: El tomate FlavrSavr, que contiene un gen que retraza su maduración y prolonga su durabilidad (por ser un fracaso comercial, tiempo después fue retirado).-En Estados Unidos, los primeros cultivos mejorados mediante la biotecnología son comercializados, incluyendo algodón y tomates resistentes a insectos, así como también soja, canola y algodón mejorado con control de malezas.-Se aprobaron los siguientes cultivos: soja resistente a insectos, maíz tolerante a herbicidas y resistente a insectos y algodón tolerante a herbicidas. -En 1996 se autorizó la comercialización de la Soja Tolerante a herbicidas

Soja resistente a herbicidas 80%Maíz Bt 6%Maíz LL 0.25%Algodón Bt 2.7%

2000Se logró la primera decodificación completa del genoma de una planta.2001Se decodificó el genoma humano.Se decodificó el genoma del arroz.

Superficie sembrada en Argentina

Problemas éticos de la Modificación Genética