Universidad de San Carlos de Guatemala González Montes, Alejandro SebastiánFacultad de Agronomía 201015141Área de Ciencias Viernes/VespertinaSubarea de Ciencias Químicas Guatemala viernes, 16 de marzo del 2012Bioquímica – Laboratorio Ing. Agr. Kelder Ortiz

Reporte # 4 – Práctica # 5 Estudio de aminoácidos, cromatografía de aminoácidos y Espectrofotometría

Introducción

La cromatografía en capa fina es un caso de cromatografía de reparto en la que los componentes de una mezcla se separan por diferencia de solubilidad entre dos sistemas disolventes. Los elementos del sistema cromatográfico son: soporte, fase estacionaria (disolvente A), y fase móvil o eluyente (disolvente B).

La Espectrofotometría es una de las técnicas experimentales más utilizadas para la detección específica de moléculas. Se basa en el patrón de absorción de luz característico de cada componente de la solución

Objetivos

General:

1. Realizar las pruebas cuantitativas Cromatografía y Espectrofotometría en las distintas soluciones de la muestra de Arveja (Pisum sativum) específicas para aminoácidos y proteínas.

Específicos:

1. Obtener la concentración de proteínas presentes en cada uno de los extractos (acuoso y salino) de la muestra vegetal con la técnica de espectrofotometría.

2. Calcular los valores de Rf de los hidrolizados para identificar aminoácidos.

3. Determinar por cromatografía los aminoácidos presentes en los hidrolizados de la muestra vegetal según el valor de Rf.

Marco Teórico

Cromatografía en Capa Fina

En la cromatografía en capa fina, CCF o TLC ("thin-layer chromatography, por sus siglas en inglés) se puede utilizar como soporte cualquier sustancia que pueda dividirse en partículas finas y distribuirse uniformemente en forma de láminas. Esto incluye sustancias inorgánicas (gel de sílice, óxido de aluminio, tierra de diatomeas, silicato de magnesio, etc) y orgánicas (celulosa, poliamida, polietileno, etc). La utilización de soportes hidrófobos facilita la

separación de compuestos no polares (lípidos, por ejemplo). En la CCF, la fase estacionaria es una lámina de 0,25-0,50 mm de espesor, extendida de forma uniforme sobre la superficie de una placa de vidrio o plástico.Uno de los extremos (el más próximo a la línea de aplicación de la muestra) se sumerge en un disolvente apropiado (fase móvil), cuyo nivel en el fondo del tanque debe quedar por debajo de la línea de aplicación. El solvente se desplaza a través del soporte por capilaridad provocando un reparto de los solutos entre él y la fase estacionaria de acuerdo con sus solubilidades relativas (coeficientes de reparto). Una vez que el solvente haya alcanzado un punto próximo al otro extremo de la placa, ésta se saca del tanque y se seca. Las manchas correspondientes a cada compuesto, si 3 no son visibles, se pueden revelar mediante técnicas analíticas concretas. Se determina la posición de cada mancha relativa al frente alcanzado por el solvente, calculándose el correspondiente valor de Rf. (2)

Ventajas de la Cromatografía en Capa Fina

Una mayor resolución, obteniéndose manchas más pequeñas. Mayor velocidad de separación. Pueden utilizarse un gran número de materiales como soportes y disolventes. Los compuestos pueden ser detectados con facilidad y su recuperación es muy

simple. (4)

SilicagelEl gel de sílice o ácido silícico es uno de los más utilizados, es débilmente ácido, su pH oscila entre 4-5. Con lo cual no se deberá utilizar con sustancias que se corrompan con los ácidos. Los geles de sílice normales suelen contener impurezas de hierro y/o aluminio, este factor también se debe tener en cuentas respecto al uso de componentes. El tamaño del grano suele ser de 10 a 40 micras (µ) y el tamaño de poro varía de 20 a 150Å. (2)

Localización de las sustanciasPara lograr ver el movimiento de las sustancias en la placa existen métodos Químicos y Físicos. (2)

Métodos físicosEl más común consiste en añadir al adsorbente un indicador fluorescente. De tal forma

que al colocar la placa bajo una lámpara ultravioleta, y dependiendo del indicador y de la longitud de onda, aparecen manchas fluorescentes en las zonas en las que hay componentes, o en otros casos aparece toda la placa fluorescente excepto donde hay componentes. (2)Algunos compuestos poseen cierta fluorescencia (aunque no es normal) con lo que pueden ser detectados directamente en una lámpara de ultravioleta. (2)

Métodos químicos (Constante Rf)La constante RF (Ratio of Front) es simplemente una manera de expresar la posición de un compuesto sobre una placa como una fracción decimal, mide la retención de un componente. Se define como:

La distancia recorrida por el compuesto se mide generalmente desde el centro de la mancha, los cálculos se simplifican si el denominador es 10. Para que los RF sean reproducibles deben ser fijadas una serie de condiciones (Espesor de la placa, fase móvil, fase estacionaria, cantidad de muestra). El máximo valor de RF que se puede alcanzar es de 1, lo ideal es un RF entre 0.65 y 0.7. (2)

Cuadro 1: Valores de la constante Rf de algunos aminoácidos

EspectrofotometríaSe refiere a la medida de cantidades relativas de luz absorbida por una muestra, en función de la longitud de onda. Cada componente de la solución tiene su patrón de absorbencia de luz característico. Comparando la luz de una muestra versus soluciones estándar, es posible determinar la identidad y la concentración de componentes disueltos en la muestra (1)

Cuando se dice que una sustancia absorbe luz de longitud de onda λ, esto significa que las moléculas de esa sustancia absorben fotones de esa longitud de onda. (3)

Cada molécula tiene una serie de estados excitados discretos (o bandas) que dependen de su estructura electrónica y que la distinguen del resto de moléculas. Como consecuencia, el espectro de absorción, es decir, la luz absorbida en función de la longitud de onda, constituye una verdadera seña de identidad de cada sustancia o molécula. (3)

La ley de Beer-Lambert para la absorción que relaciona la intensidad a la salida e la muestra If, con la intensidad inicial I0, la concentración de moléculas y la distancia recorrida por la luz en la muestra, L: (3)

En general, los espectrómetros miden en % de transmitancia (T) y absorbencia (A). El porciento de transmitancia se refiere a la cantidad de radiación que pasa a través de la muestra y alcanza el detector. Una solución límpida, no absorbente, mostrara una lectura de 100% de transmitancia en un espectrofotómetro calibrado. Las unidades de absorbencia van de 0 a 2. La absorbencia se relaciona con la transmitancia como: (1)

A = log 1/T, (logaritmo decimal). A= 2 – log T%

Resultados y Discusión

Espectrofotometría

Cuadro 2. Datos de la transmitancia de las distintas soluciones y los Extractos de arveja (Pisum sativum L.) medidas en el espectrofotómetro

Solución bajo análisis Transmitancia (%) Absorbencia (%)

Estándar 94 0.03

Hidrolizado Ácido Salino (B) 95 0.02

Fuente: Propia

Los datos obtenidos en la aplicación del espectrofotómetro del laboratorio fueron los correspondientes de Transmitancia, la absorbencia fue calculada empleando la siguiente fórmula:

Luego de haber obtenido los datos de absorbencia, es posible aplicar la fórmula que se presenta a continuación para la determinación de la concentración de proteínas presentes en el Hidrolizado Ácido Salino. Los cálculos pertinentes también son presentados a continuación.

El espectrofotómetro es una prueba cuantitativa para proteínas en la cual a partir de una sustancia de concentración conocida se logra conocer la concentración de otra con la que se va a comparar. En el laboratorio se utilizó una solución de gelatina 1% y 2% concentraciones que sirvieron para calcular las concentraciones de los hidrolizados salino y acuoso.Con la gelatina 1% se obtuvo un dato de 5.938*10-3 para la solución salina y 0.01 para la solución acuosa, esto indica que existe mayor cantidad de proteínas en el extracto acuoso que en el salino. Con la gelatina 2% de igual manera se obtuvo un dato mayor para el extracto acuoso que para el salino, lo que podría explicarse por el fenómeno de salting-in para una proteína en medio salino y que hace que se pierda mayor cantidad de proteínas que en extracto acuoso.

CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINACuadro 3. Distancias recorridas de las muestras de los hidrolizados de arveja (P. sativum)

HidrolizadoDistancia (cm)

Acido Acuoso

3

Acido Salino 2.1

Alcalina Salina

0.3

Alcalina Acuosa

0.6

Fuente: propia1. Fórmula a utilizar:

Hidrolizado Ácido Acuoso

Hidrolizado Ácido Salino

Hidrolizado Alcalino Salino

Hidrolizado Alcalino Acuoso

La cromatografía es una prueba cuantitativa para aminoácidos, con la cromatografía se logra obtener una distancia recorrida sobre una placa especial para que un eluyente suba por capilaridad y con él arrastre los distintos compuestos.

Con las distancias obtenidas y la distancia del eluyente se obtiuvo una Rf que se comparó con las Rf ya establecidad de los aminoácidos en un eluyente similar al utilizado en el laboratorio para identificar la presencia de alguno de ellos en las muestras utilizadas.

Cuadro 4. Rf obtenidas para los hidrolizados y aminoácidos presentes en la muestra vegetal según éste valor

Hidrolizado

Rf Aminoácido

Acido Acuoso

0.273Alanina, Alanina-B, Ácido

Glutámico

Acido Salino

0.191 Cistina, Ácido Aspártico

Alcalina Salina

0.027 Valina

Alcalina Acuosa

0.055 Lisina

Fuente: PropiaLa identificación de los aminoácidos en los distintos hidrolizados se realizó de acuerdo a la comparación de los valores de Rf resultantes con los Rf preestablecidos (ver cuadro 1) para esto se utilizó la columna con valores de Rf con un eluyente similar al que se utilizó en el laboratorio, varía solamente en las proporciones de solventes utilizados.

Los hidrolizados presentaron solamente un valor de Rf lo que puede interpretarse de a cuerdo con los resultados de la prueba de espectrofotometría que mostraron una alta tramitancia lo que indica que no existía mucho soluto en suspención. Ya que en los hidrolizados se tiene una mayor disolución de las biomoléculas presentes en la muestra se obtuvo un solo valor para cada uno.

Conclusiones

1. Para la obtención de las concentraciones en los extractos acuoso y salino se utilizó una solución patrón de gelatina 1% y 2% y con ello se pudo observar que el extracto acuoso reflejó una mayor concentración en los dos casos; puede decirse que existe mayor degradación de la proteínas en medios salinos.

2. Los valores de Rf en los distintos hidrolizados fueron datos que se mantuvieron cercanos a los encontrados en la teoría, con esto se pudieron identificar los aminoácidos presentes para la muestra vegetal.

3. Los valores de Rf obtenidos de forma experimental se compararon con los valores teóricos para poder identificar los aminoácidos presentes, se encontraron: Alanina, Alanina-β, Ácido Glutámico, Cistina, Ácido aspártico, Valina, Lisina.

Bibliografía

(1) Cromatografía (en línea). Consultado el 29 de agosto de 2011. Disponible en: http://www.frlp.utn.edu.ar/materias/qcasis/mostracion2.html

(2) Cromatografía de capa fina (en línea). Consultado el 29 de agosto de 2011. Disponible en: http://www.textoscientificos.com/quimica/cromatografia/capa-fina

(3) Espectrofotometría (en línea). Consultado el 29 de agosto de 2011. Disponible en: http://www.upo.es/depa/webdex/quimfis/docencia/quimbiotec/FQpractica4.pdf

(4) Espectrofotometría (en línea). Consultado el 29 de agosto de 2011. Disponible en: http://depa.pquim.unam.mx/~fercor/dqo/manuales/1311/p7.pdf