8/18/2019 Bioquimica Ultima

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Introducción:

La glucólisis es una vía importante del metabolismo humano debido a que es

una manera rápida de generar energía para los procesos vitales, sin embargo,

esta vía por sí sola no completa los requerimientos energéticos para las

grandes formas de vida multicelulares. Dada la limitación energética de la

glucólisis, las células poseen otras vías complementarias para producir más

energía a partir de los productos generados en la glucólisis: el ciclo de rebs !

la cadena respiratoria. "stas dos vías generan más energía con el piruvato

producido al #nal de la glucólisis ! los equivalentes reductores que se dirigen al

ciclo de $rebs ! a la cadena respiratoria respectivamente. In vivo, estas vías

contienen diferentes tipos de reacciones% de los tipos más importantes en ellas

son las reacciones de ó&ido reducción, que son el pilar fundamental de la

cadena respiratoria. 'ara esta práctica, se estudiarán una en(ima de la

glucólisis, una del ciclo de rebs ! componentes de la cadena respiratoria: la

lactato deshidrogenasa, la succinato deshidrogenasa ! el citocromo ) con la

citocromo o&idasa. "n general para evidenciar el transporte de electrones enlas reacciones de ó&ido.reducción que catali(an estos componentes, se

utili(arán indicadores*a(ul de metileno ! parafenildiamina.

+betivos:

-islar las en(imas ! los citocromos lo meor posible

)omprobar la actividad ó&ido reducción de los componentes aislados

Interpretar correctamente cada tubo preparado

esultados:

"&p. /0 /1 /2 /3 /4 /5 /6 /7LD8 /rans. -(ul

claro

-(ul

claro

-(ul

re!

-(ul

re!

9 9 9

D8 Decol

.

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Dec.

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9

)I/ epia /rans. café salmó

n

violet

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 /rans. )afé

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;iolet

a

claro

9Discusión de resultados

Descripción del sistema de reacción general de la deshidrogenasa succínica:

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"n este e&perimento se busca observar la reacción de ó&ido reducción que

sucede en presencia de la deshidrogenasa succínica ! el succinato. La

deshidrogenasa succínica catali(a la conversión de succinato a fumarato con la

intervención del <-D que act=a como el agente o&idante en la reacción. 'ara

que la en(ima contin=e reali(ando el proceso catalítico, su cofactor en forma

reducida debe o&idarse, por lo que debe e&istir una especie química que recibaesos electrones que el <-D81 posee% In vivo, el aceptor #nal es el o&ígeno, pero

para evidenciar la reacción, se usará otro aceptor, el a(ul de metileno, el cual

al reducirse pierde la coloración por la que es nombrado. 'ara evitar que el

aceptor #nal sea el o&ígeno *!a que el e&perimento se reali(a en condiciones

aerobias> se a?ade una capa de aceite para evitar que el o&ígeno se

introdu(ca al sistema ! evite la decoloración del a(ul de metileno que es usado

como indicador.

'ara algunos de los tubos, se a?ade además malonato de sodio, que dada su

similar estructura respecto al succinato, act=a como un inhibidor competitivo.

"sta =ltima aseveración se demostró mediante la adición de este reactivo adistintas concentraciones en los tubos.

 /ambién se usó agua destilada para completar un volumen de 2 mL para cada

tubo.

Interpretación de los tubos del e&perimento de deshidrogenasa succínica:

 /ubo 0

)ontenía succinato de sodio, a(ul de metileno, agua, la en(ima D8 ! aceite

vegetal. 'or lo comentado en la descripción general, teóricamente se esperaba

una decoloración del a(ul de metileno por la presencia tanto de la en(ima

como del sustrato. "&perimentalmente se observó la decoloración del tubo al

color del e&tracto*roo sangre>.

 /ubo 1

"ste tubo actuó como un testigo, !a que contenía agua, a(ul de metileno,

succinato de sodio ! aceite. La falta de la en(ima evidenció que la reacción no

se lleva a cabo, o si se lleva a cabo, esta tarda demasiado tiempo*lo que es

contraproducente en organismos vivos>. e mantuvo el color a(ul re! que

presenta el a(ul de metileno en su forma o&idada.

 /ubo 2

"n este tubo se a?adió la en(ima, el a(ul de metileno, agua ! aceite, pero no

sustrato. La reacción se llevó a cabo pero no se observó una decoloración

considerable. "sto sucedió por la presencia del sustrato en el e&tracto que

contenía la en(ima, debido a que era un e&tracto recién elaborado ! poco

tratado.

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 /ubo 3

)on la adición de succinato de sodio, en(ima D8, a(ul de metileno, aceite !malonato de sodio*0mL>, este tubo es el primero de los tubos que evidencian el

efecto de inhibición competitiva. e observó poca decoloración en el tubo, !

fue además el menos decolorado de los tubos que contenían el inhibidor.

 /ubo 4

"ste tubo contenía, succinato de sodio, agua, aceite, D8, a(ul de metileno !

malonato de sodio*@.4 mL>. "n el tubo se observó una ligera decoloración,

observándose un color menos intenso que el tubo 3.

 /ubo 5

"ste tubo contenía todo el sistema como los dos anteriores, ! @.14 mL de

malonato de sodio. e notó una ma!or decoloración en comparación con los

tubos 3 ! 4

 /ubo 6

"n este tubo ! en conunto con los resultados obtenidos en los tubos 3,4 ! 5, se

comprueba el tipo de inhibición que presenta el malonato de sodio respecto al

succinato de sodio. "n este tubo se adicionó la en(ima, el sustrato * 3 veces

más concentrado que el inhibidor>, el a(ul de metileno, agua, aceite, ! el

inhibidor*@.14 mL>% se observó una considerable decoloración, equiparable a ladel tubo 0. "n la serie de tubos que contenían inhibidor, a medida que se

aumenta la concentración del inhibidor se observa una disminución de la

decoloración , lo que indica que la velocidad catalítica es menor% además, en el

tubo 6 se observa que a ma!ores concentraciones de sustrato, a pesar de la

presencia del inhibidor, la velocidad de reacción no se ve drásticamente

afectada. "sto indica, que ha! una competencia por el sitio catalítico de la

en(ima, ! que a ma!ores concentraciones de inhibidor respecto al sustrato, la

reacción puede verse completamente detenida.

"&perimento deshidrogenasa succínica: "l tubo 0 se observa en el e&tremo

derecho, ! el 6mo en el e&tremo i(quierdo.

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Descripción del sistema general de la deshidrogenasa láctica

"n el e&perimento dise?ado se busca la observación de la catálisis de la

Lactato deshidrogenasa sobre el lactato. La reacción produce el cambio de

lactato a piruvato, con el uso de un A-D como coen(ima que se ve reducido enel proceso. 'ara poder continuar el proceso de catálisis, el A-D8 *forma

reducida del A-D> debe ceder esos electrones a un aceptor. "l aceptor #nal de

los electrones en la cadena respiratoria In vivo es el o&ígeno, pero para

con#rmar que la reacción se lleva a cabo, se introduce un colorante indicador

que acepta los electrones al #nal del proceso: el a(ul de metileno. 'ara evitar la

interferencia del o&ígeno, se utili(a aceite, que evita la entrada del o&ígeno

dentro del sistema de reacción. La reacción que se lleva a cabo es reversible,

por lo que para evitar la reconversión de piruvato a lactato ! el consiguiente

uso del A-D8 para ello, el piruvato formado se hace reaccionar con )A,

formando una cianohidrina que no es blanco de catálisis para la LD8. e utili(ó

también agua para completar un volumen de reacción igual para cada tubo de

4.2 mL

Interpretación de los tubos:

 /ubo 0

"ste tubo contenía a(ul de metileno, aceite, lactato, A-D, en(ima LD8 ! )A.

e observó la decoloración casi total del tubo rápidamente, !a que todos los

componentes necesarios para llevar a cabo la reacción, como se e&plicó en la

descripción del sistema general, estaban presentes.

 /ubo 1

"ste tubo se decoloró medianamente ! hasta un a(ul cielo. "l tubo contenía

LD8, agua, a(ul de metileno, aceite, )A ! lactato. La falta de la coen(ima A-D

debió hacer que el tubo se quedara en el color a(ul re! del a(ul de metileno,

pero las condiciones del e&tracto recién preparado indican que había presencia

de la coen(ima en el e&tracto.

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 /ubo 2

"l tubo 2 contenía )A, a(ul de metileno, agua, A-D, aceite ! LD8. e observó

una coloración similar a la obtenida en el tubo 1, lo que indica que se llevó a

cabo la reacción% sin embargo, por la falta de sustrato en el tubo se esperaría

que el tubo quedara en su color original. La e&plicación a este evento es similar

a la del tubo 1, esto es, debido a las condiciones del e&tracto recién preparado

que a=n contenía sustrato.

 /ubo 3

"n este tubo se tenían todos los componentes del sistema, a e&cepción de la

en(ima. "l tubo no presentó decoloración alguna durante todo el tiempo de

reacción. - pesar de que se a?adió A-D del e&tracto, no se llevó a cabo la

reacción como podría pensarse por la frescura del e&tracto. "sto se e&plica por

el tratamiento que recibió el e&tracto del A-D. "ste e&tracto se puri#có usando

temperaturas de ebullición del agua *apro&imadamente B1C)> por un periodo

de 4 min% a esta temperatura ! tiempo, se provocó la desnaturali(ación de la

en(ima, volviéndola inactiva.

 /ubo 4

)arente de )A, el tubo 4 presentó una coloración a(ul re!, lo que indica que el

a(ul de metileno no se reduo. "ste resultado indica que el proceso catalítico de

la en(ima se dirigió completamente hacia la formación de lactato, como sucede

In vivo en condiciones anaerobias en la vía de la glucólisis. "l A-D8 se reo&ida

en la conversión de piruvato a lactato, ! no ha! transporte de electrones por

medio de la cadena respiratoria.

 

"&perimento lactato deshidrogenasa. "l tubo 0 se encuentra en el e&tremo

i(quierdo, ! siguiendo el orden numérico, el tubo 4 se encuentra en el e&tremo

derecho.

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)itocromos ! citocromo o&idasa

 /ubo 0

"n el primer tubo se adiciono el D89)I/ ! la p9fenilendiamina ! agua por lo

cual la reacción que pudo haberse formado es que la p9fenilendiamina se

o&idara debido al protón del citocromo ), sin embargo no se podría dar en

evidencia que esta se lleve a cabo por que no se agregó ning=n indicador *-lfa9naftol>.

"n el tubo 1 tenemos que se agregó agua ! la p9fenilendiamina, al tener solo

estos 1 compuestos no se forma ninguna reacción.

"n el tubo 2 tenemos la presencia de un inhibidor *)A>, agua, D89)I/, la p9

fenilendiamina, estos compuestos reaccionaron pero de una forma menos

debido al inhibidor, sin embargo como en el tubo 0, no se adiciona ning=n

indicador q nos de fe de que la reacción este sucediendo ! de que intensidad, o

dicho de otra forma, la formación de la p9fenilendimina.

"n el tubo 3 tenemos agua ! D89)I/, con estos 1 compuestos no se reali(a

ninguna reacción de o&idación, esto es porque el D89)I/ no tiene a quien

pueda o&idar.

"n el tubo 4 tenemos agua, D89)I/, p9fenilendiamina ! un indicador que

formara un compleo llamado a(ul de indofenol, que se forma a partir de la p9

fenilendiamina que se o&ida ! se vuelve p9fenilendimina ! esta con el indicador

alfa naftol se produce una reacción de condensación por lo que nos da como

resultado el a(ul de indofenol.

"n el tubo 5 tenemos agua, p9fenilendiamina ! el indicador alfa naftol, lo quehace falta para que se lleve a cabo la reacción es el agente o&idante, que es el

D89)I/, por lo que no se lleva a cabo ninguna reacción de o&idación.

"n el tubo 6 tenemos el indicador alfa naftol, el D89)I/, p9fenilendiamina ! un

inhibidor es a?adido al tubo *)A> por lo que la reacción no se lleva tan

e#ca(mente como en el tubo 4, !a que el )ianuro reacciona con el citocromo,

evitando la o&idación de la p9fenilendiamina.

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"n el tubo 7 tenemos agua, alfa naftol, p9fenilendiamina ! el inhibidor, lo

=nico que hace falta para llevar a cabo la reacción es, nuevamente como en el

tubo 5 es el agente o&idante por lo que la p9fenilendiamina no se o&ida.

Tu experimento itchy bitchy

)onclusiones

La lactato deshidrogenasa catali(a una reacción de ó&ido9reducción sobre el

lactato

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La uccinato deshidrogenasa catali(a una reacción de ó&ido reducción sobre el

succinato

Los citocromos pueden actuar como agentes o&idantes

"l Ealonato de sodio es un inhibidor competitivo de la uccinato

deshidrogenasa

"l )A inhibe a la deshidrogenasa succínica ! al citocromo c.

Los e&tractos crudos poseen a=n sustratos ! en(imas, por lo que puede

producirse reacción sin adición de más reactivos

"l A-D funciona como coen(ima de la lactato deshidrogenasa

"l <-D es un grupo prostético de la succinato deshidrogenasa.

Fibliografía:

 Albert L. Lehninger “Bioquimica” Ediciones Omega Octava reinmpresion 1984.

Van Holde,K.E.; Mathes, !.K.; Ahern, K.".; #Bioqu$mica#; Editorial %earson, &era Edici'n; Es(a)a

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