bacterias anaerobias
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BACTERIAS ANAEROBIAS DE IMPORTANCIA CLINICA
Evelyn RodríguezFacultad de Microbiología,
UCR
¿Por qué son importantes?
Flora bacteriana humana predominante
Causan infecciones e intoxicaciones serias, con frecuencia fatales
Patógenos oportunistas
En asocio con infecciones por aerobios
Requerimientos de O2 para crecer
Aerobios: 15-21%Microaerofílicos: 5-10%Facultativos: 0-21%Anaerobios: 0%. Según puedan soportar O2– Obligados: < 0.05%– Moderados: 0-5%– Tolerantes: 0---?%
Toxicidad del oxígeno
O2 + e- → O2- radical superóxido
O2 - + e- + 2 H+ → H2 O2 Peróxido de
hidrógeno
H2 O2 + e- + H+ → H2 O + OH. Radical hidroxilo
(los macrófagos y PMN usan esos derivados para destruir patógenos)
Protección contra los tóxicos del O2
Superóxido dismutasa:2O2
- + 2 H+ → H2 O2 (dismunye el radical superóxido )
Catalasa:2 H2 O2 → 2 H2 O + O2
Peroxidasa:H2 O2 + Sust. reducido → H2 O + sust oxidado
Vitamina E, C, glutatión
Anaerobios y Presencia de O2
Los e-disponibles para reacciones metabólicas se dirigen a reducir el O2 :
E disponible para síntesis Efecto bacteriostático(reversible)
Se forman los derivados tóxicos Efecto bactericida
Flora normal predominante en humanos
PielTracto respiratorioBocaIntestino
UretraVagina
PropionibacteriumBG- CG-CG+, CG-, BG-Bacteroides, Clostridium,Bifidobacterium Peptostretococccs.Bacteroides, BG-Lactobacillus, Peptostreptococus
Infecciones por anaerobios
Aprox. 99% de tipo endógenoAsociadas a una mucosa cerca del sitio anatómico de la infecciónLlegada de anaerobios a sitio diferente, muerte de los anaerobios muy estrictos, crecimiento de facultativos y predominio de anaerobios menos estrictosFactores de virulenciaFlora mixta: 3-4 anaerobios
Factores que predisponen las infecciones por anaerobios
Trauma – De piel– De membranas mucosas
Irrigación sanguínea deficienteNecrosis de tejidosDisminución del potencial de Redox
Sospechas de infección por anaerobios
Historia de mordeduras, cirugías, extracciones dentales, otrosInfección en proximidades de superficies mucosasTratamiento previo con aminoglicósidos, trimetoprín-sulfa, algunas quinolonasOlor fétidoPresencia de gas Coloración negruzcaFlorescencia roja con UVPresencia de gránulos de azufreMorfología en tinción de GramAusencia de crecimiento en aerobiosis
Frecuencia de anaerobios en muestras clínicas
BacteroidesCocos G+PropionibacteriumClostridiumFusobacteriumOtros
Anaerobios de importancia clínica
Tinción de Gram
PeptostreptococcusPeptococcus
Cocos
Clostridium
Con esporas
Actinomyces BifidobacteriumEubacterium Lactobacillus
Propionibacterium
Sin esporas
Bacilos
Gram positivos
Anaerobios de importancia clínica
Tinción de Gram
Veillonella
Cocos
BacteroidesFusobacteriumPorphyromonas
Prevotella
Bacilos
Negativa
1. Selección de muestras
Todas las muestras que se contaminen con las bacterias de la flora normal deben ser rechazadas:– Torunda de garganta o nasofaringe o cualquier sitio
de la mucosa oral– Esputo expectorado– Lavados bronquiales– Torundas vaginales, cervicales o uretrales– Torundas de abscesos– Heces o torundas rectales* excepto para C. difficile
Aspirados
Cualquier aspirado de un sitio normalmente estéril es aceptable.Desinfección adecuada del sitiocon aguja y jeringa. NUNCA con torundaSe debe expulsar el aire que quede en la jeringa (cuidado con aerosoles)Transporte rápido al laboratorio (tapón de hule estéril) o inoculación de medios PRAS
Abscesos
Con aguja y jeringa, NO con torunda.Si son profundos deben ser aspirados con catéter o por procedimientos quirúrgicosSi son orales, se aísla la zona con algodón y se limpia con torunda y alcohol. Luego se aspira con aguja
Ulceras superficiales
Desinfección del sitio y debridación del tejido expuesto (por flora aerobia contaminante)Colección del material en la zona profunda de la úlceraSi la úlcera es purulenta, se puede aspirar el material
Desinfección deheridas
Toma de muestra
Con torunda Con jeringa
Con cureta
Secreciones del tracto respiratorio
Las colectadas a través de la cavidad oral NO son aceptables para anaerobios
Se requieren procedimientos quirúrgicos o invasivos con agujas o catéteres que lleguen hasta los sitios deseados
Muestras del Tracto Genitourinario
Aspiración suprapúbica (orina)Aspiración de abscesosCuldocentesis (para obtener muestras del saco vaginal)Succión de la pared endometrialProcedimientos quirúrgicosLavados (no muy adecuada)
Tejidos
Cualquier muestra de tejido obtenida por cirugía es adecuada para anaerobios
pequeña, se debe inocular en un medio sin oxígeno
grande, se coloca en placa de Petri y se procesa rápido. Si se dispone de bolsas de anaerobiosis se puede tardar más tiempo
2. Transporte de muestras
Siempre a temperatura ambiente
Nunca en la jeringa:Con aguja es muy riesgosoSin aguja se puede perder el materialSi el tiempo es corto se puede usar tapones de hule
Medios de transporte PRAS (ideal)
En medios detransporte
En mediosPRAS
Torundas en mediossemisólidos
3. Procesamiento de muestras
Idealmente en cámara anaeróbicaExamen macroscópico de la muestra:– ¿Es adecuada? ¿Se ha desecado?– ¿Tiene mal olor?– ¿Fluoresce con luz UV?– ¿Se observa el tejido necrótico?– ¿Se ven gránulos de azufre?– ¿Es purulenta?
3. Procesamiento de muestras
Examen microscópico:– Fijación del frotis con metanol 30 seg y no con calor– Tinción de Gram con fucsina básica 0.5%
Observaciones:– Tipo y número de microorganismos– Identificación presuntiva en algunos casos– Sugiere el tipo de medios de cultivo a emplear– Presencia de leucocitos *– Control de calidad
BacteroidesPrevotella
Porphyromonas
Fusobacterium
Clostridium
PropionibacteriumActinomyces
BifidobacteriumEubacterium
Veillonella
Peptostreptococcus
3. Procesamiento de muestras
Microscópico Macroscópico
Ex directo En medio líquido(PRAS)
AS suplementado con Vit K y heminaMedios selectivos
según tinción de Gram
Medios para aerobios
En Platos
Muestra
Incubación anaerobia
Medios selectivos para anaerobios
BBE: grupo Bacteroidesfragilis y BilophilaGentamicina (inhibición de
aerobios)Bilis (inhibición de otros
anaerobios)Esculina y hierro
(colonias negras de B. fragilis)
AS BBEGrupo B. fragilis
BBE
B. fragilis vrs. B. vulgatus Bilophila
Medios selectivos para anaerobios
KVLB: Bacteroides y Prevotella
– Kanamicina (inhibición de aerobios y otros anaerobios G-)
– Vancomicina (inhibición de G+)
– Sangre lisada (pigmento de Prevotella)
KVLB ASPrevotella
Medios selectivos para anaerobios
PEA: crecimiento de anaerobios– Feniletilacohol (Inhibición de aerobios y del
“swarming”, – La morfología de anaerobios es similar a la de AS
Clostridium septicum
4. Inoculación
Previa homogeneización de la muestra
5. Incubación
Cámara de anaerobiosisIncubadora, para medios PRAS (“sellados”)Evacuación y reemplazoJarra o bolsas de anaerobiosis
2 a 3 hr para lograr anaerobiosisNUNCA abrir la jarra antes de 48 hrIncubar de 5 a 7 días, hasta 3 semanas (Actinomyces)
¿Qué sugiere el crecimiento de anaerobios en placas de cultivo?
Mal olor: FusobacteriumClostridium,Porphyromonas
Morfotipos coloniales presentes en anaerobiosis y ausentes en aerobiosis
“Swarming” extenso C. tetani, C. septium, Clostriium sp.
¿Qué sugiere el crecimiento de anaerobios en placas de cultivo?
Doble hemólisis en AS C. perfringens
Fluorescencia roja con UV Prevotella, Porphyromonas
¿Qué sugiere el crecimiento de anaerobios en placas de cultivo?
Colonias café oscuro Prevotella, PorphyromonasPeptostreptococcusniger
Ennegrecimiento y buen crecimiento en BBEgrupo Bacteroidesfragilis
¿Qué sugiere el crecimiento de anaerobios en placas de cultivo?
Colonias lipasa + en AYHC. botulinum, C, sporogenes, C. novyi
Colonias lecitinasa + en AYHC. Perfringens y otros
6. Identificación
Aislamiento en cultivo puro
1. AS + CO2 2. AS + anaerobiosis
Prueba detolerancia al O2
Morfología colonialTinción de Gram
Si 1>2: facultativo
Si 1<2: anaerobio
Identificación presuntiva: B, CB G+
SI: Clostridium
+: ActinomycesPropionibacterium
Eubacterium
doble hemólisisC. perfringens
irregularswarmingcol. gdes
Clostridium
regularsin doble hemólisisActinomy, Propion.
Lactobacillus
-: Morfologia colonial
NO: catalasa
esporas
Morf. Gram
Morf. Gram
Identificación presuntiva: B G- o variables
Sí: Clostridium
PorphyromonasPrevotella
SensibleClostridium
ResistenteBG-:
FusobacteriumBacteroides
NO: sensib a vancomicina
NO: Fluroscencia UVo colonias negras
esporas
Morf. Gram
Identificación presuntiva: cocos
PeptostreptococcusPeptococcus niger
Gram positivos
Veionella
Gram negativos
Morf. colonial
Importancia de la identificación presuntiva
Puede indicar la fuente probable de una infección:– Bacteremia por :
Clostridium: problemas de colonPorphyromonas: lesiones de cavidad oralBacteroides: origen intestinal
Ayuda en la escogencia de antibióticosBase de datos que permita conocer la importancia de los agentes en determinados procesos
Identificación presuntiva (nivel II)
Morfología colonialTinción de GramSusceptibilidad a Kanamicina, VancomicinaColistinaCatalasa, indol, nitratos, urea,movilidad
Identificación presuntiva (nivel II)
Grupo Kanamicina1000ug
Vancomicina5ug
Colistina10ug
Gram - V R* VGram + V S** R
B. Grupo fragilis R R RB. ureolyticus *** S R SFusobacterium S R SPorphyromonas R S R
Prevotella R R RVeillonella S R S
Identificación presuntivanivel II: CG+
Sodio polianetil sulfonato (SPS) 10000 ug
Peptostreptococcus anaerobius SOtros cocos G + R
Identificación definitiva
Tubos convencionales (PRAS)Por pruebas bioquímicas miniaturizadas– API 20A
Sistemas de identificación basados en EZ preformadas:– API ID 32, RAPID ANA II, Vitek ANI Card
Cromatografía de gasesCromatografía de gas líquido alta resolución (análisis de ác. grasos celulares)
Tratamiento de las infecciones por anaerobios
1. Limitar la proliferación de anaerobios:Drenar, debridar, eliminar obstrucción, liberar el gas atrapado, mejorar la circulación, oxigenar, cirugía.
2. Impedir que la infección se extienda a tejidos sanos:
Tratamiento con antibióticos.3. Neutralizar las toxinas.
TRATAMIENTO ANTIMICROBIANO
Generalmente empírico
Con base en el sitio y tipo de infección:– Endocarditis: sólo bactericidas
– Abscesos cerebrales: no clindamicina porque no atraviesa
barrera hematoencefálica
Penicinilinas, Cefalosporinas, Imipenem, Clindamicina,
Metronidazol, Cloranfenicol
PSA
PSA Bacterias anaerobias: ¿Cuándo debe hacerse?
NO de rutinaSi el m.o. aislado es conocido como “resistente”:
– grupo Bacteroides fragilis - Clostridium perfringens– B. gracilis - C ramosum, C. innocum– Fusobacterium - C. clostridioforme– Bilophila
Si la infección persiste después de tratamiento empírico.Si no hay datos precedentes de sensibilidad (c/6 meses)En infecciones severasEn tratamientos prolongadosEvaluación de nuevos antimicrobianos
Resistencia múltiple en CR, grupo Bacteroides
Aislamientos: 34Antibióticos probados: 16Resistencia a número frecuencia
14 AB 1 3%12 AB 2 6%11 AB 1 3%9 AB 1 3%8 AB 5 14%
10/34 (30%) de las cepas fueron resistentes a la mitad de los AB probados
PSA Bacterias anaerobias Idealmente, según tipo de muestra
Infecciones del SNCEndocarditisOsteomielitisBacteremiaImplantesInfección de articulaciones
Métodos PSA-Bacterias anaerobias
Dilución en agar: REFERENCIA (NCCLS)– agar Brucella, con sangre lisada y vitamina K.– una placa para cada antibiótico en cada
concentración– Inóculo estandarizado como KB– incubación anaerobia– no es práctico– interpretación en tablas específicas para anaerobios– Caro, difícil.– No se hace en CR
Métodos PSA-Bacterias anaerobias: Dilución en caldo
Micro o macrométodosVarios caldos:
– Caldo Brucella + hemina + vit K– West-Wilkins– ICC, otros
Pocillos de microdilucióncomerciales y determinar la MIC Sólo si hay buen crecimiento en el control sin AB
Sistemas automatizados (VITEK)
Métodos PSA Bacterias anaerobiasEpsilométrico o E test
Inóculo 0,5 McFarlandMedio de cultivo AS u otrosUna tira y una placa por
antibióticoIncubación: anaerobiosis 24-
48-72 hrsInterpretación: MIC en la
misma tiraCaro ($300 c/paq de 100ud)
----_
Métodos PSA Bacterias anaerobiasATB ANA (casa Biomerierux)
( estudios recientes lo equiparan al método de referencia, No validado)ATB impregnado en las celdas
inóculo: 3 Mc FarlandIncubación: anaerobiosis 24-48 hInterpretaciInterpretacióón: dos n: dos concconc..
–– si crece en ambas es Rsi crece en ambas es R–– si crece en la mayor es Isi crece en la mayor es I–– si no crece en ninguna es Ssi no crece en ninguna es S
No todas las bacterias crecen bien, en cuyo caso NO se puede interpretarCaro? ($10 cada tira).
Importancia clínica: BG+esporulados (Clostridium)
1. Tétanus: C. tetaniAmpliamente distribuido en el suelo: hasta en 54% (7/% en Meseta Central, 43% en UCR).Presente en aguas, sedimentos e intestinos de animalesContaminación de la herida con esporasContaminación fecal del cordón umbilical (Tétanos neonatal)Disminución del potencial de oxidorrecducciónGerminación y producción de tetanospasmina, Inhibición de neurotransmisores y rigidez muscular
C. tetani, cont.
P.I.:7 días (1-54)Síntomas en mandíbula (risa sardónica), cuello, espalda, faringe, dificultad respiratoria y muerte.Vacuna DPTDiagnóstico: clínico*, de lab: BG+, esporulados(pocas veces), sarwming en AS, toxigenicidad en ratónTx: toxoideCasos en CR: sí, (pocos), tétano neonatal
Importancia clínica: BG+esporulados (Clostridium)
2. Gangrena gaseosa o mionecrosis:C. perfringens (80%), C. hystoliticum, C. septicum, C. novyi, C. bifermentans.Heridas contaminadas, traumas o cirugíasInvasión y necrosis licuefactiva de músculoProducción de exotoxina mionecrótica potente y de rápida acciónDiagnóstico: BG+, esporulados o no en las muestrasDebridación AmputaciónNo hay registros en CR
Importancia clínica: BG+ esporulados(Clostridium)
3. Botulismo: C. botulinumDistribución mundial en suelos, ambientes acuáticos, e intestinos de aves y mamíferos.Conglomerado de especies fenotípicamentediversasProductoras de la exotoxina más letal que se conoce: neurotoxina botulínica (1 X 108 LD 50ratón/mg)
C. botulinum, cont.
parálisis flácida aguda bilateral que inicia en cara, cabeza, faringe y desciende simétricamente a tórax y
extremidadesmuerte por fallo respiratorio (parálisis de la lengua,
músculos de faringe, diafragma e intercostales)Diagnóstico:– Identificación de la toxina específica en:
SueloHecesAlimentoAspirado gástricoSuero
Cultivo de C. botulinum e identificación de toxina
1. Botulismo clásico
Cocción inadecuada
Sobrevivencia de esporas
Germinación y multiplicaciónProducción de toxina
Ingestióm de toxinapreformada en alimentos
Alimentos en conserva (hortalizas y frutas), pasteles, papas asadas (USA, tipoA)
Embutidos, Europa, tipo B
Pescado, Japón, tipo E
PI 12PI 12--36 h, hasta d36 h, hasta dííasas INTOXICACION
2. Botulismo intestinal
Ingestión de esporas
Germinación y multiplicaciónen intestino
Producción de toxina en intestino
INFECCIÓN, con producción de toxina
2. Botulismo intestinal
Forma más común de la enfermedad (USA)Niños < 1 año (94% < 6 m meses) o adultos con alteraciones en anatomía y flora intestinalEstreñimiento, intranquilidad, pérdida de control de cabeza, hipotonía (bebé laxo)fallo respiratorio.
benignaMuerte repentina
5% de casos de muerte súbita
Letalidad de 1% en hospitalizados
3. Botulismo por heridas
Esporas en suelos
Germinación y multipli-cación en herida
Producción de toxina in situ
Similar a tétano Se ha relacionado con drogas endovenosas
Clostridium boulinum, Costa Rica (23%)
Jicaral
Barranca
Mata de Limón
Pitahaya
Paquera
Chirripó
Parismina
Suelos toxigéncicos
Aislamientos
¿Qué pasa en Costa Rica?
¿Casos en CR?¿Condiciones para que se den?¿Uso de conservas en CR?¿Papel de C. perfringens en suelos?
58% de las cepas con efecto inhibitorio sobre C. botulinum2 cepas de 38 inhibían la producción de toxina
Importancia clínica: BG+esporulados (Clostridium)
4. Tóxicoinfección: C. perfringensPatógeno más abundante en la naturalezaPresente en casi todo material expuesto al polvo, incluyendo alimentos (< 5 x 102
esporas/día)103 a 108 UFC/g de heces en niños desde 6 meses hasta adultos
4. Tóxicoinfección: C. perfringens(cont.)
En CR: – 88% en suelos – 46 % de carnes cocidas en restaurantes – 44 % de embutidos a base de carne de
cerdo (chorizo, salchichón y mortadela)– 93% de ganado vacuno, 55% de carne en
canal, 61% a 75% de carne procesada o molida en el expendio y 3 % restaurantes
4. Tóxicoinfección: C. perfringens(cont.)
Cocción inadecuada
Sobrevivencia de esporas
Germinación y multiplicación
Ingestión de 105-108 cél/g
Esporulación en intestino
Carnes y derivados
Recalentamiento inadecuado
enterotoxina Diarrea, cólico y náuseas
4. Tóxicoinfección: C. perfringens(cont.)
Aparición repentina de cólicos, diarrea y náusea (generalmente sin vómitos ni fiebre)PI: 7 a 15 hr.Leve, de corta duración (menos de 24 hr)Segunda causa de enfermedad asociada a alimentos en USA, sólo precedida por Salmonella. Diagnóstico:
– Datos epidemiológicos sugestivos– Aislamiento de al menos 105 cél/g alimento o 106/g en heces – Determinación de enterotoxina en heces o en cepas aisladas
Importancia clínica: BG+esporulados (Clostridium)
5. Diarrea asociada a antibióticos, colitis seudomembranosa, diarrea nosocomial : C. difficile
AB:ampicilina, clindamicina y cefalosporinasAislado de suelos, paja, heces. Parte de la flora normal – 50% en niños < 1 año– 3% en niños > 2 años– 1.9% (Suecia) a 15.4% (Japón) en adultos– 21% en pacientes hospitalizados con alta
prevalencia de C. difficile, 1/3 con síntomas.
C. difficile, cont.
Proliferación de C. difficile por alteración de la flora normal.Produción de toxinas A y B (enterotoxina y citotoxina) y factor de alteración de la motilidadDiarrea y necrosis del colon
Importancia clínica: BG+ no esporulados
1. Actinomycosis: Actinomyces, Bifidobacterium, Eubacterium y Propionibacterium)
Infecciones oportunistas, parte de flora normalInfección granulomatosa crónica, con fístulas que drenan en la superficie pus y gránulos de azufre.Común en región orofacial, también en cerebro, región pleuropulmonar y órganos genitalesMorfología microscópica en material purulento: Dxpresuntivo
Importancia clínica: BG+ no esporulados
2. Vaginosis bacteriana: Mobiluncus(Bacteroides, Peptostreptococcus, Gardnerella)Flujo anormal y maloliente, infección más profunda hasta útero.Partos prematuros y otras complicacionesDe difícil cultivo, morfología microscópica característica (BG positivos curvos)
3. Abscesos, bacteremias, infecciones de heridas, peritonitis, etc.
Importancia clínica: BG-
Grupo Bacteroides fragilis, Prevotella, Porphyromonas y Fusobacterium.Generalmente de la flora normalInfecciones mixtas:
– Tejidos blandos– Orales, abdominales, respiratorias, etc– Abscesos– Peritonitis– Bacteremias– Infecciones sistémicas
Grupo Bacteroides fragilis
Patógeno más frecuente en infecciones humanasFuente usual: flora normal fecalAbscesos cerebrales, pulmonares, infecciones intraabdominales e intrapélvicas, peritonitis.20 a 30% de las infecciones por anaerobios25% de los aislamientos de anaerobios en el HSJD: 35% de abscesos, 30% de secreciones, 17% de cavidad abdominal.
Importancia clínica: Cocos
Gram positivos:– Peptostreptococcus anaerobius– Peptococcus niger ( > importancia veterinaria)– Abscesos cerebrales,orales, pulmonares,
genitales, etc.
Gram negativos:– Veillonella (habitante de cavidad oral).
Infecciones en cabeza, cuello, dentales y pulmonares, heridas por mordeduras