Biotec 2015 PCR 1era Parte
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1 1 PCR (Polymerase chain reaction) Reacción en cadena de la polimerasa 1era parte Joan Miró i Ferrà (1893-1983 ) COMO SE OBTIENE UN GEN AISLADO ??? Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 1985
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pcr
Transcript of Biotec 2015 PCR 1era Parte
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1
PCR
(Polymerase chain reaction)
Reacción en cadena de la polimerasa
1era parte
Joan Miró i Ferrà
(1893-1983 )
COMO SE OBTIENE UN
GEN AISLADO ???
Reacción en cadena
de la polimerasa (PCR)
1985
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Un lirio de agua produce una hoja nueva cada día, por cada hoja que tenía el día anterior.
Comenzando con una única hoja, el lirio cubre un estanque de media hectárea en unos 30 días.
Cuánto tardará en cubrir un estanque de una hectárea?
La respuesta correcta es 31 días, no 60, porque el tiempo de duplicación es de un día.
En condiciones de crecimiento exponencial, los seres vivos se multiplican con una asombrosa
rapidez. Durante cada tiempo de duplicación se producen tantas nuevas células como se habían
producido anteriormente de manera acumulada.
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PCR
(Polymerase chain reation)
Reacción en cadena de la polimerasa
-1985-
Es un método para sintetizar enzimáticamente
un fragmento de DNA
-Específico. Es posible sintetizar un fragmento presente en una mezcla
-Sensible. Requiere muy pocas moléculas de templado (ng)
-Rápido. ~ 3 min por ciclo de síntesis
-Simple. …..es una reacción enzimática
KB Mullis
Premio Nobel Qímica
1993
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5
BREVE HISTORIA DE LA PCR
El DNA es aislado por
1era vez
1993, KB Mullis, Premio Nobel de Química
El DNA es amplificado por
1era vez utilizando DNA pol
de E. coli
El DNA es amplificado por
1era vez utilizando DNA pol
de T. aquaticus
Taq DNA pol es clonada y
expresada en E. coli
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• The Polymerase Chain Reaction was developed
from an idea by Kary B. Mullis.
– Born in 1944 in Lenoir, North Carolina.
– B.S. – Chemistry - Georgia Institute of Technology (1966).
– Ph.D. - Biochemistry - University of California at Berkeley (1972).
– Post-doctoral research at the University of Kansas Medical School.
• At the time Dr. Mullis thought up PCR in 1983, he was working at Cetus, one of the first biotechnology companies, in Emeryville, California. There he was charged with making short chains of DNA for other scientists. Mullis has written that he conceived of PCR while cruising along the Pacific Coast Highway 128 one night on his motorcycle. He was playing in his mind with a new way of analyzing mutations in DNA when he realized that he had instead invented a method of amplifying any DNA region.
• Mullis received a $10,000 bonus from Cetus for his invention. In 1992 Cetus, sold the patent for PCR and Taq polymerase to Hoffmann-La Roche for $300 million.
• Mullis was awarded the Nobel Prize for Chemistry in 1993.
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7
Replicación del DNA
División celular
Helicasas específicas desenrollan y
desnaturalizan el DNA.
Una RNA polimerasa sintetiza
“primers” complementarios a una de
las hebras.
La DNA polimerasa reconoce el
híbrido DNA/RNA como sitio de inicio
de replicación y produce la hebra
complementaria.
PCR
El DNA es desnaturalizado por
exposición a alta temperatura.
Secuencias sintéticas de DNA
simple cadena sirven de “primers”.
Cada uno complementario a una
hebra opuesta.
La DNA polimerasa reconoce cada
“primer” unido al DNA e inicia una
replicación circunscripta a la zona
delimitada por los “primers”
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Elementos para la reacción de PCR
“primers” DNA
templado
DNA
polimerasa MgCl2 dNTPs
5
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ETAPAS DE LA REACCIÓN
Repetición múltiple de tres etapas (cadena)…
Desnaturalización
El DNA es desnaturalizado en cadenas simples a altas temperaturas
Extensión
Los “primers” son extendidos por acción de la DNA polimerasa
Unión de los “primers”
Hibridización de los oligonucleótidos sintéticos a bajas temperaturas
1
2
3
Las tres etapas constituyen 1 ciclo
10
Desnaturalización
Unión de los “primers”
Extensión de los “primers”
Ciclo 1
6
11
Ciclo 2 Desnaturalización
Unión de los “primers”
Extensión de los “primers”
12
Ciclo 2
Ciclo 3 Amplifica ~ en el orden de 106 veces
Puede generar g de producto!!
En cada ciclo, la secuencia de DNA
limitada por los “primers” se duplica ….
7
13
Co
pia
s d
el
frag
men
to a
mp
lifi
cad
o
20
108
107
106
105
104
103
102
10
2 12 6 4 14 8 10 16 18
Número de ciclos de PCR
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Primers , dNTP, DNA polimerasa, Mg++
Desnaturalización
Unión
“primers
”
Extensión
95ºC
50-60ºC
72ºC
variación de la temperatura en un ciclo de PCR
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Melting
94 oC
Tem
per
ature
100
0
50
T i m e
5’ 3’
3’ 5’
Melting
94 oC
Tem
per
ature
100
0
50
T i m e
3’ 5’
5’ 3’
Heat
9
Melting
94 oC Annealing
Primers
50 oC
Extension
72 oC
Tem
per
ature
100
0
50
T i m e
3’ 5’
5’ 3’
5’
5’
Melting
94 oC
Melting
94 oC
Melting
94 oC Annealing
Primers
50 oC
Extension
72 oC
Tem
per
ature
100
0
50
T i m e
30x
3’ 5’
5’ 3’
Heat
Heat
5’
5’
5’
10
Melting
94 oC
Melting
94 oC Annealing
Primers
50 oC
Extension
72 oC
Tem
per
ature
100
0
50
T i m e
30x
3’ 5’
5’ 3’ 5’
5’
5’
5’
5’
5’
Melting
94 oC
Melting
94 oC Annealing
Primers
50 oC
Extension
72 oC
Tem
per
ature
100
0
50
T i m e
30x
3’ 5’
5’ 3’ 5’
5’
5’
5’
5’
5’
Heat
Heat
11
Melting
94 oC
Melting
94 oC Annealing
Primers
50 oC
Extension
72 oC
Tem
per
ature
100
0
50
T i m e
30x
3’ 5’
5’ 3’ 5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
Fragments of defined
length
Melting
94 oC
Melting
94 oC Annealing
Primers
50 oC
Extension
72 oC
Tem
per
ature
100
0
50
T i m e
30x
3’ 5’
5’ 3’ 5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
12
23
100C
90C
80C
70C
60C
50C
40C
30C
Desnaturalización
Extensión
Unión de “primers”
~ 20-35
ciclos
Detección
dsDNA ssDNA
“primers”
DNA
polimerasa
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Automatización del PCR
Termociclador: permite el control
computarizado de los cambios de
temperaturas requerido
Taq polimerasa: DNA polimerasa
termoestable aislada de la bacteria
extremófila Thermus aquaticus que habita
en aguas termales resistiendo
temperaturas cercanas a los 100C
13
DNA polimerasas termoestables
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Detección del producto de PCR
Electroforesis en geles de agarosa o poliacrilamida
dependiendo del tamaño del fragmento amplificado
14
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Los primers son oligonucleótidos de simple hebra, cortos, sintéticos, a menudo no más de 50 y
usualmente entre 18 y 25 nucleótidos de largo los cuales son complementarios al comienzo y al
final del fragmento a ser amplificado
Construcción de primers
Si los primers son de un largo menor a 25 nucleotides, la temperatura de melting se calcula
aproximadamente: Tm = 4 (G+C) + 2 (A+T)
5´CCCATTTTAGAGATATGACACAGATACAGATACAGGTCGCTCGCTCGCTCGCTCGCTCGCTCGCTCGATATAGTACCATACATACATACATG 3´ 3´GGGTAAAATCTCTATACTGTGTCTATGTCTATGTCCAGCGAGCGAGCGAGCGAGCGTGCGAGCGAGCTATATCATGGTATGTATGTATGTAC 5´
5´CCCATTTTAGAGATATGACT 3´
3´CATGGTATGTATGTATGTAC 5´
Forward (hacia delante)
Reverse (hacia atrás) 5´CATGTATGTATGTATGGTAC 3´
5´CCCATTTTAGAGATATGACT 3´
5´CCCATTTTAGAGATATGACT 3´
3Gs, 4Cs, 6As, 7Ts
Tm = 4 x 7 + 2 x 13
Tm = 28 + 26
Tm = 54C
Estimación de las temperaturas de “melting” y “annealing” de los primers:
La temperatura de annealing es aprox 5C menor a la Tm, 49C
(Dirección de la síntesis)
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Algunas aplicaciones del PCR
Investigación básica
Medicina
Detección de agentes infecciosos (virus, bacterias, etc)
Diagnostico de enfermedades genéticas
Antropología y Ciencias forenses
Restos fósiles
Filiación
Detección de personas
Agronomía y diversidad
Identificación de variedades vegetales
Detección de transgénicos
Veterinaria
Sexado de embriones
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3ra etapa: electroforesiss
+
-
Que individuo es carrier?
individuos
PCR-RFLP (Restriction fragment length polymorphism)
ej.:Sickle cell (SSD), hemoglobina cadena-b Glu6Val6
1era etapa: PCR
A
T
Gen normal
T A
Gen mutado
2da etapa: Cortar con Mst II.
1. 2. 3. 4.
30
Electroforesis en gel de poliacrilamida
+
-
Las cualtro muestras provienen de una
familia; indique cuales son los padres
(sanos) y cuales los hijos enfermos.
Primers:
Gen CFTR
Detección de una deleción
ej.: Fibrosis Cistica, mutación ΔF508: deleción de 3 bp (codon de fenilalanina)
Producto normal
Producto mutado
(mas corto)
1 2 3 4
16
31 Qué individuo tiene DMD?
Identificación de deleciones grandes
ej.: DMD (Duchenne distrofia muscular)
Herencia ligada al crom X (frecuencia 1: 3500 hombres)
El gen mas grande conocido (2 millones pb)
Producto: Distrofina (MW 426 kD)
Primers complementarios a la secuencias delecionadas
B A
Ubicación de deleciones
C
1 2 3 4
32
PCR múltiple
Gen afectado
X X X
300 pb
450 pb
700 pb
Los “primers” son complementarios a la secuencia mutada de modo
que sólo se produce amplificación si la mutación está presente.
17
33
Análisis de distintas mutaciones en
forma simultánea.
Patología: Fibrosis Quística
Cada tubo contiene los “primers” necesarios
para detectar 12 mutaciones
Mutaciones detectadas
Nro de individuos: 3 [para cada individuo se llevaron a cabo 2
reacciones de PCR (A y B) para detectar distintas mutaciones ]
34
ASA: “Allele Specific Amplification”
STOP
STOP
... ...
DNANormal
PN: primer normal
3’
3’
PMt: primer mutado
... ... DNANormal
PN: primer normal DNAMutado
... ...
3’
... ...
DNAMutado
PMt: primer mutado
3’
Principio: si el terminal 3´del primer no es complementario al templado
NO se genera producto de PCR
18
35
Primera reacción de PCR
Segunda reacción de PCR, se utiliza
el producto obtenido en la primera
reacción y primers que hibridicen en
una región interna; obteniéndose un
fragmento de menor tamaño.
“Nested”-PCR o PCR “anidado”
VENTAJAS: MAYOR SENSIBILIDAD, MAYOR ESPECIFICIDAD
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Comparación visual de los productos de una reacción de PCR y nested-PCR
Líneas 1-9: el templado utilizado en la línea 1 fue diluido sucesivamente 10 veces en las siguientes líneas.
Líneas 10-18 nested-PCR utilizando como templado el producto obtenido en las líneas 1-9
“Nested”-PCR o PCR “anidado”
19
37
SECUENCIA 100% HOMOLOGA A
LA QUE SE QUIERE ANALIZAR
SECUENCIA PARCIALMENTE HOMOLOGA
A LA QUE SE QUIERE ANALIZAR
“Nested”-PCR o PCR “anidado”
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El PCR generalmente genera fragmentos con finales imperfectos que son
difíciles de clonar:
- La Taq polimerasa puede adicionar A en el terminal 3’ de los fragmentos
- Esos terminales necesitan ser eliminados antes del clonado
- O…. clonar en un vector que posea sus terminales con una T
desapareada
Subclonado de fragmentos de PCR
T T
A A
Producto de
PCR
20
39
Ciclo 1
Ciclo 2
Adición de sitios de restricción a elección, en un fragmento de DNA
Subclonado de fragmentos de PCR
40
Ciclo 1
Ciclo 2
Digestión
Adición de sitios de restricción a elección, en un fragmento de DNA
Subclonado de fragmentos de PCR
Subclonado en un vector adecuado
Enzima 1 Enzima 2
21
41
PCR en emulsion “Emulsion PCR” (ePCR) [Tiene utilidad para reacciones de secuenciamiento que se
vera en clases proximas ]
42
Medición de los niveles de expresión de genes
Diseño de los “primers” para la síntesis de cDNA
mRNA
mRNA
mRNA Al azar
Oligo (dT)
Específico
RT-PCR [amplificación de cDNA]
Síntesis de cDNA por Transcripción Reversa (RT) seguida de
amplificación por PCR
22
43
mRNA
1. Aislamiento de RNA total
3. PCR usando el cDNA como templado y dos “primers” específicos
4. Electroforesis en geles de agarosa
Transcriptasa Reversa
2. Síntesis de cDNA
1era hebra del cDNA
En el 1er ciclo de PCR se sintetiza la 2da hebra de cDNA y luego se prosigue como una PCR estándar
RT-PCR
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-Los productos de PCR son detectados por electroforesis en geles. Para
la electroforesis, se necesitan de 20-25 ciclos para producir cantidad
suficiente y detectable.
-Permite análisis fundamentalmente Cualitativos
Limitaciones de la PCR y la RT-PCR
Rango de sensibilidad de
la electroforesis
# de ciclos de PCR
[ Reactivos ]
[ DNA ] 10 copias iniciales
50 copias iniciales
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RT-PCR no competitivo:
Mide los niveles de RNA (cDNA) utilizando un control interno.
No determina la cantidad absoluta de RNA, es útil para comparar la expresión de un mismo
RNA en distintos tejidos o distintas condiciones. Se debe realizar PCR a distintas
concentraciones de templado a fin de trabajar en la zona lineal de generación de producto.
cDNA ubicuo
(GAPDH)
Cantidad de cDNA
cDNA
PCR semicuantitativo (para la determinación de RNAm)
El control interno (GAPDH) es utilizado para controlar la cantidad de cDNA utilizado como templado
Tejido A Tejido B
![Corp biotec resumen srib-enero2011 (2)[1]](https://static.fdocuments.ec/doc/165x107/55b51c96bb61eb07698b47fa/corp-biotec-resumen-srib-enero2011-21.jpg)
