Instituto Politécnico Nacional ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

QBPPRÁCTICA: RECUENTO Y ASILAMIENTO DE

BACTERIAS ANAEROBIAS

3/10/2016

3QM1

INTRODUCCIÓN

Los microorganismos con base en su requerimiento de oxigeno pueden dividirse en: • Aerobio Estricto: Cuando necesita oxígeno para vivir,

potencial REDOX oxidante (Positivo)• Microaerofílico: Requieren oxígeno en concentraciones

menores a la atmosférica (21%)• Aerotolerante: No requieren el oxígeno para vivir pero

tampoco es tóxico para ellos.• Anaerobios Facultativos: Pueden vivir con o sin oxígeno

(Metabolismo oxidante y metabolismo reductor)• Anaerobios estrictos: No requieren oxígeno para vivir,

potencial REDOX bajo (Reductor)

El oxígeno es un agente altamente oxidante fuerte, capaz de generar radicales libres altamente reactivos, llamados ROS (Siglete O•, Superóxido O2•, Peróxido O2^-2, hidroxilo OH) Los microorganismos que utilizan o toleran el oxígeno han desarrollado mecanismos protectores como la presencia de enzimas que eliminan estos radicales.

También el oxígeno afecta el potencial REDOX.

Superóxido dismutasa (SOD)

• Esta enzima cataliza la dismutación de superóxido en oxígeno y peróxido de hidrógeno. Debido a esto es una importante defensa antioxidante en la mayoría de las células expuestas al oxígeno.

• Impide la acumulación potencial letal de superoxido (O2∙) al catalizar su conversión en oxígeno y peróxido de hidrogeno.

Peroxidasa

• La peroxidasa es una enzima capaz de catalizar la oxidación de una amplia cantidad de sustratos, utilizando el poder oxidante del peróxido de hidrógeno.

Catalasa

La descomposición del peróxido en el tejido animal es catalizada por la catalasa:

2H2O2 2 H2O + O2

La actividad de la catalasa se encuentra en las células de la mayoría de los organismos, menos en los anaerobios estrictos.La catalasa evita la acumulación nociva de peróxido, ya que sin esta enzima, no habría forma de eliminarlo del organismo.

Potencial REDOX

El potencial redox del medio de cultivo nos indica su capacidad para aceptar o donar electrones, esto es: sus características oxidantes o reductoras.

Cuando un microorganismo requiere un ambiente oxidante se dice que desarrolla un metabolismo oxidativo (o respirativo) mientras que los microorganismos que requieren ambientes reductores (o menos oxidantes) realizan un metabolismo fermentativo.

Condiciones anaerobias

• Adición de sustancias reductoras a medios de cultivo líquidos que contienen grupos sulfhidrilo que al unirse ceden sus electrones reduciendo el medio.

• Uso de topones de rosca, sellos de aceite mineral o vaselina que evitan el acceso del oxígeno atmosférico a los cultivos.

• Calentamiento del medio de cultivo previo a su inoculación para eliminar O2 disuelto.

Cisteína Tioglicolato

• Conteniendo del medio en el tubo hasta ¾ partes de la altura, con lo que el fondo tienen una concentración de oxígeno muy baja.

• Remoción del oxígeno de la atmósfera de incubación.

1. Reacciones químicas Sistema Gas Pak, Anaerogen.

2. Desplazamiento de O2 de los medios substituyendolo por otros gases (H2, N2, CO2)

Se puede notar estas condiciones usando un indicador Redox (Azul de Metileno o Resarzurina) .

Condiciones anaerobias

SISTEMA GAS-PAK

La generación de H2 y CO2 por medio de una reacción química cuyos sustratos se encuentran separados en un sobre al cual se le agrega agua, desencadenando la siguiente reacción:

NaBH4  + 2H2O →  NaBO2  + 4H2

Sustrato 1

C6H8O7(s) + H2O → C6H8O7(aq) Sustrato 2

C6H8O7(aq) + 3NaHCO3(s)  → C6H5O7Na3 + 3H2CO3 C6H5O7Na3 + 3H2O + 3CO2  Sustrato 3

(Sustratos)

La combinación del H2 y el O2 del aire para formar agua generan la anaerobiosis, esta reacción se cataliza utilizando granallas de Zinc recubiertas de Paladio.Una tirilla de papel impregnada en Azul de metileno (azul en presencia de O2, incoloro en ausencia) introducida en la Jarra es el indicador de Anaerobiosis.

S

N

NCH3

CH3

NCH3

CH3

Azul de Metileno(Estado

Oxidado)Color azul

S

HN

NCH3

CH3

NCH3

CH3

Azul de Leucometileno(Estado reducido)

Incoloro

ANAEROGEN.

Sistema generador de atmósfera anaeróbica que contiene como componente activo ácido ascórbico. La reacción del ácido ascórbico con el oxígeno es exotérmica y alcanza una temperatura de 65 º C.

OBJETIVOS

• Conocer algunas técnicas y medios de cultivo para el aislamiento, recuento y cultivo de bacterias anaerobias.

• observar el efecto de los diferentes potenciales REDOX de los medios de cultivo sobre el crecimiento de microorganismos aerobios, anaerobios estrictos y anaerobios facultativos.

• Estimar la población de microorganismos anaerobios estrictos por el método del Número Más Probable.

MEDIOS DE CULTIVO.FUNDAMENTOS.

AGAR GELOSA SANGRE (GS)

• Clasificación: Diferencial y rico.

• Componentes: Sangre e infusión de tejidos de corazón de ternera.

Fundamento:

I. Permite el crecimiento de una gran variedad de microorganismos, aún de aquellos nutricionalmente exigentes.

II. Permite detectar hemólisis:

• Hemólisis  β (beta-hemólisis)• Hemólisis α (alfa-hemólisis)• Hemólisis γ (gamma-hemólisis)

Hemólisis

Hemólisis β Es una hemólisis completa que decolora la zona alrededor de la colonia en agar de sangre.Bacterias que muestran este comportamiento producen estreptolisina O ó S y lisan todos los eritrocitos.Descomponen la hemoglobina completamente.

Hemólisis γ

Es un término que expresa la ausencia de hemólisis en los cultivos como es el caso en la especie S. bovis. 

Es una hemólisis parcial que crea un color verdoso alrededor de las colonias (la reducción de la hemoglobina a biliverdina).

Atacan los eritrocitos y descomponen la hemoglobina pero no producen la hemolisina así que en las zonas verdes se encuentran todavía eritrocitos enteros.

(S. viridans y S. pneumoniae)

Hemólisis α

AGAR TRIPTICASA SULFATO DE NEOMICINA Y POLIMIXINA (TSN)

Componentes g/LPeptona de caseína 15.0Extracto de levadura 10.0

Sulfito de sodio 1.0

Citrato férrico 0.5

Sulfato de polimixina B 0.02

Sulfato de neomicina 0.05

Agar 13.5

pH 7.2

Medio selectivo (sulfito de sodio).• Peptona fuente de carbono y

nitrógeno. • Extracto de levadura aporta factores

de crecimiento.• Citrato férrico hace evidente H2S. • Polimixina B inhibe bacilos Gram -.• Neomicina inhibe bacilos Gram – y

Gram +.

USO: Cultivo y recuento de Clostridium perfringens.

MEDIO LECHE HIERRO

COMPOSICIÓN• Leche Descremada en polvo (2.5%)• Caldo Nutritivo en Polvo (0.8%)

Aforar a 1 L. de agua• Sello de Aceite mineral

Hierro (Clavo)

Fundamento

• Sustrato: Caseína (proteína). • Enzima: Caseinasa (Proteasa, exoenzima). Medio en el cual la presencia de Caseína y de lactosa

(Compuesto fermentable), permite que en condiciones anaeróbicas el microorganismo realice la fermentación usando como aceptor final de electrones el Fierro (Fe3+) reduciéndolo a (Fe+2), siendo que en condiciones ácidas la caseína se precipite en forma de coágulos por la ‘’Desnaturalización’’ a pH Acido (4.6-4.7)

CALDO NUTRITIVO

Componentes:• Extracto de carne deshidratado 3g• Peptona 5g

Medio no selectivo, contiene pluripeptona (una mezcla de partes iguales de peptona de carne y peptona de caseína) y extracto de carne que constituyen la fuente de carbono y nitrógeno necesarias para el crecimiento bacteriano de organismos con escasos requerimientos nutricionales.

CALDO CARNE.

• Es un medio de enriquecimiento utilizado para el cultivo de microorganismos anaerobios, especialmente los pertenecientes al género Clostridium.

• Contiene sustancias reductoras que favorecen el crecimiento de microorganismos anaerobios estrictos. La disponibilidad de los grupos sulfhidrilos, que aumentan el efecto reductor, es mayor en la proteína desnaturalizada, por ello en este medio se utiliza carne cocida.

Componentes g/LExtracto de levadura 5.0

Casetoina 15.0

Dextrosa 5.0

NaCl 2.5

Cisteína 0.5

Ácido tioglicólico 0.3

Rezarsurina 0.001

Agar 0.75

pH 7.1

• Extracto de levadura aporta factores de crecimiento.

• Casetoina fuente de carbono y nitrógeno.

• Dextrosa fuente de carbono. • Ácido tioglicólico y cisteina son agentes

reductores (-SH).• Rezarsurina indicador REDOX (rosa

oxidado, incoloro reducido).• Agar ayuda al bajo potencial REDOX.

CALDO TIOGLICOLATO

DIAGRAMAS DE FLUJO

• Aislamiento de bacterias anaerobias de suelo o materia fecal.

Adicionar 1g de la muestra al tubo

con 9 ml de agua destilada

homogenizar y sedimentar

Tomar una asada del sobrenadante, sembrar por estría cruzada en agar

TSN o agar tioglicolato.

Homogeneizar nuevamente y calentar en un baño de agua en

ebullición durante 5 minutos. Dejar enfriar y

sedimentar.

Nuevamente sembrar por estría cruzada en

agar TSN o tioglicolato.

Colocar las placas las placas

sembradas en una jarra de anaerobiosis

Incubar a 37°C durante 48 horas.

• II.Cultivo en la jarra de anaerobiosis.• (Sistema Gas pak)

Sembrar por estría cruzada Clostridium sp en 2 placas de gelosa sangre y

TSN.

Colocar una placa de gelosa sangre, agar TSN en una

jarra.

Colocar en el fondo de la jarra el

sobre de Anaerogen, y en

una pared el indicador de

oxido-reduccion.

Incubar en condiciones aeróbicas una placa de gelosa sangre y agar TSN como testigos del

experimento.

Incubar a 37°C por 48 horas. Se debe

verificarlas condiciones

anaeróbicas revisando el indicador (tira

impregnada en azul de metileno) que debe

estar reducido (incoloro)

Hacer un frotis y

teñirlo por Gram

• III.Estimacion de Clostridium sp. En una muestra de suelo o de materia fecal por el NMP

Hacer una serie de diluciones decimales

hasta 10-3 .

Sembrar por triplicado 1 ml de cada dilución en tubos con 10 ml de leche-fierro con sello

de aceite mineral.

Los tubos que presentan

fermentación tormentosa se

consideran positivos.

Incubar a 43°C de 18 a 24

horas.

Estimar el NMP/g en la

muestra original usando la tabla del apendice.

• IV. Comparación del crecimiento en un medios líquidos de diferente potencial de oxidorreduccion de Clostridium sp., Escherichia coli y Bacillus subtilis.

•

Con pipeta Pasteur estéril inocular cada cepa en el fondo de tubos de caldo

tioglicolato, caldo carne y caldo nutritivo.

Incubar a 37°C de 24 a 48 horas.

Observar el crecimiento y su localización en los diferentes

medios de cultivo.

RESULTADOS

MORFOLOGIA COLONIAL Clostridium sp.

GS TSN

FORMA Irregular Irregular

TAMAÑO 2-4mm 2-4mm

COLOR Gris Negro

BORDE Filamentoso Filamentoso

SUPERFICIE Granular Granular

ELEVACIÓN Plana Plana

LUZ TRANSMITIDA Opaca Opaca

LUZ REFLEJADA Mate Mate

ASPECTO Seco Seco

CONSISTENCIA Butirosa Butirosa

OTROS Β- hemolisis

Bacilos Gram +AisladosPresencia de esporas.

Número Más Probable• Es una estrategia eficiente de estimación de densidades

poblacionales cuando una evaluación cuantitativa de células individuales no es factible .

• La técnica se basa en la determinación de presencia o ausencia (pos. o neg.) en réplicas de diluciones consecutivas de atributos particulares de microorganismos presentes en muestras de suelo u otros ambientes.

• El estimado de densidad poblacional se obtiene del patrón de ocurrencia de ese atributo en diluciones seriadas y el uso de una tabla probabilística.

Interpretación NMP

Eq 4 Lab 3

Eq 4 Lab 3

Eq 1 Lab 4

Eq 2 Lab 3

Resultados obtenidosNMP reportado

Equipo Laboratorio 3 Laboratorio 4

1 27 NMP/g < 3 NMP/g

2 93 NMP/g < 3 NMP/g

3 < 3 NMP/g < 3 NMP/g

4 > 1100 NMP/ g 11 NMP/ g

5 23 NMP/g < 3 NMP/g

6 < 3 NMP/g 460 NMP/g

7 460 NMP/ g 27 NMP/g

8 39 NMP/ g -

Crecimiento en medio líquido

Caldo tioglicolato Caldo carne Caldo Nutritivo

E.coli Homogéneo. Homogéneo. Homogéneo.

B.subtilis No crece. No crece o crece muy poco en membrana.

Membrana.

Clostridium sp Homogéneo. Crecimiento en el fondo y disminución de las trazas de carne en el medio.

No crece.

Eq 3 Lab 4

Eq 2 Lab 3

Crecimiento en medio liquido

Crecimiento en medio liquido

Caldo nutritivo Caldo Tioglicolato Caldo Carne

Bacillus Subtilis 12 11 10

Escherichia coli 12 12 12

Clostridium sp. 0 11 10

CONCLUSIONES

• Conocimos las diferentes técnicas empleadas así como los medios de cultivo para aislar bacterias anaerobias.

• Gracias al empleo de NMP se estimo la población de microrganismos anaerobios estrictos.

• Observamos como el efecto REDOX de diferentes medios de cultivo influye sobre el crecimiento de microorganismos anaerobios estrictos, facultativos y aerobios estrictos.

BIBLIOGRAFIA.

• http://www.higiene.edu.uy/cefa/Libro2002/Cap%2026.pdf• https://prezi.com/4_fkkqu0h9uu/camara-de-gas-pak/• http://www.condalab.com/pdf/1075.pdf• https://

www.bd.com/europe/regulatory/Assets/IFU/HB/CE/BA/ES-BA-257144.pdf