Bacterias Anaerobias Esporuladas

y no Esporuladas

Cátedra Microbiología GeneralFACENA – UNNE

2010

Objetivo

Conocer las principales características biológicas de los gérmenes anaerobios

esporulados y no esporulados, su capacidad para producir infecciones, las posibilidades

diagnósticas y las medidas profilácticas

Anaerobios No Esporulados Características generales

Son incapaces de desarrollar en contacto con el oxígeno

Anaerobios estrictos: requieren un 0% de oxígeno para crecer

Anaerobios aerotolerantes: sobreviven hasta con 0,5% de oxígeno

Son exigentes para crecer, necesitan vitaminas y cofactores.

Forman parte de la flora normal del hombre y de los animales.

Producen infecciones oportunistas, generalmente endógenas.

Las infecciones generalmente son mixtas con bacterias aerobias.

Incluyen a varios géneros de cocos y bacilos, grampositivos y gramnegativos.

• Efecto tóxico directo

• Formación de anión peróxido y superóxido

• Oxidación de enzimas esenciales que contengan grupos SH-

• Inhibición del metabolismo de flavoproteínas y NADH oxidasa

• Imposibilidad para alcanzar potenciales redox bajos

• Déficit o ausencia de catalasa y/o superóxido dismutasa (presente en

aerotolerantes)

Bacterias Anaerobias Efecto tóxico del oxígeno

Adherencia a las células Polisacárido capsular Endotoxina Hialuronidasa, colagenasa, fibrinolisina,

neuraminidasa Exotoxinas

Factores de virulencia de bacterias anaerobias

Flora Normal AnaerobiaFlora Normal Anaerobia

• Piel: la flora normal se limita a los folículos pilosos.

• Boca y faringe: flora muy abundante. Las encías son un nicho muy importante. Se asocian con infecciones a nivel de cabeza y cuello.

• Intestinos: hay 1.000 veces más anaerobios que aerobios. Degradan sales biliares, sintetizan vitaminas y se oponen a la colonización por otras bacterias. Se relacionan con infecciones abdominales.

• Vagina: Predominan los Lactobacillus en condiciones normales. Alteraciones hormonales y tratamientos con antibióticos alteran la flora con sobrecrecimiento de otras bacterias (vaginosis). Se asocian con aborto séptico.

Flora normal anaerobia

Cavidad oral y TRS:

Bacilos gram-negativos: Porphyromonas Prevotella, Fusobaterium nucleatum – Cocos gram-positivos Actinomyces

100:1 (ANA/AER)

Piel:

Propionibacterium acnes

Peptostreptococcus

Tracto genital femenino:

Bacilos gram-negativos: Porphyromonas Prevotella bivia-disiens Cocos gram-positivos Lactobacillus - Clostridium

Colon

Bacilos gram-negativos: Bacteroides grupo fragilis– Cocos gram-positivos - Clostridium, Eubacterium, Bifidobacterium

1000:1 (ANA/AER)

Género Veillonella

V. parvula

Cocos Gramnegativos Anaerobios

Género Peptostreptococcus

P. anaerobiusP. magnusP. micros

P. asaccharolyticus

Cocos Grampositivos Anaerobios

Género ActinomycesA. israeliiA. odontolyticusA. viscosus

Género EubacteriumE. lentumE. aerofaciens

Género LactobacillusL. casseiL. bulgaricusL. yoghurtii

Bacilos Grampositivos Anaerobios

Género PropionibacteriumP. acnesP. propionicumP. granulosumP. avidum

Género BifidobacteriumB. dansium

Género MobiluncusM. curtisiiM. mullieris

Bacilos Grampositivos Anaerobios

Género BacteroidesB. fragilisB. thetaiotaomicron

Género PorphyromonasP. gingivalisP. endodontalis

Género PrevotellaP. melaninogenicaP. bivia

Género FusobacteriumF. nucleatumF. necrophorum

Bacilos Gramnegativos Anaerobios

Características de las infecciones por Anaerobios

ENDOGENAS

•Polimicrobianas

•Relacionadas a mucosas

• Sinérgicas

Características de las infecciones por Anaerobios

EXOGENAS

• Clostridiales

• No Clostridiales

Infecciones por anaerobios:

Odontógenas – Cabeza y cuello

Abdominales

Piel y partes blandas

Ginecológicas: vaginosis, abscesos vaginales, aborto séptico, etc

SNC: abscesos cerebrales, empiema subdural

Oseas

Infección por anaerobios: Factores predisponentes

Factores predisponentes: Enfermedades vasculares

Shock

Traumatismos

Cirugías

Cuerpos extraños

Enfermedades malignas

Edema

Infecciones previas

Infecciones por anaerobios Infecciones por anaerobios CaracterísticasCaracterísticas

• Olor pútrido de las secreciones purulentas• Proximidad a mucosas• Gas en el sitio de la infección• Necrosis tisular o gangrena• Tratamiento previo con aminoglucósidos (inactivos frente a anaerobios)• Infección secundaria a mordeduras animales o humanas• Paciente portadora de Dispositivo Intrauterino• Maniobras comprometedoras (cirugía abdominal o aborto provocado)• Evolución lenta de la enfermedad• Coloración negra de la herida • Gránulos de azufre (actinomycosis)• No desarrollo en aerobiosis de los microorganismos observados en el Gram.

Infecciones por anaerobios Son polimicrobianas y endógenas, por lo tanto su

etiología puede ser predecible de acuerdo a la localización.

El hallazgo de un patógeno determinado permite sospechar cual es el foco de infección

Las características de la muestra nos permiten sospecharlos.

Tratamiento basado en: debridamiento, drenaje y ATB

Infecciones por anaerobios Infecciones por anaerobios PrevenciónPrevención

• Uso racional de los antimicrobianos

• Tratamiento de las enfermedades de base

• Minimizar el uso de técnicas invasivas

• Disminuir el tiempo de internación

•Tratar rápidamente las heridas profundas, especialmente

las punzantes o secundarias a mordeduras humanas y de

animales

Recolección,transporte y

conservación de muestras

Muestras NO aptas para cultivo anaerobios

Heces o materiales que estén contaminados con contenido intestinal (excepción C. difficile)

Exudados vaginales o cervicales Orinas tomadas por micción espontánea o

sonda Esputos, secreciones nasofaringeas o

materiales tomados por broncoscopía sin protección.

Muestras aptas para cultivo anaerobios

Líquidos normalmente estériles: LCR, pleural, peritoneal, etc.

Muestras tomadas por punción a través de piel sana (Heridas, hematomas, colecciones, punción suprapúbica, etc.)

Muestras de endometrio, pulmón, etc., tomadas por biopsia o cepillos recubiertos.

Biopsias (de sitios sin flora habitual)

Transporte y conservación de muestras

Las muestras líquidas, purulentas y de volumen considerable pueden transportarse en tubos estériles.

Las colecciones claras o de volúmenes reducidos pueden inyectarse en frasquitos con tapón de goma y atmósfera inerte, sin introducir aire.

No es conveniente el sistema de transporte de muestras en jeringas, porque permite la difusión del oxígeno al interior de la muestra.

Los raspados, hisopados y piezas de tejido pequeñas pueden colocarse en tubos que contengan medio de Stuart, Cary-Blair, pre-reducido.

Las piezas de tejido con un volumen mayor a 1 cm3, pueden transportarse en recipientes estériles, sin conservantes.

Transporte de MuestrasTransporte de Muestras

• Frascos para hemocultivos

anaeróbicos

• Jeringa y aguja con tapón de goma

(No se aconseja por cuestiones de

bioseguridad)

• Frascos con medios prerreducidos

Tiempo de transporte sugerido según: volumen, Tiempo de transporte sugerido según: volumen, método de conservación y tipo de muestramétodo de conservación y tipo de muestra

MuestraTiempos hasta la

siembra

Aspirados< 1 ml

1-2 ml

> 2 ml

Tejidos y biopsias- +) en recipiente estéril sin anaerobiosis- +) en bolsa anaeróbica

10 minutos

30 minutos

2 – 3 horas

30 minutos

2- 3 horas

Conclusiones Obtener las muestras en forma adecuada Protegerlas de los efectos deletéreos del

oxígeno Mantenerlas a temperatura ambiente Las mejores muestras son las obtenidas de

cavidades cerradas a través de tejidos no contaminados

Bacterias anaerobias: Bacterias anaerobias: Diagnóstico microbiológicoDiagnóstico microbiológico

e identificacióne identificación

Cultivo de anaerobios: Muestra

Características macroscópicas: aspecto, olor, fluorescencia, etc

Observación microscópica:

flora polimicrobiana, leucocitos, orienta terapia empírica, etc.

Gérmenes AnaerobiosGérmenes Anaerobios - - DiagnósticoDiagnóstico

Sospecha clínica

Toma de Muestra

Coloración de Gram

Siembra en Agar sangre con y sin ATB

Incubar 48 hs a 37ºC en anaerobiosis

Morfología colonial y Gram

Pruebas bioquímicas

Diagnóstico microbiológico:Cultivo

Utilizar medios frescos, recientemente preparados o pre-reducidos

Procesar rápidamente

Evaluar qué microorganismos buscamos para elegir el medio: suplementos específicos

Diagnóstico microbiológico:Medios

Medios sólidos NO selectivos: (Agar base enriquecido: Brucella, Columbia, Schaedler, etc) Agar Base + Vit K (1 mg/ml) + Hemina (5 mg/ml) +

sangre lacada al 5% (BHKA) Medios sólidos selectivos:

BHKA + KAN (30 a 50 µg/ml) BHKA + VAN (5 µg/ml)

Medios líquidos: Resguardo (“Backup”) Caldo BHI, tioglicolato suplementado con cisteína, Vit K y

hemina.

Cultivo de anaerobios: Atmósfera

Métodos para generar atmósfera anaerobia: Mezcla de gases: Se utiliza una mezcla compuesta por

5-10% H2, 5-10% CO2 y 80 a 90% de N2, Generadores comerciales: Hay diferentes sistemas

comerciales: Con catalizador (Gas Pack, BBL; Anaerobic Gas

generator, Oxoid): BH4Na y ácido cítrico y una tableta de HCO3Na para generar H2 y CO2

Sin catalizador: mezcla de reactivos que fijan el O2 y generan CO2.

** Activados con agua: Anaerocult, Merck; Britania. ** Activan al contacto con el aire: Anaerogen, Oxoid; Key

Scientific, Mitsubishi; Genbox, Biomerieux

Cultivo de anaerobios: Atmósfera

Sistemas de incubación:

a)     Jarras anaerobias

b)     Cámara anaerobia

c)      Bolsas anaerobias

Obtención de atmósfera anaerobiaObtención de atmósfera anaerobia

2H2 + O2 2H2O

CO2

H2

Obtención de atmósfera anaerobiaObtención de atmósfera anaerobia

Cámara Anaerobia

Cultivo de anaerobios: Incubación - Controles

Incubación: al menos 48 hs a 35-37ºC, hasta 5 a 7 días. Atmósfera anaerobia (< 1% O2)

Control de anaerobiosis Indicadores de Ox-Red: resarzurina, azul de

metileno Recuperación de anaerobios estrictos: F. nucleatum, BGN pigmentados, etc.

Bacterias anaerobiasBacterias anaerobiasIdentificaciónIdentificación

Identificación de Anaerobios: Limitaciones técnica

Bacterias fastidiosas Requerimientos culturales especiales

Atmosfera (<1% O2) Nutrientes Tiempo de desarrollo Metabolismo (algunos inactivos)

Descripción macroscópica

Coloración de Gram

Prueba de toleranciaal oxígeno (CA)(en agar chocolate en Lata con vela)

Procedimiento a seguir con cada colonia:

CULTIVO DE ANAEROBIOS: IdentificaciónCULTIVO DE ANAEROBIOS: Identificación

Colonia

1- Bacilos gram negativos: Discos potencia especial :Vc 5µg+ Cs 10µg + Ka 1000 µgIndolBilisNitratoEsculinaCatalasa

Gram

TablasEspecíficas

4- Cocos gram positivos:

SPS IndolNitrato Esculina

Catalasa Urea

3- Cocos gram negativos:

NitratoFluorescencia (UV)

2- Bacilos gram positivos:

No esporulados: CatalasaNitratoIndol

Esporulados:Glucosa CAMP reversa Gelatina UreaLipasa LecitinasaIndol

IDENTIFICACION IDENTIFICACION PRESUNTIVAPRESUNTIVA

Identificación

IDENTIFICACION: CONCLUSIONESIDENTIFICACION: CONCLUSIONES

Buena observación micro y macroscópica Siempre hacer pruebas básicas de entrada Utilizar pruebas rápidas en spot o enzimas

preformadas (inóculo alto) Asegurarse buen desarrollo en pruebas de

crecimiento.

Anaerobios Esporulados

Características generales

Son incapaces de desarrollar en contacto con el oxígeno

Resisten hasta 120ºC, la desecación y cambios de pH

Forman parte de la flora normal del hombre y de los animales.

Se los encuentra ampliamente distribuidos en el agua, el suelo y

las plantas

Producen infecciones oportunistas.

Su acción se manifiesta por la producción de potentes exotoxinas.

Incluyen al género Clostridium con varias especies.

Las infecciones son muy típicas y el diagnóstico generalmente es

clínico.

Anaerobios Esporulados

Clasificación

Neurotóxicos

Clostridium tetani

Clostridium botulinum

Histotóxicos

Clostridium perfringens

Clostridium septicum

Enterotóxicos

Clostridium difficile

Clostridium perfringens

Clostridium tetani

Clostridium tetani

Se encuentran en el suelo e intestino del hombre y animales.

Las esporas ingresan a través de heridas.

Al alcanzarse el potencial redox adecuado la espora germina.

La forma vegetativa produce una exotoxina (tetanoespasmina).

La toxina difunde por vía neural hasta las neuronas motoras.

En SNC bloquea la liberación de glicina y GABA. A nivel periférico

inhibe la liberación de acetilcolinesterasa dando como resultado la

estimulación incontrolada de los músculos esqueléticos.

El paciente muere por parálisis de los músculos respiratorios.

Clostridium tetani

Clostridium tetani - Prevención

Se previene vacunando con el toxoide tetánico (Vacuna DPT o

antitetánica sola).

Se aplica a los 2, 4 y 6 meses. Primer refuerzo a los 18 meses y

segundo refuerzo al ingreso escolar. Cada 10 años deben

aplicarse refuerzos. La embarazada debe vacunarse al 5to y 7mo

mes de embarazo.

Deben lavarse perfectamente las heridas profundas,

principalmente las producidas por material herrumbrado y las

contaminadas con tierra o materia fecal.

En caso de heridas puede emplearse profilácticamente la

antitoxina, la cual se administra en forma conjunta con la vacuna.

Clostridium botulinum

Clostridium botulinum

Se encuentran en la tierra y sedimentos acuáticos

La fuente más común de intoxicación es la ingestión de

conservas o fiambres caseros.

Al alcanzarse el potencial redox adecuado la espora germina en

el alimento y la forma vegetativa produce una exotoxina.

La toxina ingresa por vía digestiva y difunde por vía humoral hasta

las neuronas motoras.

La toxina bloquea la liberación de acetilcolina dando como

resultado una parálisis fláccida de los músculos esqueléticos.

El paciente muere por parálisis de los músculos respiratorios.

Clostridium botulinum

Clostridium botulinum - Prevención

Deben cumplirse estrictamente las normas de

seguridad en la manipulación de los alimentos

en la industria alimentaria.

Debe educarse a la población general respecto

de los procedimientos seguros de envasado de los

alimentos.

En caso de dudar del origen de los alimentos,

deben calentarse 10 minutos a 100ºC para destruir

la toxina.

No debe administrarse miel a lactantes menores de

1 año de edad (Botulismo del lactante).

No existe vacuna de aplicación universal.

Aplicaciones de la

Toxina botulínica tipo A: BotoxIndicaciones terapeúticas

Espasticidad asociada con accidente cerebro vascular.

Tratamiento en pacientes con parálisis cerebral Distonía cervical (tortícolis) en adultos Blefarospasmo y espasmo hemifacial Corrección del estrabismo Tratamiento focalizado de la hiperhidrosis axilar.

Aplicaciones de la

Toxina botulínica tipo A: BotoxIndicación cosmética

Corrección estética facial para remoción de arrugas glabelares.

Clostridium perfringens

Clostridium perfringens

Se encuentran en el suelo e intestino del hombre y animales.

La bacteria ingresa a través de heridas en forma endógena o

exógena.

Al alcanzarse el potencial redox adecuado la espora germina.

La forma vegetativa produce varias exotoxinas

Las toxinas difunden por contigüidad produciendo necrosis tisular y

abundante cantidad de gas.

La infección se manifiesta como gangrena gaseosa cuando afecta al

tejido subcutáneo o como mionecrosis cuando afecta al tejido

muscular

Con frecuencia debe amputarse el miembro afectado.

Clostridium perfringens

Clostridium perfringens

Clostridium perfringens - Prevención

No existe vacuna de aplicación universal.

Deben extremarse las medidas de asepsia durante las cirugías

abdominales o al aplicar inyecciones intramusculares profundas.

Deben tratarse rápidamente con antibióticos las heridas

contaminadas.

Cámaras hiperbáricas.