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Avda. Cardenal Herrera Oria, 63 28034 Madrid Tel.: +34 917.290.333 E-mail: [email protected] www.cultek.com/biobancos

__________________________________________________________________________________________________ Biobancos

Cultek, S.L.U. www.cultek.com/biobancos

Índice. Pág.

Introducción ............................................................................................................................................. 1

Productos relacionados ........................................................................................................................... 3

Transporte de muestras ..................................................................................................................... 3

Procesamiento de muestras................................................................................................................ 7

Almacenamiento de muestras........................................................................................................ 7

Laboratorio de Biología Molecular ................................................................................................ 20

Extracción del DNA ................................................................................................................. 20

Extracción manual............................................................................................................... 20

♦ Cromatografía de intercambio iónico............................................................................. 20

♦ Cromatografía de adsorción (membranas de sílica gel)................................................ 21

♦ Bolas magnéticas........................................................................................................... 21

♦ Ultrafiltración .................................................................................................................. 22

Extracción robotizada.......................................................................................................... 23

Cuantificación del DNA ............................................................................................................ 27

Amplificación del DNA.............................................................................................................. 28

Software de gestión de muestras....................................................................................................... 32

Tabla resumen de todos los productos que ofrece Cultek para los biobancos....................................... 35

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Cultek, S.L.U. www.cultek.com/biobancos Página 1

Introducción. Los avances en la biología molecular acaecidos en las ultimas décadas, permiten el procesamiento de un gran número de datos, lo que unido a la necesidad de disponer de muestras de calidad en excelentes con-diciones y fácilmente disponibles, hace necesaria la creación de los denominados biobancos.

Un biobanco es un establecimiento público o privado, sin ánimo de lucro, que acoge una colección de mues-tras biológicas concebida con fines diagnósticos o de investigación biomédica y organizada como una uni-dad técnica con criterios de calidad, orden y destino.

La investigación médica de las últimas décadas se ha centrado de forma progresivamente más específica, merced al avance tecnológico y científico, en el estudio de las alteraciones y mecanismos de la vida. Con este fin, actualmente es de gran importancia disponer de muestras biológicas representativas de los distin-tos constituyentes de la función vital como tejidos, tumores, células, proteínas, ADN y distintos fluidos vitales como sangre, suero, orina, etc. susceptibles de posteriores estudios. Otro tema importante es la cada vez más creciente y estrecha colaboración entre diferentes laboratorios por todo el mundo que hace que el en-vío de muestras de unos a otros sea cada vez más frecuente y haga necesario un completo control sobre las mismas.

En este sentido y para potenciar diversos tipos de investigaciones se han constituido los biobancos de muestras vinculadas a diagnósticos, muestras de individuos sanos, etc. desde el que se puedan desarrollar ulteriores investigaciones de algunos procesos tan frecuentes en la población como son las enfermedades infecciosas, de origen genético, neurodegenerativas, el cáncer, etc.

En los biobancos se almacenan muestras biológicas que son una parte del cuerpo humano con información genética de una persona concreta. Es un soporte de datos genéticos distinto de los datos de salud, que se mantienen incluso después de la muerte y que podrían tener efectos para la familia biológica (incluida la descendencia).

El espectacular auge de la investigación biomédica está impulsando la necesidad de disponer de muestras biológicas, lo que conlleva una necesaria modificación de la organización hospitalaria actual.

Un tercio de los biobancos españoles no poseen consentimientos informados (especialmente los no vincu-lados a pruebas genéticas) y cuando existen no se utilizan; sin embargo, destaca el hecho de que el 100% de las muestras en centros de Investigación están anonimizadas. Otro aspecto muy importante de los bio-bancos ya existentes, es la imperiosa necesidad de una modernización de sus instalaciones, con sistemas de alarma y control en caso de un fallo de corriente, la mejoría del control de calidad y el fomento de la co-laboración con otros biobancos nacionales o internacionales mediante el funcionamiento en red.

El almacenamiento masivo de muestras biológicas plantea cuestiones técnicas complejas que afectan des-de la propia recolección de la muestra, su transporte, su identificación, la trazabilidad, su conservación a di-ferentes temperaturas, la recuperación de la muestra guardada y el tratamiento informático de los datos, etc. Además, el hecho de que cada vez más laboratorios (sobre todo de diagnóstico) estén entrando en un sis-tema de gestión de calidad, hace imprescindible una correcta trazabilidad de las muestras en todo momen-to. En especial, en los laboratorios de diagnóstico humano, animal y/o vegetal, la ley obliga a guardar alí-cuotas de todas las muestras analizadas durante un periodo determinado de tiempo (normalmente entre 6 meses y 1 año) en caso de que haya necesidad de volver a analizar la muestra o de realizar un contra-análisis.

Para hacer eficaz la existencia de este tipo de recintos es preciso llevar a cabo cuatro tareas fundamenta-les, como son:

1. la estandarización de los protocolos utilizados. 2. el establecimiento de una adecuada metodología para la codificación e identificación de las muestras. 3. disponer de unos consentimientos informados rigurosos. 4. poseer un personal responsable bien cualificado.

El 28 de Marzo de 2007 se ha aprobado por parte de las cortes generales la Ley de Investigación Biomé-dica en la que se “establecen normas de calidad y seguridad para la donación, la obtención, la evaluación, el procesamiento, la preservación, el almacenamiento y la distribución de las células y tejidos humanos, y se regulan las normas de coordinación y funcionamiento para su uso en humanos” (vinculado a aplicación en humanos con fines terapéuticos o de investigación clínica). La ley contempla la utilización de muestras bio-lógicas para test genéticos, cribados genéticos y la investigación biomédica. Además, se debe respetar el derecho a la información y el derecho a no ser informado (obviado si hay grave perjuicio a terceros). Las Au-toridades Sanitarias determinarán la pertinencia de los cribados genéticos, previa evaluación del Comité Éti-co de Investigación. En definitiva, esta Ley responde a los retos que plantea la investigación biomédica y trata de aprovechar sus resultados para la salud y el bienestar colectivos, impulsando la acción coordinada entre organismos públicos y privados, defendiendo a su vez, los derechos de los individuos.

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Bajo toda esta legislación aplicable a los biobancos (Ley Orgánica de Protección de Datos, Ley del Paciente y la nueva Ley de Investigación Biomédica), hay una serie de artículos que hacen especial referencia a cada uno de los tres grandes apartados en los que se puede dividir un biobanco (recogida y envío, procesamiento y cesión de muestras), tal y como se muestra en el siguiente cuadro:

RECOGIDAY ENVÍO

PROCESAMIENTO

CESIÓN

1. Donación muestras por parte de los pacientes.

2. Información asociada a la muestra, por parte del médico.



Ley Orgánica de Protección de DatosLey del PacienteLey de Investigación BiomédicaArt. 58: Obtención de la muestra.Art. 59: Información previa a la utilización muestra.Art. 60: Consentimiento informado.Art. 70: Derechos de sujeto fuente.


1. Procesamiento de datos y muestras.

2. Almacenamiento.


2. Almacenamiento.

Ley Orgánica de Protección de DatosLey del PacienteLey de Investigación BiomédicaArt. 61: Conservación y destrucción de la muestra.


1. Investigadores solicitan muestras para proyectos concretos.

2. Entrega de las muestras por parte del biobanco.



Ley Orgánica de Protección de DatosLey del PacienteLey de Investigación BiomédicaArt. 62: Informe CEIC.Art. 69: Obtención y cesión de muestras.


RECOGIDAY ENVÍO

PROCESAMIENTO

CESIÓN








2. Almacenamiento.


2. Almacenamiento.









En definitiva, un biobanco es una herramienta para la investigación en biomedicina que beneficia a:

1. La población en general: 1.1. Relaciona estilo de vida o factores ambientales con la enfermedad, identificando posibles factores

de riesgo. 1.2. Sirve para desarrollar herramientas de diagnóstico para la prevención de dichas enfermedades.

2. Los pacientes: 2.1. Desarrollo de sistemas de diagnóstico que permitan una clasificación precisa, un diagnóstico pre-

coz y la implantación de métodos no invasivos. 2.2. Desarrollo de sistemas de pronóstico. 2.3. Identificación de posibles dianas terapéuticas.

y al mismo tiempo:

Para los investigadores del ámbito sanitario: Proporciona un sistema único y consensuado de recogida, almacenamiento y donación de ADN con

criterios de calidad y orden que permite adecuados estudios epidemiológicos. Proporciona asesoramiento legal y ético, y regula el intercambio de muestras biológicas para la inves-

tigación con procedimientos normalizados y un mecanismo transparente. Sirve de instrumento para la investigación cooperativa multicéntrica, multidisciplinar e intersectorial. Contribuye a la entrada de nueva financiación y patentes en el Sistema Sanitario.

Para la industria biotecnológica y farmacéutica: Le permite contar con un centro de referencia como proveedor de muestras biológicas con todos los

requisitos éticos y legales requeridos. Le permite cambiar la estrategia de los ensayos clínicos mediante la farmacogenómica y farmacoge-

nética lo que supone: Ahorro de costes. Reducción de número de pacientes reclutados en ensayos clínicos. Agilizar protocolos y la comercialización de nuevos fármacos.

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Productos relacionados. TRANSPORTE DE MUESTRAS.

Siempre deben cumplirse las normativas de transporte de la ONU al transportar sustancias infecciosas de Categoría A y B. Los requisitos varían dependiendo del país, el modo de transporte (avión – normati-va IATA – o carretera – normativa ADR –); la clasificación y el acondicionamiento de la muestra.

Estos requisitos están diseñados para asegurar que las muestras llegan a su destino en buen estado y no presenten riesgos para personas o animales durante el transporte.

Las muestras infecciosas (sustancias de las que se sabe o se espera razonablemente que contengan patógenos), se dividen en dos categorías:

Categoría A: sustancia infecciosa que se transporta en un estado tal que, en caso de producirse la exposición a la misma, puede producir discapacidad permanente, es potencialmente mortal o puede provocar una enfermedad fatal a los seres humanos o animales.

Las sustancias infecciosas que cumplen estos criterios y que pueden provocar enfermedades en los seres humanos y animales deben tener asignado el código UN2814. Las sustancias infecciosas que provocan enfermedades sólo en animales deben llevar el código UN2900.

Durante el transporte de las sustancias infecciosas asignadas a la Categoría A, deben cumplir las Instrucciones de Acondicionamiento 602 (IATA, por aire) ó 620 (ADR, por tierra).

Categoría B: sustancia infecciosa que no cumple los criterios para su inclusión en la Categoría A. Las sustancias infecciosas de la Categoría B tienen el código UN3373.

Durante el transporte de las sustancias asignadas a la Categoría B, deben cumplir la Instrucción de Acondicionamiento 650 (IATA o ADR).

No obstante, las sustancias infecciosas se subdividen aún más por su definición:

Sustancias biológicas: conocidas previamente como Muestras Diagnósticas o Muestras Clínicas, las sustancias biológicas son cualquier material humano o animal, que incluye, entre otros: excreciones, secreciones, sangre y sus componentes, torundas con tejido y líquido tisular y partes del cuerpo que se transportan con fines como investigación, diagnóstico, actividades de investigación, tratamiento y prevención de enfermedades.

Las muestras diagnósticas se clasifican como de Categoría B cuando se transportan y deben cumplir las Instrucciones de Acondicionamiento 650 (IATA o ADR).

Productos biológicos: aquellos productos derivados de organismos vivos, que se fabrican y distribu-yen de acuerdo con los requisitos de las autoridades políticas nacionales que pueden tener requisitos de autorización especiales y que se usan para la prevención, el tratamiento o el diagnóstico de en-fermedades en seres humanos o animales o para el fines de desarrollo, experimentales o de investi-gación relacionados con lo anterior. Incluyen, entre otros, los productos terminados o no terminados, como las vacunas.

Los productos biológicos se dividen en dos grupos:

Los fabricados y acondicionados de acuerdo con los requisitos de las autoridades nacionales co-rrespondientes y transportados con fines de acondicionamiento o distribución final y uso por parte de personas. Las sustancias de este grupo no están sujetas a estas normas.

Los que no entran dentro de los requisitos del apartado anterior y se sabe o se cree razonable-mente que contienen sustancias infecciosas y que cumplen los criterios para su inclusión en la Ca-tegoría A o la Categoría B. Las sustancias de este grupo deben incluirse en las normas UN2814, UN2900 o UN3373 según proceda.

Microorganismos y organismos genéticamente modificados: microorganismos y organismos en los que el material genético se ha alterado deliberadamente mediante ingeniería genérica de una for-ma que no se produce naturalmente. A los microorganismos y organismos que cumplen los criterios para inclusión en la Categoría A ó la Categoría B se les asigna la UN2814, UN2900 o UN3373 según proceda.

Los microorganismos y los organismos genéticamente modificados que no cumplen la definición de sustancia infecciosa se clasificarán como sustancia peligrosa miscelánea y se envasarán en conse-cuencia.

Residuos clínicos: residuos derivados del tratamiento médico de animales o seres humanos proce-dente de investigación biológica.

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A los residuos médicos o clínicos con sustancias infecciosas de categoría A se les deben aplicar la UN2814 o UN2900, según proceda. A los residuos médicos o clínicos con sustancias infecciosas de la Categoría B se les debe aplicar la UN3291.

Cultivos: los cultivos (reserva de laboratorio) son el resultado de un proceso por el que los patógenos se amplifican o propagan intencionalmente para generar concentraciones elevadas, aumentando así el riesgo de infección cuando se produce exposición a ellos. Esta definición no incluye los cultivos pensados con fines diagnósticos y clínicos.

Los productos de DGP están probados y certificados para que cumplan las normas correspondientes de la ONU y las instrucciones de envasado de la IATA y la ADR. Nuestros envasados se revisan y actuali-zan de forma continua para satisfacer las diversas enmiendas de instrucciones de envasado.

El envasado para las sustancias infecciosa de categoría A y B debe comprender tres capas de acondi-cionamiento:

Acondicionamiento (o envasado) primario/interno (p. ej., tubos evacuados; bolsas de muestras; tarros universales). El acondicionamiento primario debe estar a prueba de fugas y el primario o el secundario deben soportar una pre-sión interna de 95kPa.

Absorbente (p. ej., material absorbente, bolsa de 4 huecos). Para líquidos, de-be haber absorbente suficiente para todo el contenido del acondicionamiento primario. Los acondicionamientos primarios deben ser envueltos individualmen-te o por separado para impedir el contacto entre ellos.

Acondicionamiento secundario (p. ej., bolsa, contenedor). El acondiciona-miento secundario debe ser a prueba de fugas y el secundario o el primario de-ben soportar una presión interna de 95kPa. Acondicionamiento externo (p. ej., caja externa). Acondicionamiento externo rígido de resistencia adecuada para su capacidad, masa y uso previsto y con al menos una superficie con dimensiones mínimas de 100mm × 100mm. También debe poder contener un material de acolchamiento adecuado y debe estar marcado adecuadamente.

De conformidad con todo lo expuesto anteriormente, Cultek ofrece a través de una de sus representadas (DGP Ltd.) toda una gama de productos para el envasado y transporte de muestras, tal y como se mues-tra a continuación:

Infeccioso De diagnóstico Control de

temperatura

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Infeccioso

Completos y listos para enviar. Certificados por la ONU para muestras infecciosas/de diagnóstico. Resistentes, duraderos y de gran protección. Reutilizables. Rentables. Fáciles de utilizar. Ideales para el envío de una amplia gama de contenedores primarios incluidos tubos para muestras de sangre, viales, frotis, envases genéricos y placas de Petri.

Gama PATHOPAK PATHOSHIELD 4 BIOSHIELD TR BIOTAINER 12L

De diagnóstico

Completos y listos para enviar. Sistemas conforme con la norma PI650. Económicos. Ideales para el envío de una amplia gama de contenedores primarios incluidos tubos paramuestras de sangre, viales, frotis, envases genéricos y placas de Petri.

Gama PATHOSHIELD

IATA - por aire ADR - por tierra

PATHOPAK 20L BIOSHIELD BIOCARRIER

Control de

temperatura

BIOTHERM Reutilizable, económico y de gran eficacia. Ideal para el envío de una amplia gama de muestras con nieve carbónica. Asa de transporte para facilitar una manipulación cuidadosa. Disponibles cajas de repuesto. Consulte los productos “componentes”. Informes de rendimiento probado de temperatura disponibles bajo pedido.

BIOTHERM COMBI Completo y listo para enviar. Productos no alterables y con cadena de frío juntos. Reutilizable. Bajo coste. Fácil de utilizar. Asa de transporte para facilitar una manipulación cuidadosa. Ideal para el envío de una amplia gama de muestras con control de temperatura mediante nievecarbónica.

Pueden usarse los productos DGP PATHOPAK para los envíos de muestras para diagnóstico e infecciosas.

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Equipos COOLPAC validados para el control de temperatura de +2°C a +8°C Deben enfriarse o congelarse 24h antes de su uso. Rentable. A usar con la gama BIOTHERM.

Dispositivos TECHNI-ICE de control de temperatura Deben enfriarse o congelarse 24h antes de su uso. TECHNI-ICE se suministra deshidratado en un envase plano. Fácil de almacenar. Rentable. Puede utilizarse con cajas BIOTHERM y Combi.

PATHOSHIELD 4 Aislado Completo y listo para enviar. Reutilizable. Rentable. Fácil de utilizar. Puede convertirse en embalaje plano para mejorar el almacenaje. Ideal para su uso con hojas COOLPACS o TECHNI-ICE.

BIO-FREEZE Completo y listo para enviar. Certificado por la ONU para el envío de muestras infecciosas/de diagnóstico. Mantiene el contenido congelado hasta 44 – 48h. Informe de validación disponible bajo pedido. Reutilizable. Fácil de utilizar. Ideal para el envío de una amplia gama de muestras y envases, incluidos tubos para muestrasde sangre, frotis y envases genéricos.

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PROCESAMIENTO DE MUESTRAS. ALMACENAMIENTO DE MUESTRAS.

A la hora de almacenar muestras, hay muchos métodos de identificar las muestras desde los más sencillos de escribir una simple etiqueta a mano hasta los más sofisticados con codificaciones 2D, pe-ro en todos los casos hay que asegurarse de una completa trazabilidad de la muestra:

Escribir la identificación en el propio tubo o en una etiqueta a mano: es un trabajo muy costoso pa-ra el personal del laboratorio y una manera muy poco segura de buscar la trazabilidad de una muestra, incluso cuando se trabaja con un número muy pequeño de muestras. Hay un elevado riesgo de una mala identificación de las muestras debido a una incorrecta anotación o interpreta-ción del código de la muestra por parte del personal del laboratorio o incluso por un borrado acci-dental del mismo debido a los solventes utilizados en el laboratorio o el propio proceso de almace-namiento (-20°C ó -80°C).

Utilizar tubos con codificación alfanumérica y cajas con códigos de barras: es un sistema semi-único que implica una menor mano de obra por parte del personal del laboratorio ya que los tubos vienen ya colocados en su correspondiente posición por parte del fabricante de los tubos; incre-menta la trazabilidad de las muestras siempre y cuando el tubo se relacione estrictamente con la caja que lo contiene, pero proporciona mucho riesgo de una perdida de la trazabilidad de las muestras en caso de caída accidental de los tubos de su caja o cuando se esta trabajando con va-rias cajas simultáneamente. No proporciona una completa trazabilidad de las muestras.

Utilizar etiquetas de códigos de barras (1D o 2D) en los tubos: es una labor bastante costosa para el personal del laboratorio ya que hay que imprimir y etiquetar todos y cada uno de los tubos y re-quiere bastante inversión inicial en cuanto al sistema específico de impresión de etiquetas; por otro lado hay que asegurarse de que las etiquetas soporten las temperaturas a las que se van a alma-cenar los tubos para no correr el riesgo de que se desprendan a lo largo del tiempo.

Utilizar tubos con codificación 2D fija en el fondo del tubo: actualmente hay dos sistemas disponi-bles – Tracker o Datamatrix y TraXis – y ambos sistemas proporcionan una trazabilidad completa de la muestra a lo largo del tiempo al mismo tiempo que no ocasiona un trabajo extra al personal del laboratorio.

Sistema Tracker (Datamatrix) Sistema TraXis

En ambos casos, el código y el tubo vienen como un sólo producto ya que la misma se graba me-diante un láser sobre el propio plástico del fondo del tubo (hay que asegurarse que la codificación 2D no viene simplemente pegada, en cuyo caso podría caerse durante el almacenamiento a -20°C ó -80°C); esto garantiza que la codificación nunca se puede caer del tubo a lo largo de toda su vida útil.

Por otro lado, hay que destacar que la codificación de cada uno de los tubos individuales es com-probada antes de salir de la fábrica, para asegurar al 100% el control de calidad de los mismos.

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Proceso de fabricación de los tubos

Grabado por láser de la codificación en fondo de los tubos

Sección de uno de los puntos del código grabado mediante el láser

Además, estos sistemas de almacenamiento en formato de rack de 96 pocillos en estándar SBS (Society for Biomolecular Screening) proporcionan una rápida lectura de todo el rack al mismo tiempo que permiten una completa robotización de los mismos por brazos robóticos. La lectura se realiza mediante un escáner y un software específico que decodifica los tubos y los exporta a cualquier base de datos ODBC:

Escáner de lectura de los racks Software para decodificar los tubos

Exportación de los resultados vía ODBC

Mientras que el sistema Tracker (Datamatrix) tiene un número limitado de combinaciones posibles (alrededor de 10 billones) y es proporcionado por diferentes fabricantes, el sistema TraXis es exclusivo de la empresa Micronic y ésta garantiza al 100% que nunca en toda la vida habrá en el mundo dos tubos que posean la misma codificación.

En la siguiente tabla se puede observar un resumen de las propiedades de todos los posibles siste-mas de almacenamiento de muestras:

Sistema Mano de obra Trazabilidad Velocidad Seguridad Automatización

Escritura en el tubo Elevada Mala Mala Mala Mala

Tubos alfanuméricos Baja Media Buena Mala Media

Etiquetas de códigos de barras

Extremadamente alta Buena Mala Mala Media

Tubos con codificación 2D en el fondo Nula Completa Máxima Excelente Total

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Otro aspecto muy importante a tener en cuenta (además de la propia codificación) es la calidad del material del que están fabricados los tubos. La empresa Micronic, como especialista mundial en sis-temas de almacenamiento fabrica todos sus tubos de polipropileno de la máxima calidad y en salas limpias clase 10.000; además, están aprobados por la FDA americana para su utilización en medici-na, están certificados libres de DNasas y RNasas y muestran las siguientes propiedades diferencia-doras de otros sistemas de almacenamiento disponibles comercialmente:

Todos los tubos tienen un doble anillo en la parte superior para asegurar perfectamente los tapones, evitar que salten durante los ciclos de con-gelación y descongelación y permitir ser manipulados sin problemas por brazos robóticos.

Para demostrar lo bien que los tapones se fijan a los tubos, se llenaronvarios racks de tubos de Micronic y de otro fabricante con 1,0mL deagua y se metieron en el congelador toda la noche. Al día siguiente sesacaron los racks con los tubos para que se descongelaran.

Según se iba produciendo la descongelación, los tapones empezaron asaltar de los tubos del otro fabricante (foto de abajo) mientras que el100% de los tubos de Micronic mantuvieron los tapones intactos (foto dearriba).

Todos los tubos de Micronic están disponibles con fondo en “U” o en “V”proporcionando una máxima flexibilidad para el pipeteo y almacena-miento de las muestras.

Todos los tubos de Micronic están fabricados de polipropileno de lamáxima calidad y en salas limpias clase 10.000. La codificación de cada tubo es comprobada individualmente antes de salir de la fábrica.

Todos los tubos de Micronic están disponibles en negro para el almace-namiento de sustancias sensibles a la luz.

Todos los tubos de Micronic están disponibles en formato “SNAP” de tal forma que los tubos quedan bloqueados dentro del rack impi-diendo que se caigan en caso de voltear accidentalmente el rack.

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Los sistemas de tapones de TPE para el almacenamiento hasta -80°C están disponibles en 10 co-lores diferentes y vienen en forma-to blister para sellar los 96 tubos simultáneamente, quedando poste-riormente sellados individualmente.Además, están disponibles ya per-forados para una mejor toma de muestra del tubo sin necesidad de tener que destaponarlos lo que fa-cilita su manipulación y evita ries-gos de contaminación cruzada.

Sistema “twistlock”

Igualmente, todos los tubos de Mi-cronic están disponibles con tapón de rosca y en 6 colores diferentes para una mejor identificación, para el almacenamiento a ultra bajas temperaturas (-20°C, -80°C y va-pores de nitrógeno líquido). Además los racks incorporan el sistema de anclaje “twistlock” para evitar que los tubos roten dentro de su posición y sea más fácil desta-parlos:

Micronic ofrece la más amplia gama de volúmenes disponibles de todo el mercado y en todos los formatos posibles:

Tubo Fondo Volumen bruto Volumen neto Altura Polipropileno 0,50mL V 0,50mL 0,30mL 13,0mm Polipropileno 0,75mL V 0,75mL 0,52mL 26,0mm Polipropileno 0,75mL U 0,79mL 0,57mL 26,0mm Polipropileno 1,1mL Screw-Top V 1,13mL 0,82mL 36,5mm Polipropileno 1,4mL A 1,34mL 1,12mL 44,0mm Polipropileno 1,4mL V 1,34mL 1,12mL 44,0mm Polipropileno 1,4mL U 1,42mL 1,19mL 44,0mm Polipropileno 1,4mL no codificado U 1,34mL 1,11mL 44,0mm Polipropileno 2,5mL no codificado U 2,90mL 2,68mL 82,5mm Polipropileno 7,5mL Plano 7,49mL 6,33mL 44,0mm

Otro aspecto importante de estos sistemas son los propios racks de almacenamiento. Micronic dispo-ne de racks completamente apilables para cada rango de volúmenes:

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Roborack-96

(tubos de 1,1mL y 1,4mL) Loborack-96

(tubos de 0,50mL y 0,75mL) Comorack-24

(tubos de 7,5mL)

Una ventaja adicional de estos sistemas de almacenamiento es el enorme porcentaje de ahorro de espacio que se consigue en cada congelador; en la siguiente tabla se muestra una comparativa del número de tubos que se pueden almacenar en un congelador estándar de 500L:

Tipo de tubo Num. de bandejasdel congelador

Num. de rackspor bandeja

Racks totales

Tubos por rack

Capacidad totalde tubos

Caja estándar 9×9 36 11 396 81 32.076 Racks Micronic 1,4mL 54 12 648 96 62.208 Racks Micronic 0,75mL 54 16 864 96 82.944

La empresa Micronic, como líder mundial en sistemas de almacenamiento, ofrece la posibilidad de un sistema completo inicial de almacenamiento con una mínima inversión inicial y que asegura la total trazabilidad de las muestras. El sistema consta de:

Escáner de placa para leer los tubos. Software para decodificar los tubos y exportar los resultados a cualquier software de gestión de la-

boratorio (LIMS) o base de datos vía ODBC. 40 racks de 96 tubos del formato y volumen que se elija (codificación Tracker o TraXis, volúmenes

de 0,5mL, 0,75mL, 1,1mL ó 1,4mL).

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40 blister de tapones estándar (TPE) ó de rosca para almacenamiento a ultra bajas temperaturas. Sellador manual para los tapones estándar. Destaponadores manuales individuales y de 8 pocillos. Selector individual de tubos.

Un aspecto muy importante, sobre todo cuando se trabaja con muestra líquidas, tales como sangre, suero, plasma, orina, etc., es el registro y alicuotado de la muestra original y que en ningún momento se pierda la trazabilidad de las muestras al realizar el alicuotado en los tubos finales de almacena-miento, es decir, que haya una correlación completa entre el código de barras del tubo de sangre ori-ginal y la codificación de los tubos de almacenamiento.

Cultek ha llegado a un acuerdo de colaboración con la empresa suiza Tecan, líder mundial en la fabricación de robots de manejo de líquidos para ofrecer una solución global en esta aplicación. De esta forma

podemos ofrecer un sistema completo consistente en una plataforma de manejo de líquidos TECAN Freedom EVO100 con un brazo de pipeteo de 4 puntas, con una superficie útil de trabajo de 100cm aproximadamente y con un sistema de jeringas y dilutores para dispensación de líquidos que cubre un rango de volumen entre 2 y 1.000μL. El brazo de pipeteo puede utilizar puntas desechables, con control independiente sobre cada una de ellas.

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Asimismo, sobre la mesa de trabajo se pueden colocar distintos soportes para tubos y placas de dis-tintos tamaños y capacidades ya que existe una amplia colección de accesorios para alojar tubos, placas y reservorios.

El equipo va preparado para trabajar en distintos formatos de tubos: 0,2mL, 0,5mL, 1,5mL, 2,0mL, 5,0mL, 10,0mL, tubos Micronic, etc., así como en distintos formatos de placas: 96 pocillos ó 384 poci-llos.

Las características principales del equipo son: Detección de líquidos para controlar el volumen de reactivos necesario en cada uno de los cana-

les.

Lectura automática de los códigos de barras de tubos y placas.

Lectura de código de barras de los soportes para controlar la correcta ubicación de la muestra. Transferencia de muestras (sangre, suero, ADN, etc.) de tubo a placa o de placa a placa o a tubo

Micronic.

Generación de listas de trabajo para comunicación con LIMS.

Capacidad para realizar otros protocolos de pipeteo. Posibilidad de integrar lectores de placas, agitadores, posiciones termostatizadas, etc.

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Una vez tenemos nuestras muestras en los tubos hay que colocarlas dentro de los congeladores de -20°C ó -80°C dependiendo del tipo de muestra a almacenar. La criopreservación permite el mante-nimiento de diferentes tejidos a ultra bajas temperaturas; su objetivo es minimizar el daño a los dife-rentes materiales biológicos, como tejidos, células eucariotas, bacterias, hongos y virus durante la congelación y el almacenamiento a dichas ultra bajas temperaturas.

Un principio básico de la criopreservación es que la cantidad del daño provocado por la congelación depende de la cantidad de agua libre en el sistema y la capacidad de dicho agua de cristalizar duran-te la congelación; como se sabe, el agua es el principal componente de todos los sistemas vivos y debe estar presente dentro de la célula para que se produzcan las reacciones químicas del metabo-lismo. Durante la congelación, la mayoría del agua se transforma en hielo, cesando el metabolismo celular.

La formación de hielo se inicia en el medio extracelular, lo que provoca un aumento de la concentra-ción de sales debido a la disminución del agua cuando ésta se transforma en hielo, es decir, se pro-duce un desequilibrio osmótico. Entonces el agua sale de las células por ósmosis y se produce una deshidratación celular, la cual puede ir en detrimento de una posterior recuperación celular. Este efec-to puede minimizarse con las siguientes acciones:

Controlando la tasa de enfriamiento mediante el uso de un congelador con control de la tasa de congelación.

Utilizando agentes crioconservantes. Manteniendo las temperaturas de almacenamiento adecuadas. Controlando la tasa de descongelación.

Todas estas variables interaccionan influyendo en el resultado de la criopreservación, por lo que se analizan más en detalle a continuación:

• Utilización de agentes crioconservantes. Los más utilizados son el DMSO y el glicerol; el suero fetal bovino (SFB) también se utiliza a menudo para la criopreservación de células de mamíferos, pero no es un agente crioconservante. Otros crioconservantes reportados en la literatura son las sales, como el cloruro magnésico (Karow y Carrier, 1969), los dextranos, glicoles, el almidón o los azucares (Mazur, 1981).

Estos agentes crioconservantes protegen a las células que se congelan lentamente mediante uno o más de los siguientes mecanismos:

Eliminando las elevadas concentraciones de sales. Reduciendo el encogimiento celular a una determinada temperatura. Reduciendo la fracción de la solución congelada a una determinada temperatura. Minimizando la formación de hielo intracelular.

La combinación de diferentes crioconservantes puede producir un efecto sinérgico, provocando un incremento de la viabilidad celular (Brockbank y Smith, 1993; Brockbank, 1992) y aunque todos ellos no poseen características químicas comunes, se suelen dividir en dos categorías:

1. Crioconservantes intracelulares con bajo peso molecular que hacen permeables las células; por ejemplo el glicerol o el dimetil sulfóxido a concentraciones entre 0,5M y 3M son efectivos minimizando el daño celular.

2. Crioconservantes extracelulares con pesos moleculares relativamente altos (mayores o iguales que el de la sacarosa) que no penetran en las células; son más efectivos protegiendo sistemas biológicos que se congelan a tasas muy rápidas. Aunque algunos de estos agentes tienen un efecto protector sobre la membrana celular, parece ser que el mecanismo primario de acción es la inducción de la vitrificación (formación de cristales extracelulares).

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La formación de hielo puede eliminarse completamente tanto del interior de las células como de la matriz extracelular mediante la utilización de crioconservantes a muy elevadas concentraciones (al menos 50% v/v) (Fahy, 1988).

• Medios para la criopreservación de células y tejidos. Casi sin excepción, todos los métodos de criopreservación comienzan con un paso inicial de “precongelación”, fase en la cual se transfieren las células o el tejido desde un medio fisiológico a una solución crioprotectora (medio tamponado que contiene un agente crioconservante para minimizar el daño ocasionado por la congelación). Esta fase de precongelación conlleva una fase inicial de enfriamiento (a menudo denominada “fa-se hipotérmica”) que sirve a dos propósitos:

Ralentizar el metabolismo y minimizar los cambios isquémicos y de hipoxia. Reducir la toxicidad química de la agentes crioconservantes.

El material biológico puede introducirse en la solución crioprotectora previamente enfriada entre 0°C y 4°C y después colocada en una cámara de criopreservación también previamente enfriada o se puede utilizar un congelador con control de la tasa de congelación para enfriar el material bioló-gico desde temperatura ambiente hasta 0°C – 4°C.

Es muy importante tener en cuenta la composición del medio utilizado para la criopreservación; normalmente se utilizan medios de cultivo convencionales porque se asume que los medios utili-zados para nutrir a las células a temperatura fisiológica proporcionan también un medio adecuado a estas bajas temperaturas; no obstante, hoy en día se sabe perfectamente que el equilibrio iónico e hídrico en las células durante la hipotermia puede controlarse mejor utilizando soluciones dise-ñadas específicamente para restringir físicamente estos desequilibrios provocados por la tempera-tura (Taylor y Hunt, 1985; Taylor, Elrifai y Bailes, 1996).

• Tasa de enfriamiento. Se sabe que es la variable que influye más significativamente en la super-vivencia celular, por lo que controlarla antes de un almacenamiento a largo plazo maximiza la via-bilidad de la mayoría de las células.

La tasa de cambio desde la temperatura ambiente hasta 1°C – 2°C por debajo del punto de conge-lación de la solución puede tener un efecto muy importante en la posterior viabilidad si las células son relativamente sensibles a los shocks térmicos. Durante el proceso de enfriamiento, se puede inducir la congelación de la muestra en cualquier punto por debajo del punto de congelación de equilibrio; enfriar las muestras hasta su punto de congelación e incluso más allá, no significa au-tomáticamente que hayamos congelado las muestras en su punto de congelación de equilibrio. In-variablemente, las muestras tienden a sobre enfriarse (proceso que se conoce como “superen-friamiento”) en un grado que depende de:

La tasa de enfriamiento. El tamaño de la muestra. Presencia de “agentes nucleadores” que son partículas externas en solución que catalizan la

formación de un núcleo de hielo, iniciando el proceso de congelación. La nucleación representa el inicio de un cambio de estado desde el estado líquido a un estado cristalino e implica la separación progresiva de hielo de la solución restante sin congelar, lo que aumenta la concentración de solutos en la solución. Este inicio del proceso de congelación viene asociado con un incremento localizado de la temperatura, conocido como el calor latente de fu-sión.

El control de la nucleación y de esta compensación de temperatura ocasiona una mejor viabilidad celular y, por lo tanto, es la principal razón por la que se recomienda utilizar equipos de tasa de en-friamiento controlada en lugar de colocar simplemente las muestras en un medioambiente frío.

Los métodos más habituales de congelación con una tasa de enfriamiento controlada son: Métodos con nitrógeno líquido. El uso de nitrógeno líquido se basa en que es químicamente

inerte, relativamente barato, no es toxico, no es inflamable y actualmente esta fácilmente dis-ponible comercialmente.

Método “Step Down”. En este método, las muestras se colocan durante toda la noche en un re-frigerador, se transfieren a un congelador de -70°C durante un determinado periodo de tiempo y, posteriormente, se introducen en vapores de nitrógeno (en algunos casos, se pueden su-mergir en nitrógeno líquido para un almacenamiento permanente).

• Tasa de descongelación. La tasa de descongelación de muestras criopreservadas puede tam-bién influir en la viabilidad celular, aunque en general es menos crítico que la tasa de enfriamiento. En la mayoría de los procesos de criopreservación la tasa de enfriamiento ha sido optimizada para una descongelación rápida, por lo que una descongelación lenta disminuye la viabilidad celular.

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No obstante, en algunos casos muy concretos, como en el almacenamiento de embriones de ma-míferos y en el de hematíes, sólo se consiguió una correcta preservación de los mismos después de someterlos a una lenta descongelación (Whittingham, Leibo y Mazur, 1972). Parece ser que es-to tiene que ver con que las células se cargan fuertemente con solutos durante la lenta congela-ción y esto, unido a su baja permeabilidad al agua, causa una lísis osmótica durante la desconge-lación; por eso, le descongelación lenta en estos tipos de células permite que haya suficiente tiempo para una correcta rehidratación y la pérdida progresiva de los solutos acumulados (Miller y Mazur, 1976).

Por norma general, la tasa de enfriamiento y la de calentamiento no pueden optimizarse de mane-ra independiente, sino conjunta para maximizar la viabilidad celular.

Los congeladores pueden ser horizontales o verticales dependiendo, sobre todo, del espacio disponi-ble (no hay ningún criterio especial hacia uno u otro, aunque sí es cierto que la mayoría de los bio-bancos se decantan por lo verticales por su ahorro de espacio); en cuanto a la capacidad del conge-lador, depende mucho de la cantidad de muestras a almacenar pero se suele tender hacia congelado-res de 700L por su mayor capacidad.

Hay una serie de puntos a tener en cuenta a la hora de instalar los congeladores:

Se debe colocar un sistema de alarmas de tal manera que el sistema nos avise en caso de un fallo de corriente o que uno de los congeladores se estropee; gracias a las nuevas tecnologías de co-municación, se puede definir que el sistema nos avise automáticamente a nuestro teléfono móvil mediante un mensaje de alarma.

También es muy aconsejable disponer siempre de un congelador más de los necesarios para al-macenar nuestras muestras, es decir, un congelador operativo de reserva para que en caso de que falle uno de en los que ya se están almacenando muestras y el sistema nos avise mediante el sistema de alarma, podamos inmediatamente acudir a nuestro biobanco para transvasar todas las muestras desde el congelador estropeado al de reserva.

Además, es muy importante colocar un Sistema de Alimentación Ininterrumpida (“SAI” o más co-nocido por sus siglas en inglés UPS) que es un dispositivo que gracias a sus baterías, puede pro-porcionar energía eléctrica tras un apagón a todos los dispositivos que tenga conectados. Otra de las funciones de los SAI es la de mejorar la calidad de la energía eléctrica que llega a los aparatos, filtrando subidas y bajadas de tensión y eliminando armónicos de la red en el caso de Corriente Al-terna. De esta forma proporcionan en todo momento energía eléctrica a estos equipos críticos, que requieren tener siempre alimentación y que ésta sea de calidad debido a la necesidad de estar en todo momento operativos y sin fallos (picos o caídas de tensión).

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En este sentido también es muy recomendable adquirir un congelador con los denominados “sis-

temas de back-up de CO2”, de tal manera que inyectan este gas al sistema con un doble propósi-to: por un lado mantienen la temperatura constante entre -55°C y -70°C dentro del congelador du-rante los inevitables pasos de apertura y cierre del congelador para coger o introducir muestras y, por otro lado, mantienen esta temperatura durante horas, lo que nos proporciona un tiempo extra para transvasar las muestras al nuevo congelador en caso de fallo del equipo.

También es muy importante que el congelador incorpore un sistema de monitorización continua de la temperatura de tal manera que en todo momento podamos comprobar si se han producido subi-das de la temperatura y durante cuanto tiempo.

Otra posibilidad para el almacenamiento de muestras a temperatura controlada son los congeladores completamente automatizados, de tal manera que es el propio congelador el que mediante un softwa-re de gestión de muestras y un sistema robotizado incorporando dentro del propio congelador incor-pora y saca las muestras del mismo, evitándose así las variaciones de temperatura en las muestras provocadas por la continua apertura y cierre del congelador, los posibles errores humanos a la hora de recuperar o incorporar muestras al congelador y el tener que estar trabajando con múltiples racks simultáneamente cuando se quieren recuperar muestras de los mismos.

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En este sentido, Cultek, a través de una de sus representadas, líder mundial en la fabricación de sistemas automatizados para la gestión de muestras en biobancos (Liconic Instruments) ofrece el sistema STT1000-Kivi, en el que se pueden almacenar hasta

120.000 tubos de 0,5mL, 60.000 tubos de 1,1mL ó 50.000 tubos de 1,4mL:

Para el caso concreto del almacenamiento de ácidos nucleicos extraídos de muestras de sangre, plasma o suero, el procedimiento más habitual o más recomendables es utilizar los tubos de 1,1mL ó 1,4mL de fondo en U para el almacenamiento de uno o varios alícuotas de la muestra original co-mo backup en caso de que en un futuro se desee o necesite volver a extraer el ácido nucleico de la muestra y los tubos de 0,75mL ó de 0,5mL de fondo en V para el almacenamiento de los ácidos nu-cleicos ya extraídos; es importante usar estos tubos de fondo en V ya que al trabajar con pequeños volúmenes, se facilita la recuperación completa de la muestra.

Tubos de 1,1mL y 1,4mL para el alma-cenamiento de muestras originales de reserva.

Tubos de 0,75mL y 0,5mL para el alma-cenamiento a -20°C ó -80°C de los áci-dos nucleicos ya extraídos.

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Además, muchos biobancos guardan también otro alícuota de la muestra original a temperatura am-biente y en un lugar completamente diferente y alejado de los congeladores; esto se hace como me-dida de seguridad en caso de que los congeladores se estropeen o haya cualquier tipo de accidente que provoque la pérdida de las muestras almacenadas en los mismos. Para ello se recurre a unas tarjetas especiales en las que se puede almacenar la sangre a temperatura ambiente durante años, ya que están fabricadas de un material especial e impregnadas de unas substancias que estabilizan el DNA y evitan su degradación durante el almacenamiento:

En caso de necesitar recuperar la muestra, basta con cortar un pequeño disco de papel de unos 3mm y hacer la extracción con el correspondiente kit de purificación de ácidos nucleicos (por ejem-plo, el kit NucleoSpin Tissue de Macherey-Nagel)

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LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR. En la mayoría de los biobancos (por no decir en todos) además del propio proceso de almacenamien-to de muestras, se realizan técnicas de Biología Molecular, ya que no sólo interesa almacenar la muestra original del paciente, sino que también es muy importante almacenar su DNA para posterio-res proyectos de investigación.

Si vemos el flujo normal de técnicas que se deben realizar en un laboratorio hasta conseguir el DNA de la muestra perfectamente purificado y cuantificado sería el siguiente:

Extracción del DNA.

La forma de realizarla depende de la cantidad de muestras y, sobre todo, del tipo de éstas, pero normalmente y debido a la necesidad de trazabilidad de los biobancos, lo más seguro es realizarla mediante equipos automatizados que garantizan una reproducibilidad absoluta y minimizan el riesgo de errores. No obstante, también se puede realizar manualmente aunque siempre es reco-mendable realizarla mediante kits comerciales.

Extracción manual. Los kits de extracción de ácidos nucleicos se basan en cuatro tecnologías diferentes: ♦ Cromatografía de intercambio iónico.

Estos kits se basan en el intercambio reversible de los iones en solución con los grupos fun-cionales unidos covalentemente a una fase estacionaria insoluble llamada resina.

En los kits comerciales de extracción en fase sólida, se utiliza una matriz intercambiadora de aniones empaquetada en columnas de polipropileno. La unión de los ácidos nucleicos se produce bajo condiciones de baja salinidad y durante los pasos de lavado se va incremen-tando la concentración de sales en los tampones correspondientes, por lo que las impurezas se eliminan debido a su diferente capacidad de unión y se obtienen una rápida y eficiente purificación de los ácidos nucleicos (ADN y/o ARN). Al final los ácidos nucleicos se eluyen con un tampón de máxima salinidad; por último, se precipita con isopropanol para lavar y eliminar todos los restos de impurezas y finalmente, se reconstituye el ADN de elevada pu-reza en un tampón de baja salinidad para su posterior utilización o almacenamiento.

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♦ Cromatografía de adsorción (membranas de sílica gel).

El mecanismo de purificación de estos kits se basa en la adsorción y desorción de los áci-dos nucleicos en presencia de sales caotrópicas. Bajo condiciones nativas, los ácidos nu-cleicos están recubiertos de una capa hidratante de moléculas de agua que mantienen la solubilidad del DNA en soluciones acuosas. Con la adición de iones caotrópicos a los ácidos nucleicos, se destruye esta estructura ordenada de moléculas de agua de la capa hidratan-te, por lo que las sales caotrópicas crean un entorno hidrofóbico alrededor del DNA.

Bajo estas condiciones hidrofóbicas, los ácidos nucleicos se unen perfectamente a la mem-brana de sílica de las columnas, mientras que las proteínas, los metabolitos y otros conta-minantes no se unen y, por lo tanto, son eliminados de la muestra durante los pasos de la-vado. Posteriormente, los ácidos nucleicos se eluyen de la membrana de sílica mediante tampones de elución con baja concentración de sales (ligeramente alcalinos) o simplemente agua, ya que permiten recuperar la capa hidratante de los ácidos nucleicos, liberándolos así de la membrana:

Con esta tecnología, no se produce ningún efecto sobre las moléculas de los ácidos nuclei-cos ya que la unión intramolecular de los mismos no es de naturaleza hidrofóbica. Con este rápido proceso de purificación mediante la tecnología de la adsorción-desorción sobre membranas de sílica, se obtiene ácidos nucleicos altamente purificados y listos para usar en procesos posteriores como PCR, RT-PCR, qPCR, secuenciación, blotting, clonaje, etc.

♦ Bolas magnéticas. Con esta tecnología, los ácidos nucleicos se unen selectivamente a bolas paramagnéticas en presencia de sales caotrópicas mientras que el resto de los contaminantes son elimina-dos de la muestra. Los ácidos nucleicos purificados (unidos a las bolas paramagnéticas) se eluyen de la solución que contiene las bolas paramagnéticas, bajo condiciones de baja sali-nidad y quedan listos para ser usados en posteriores aplicaciones.

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♦ Ultrafiltración. Es una cromatografía por exclusión por tamaño en una membrana de un determinado ta-maño de poro. La muestra se carga directamente sobre la membrana de ultrafiltración y mediante vacío o centrifugación, se eliminan todos los contaminantes mientras que la mues-tra con los ácidos nucleicos (de tamaño superior normalmente a 150pb) permanecen reteni-dos en la superficie de la membrana. Después de un paso de lavado opcional para eliminar más impurezas de la muestra, se recuperan los ácidos nucleicos añadiendo agua o un tam-pón adecuado.

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Extracción robotizada. Cultek ofrece dos posibilidades de extracción y purificación de DNA mediante equipos automatizados. ♦ La primera es mediante el equipo AutoGenFlex STAR de la

empresa americana Autogen. Este equipo permite la ex-tracción automatizada de DNA genómico de mues-tras de sangre, tejido y/o saliva mediante la tecnología llamada “FlexiGene”, de tal manera que permite la extracción a partir de elevados volúmenes de muestra (hasta 5mL de sangre) y se garantiza que no hay contaminación del DNA genómico con proteínas o RNA de la mues-tra.

La principal ventaja de este equipo y la tecnología que utiliza es que al no utilizar solventes orgánicos ni membranas de extracción, se puede obtener todo el DNA genómico íntegro (hasta 150kb), con muy elevados rendimientos (100 – 210µgDNA/5mLsangre) y pureza (1,8 ≤ A260/280 ≤ 2,0), se puede extraer de muestras de sangre almacenadas con cualquier tipo de

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anticoagulante (citrato, heparina, EDTA), frescas o almacenadas durante varios días a +4°C y se puede almacenar dicho DNA extraído a -20°C durante años sin degradación apreciable:

AutoGenFlex STAR

DNA genómico aislado de 20 muestras de 5mL de sangre (no se observan contaminaciones ni degradación del mismo).

DNA genómico purificado de muestras de 5mL de sangre fresca o almacenadas a +4°C y con diferentes anticoagulan-tes (4 replicados de 2 pacientes diferentes).

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Estabilidad del DNA genómico almacenado a +4°C y a -20°C a lo largo del tiempo.

♦ La segunda posibilidad que ofrece Cultek para la extracción de DNA genómico es la utilización de los kits comerciales manua-les en robots automáticos de extracción.

Para ello hemos llegado a un acuerdo de colaboración con la empresa suiza Tecan, líder mundial en la fabricación de robots de manejo de líquidos y extracción de ácidos nucleicos y junto con la empresa alemana Macherey-Nagel, referencia mundial en la fabricación de kits de extracción de ácidos nucleicos para ofrecer una solución global en esta aplicación.

Todos estos kits comerciales, sea cual sea la tecnología en la que estén basados, están disponibles en formato de columna individual, tiras de 8 columnas y placas de 96 columnas, de tal forma que dependiendo del throughput de nuestro laboratorio nos decantaremos hacia un formato u otro. De la misma manera hay kits específicos para la extracción de cada tipo de muestra (sangre, tejido, plasma, suero, células, etc.).

Columnas individuales Tiras de 8 columnas Placa de 96 columnas

Sangre Tejidos Muestras forenses Plantas Alimentos

La automatización se realiza con robots modulares (Freedom EVO) a los que se les puede añadir uno u otro módulo dependiendo del kit y tecnología que se vaya a utilizar y así se pueden poner módulos de agitación, incubación hasta 50°C, cabezales de 1, 8, 96 ó 384 puntas, sistemas de cuantificación de ácidos nucleicos, módulos de vacío o para bolas magnéticas, centrífuga, hoteles para placas, módulos de lectura de códigos de barras, etc.

Brazo para manejo de líquidos de 4 u 8 puntas o cabezal de 96 ó 384 puntas.

Brazo manipulador para la transferencia de las placas de una posición a otra.

Módulo de agitación. Hotel para almacenamiento de

placas. Módulo de vacío. Módulo para bolas magnéticas. Centrífuga incorporada.

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Este tipo de robots son plataformas completamente abiertas, escalables y muy flexibles, ya que casi todos los fabricantes de kits de extracción proporcionan los archivos necesarios con las instrucciones que debe seguir el robot (“scripts”) para realizar la extracción con un determinado kit u otro, pudiéndose incluso realizar simulaciones 3D previas a la extracción para comprobar que todos los parámetros son correctos.

Si se opta por hacer una extracción manual en lugar de automatizada con equipos robóticos, es muy importante que dicha extracción se realice dentro de cabinas de flujo laminar para evitar con-taminaciones cruzadas y posibles riesgos al operario, ya que en la mayoría de los casos se trabaja con muestras potencialmente infecciosas.

Las cabinas de seguridad biológica se dividen en tres clases, dependiendo de su modo de funcio-namiento, de tal forma que proporcionan diferentes niveles de protección:

Protección Clase I Clase II Clase III Operario Buena Buena Excelente Medioambiente Buena Excelente Excelente Muestra Ninguna Excelente Pobre

por lo que queda claro, que para este tipo de aplicaciones, la mejor clase de cabinas son las de Clase II en las que vamos a proteger tanto al operario como a la muestra. En ellas, la entrada de aire de la habitación forma una cortina de aire que minimiza la salida de aerosoles de la cabina, proporcionando la protección del operario. Por otro lado, el flujo descendente de aire purificado a través del filtro HEPA (High Efficiency Particulate Air; debe capturar el 99,999% de las partículas de un tamaño de 0,3µm) y con un determinado grado “laminar” protege la muestra evitando cual-quier tipo de contaminación cruzada. Alrededor de un 70% del aire se recircula internamente a tra-vés del filtro HEPA y un 30% es expulsado al exterior de la cabina a través de un segundo filtro HEPA.

A: Apertura frontal. B: Panel frontal. C: Filtro HEPA de expulsión. D: Filtro HEPA principal. E: Plenum de presión positiva. F: Plenum de presión negativa. Aire ambiental. Aire contaminado. Aire purificado a través del filtro HEPA.

Cultek, a través de una de sus representadas, Faster, ofrece una completa gama de cabinas de flujo laminar de alta seguridad biológica (Clase II) para los biobancos:

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BH-EN 2000 BHG 2000 CYTOSAFE-N 2000

Cabina de alta seguridad biológica, di-señada para trabajar con todo tipo de microorganismos en laboratorios de microbiología, virología, hematología, cultivos celulares, biología molecular, etc. Cumple con todos los estándares y normativas internacionales de seguri-dad.

Cabina de alta seguridad biológica, di-señada para trabajar con todo tipo de microorganismos en laboratorios de microbiología, virología, hematología, cultivos celulares, biología molecular, etc. Cumple con todos los estándares y normativas internacionales de seguri-dad.

Cabina de alta seguridad biológica y citotóxica (el 100% del aire es filtrado a través del filtro HEPA), diseñada para trabajar con todo tipo de microorga-nismos en laboratorios de microbiolo-gía, virología, hematología, cultivos ce-lulares, biología molecular y prepara-ción de terapias antitumorales con agentes citostáticos y citotóxicos. Cumple con todos los estándares y normativas internacionales de seguri-dad.

Cuantificación del DNA. Una vez realizada la extracción de DNA es muy importante comprobar su pureza y su cuantifica-ción. Para comprobar su pureza, se mide espectrofotométricamente la absorbancia a 260nm (A260) y a 280nm (A280), ya que los ácidos nucleicos tienen su máximo de absorción a 260nm mientras que las proteínas lo tienen a 280nm; por lo tanto, viendo la relación entre ambas absorbancias (A260/280) podremos saber si nuestro DNA genómico extraído esta puro o contaminado con restos de proteínas; lo ideal es que 1,8 ≤ A260/280 ≤ 2,0.

Para calcular la cantidad de DNA en nuestra muestra, se utilizan las siguientes conversiones:

µgdsDNAmL260

µgssDNAmL260

µgssRNAmL260

A 1 50 de dsDNAA 1 33 de ssDNAA 1 40 de ssRNA

= ⇔

= ⇔

= ⇔

de tal forma que si, por ejemplo, tenemos una muestra de DNA genómico (dsDNA) ya extraída en un volumen de 50µL, tomamos un alícuota de 1µL, lo diluimos 1:50 en agua, medimos su A260 y obtenemos un valor de 0,55 la concentración y cantidad de DNA en la muestra será:

[ ][ ]

µg µg µgmL mL mL260

µgmL

DNA 50 A Dilución 50 0,55 50 1.375

DNA DNA Volumen 1.375 0,05mL 68,75µg

= × × = × × =

= × = × =

Actualmente todas estas operaciones las realizan ya los espectrofotómetros mediante el propio software que tienen instalado o mediante aplicaciones periféricas y se utilizan volúmenes tan pe-queños como 1µL de muestra para realizar la cuantificación.

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De la misma manera que con los robots de extracción de ácidos nucleicos, Cultek tiene un acuerdo de colaboración con la empresa suiza Tecan para la comercialización del espectrofotómetro Infinite

200 Nanoquant para realizar la cuantificación de los ácidos nucleicos extraídos de las muestras almacenadas en el biobanco.

La principal ventaja de este equipo es que es un lector en formato de placa de 96 pocillos pero que puede trabajar con volúmenes mínimos de hasta 2µL (el resto de equipos disponibles comercial-mente que pueden trabajar con estos volúmenes tan bajos son para muestras individuales) y pue-de detectar concentraciones de hasta 1ng/µL. Esto se realiza gracias a la llamada placa “Nano-Quant” en la que se pueden medir hasta 16 muestras simultáneamente, siendo compatible con las pipetas multicanales estándar. Una vez leídas las A260 y A280 y mediante el software incluido, el propio equipo realiza los cálculos de pureza y concentración de la muestra, tal y como se puede observar en la figura.

Placa NanoQuant

Resultados de concentración y pureza proporcionados por el software para las muestras.

Amplificación del DNA. Una vez realizada la extracción del DNA genómico y su cuantificación, llega el momento de su amplificación mediante PCR, para disponer de cantidades suficientes del mismo para futuros pro-yectos de investigación.

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Para ello es inevitable disponer de un termociclador y Cultek, a través de una de sus representadas, la empresa alemana Biometra, líder mundial en la fabricación de termocicladores, ofrece una completa gama de termocicladores licenciados para PCR, de elevada calidad y robustez y con diferentes especificaciones técnicas: con bloques de 48, 60, 96 y 384 pocillos, con bloques combinados para

tubos de 0,2mL y 0,5mL, con bloques de plata recubiertos de oro para una optima transferencia térmica, con y sin gradiente, con tapa térmica para evitar el uso de aceite en los tubos, con rampas de calentamiento y enfriamiento de hasta 5°C/seg y con una precisión de 0,1°C y una uniformidad de temperatura de ±0,2°C:

TProfessional T1 y TGradient

Tpersonal T3000

Aparte del propio termociclador, otro punto muy importante a tener en cuenta a la hora de realizar la amplificación es la polimerasa que se va a utilizar en la reacción de PCR. Para un biobanco las muestras tienen un valor incalculable y no se pueden permitir el lujo de introducir mutaciones en el genoma durante la amplificación; por otro lado hay que tener en cuenta el tamaño del fragmento que queremos amplificar ya que no todas las polimerasas son capaces de amplificar grandes fragmentos de DNA o con mucho contenido en GC o con muchos inhibidores, etc.

Cultek, a través de una de sus representadas (KAPA Biosystems) ofrece una amplia gama de polimerasas fabricadas mediante ingeniería genética y específicas para cada aplicación:

KAPAHiFi Hot Start: es una enzima con una máxima fidelidad de copia (hasta 25 veces la fide-lidad de copia de la Taq normal, con una tasa de error de 8,5×10-7), con un comportamiento muy robusto incluso con dianas muy difíciles, con una elevada sensibilidad y procesividad (am-plifica dianas genómicas de hasta 15kb) y una elevada velocidad de amplificación, con lo que se pueden reducir los tiempos de reacción en hasta un 75%. Viene en formato “Hot Start” para evitar amplificaciones inespecíficas antes de comenzar la reacción de PCR.

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Amplificación de dianas de DNA genómico humano ricas en GC. El tamaño de los amplicones estaba entre 0,4kb y 0,7kb el porcentaje de GC entre un 28% y un 84%. Todas las reacciones contenían 100ng de DNA genómico humano como molde.

KAPA Blood PCR Mix: esta enzima ha sido diseñada para la amplificación de DNA genómico directamente de sangre (fresca o congelada, almacenada con EDTA o en “Guthrie cards”) sin necesidad de realizar extracción previa del mismo. La enzima viene en formato Master Mix, de tal forma que sólo hay que añadir los primers y el template (sangre).

Amplificación de un fragmento de 459pb del exon 19 del gen de la distrofia muscular humana de Du-chenne directamente de sangre total utilizando la KAPA Blood PCR Mix. Las reacciones contenían diferentes cantidades de sangre (0 – 20% v/v) de tubos con EDTA como anticoagulante almacenados a +4°C (líneas 1 a 6), tarjetas FTA® Elute Card (lí-nea 7) o tarjetas Guthrie (línea 8). Se incluyeron reacciones control realizadas con 10ng ó 1ng de DNA genómico humano como template y la KAPA Blood PCR Mix (líneas 9 y 10) o una Taq conven-cional (líneas 11 y 12).

KAPA2G Robust Hot Start: es una enzima diseñada específicamente para tener una robustez extrema y poder amplificar incluso en presencia de elevadas concentraciones de inhibidores habituales de la PCR (sales, urea, SDS, etanol, EDTA, etc.). Viene en formato “Hot Start” para evitar amplificaciones inespecíficas antes de comenzar la reacción de PCR.

Amplificación con la KAPA2G Robust Hot Start (arriba) y una Taq convencional (abajo) de un fragmento de 1,5kb de DNA en presencia de cuatro inhibidores comunes de la PCR.

KAPA2G Fast Hot Start: esta enzima ha sido diseñada específicamente para tener tasas de reacción increíblemente rápidas (hasta 1seg/kb), con lo que se puede ahorrar entre un 20% y un 70% del tiempo total de reacción sin necesidad de disponer de un termociclador especial. Viene en formato “Hot Start” para evitar amplificaciones inespecíficas antes de comenzar la re-acción de PCR.

Amplificación de un fragmento de 1,3kb del receptor 1 es-

timulador de macrófagos de una dilución 10× de DNA ge-nómico humano utilizando la KAPA2G Fast Hot Start.

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SOFTWARE DE GESTIÓN DE MUESTRAS. Un biobanco puede ser mononodal, es decir, formado por un único nodo responsable de mandar las muestras a los investigadores, pero casi siempre es multinodal, es decir, formado por diferentes nodos, casi siempre localizados en diferentes lugares (hospitales o centros de investigación), de tal manera que cada nodo es el responsable de gestionar y procesar sus muestras, siempre bajo la supervisión del nodo coordinador.

Esto hace que las actividades de los biobancos requieren sistemas de trazabilidad y de gestión de la in-formación, ya que en todos ellos, la información asociada a las muestras también es muy importante.

Hay muchas e importantes razones que hacen necesario el disponer de un software de gestión de mues-tras cuando se pone en marcha un biobanco, y todas ellas se pueden clasificar desde un punto de vista operacional o desde un punto de vista legal:

Operacional: El almacenamiento masivo de muestras biológicas requiere un sistema de gestión que permita re-

gistrar un gran número de datos. La implicación de diferentes agentes (comité ético, comité científico, coordinador y técnicos del

biobanco) en el trabajo diario del biobanco requiere un sistema de gestión de datos que permita la conexión de diferentes usuarios simultáneos en diferentes localizaciones.

La implicación de diferentes agentes hace necesario que sea necesario tener un sistema de ges-tión de datos estandarizado.

La implementación del sistema de calidad requiere un sistema de control de modificación de datos y un registro de acceso de datos, disponible por el software de gestión de biobancos.

Legal: Asegurar la trazabilidad en los procesos. Guardar los datos genéticos durante los 5 años posteriores a la obtención de los datos. Anonimizar las muestras cuando el donante lo requiera.

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Permitir el acceso a los datos personales de los pacientes sólo el personal autorizado. Cuando se gestionan datos personales, se deben considerar las normas descritas por la Agencia

de Protección de Datos (en caso de que un biobanco no gestione datos personales capaces de identificar a una persona individual, no se aplican las normas de la LOPD). Si el biobanco gestiona datos clínicos y genómicos, estos tipos de datos se consideran datos personales, por lo que debe-rán aplicar las normas de la LOPD.

Los biobancos son sistemas muy complejos, por lo que el software de gestión debe satisfacer los reque-rimientos de los diferentes usuarios que trabajan en el biobanco, debe ayudar a cumplir con los requeri-mientos legales y operacionales y debe ser de fácil manejo y amigable para asegurar una correcta utili-zación.

Para ser realmente operativa y cumplir con todas las necesidades de un biobanco, la plataforma del software de gestión debe de componerse de diferentes aplicaciones complementarias que gestionen los diferentes grupos de información:

Además, debe de haber una parte de acceso público a todos los nodos e investigadores para consulta de poblaciones, solicitud de muestras, etc. y otra parte de acceso restringido donde solamente el admi-nistrador del nodo coordinador y/o el de cada nodo puede tener acceso para gestionar la aplicación:

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No obstante, como todo en Biotecnología, el software de gestión tiene ventajas e inconvenientes que hay que tener en cuenta a la hora de ponerlo en marcha:

VENTAJAS LIMITACIONES ☺ Centraliza la información. ☺ Evita confusiones y registros duplicados. ☺ Estandariza y automatiza los procesos. ☺ Proporciona la gestión de calidad y de control. ☺ Analiza y explota la información almacenada. ☺ Genera estadísticas e informes. ☺ Proporciona garantía de confidencialidad de datos (nivel de

seguridad 3). ☺ Asegura la trazabilidad de las muestras. ☺ Es de uso amigable. ☺ Permite el cumplimiento de la LOPD. ☺ Permite el cumplimiento de la legislación de biobancos. ☺ Sirve para estandarizar los procedimientos de trabajo.

Es necesario que los usuarios aprendan a utilizar la aplica-ción.

Es necesario que los flujos de trabajo del sistema estén muy bien definidos.

La entrada de datos debe estar regulada.

Cultek, a través de los diferentes acuerdos de colaboración con las diferentes empresas líderes del sector en sus respectivos campos, colabora con la em-presa española Noray Bioinformatics para ofrecer el software de gestión NorayBanks como plataforma bioinformática para la gestión y trazabilidad de

biobancos, la cual permite la gestión integral y la trazabilidad del proceso seguido por las muestras en cualquier tipo de biobanco: desde sencillos bancos locales para abastecer de muestras biológicas a un centro de investigación, hasta grandes biobancos multinodales a nivel nacional e internacional, compues-tos por varios nodos en los que las muestras se localizan en distintos centros y dan servicio a una amplia comunidad científica.

Esta aplicación permite gestionar, entre otros procesos: Gestión de muestras biológicas: alta de muestras en el biobanco y la información asociada a las mis-

mas: origen, datos clínicos relevantes, analíticas asociadas, etc. Gestión de protocolos y PNTs: asocia a cada muestra un protocolo de actuación. Gestión de banqueo: obtención de alícuotas, subcultivos, etc. Lectura de códigos de barras. Almacenamiento de muestras y alícuotas: seguimiento de ubicación dentro del biobanco. Cadena de custodia de las muestras. Controles de calidad de las muestras custodiadas en el biobanco. Planificación de actividades y procesos de rutina en el biobanco. Agenda y generación de alertas y avisos al personal del biobanco. Gestión de proyectos autorizados para solicitar y trabajar con muestras del biobanco. Comunicación con investigadores autorizados a solicitar muestras al biobanco. Extracción de la información almacenada en la base de datos: generación de informes, obtención de

estadísticas, histórico de accesos a la aplicación, mantenimiento de históricos de registros, etc.

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Tabla resumen de todos los productos que ofrece Cultek para los biobancos.

Transporte de muestras

Gama PATHOPAK PATHOSHIELD 4 BIOSHIELD TR BIOTAINER 12L

Gama PATHOSHIELD

IATA - por aire ADR - por tierra

PATHOPAK 20L BIOSHIELD BIOCARRIER

BIOTHERM BIOTHERM COMBI Equipos COOLPAC validados

para el control de temperatura de +2°C a +8°C

Dispositivos TECHNI-ICE de control de temperatura

PATHOSHIELD 4 Aislado BIO-FREEZE

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Sistemas de almacenamiento

Sistema Tracker Sistema TraXis Tapones TPE Tapones de rosca

Tubos SNAP anti-

caída Amplio rango de

volúmenes StarterPack

Congeladores verticales

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Robots automáticos de extracción de ácidos nucleicos

AutoGenFlex STAR Freedom EVO

Kits de extracción de ácidos nucleicos

Columnas individuales Tiras de 8 columnas Placas de 96 columnas

Sangre Tejidos Muestras forenses Plantas Alimentos

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Cabinas de flujo laminar

BH-EN 2000 BHG 2000 CYTOSAFE-N 2000

Equipo de cuantificación de ácidos nucleicos

Infinite 200 Placa NanoQuant

Termocicladores para amplificación de ácidos nucleicos

TProfessional T1 y TGradient Tpersonal T3000

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Enzimas para amplificación de ácidos nucleicos

KAPAHiFi Hot Start KAPA Blood PCR Mix KAPA2G Robust HS KAPA2G Fast Hot Start

Software de gestión de biobancos

Avda. Cardenal Herrera Oria, 63 - cultek.com · Las muestras infecciosas (sustancias de las que se...

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