Determinación Experimental de Estructuras de Proteínas

Universitat de València - Grado en Química Prácticas de Bioquímica y Química Biológica

P1 - Representación y Análisis de Estructuras de Macromoléculas

Actualizado: 09/17/2019 10:32:46

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Introducción

Bases de Datos de Información EstructuralEn la actualidad se conocen con detalle atómico mas155,000 estructuras tridimensionales demacromoléculas biológicas. Cada una de ellas hasido determinada experimentalmente, utilizandodistintos métodos, principalmente Difracción deRayos-X (~90% de los casos), Resonancia magnéticaNuclear (RMN) (~9% de los casos), y en menormedida, Microscopía Electrónica y otras técnicasde difracción.

Toda esta enorme información estructural estádisponible de forma libre para la enseñanza, lainvestigación la sanidad o la industria. Para ellose utiliza un formato especial único (formato pdb), enel cual se escribe la estructura de cada proteínaen un fichero de texto y se le asigna un códigopropio de identificación (pdb-ID). Todos los ficheros deestructuras se depositan y organizan en un archivoúnico accesible sin restricciones a través deInternet.

El archivo único de estructuras 3D demacromoléculas es gestionado a nivel Mundial através del Consorcio Worldwide Protein Data Bank(wwPDB), formado por cuatro miembros: dos en USA(RCSB PDB y BMRB), uno en Europa (PDBe) y uno enJapón (PDBj). Cada uno de ellos organiza eldeposito de nuevas estructuras, a la vez que mantiene una copia del archivo de estructurascompleto, a través de las bases de datos RCSB PDB, PDBe y PDBj.

Las bases de datos facilitan el acceso a la información estructural a través de herramientas debúsqueda. Además, proporcionan información estadística sobre el contenido del archivo e informaciónbibliográfica sobre cada registro, y complementan la información estructural depositada por losautores con una amplia gama de nuevos datos obtenidos a partir del análisis de las estructuras,tales como:

Modelos gráficos de estructuras terciaria y cuaternaria.Evaluación de la calidad de las estructuras.Esquemas de estructura primaria y secundaria.Localización de dominios.Estudio de ligandos y sitios de unión.Vínculos a entradas de la misma molécula en otras bases de datos (de secuencias, declasificación estructural, de función, etc.).

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Representación y Análisis de EstructurasLas estructuras de macromoléculas biológicas corresponden a una escala nanométrica, por lo queno pueden ser observadas directamente con resolución atómica. Por ello, para su estudio se llevan a caborepresentaciones gráficas a partir de los ficheros de coordenadas atómicas experimentales y conayuda de programas informáticos. Dichas representaciones computacionales son modelos molecularestridimensionales que pueden ser rotados, anotados y re-escalados y que en muchos casos permiten elcálculo de propiedades moleculares.

Existe una gran variedad de programas informáticos adecualdos para llevar a cabo representacionesgráficas de macromoléculas biológicas. En general, pueden clasificarse en:

1. Programas de visualización molecular. Permiten una exploración rápida de la molécula a través dedistintos modos de ilustración. Se integran fácilmente en sitios web, aunque su capacidadgráfica y de análisis molecular es limitada. Dos buenos ejemplos son Jmol y NGL Viewer.

2. Programas de análisis y modelización molecular. Permiten una visualización acoplada a herramientas demodelización y análisis de la estructura. DeepView - SwissPdbViewer es de los más sencillos dentrode este grupo, aunque incorpora herramientas de alineamiento estructural de varias moléculas,sustitución de residuos, búsqueda de cavidades y detección de contactos. Otros casos, comoPyMol y VMD presentan una alta calidad gráfica y multiples posibilidades de análisis, queademás pueden expandirse mediante el uso de scripts y plugins.

Resumen del Desarrollo de la PrácticaEn la Parte 1, "visitaremos" una de las bases de datos del consorcio wwPDB y revisaremosbrevemente el tipo de información general que proporciona. Tomaremo un ejemplos de estructuraconcreta. Estudiaremos las características de sus ficheros estructurales en formatos PDB y FASTAy llevaremos a cabo una observación preliminar de modelos de esa estructura utilizando in situ elvisualizador NGL (WebGL). Finalmente descargaremos los ficheros pdb de las estructuras elegidaspara trabajar con ellos en nuestro propio ordenador.

En la Parte 2, llevaremos a cabo representaciones de la estructura elegida partiendo de su ficheroDPB y con la ayuda de un programa avanzado de análisis molecular. Visualizaremos la moléculacon detalle atómico a través de diversos modelos. Paralelamente, llevaremos a cabo un estudio dealgunos detalles de las estructuras que nos permitirán conocer las propiedades de sus nivelestridimensionales (estructuras secundaria, terciaria y cuaternaria), las características de susitio de unión de ligandos, la búsqueda de interacciones específicas, y las diferencias entredistintas formas estructurales de la misma molécula.

Objetivos

1. Conocer la base de datos PDB de estructuras tridimensionales de macromoléculas biológicas.2. Llevar a cabo búsquedas y acceder a información estructural concreta.3. Aprender en qué consiste la información estructural depositada en las bases de datos, así como

las características de los formatos de fichero estructural más comunes.4. Llevar a cabo representaciones de modelos moleculares a partir de datos estructurales

obtenidos de la base de datos.5. Visualizar y analizar y comparar estructuras de proteína.

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Introducción | Parte 2

Parte 1

INSTRUCCIONESEn el terminal de trabajo en el Aula Informática solo tienes permiso temporal de escritura ylimitado a unas pocas carpetas. Durante la práctica generarás ficheros que vas a necesitardespués. Para salvarlos haz lo que sigue:

1. Crea una carpeta dentro de "Descargas" o en el "Escritorio" con un nombre reconocible.2. Guarda en ella las imágenes y notas que generes durante la práctica.3. Al terminar la práctica, comprime la carpeta en un fichero zip.4. Envía el fichero zip a tu propria dirección de e-mail.

El texto que sigue es un guion de la práctica.

Los cuadros con fondo gris contienen instrucciones concretas sobre lo que debes hacer así comoalgunas preguntas sencillas. Anota las respuestas a las preguntas, ya que podrías necesitarlaspara completar el formulario de resultados.

El formulario de resultados está disponible en Aula Virtual. Es obligatorio entregarloindividualmente y antes de la fecha límite a través de la Tarea Pr1 del Aula Virtual.

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Protein Data Bank, en www.rcsb.org

Bases de Datos del wwPDBComo se ha descrito en la Introducción, wwPDBmantiene un repositorio único de estructuras demacromoléculas determinadas experimentalmente quepuede consultarse a través de distintos puntos deacceso. Vamos a utilizar el gestionado por RCSB(Research Collaboratory for Structural Bioinformatics), cuyabase de datos se denomina RCSB PDB.

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Vista general de la base de datos

Accede a RCSB PDB y revisa su contenido.

En la página inicial encontrarás un campo pararealizar búsquedas y el cuadro principal condistintos tabuladores (con opciones que tambiénpuedes encontrar en el menú superior).

Los apartados Welcome y Learn contienen informacióngeneral, divulgativa y educativa. Los apartados Deposit y Analyze son utilizados por usuariosavanzados. Permiten insertar nuevas estructuras, estudiar su calidad o comparar distintasestructuras. En el apartado Search podemos navegar a través del archivo y localizar estructurasindividuales o por tipos. Por último, en el apartado Visualize encontraremos herramientassencillas para crear y observar modelos gráficos de estructuras.

Revisaremos brevemente la distribución de información en el archivo, a través de Search. Buscarespuestas a las preguntas del recuadro:

1. ¿De qué organismos existe un mayor número estructuras conocidas?2. A pesar del nombre de la base de datos, no todas las estructuras que se encuentran en ella

son proteínas. ¿Qué otros tipos de moléculas hay?

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Búsqueda de estructuras de una proteína: Oxi-hemoglobina humana

A cada estructura se le asigna un código de 4 dígitos (PDB-ID). Para acceder a los datos de unaestructura determinada introduce su PDB-ID en la herramienta de búsqueda. Si desconoces ese código parala estructura que te interesa, puedes buscarla utilizando el nombre de la molécula, su función, elnombre del autor de la estructura, etc.

Una de las proteínas con más estructuras en la base de datos es la hemoglobina. La primeraestructura de hemoglobina fue determinada mediante difracción de rayos X por Max Perutz,galardonado premio Nobel de química (1962) junto a John Kendrew (descubridor de la estructura de lamioglobina mediante el mismo método). Estas estructuras inauguraron en 1976, junto a otras 10, la primeraversión del Protein Data Bank.

Vamos a estudiar la estructura de la hemoglobina humana determinada en presencia de oxígeno.Utilizaremos datos recientes, publicados por J. R. Tame y colaboradores en 2006 (puedesencontrarla a través de la siguiente búsqueda "human oxy haemoglobin 2006).

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Información estructural en el formato PDB

1. ¿Cuál es el PDB-ID de la primera estructura de hemoglobina (de Perutz)? ¿De qué organismo es esahemoglobina? ¿En qué revista y año se publicó la estructura?

2. ¿Qué método se ha utilizado para resolver la estructura de la oxi-hemoglobina humana publicadapor J. R. Tame y colaboradores en 2006? ¿Con qué nivel de resolución se ha obtenido? Toma notadel PDB-ID de esa estructura; vas a necesitarlo después.

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Ficheros de datos estructurales. Formatos FASTA y PDB

La estructura de cualquiera de las moléculasincluidas en la base de datos se escribe en ficherosde texto con formatos especiales. Cuando accedemos aun registro, sus ficheros estructurales seencuentran en el apartado "Display Files".

El primero de los ficheros disponibles contienesolo la estructura primaria (secuencia de residuos), escritaen formato FASTA. Después se encuentran variosficheros de estructura tridimensional, que contienenprincipalmente las coordenadas espaciales ocartesianas {x,y,z} de los átomos de la molécula. Porlo general se incluyen solo las coordenadas de losátomos pesados (C, O, N, S, P u otros, si los hay, perono H). El formato de estructura 3D más intuitivo ymás utilizado recibe el nombre de formato "PDB".

En los ficheros PDB suele haber una primera parte,denominada HEADER con información complementaria acerca del origen de la proteína, el método usadopara la determinación estructural, la calidad de la estructura, la secuencia de residuos, laestructura secundaria, etc. La estructura 3D como tal se encuentra a continuación y corresponde atodas las líneas que comienzan por ATOM. Si existen grupos químicos no proteicos en la molécula, suestructura se escribe en las lineas que comienzan por HETATM. En ambos casos, cada linea seorganiza en columnas que contienen el número de orden del átomo, su nombre,el nombre y orden de secuenciadel residuo correspondiente a dicho átomo y las tres coordenadas cartesianas que dictan la posición espacialpuntual de ese átomo. Seguido a estos valores se encuentran normalmente dos más, con el número deocupación (frecuencia de esa posición espacial entre varias conformaciones posibles) y el factor "B"o factor isotrópico de temperatura (desplazamiento de la posición del átomo con respecto a un valormedio). Estos dos últimos números son una medida de la flexibilidad de la molécula en el puntocorrespondiente al átomo considerado.

Algunos autores proporcionan también para cada átomo, los factores de temperatura anisotrópicos(relacionados con el factor B), en líneas adicionales que comienzan por ANISOU

Revisa los ficheros FASTA y PDB de estructura de la oxi-hemoglobina humana (determinada porTame en 2006) y responde:

1. ¿Qué código se utiliza para definir la secuencia de residuos en el formato FASTA?2. ¿Cuántas cadenas aparecen en el fichero FASTA de esta estructura? ¿Cómo se nombran esas cadenas?

Compara esas cadenas, ¿son idénticas o diferentes?3. Anota los 4 primeros residuos de cada cadena4. ¿Qué partes de la información presente en un fichero PDB son imprescindibles para definir la

estructura de la molécula?5. ¿A qué moléculas o grupos químicos corresponden los átomos no proteicos presentes en esa

estructura?6. ¿Cuántas cadenas hay en el fichero? Anota los 4 primeros residuos de cada una de ellas y

compáralos con los 4 primeros residuos de la secuencia en el formato FASTA. NOTA: El primer residuo de la secuencia (en FASTA) no está presente en el fichero de

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La unidad de asimetría de 2DN1 (oxi-hemoglobina) es un dímeroαβ, distinto de la agrupación biológica esperada (tetrámero α2β2).

coordenadas (pdb). La explicación a esta aparente contradicción está en el REMARK 465 delfichero pdb

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Estructuras cuaternarias biológicas en registros PDB

La mayoría de las estructuras de la base de datoshan sido determinadas mediante difracción de rayosX. Por ello corresponden a una unidad de asimetría,definida como la parte mas simple de la estructuracristalina que permite reconstruir una celdaunidad (o unidad repetida del cristal). Sinembargo, la organización molecular supuestamente funcional,llamada agrupación biológica (biological assembly) enmuchos casos no coincide con la unidad de asimetría.

Un buen ejemplo de ello es el caso de estructurasde hemoglobina. En esta proteína la agrupaciónbiológica es un tetrámero (α2β2), aunque en algunasestructuras de hemoglobina la unidad de asimetríaes dímerica (αβ).

Cuando la agrupación biológica y la unidad deasimetría no coinciden, la primera puedeconstruirse a partir de la segunda utilizando lamatriz de transformación proporcionada en el propio fichero PDB, en las lineas del HEADERmarcadas con REMARK 350. El programa libre disponible on line MakeMultimer.py, a través de la Universidadde Waterloo (Ontario, Canadá), permite obtener de manera fácil ficheros pdb con estructurascuaternarias correctas.

En estructura de la oxi-hemoglobina que hemos elegido anteriormente la unidad de asimetría es undímero αβ. Hemos construido a parte un fichero pdb con la agrupación biológica (tetramérica),utilizando MakeMultimer.py. Descárgalo a través de este link.

Guarda ambas estructuras en el directorio de Descargas de tu ordenador. Trabajaremos con ellasen la Parte 2.

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Visualización de estructuras "in situ" (WebGL)

La base de datos proporciona herramientas de visualización de modelos moleculares de cadaestructura. La visualización se accede a través del tab 3D View presente en la página de unregistro concreto.

Utiliza el visualizador NGL (WebGL) para obtener modelos sencillos de la de oxi-hemoglobina.

Para el caso de la oxi-hemoglobina prepara una imágen del sitio de unión del oxígeno en la cadena A.Orienta la imagen de manera que se observen bien, al menos, el oxígeno y las histidinas distaly proximal. Anota la numeración de estos residuos así como otros que se aparezcan representados

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con claridad. Guarda esta imagen localmente en tu ordenador.

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P1 - Representación y Análisis de Estructuras de Macromoléculas

Actualizado: 09/17/2019 10:30:37

Introducción | Parte 1

Parte 2

Representación y Análisis de la Estructura de laOxi-hemoglobinaComo acabas de ver en la Parte 1, aunque es posible representar la estructura a través deherramientas presentes en la propia base de datos (ver Parte 1.5), sus posibilidades sonlimitadas. Por ello vamos a utilizar el programa VMD (Visual Molecular Dynamics), desarrollado en laUniversidad de Illinois y disponible en código abierto de forma libre. Puedes encontrar un manual deVMD en este enlace.

Con ayuda de este software representaremos y analizaremos la estructura de la oxi-hemoglobina (verParte 1.2).

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Visión general de la estructura

Abre con VMD el fichero PDB de la estructura de la oxi-hemoglobina. Obtendrás inicialmente unarepresentación por defecto de todos los atomos de la molecula. Vamos a crear representacionesmás claras teniendo en cuenta aquello que nos interesa observar o analizar. Para elloutilizaremos las herramientas que aparecen en la ventana de Graphics -->Representations. Podemoscombinar múltiples tipos de representación, de toda la molécula o de partes de ella utilizandoadecuadamente las reglas de selección para cadenas, residuos, etc.

Para empezar sigue, paso a paso, las instrucciones del cuadro siguiente:

Guía:

En la ventana de Representaciones (Graphics -->Representations)...

En la estructura hay cuatro cadenas. De momento vamos a trabajar solo con la cadena A (chainA)...

(1)En el campo Selected Atoms introduce chain A Representa los átomos como puntos (en Drawing Method selecciona Points) y aumenta el tamaño de lospuntos (Size → 10)

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Recuerda que no todos los átomos son proteicos. Vamos aseparar átomos proteicos y no proteicos...

(2)Haz click dos veces sobre la linea de la representaciónanterior. Crea una representación nueva (Create Rep) y cambia suspropiedades: En Selected Atoms → not protein and chain A En Drawing Method → CPK

CPK es una representación con bolas y barillas de manera queaparecerán enlaces entre átomos cercanos cuando asícorresponda. Ello te permite observar con claridad que losátomos no proteicos son de dos tipos.

Puedes saber fácilmente de qué átomos se trata marcándolosen el Display. Para ello haz lo siguiente:

(3)Con el cursor dentro de la ventana Display: Pulsa 1, después con el botón izquierdo del ratón pulsa sobre un átomo y verás una marca con elnombre de residuo, numeración y tipo de átomo

- ¿A que tipo de atomos corresponde la selección not protein (a qué moléculas o gruposquímicos corresponden (ver Parte 1.3, pregunta 5)?

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"Construye" la cadena y estudia la estructura secundaria

Para entender mejor la estructura de la proteína vamos a alargar la cadena poco a poco.

Guía:

Esconde la representación que tengas visible (click dosveces sobre la linea de la representación) y crea unanueva (Create Rep)

(1)En la nueva representación ajusta lo siguiente: Drawing Method → Licorice Selected Atoms → protein and chain A and resid 1

NOTA: resid se refiere al número de residuo en el fichero decoordenadas (pdb) de la estructura. Ten en cuenta que eneste fichero la numeración de residuos podría empezar con unnúmero distinto de 1 (ver Parte 1.3). Puedes ver los númerosresid que corresponden a tu estructura entrando en el tabSelections y seleccionando resid en la lista de Keywords.

Cuando logres visualizar el primer residuo, puedes ver sunombre y la denominación de sus átomos seleccionándolos con el ratón:

(2)Con el cursor dentro de la ventana Display: Pulsa 1, después con el botón izquierdo del ratón pulsa sobre un átomo y verás una marca con elnombre de residuo, numeración y tipo de átomo

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- ¿Cuál es el primer residuo de la cadena A de tu estructura? ¿Qué numeración tiene? Si esanumeración es distinta de 1 explica porqué (ver Parte 1.3, pregunta 6).

Continúa alargando la cadena...

(3)Selected Atoms → protein and chain A and resid 1 to 2, y poco a poco hasta 1 to 20

Quizá veas que la estructura que aparece es bastante regular. Para observar mejor como esduplica la representación de la forma siguiente:

(4)Crea una representación nueva (Create Rep) y cambia sus propiedades: Selected Atoms → protein and chain A and resid 1 to 20 Drawing Method → tube

Alarga esta nueva representación hasta el residuo 40 ( Selected Atoms → protein and chain A and resid 1 to40) y hasta el final de la cadena ( Selected Atoms → protein and chain A)

(5)Completa la cadena y representa de manera especial la estructura secundaria: Selected Atoms → protein and chain A Drawing Method → cartoon Coloring Method → secondary structure

1. ¿Qué tipo o tipos de estructura secundaria presentan las cadenas α de la hemoglobina?2. ¿Qué tipo o tipos de estructura secundaria presentan las cadenas β? NOTA: Para responder a

esta pregunta repite el paso (5) de la guía anterior, seleccionando ahora la cadena B.

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Representación del complejo hemoglobina(cadena α)-O2

Ahora representaremos con detalle el grupo hemo y el O2 en una de las cadenas de la hemoglobina.En la representación destacaremos también dos residuos importantes de la proteína: lashistidinas histidinas proximal y distal. Para utilizar el grupo hemo y el oxígeno te será de utilidadrecordar sus denominaciones como residuo en el fichero pdb (Parte 1.5). Sigue la guía del cuadro:

Guía:

Recuerda que puedes combinar varias representaciones si necesitas utilizar estilosdiferentes.

(1)Para tener una perspectiva sencilla de la cadena creamos primero una representaciónesquemática: Create Rep ⇒ ⇒ Selected Atoms → chain A ⇒ Drawing Method → tube ⇒ Radius → 0.1 ⇒ Coloring Method → ColorID → 2 gray

(2)A continuación, en una nueva representación mostramos el grupo hemo ( resname HEM) el oxígeno(resname OXY) y las histidinas ( resname HIS): Create Rep ⇒ ⇒ Selected Atoms → chain A and resname HEM OXY HIS ⇒ Drawing Method → Licorice

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La histidina proximal es la que se encuentra coordinada alFe2+ del grupo hemo. La distal es la siguiente más cercana,por la cara opuesta del plano del hemo. Pararepresentarlas "a parte" necesitamos conocer su numeraciónde residuo:

(3)Con el cursor dentro de la ventana Display: Pulsa 1, después con el botón izquierdo del ratón pulsa sobrecualquier átomo de las His proximal o distal. El nombre y numeración deresiduo aparecerán en el Display

(4)Reajusta la representación que has hecho en el punto (2): Selected Atoms → chain A and (resname HEM OXY or resid #N1 #N2)

NOTA: sustituye #N1 y #N2 por los números de residuo quedebes haber encontrado para las histidinas proximal ydistal. Seguramente has anotado también estos números apartir de la visualización que hicimos en el apartadoanterior (Parte 1.5).

Si quieres completar tu representación con mas residuoscercanos al sitio de unión de oxígeno, puedes tomar elátomo de Fe como referencia y buscar otros átomos cercanos a él:

(5)Crea una nueva representación, con las siguientes características: Create Rep ⇒ ⇒ Selected Atoms → protein and chain A and (not resid 58 87) and within 6 of name FE ⇒ Drawing Method → licorice ⇒ Coloring Method → color ID → 0

Como has hecho ya en el punto (3), averigua los números de residuo a los que corresponden losnuevos átomos que aparecen en la representación. Utiliza esos números para representar lascadenas laterales de esos residuos.

(6)Exporta tu representación como imagen: File → Render → Start Rendering

- Busca una orientación adecuada del sitio de unión de oxígeno. Crea una imagen yguardala en tu carpeta de resultados. Deberás incorporar la imagen, junto con unadescripción de la misma, en tu formulario de resultados.

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Estructura cuaternaria: Interacción entre subunidades

Para terminar estudiaremos la proteína completa, incluyendo sus cuatro subunidades. Para estetipo de representaciones de estructura cuaternaria conviene utilizar visualizaciones de superficie,que nos dan una idea clara de la forma de la molécula y permiten analizar las interaccionesentre subunidades. Dichas superficies pueden colorearse según el tipo de cadena, el tipo deresiduo, etc.

Guía:

Esconde tus representaciones activas (click dos veces sobre la linea de la representación);trabajaremos con otras nuevas.

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(1)Create Rep ⇒ ⇒ Selected Atoms → protein ⇒ Drawing Method → QuickSurf ⇒ Coloring Method → Chain

Ahora cada cadena se muestra con un color diferente.Recuerda que las cadenas son iguales dos a dos. Lascadenas A y C son de tipo α. Las cadenas B y D son de tipoβ. Con las cuatro cadenas visibles puedes ver que lasuniones entre ellas no son en todos los casos igual decercanas. Prueba a representarlas en pares (α1 con β1, α1con β2, α1 con α2, β1 con β2,):

(2)Modifica tu última representación, o escóndela y crea unanueva... Coloring Method → Chain, Drawing Method → QuickSurf Selected Atoms → protein and chain A B (o protein and chain A D... etc)

- ¿Qué pares de cadenas presentan una interacción más fuerte?

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