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ES

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

FACULTAD DE FARMACIA

EVALUACIÓN DEL EFECTO BIOLÓGICODE LA

CONCENTRACIÓN DE "CMU" ENHOJAS DE PLANTAS CULTIVADAS

POR

REGINA REVILLA PEDREIRA

ORIA

PRESENTADA PARA ASPIRAR AL

GRADO DE DOCTOR EN PARMACIA

JUNTA DE EPER6IA NUCLEAR

MADRID , MAYO 1980

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID


EVALUACIÓN DEL EFECTO BIOLÓGICODE LA

CONCENTRACIÓN DE "CMU" ENHOJAS DE PLANTAS CULTIVADAS

POR

REGINA REVILLA PEDREIRA

ORIA

PRESENTADA PARA ASPIRAR AL

GRADO DE DOCTOR EN FARMACIA

JUNTA DE ENER6IA NUCLEAR

M A D R I D , M A Y O 1 9 8 0

EVALUACIÓN DEL EFECTO BIOLÓGICO DE

LA CONCENTRACIÓN DE "CMU" EN HOJAS

DE PLANTAS CULTIVADAS

EVALUACIÓN DEL EFECTO BIOLÓGICO SE LA CONCENTRACIÓN

DE CMU EN HOJAS DE PLANTAS CULTIVADAS

Meaoria que presenta la licen-ciada Regina Revilla Pedreirapara aspirar al Grado de Doctoren Farmacia.

Director:Prof. Dr. D. Jesús Fernández González -

Ponente:Prof. Dr. D. Juan Barceló Coll

Licenciada:

Regina Revilla Pedreira.Aspirante al Grado de Doctoren Farmacia.

Madrid, 23 de Mayo de 1980

MINISTERIO DE INDUSTRIA Y ENERGÍAJUNTA DE ENERGÍA NUCLEAR

J>, Jesús Fernández González, Jefe del Grupo de Biosintesisde la División de Isótopos de la Junta de Energía Nuclear,

CERTIFICA: ' Que D&a. REGINA SEVILLA PEDREIRA,licenciada en Farmacia, ha realizado en este Laboratoriode Biosintesis de la JEN, el trabajo experimental de suTESIS DOCTORAL, para su presentación en la Facultad deFarmacia de la Universidad Complutense de Madrid, titu-lado "Evaluación del efecto biológico de la concentra-ción de CHD en hojas de plantas cultivadas", encontrán-dose, en la actualidad, en condiciones para su presentación.

Lo que certifico para sus efectos oportunos enMadrid, a veintitrés de Mayo de mil novecientos ochenta.

Firmado: Jesús Fernández González


D. JUAN BARCELO COLL, CATEDRÁTICO Y DIRECTOR DEL

DEPARTAMENTO DE FISIOLOGÍA VEGETAL DE LA FACULTAD

DE FARMACIA DE LA UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

C E R T I F I C A , como ponente del trabajo experimen

tal de Dña. Regina Revilla Pedreira, realizado en

la Junta de Energía Nuclear, bajo la dirección del

Prof. Dr. Jesús Fernández González, que la presen-

te memoria reúne cumplidamente las condiciones exi

gidas para optar al grado de Doctor en Farmacia.

Para que asi conste, firmo este certifi-

cado en Madrid, a dieciséis de mayo de mil nove-

cientos ochenta*

Fdo.: Juan Barceld Coll

- I -

£1 presente trabajo ha sido realizado en el Grupo deBioslntesis de la Division de Isótopos de la Junta deEnergía Nuclear.

Quiero aqui expresar mi agradecimiento:

Al Prof. Dr. D. Jesús Fernández González, dire£

tor de esta Tesis, cuya disensión humana 7 científica

ha constituido un estimulo, una ayuda y un ejemplo

constante.

Al Prof. Dr. D. Juan Barceló Coll, ponente deesta Tesis, por su comprensión, ayuda, consejos, comentarios y corrección del texto.

A las autoridades de 3a Junta de Energía Nuclear,y en especial, al Dr. D. Manuel Qulnteiro y al Dr. D.Agustín Tanarro, actual Director del Instituto de Estudios Nucleares, por las facilidades concedidas pararealizar 'este trabajo.

A la Srta. MS Jesús Chaves por el interés y cuidado puestos en la mecanografía del texto.

A los Sres. D. José Luis Martin Guinea y Ramiro

Español por la delincación de las figuras.

A los compañeros de laboratorio y en especial alas Srtas. Pilar Maz&n, Margarita Sanz y Pilar Sorianopor su ayuda y colaboración.

Finalmente, al Servicio de Biblioteca y Documentación de la Junta de Energía Nuclear y a todo el -per-sonal técnico y auxiliar que ha contribuido a la real£,zación de este trabajo.

- II -

Dedicatoria:

A ai familia *

A ais maestros

A mis aaigos

- Ill -

RESUMEN Pápina

1. INTRODUCCIÓN 1

1.1. OBJETO E INTERÉS DEL TEMA 2

1.2. DESCRIPCIÓN Y PROPIEDADES QUÍMICASDEL MONURON (CMU) h

"[.3. EFECTOS DEL CMU SOBRE LOS VEGETALES .... 8

1.3.1. Historia de su utilización COBO

herbicida 8

1.3.2. Absorción y traslocación del CMUen plantas superiores 9

1.3.3. Efectos del CMU sobre la «orfología y el desarrollo de las plan-tas 11

1.3.4. Efecto del CMU sobre la respira-ción y el »etabolís«o general delos vegetales 14

1.3.5. Efecto del CMU sobre la fotosín-tesis 15

1.3.5.1. Descripci&n del procesofotosintético 13.

1.3.5.2. Efecto del CMU sobre lareacción de Hill 20

1.3.5.3. Efecto del CMU en lafotocarboxilacion 22

1.3.5*4. Efecto del CMU sobre laactividad fotosintéticade algas unicelulares .. 23

1.3.6. Metabolismo del CMU en vegetales. 26

1.3.7. Sensibilidad de las diferentes e¿pecies vegetales al CMU 30

- IV -

Página

1.4. MÉTODOS DE ANÁLISIS DE RESIDUOS DE CMD

EN VEGETALES 36

1.4.1. Métodos quiaicos 7 fisLco-quiaicos 36

1.4.1.1. Espectrofotoaétrieos ... 36

1.4.1.2. Croaatográficos 381.4.1.2.1. Croaatografia

gas-liquido ... 381.4.1.2.2. Croaatografia

en papel 401.4.1.2.3. Croaatografia

en capa fina .. 40L4.1.2.4. Cromatografía

líquido-liquidode alta presión 41

1.4.1.3* Otras técnicas analíti-cas 41

1.4.2. Bioensayos 42

1.4.2.1. Métodos que utilizanplantas coapletas 43

1.4.2.2. Métodos que utilizan elcreciaiento raíz/tallo . 44

1.4.2.3. Métodos que utilizanalgas 45

1.4.2.4. Métodos que utilizanotros organisaos acuá-ticos 45

1.4.2.5. Métodos que utilizanhongos 46

- V -

Página

1.4.3. Consideraciones sobre los «éto-dos de análisis de residuos herbieldas 46

2. MATERIAL I MÉTODOS 49

2.1. ESTUDIO DEL EFECTO DEL CMU SOBRE ELDESARROLLO DE PLANTAS CULTIVADAS 50

2.1.1. Especies vegetales ensayadas .... 50

Z,"\.Z. Condiciones de cultivo 50

2.1.3. Observaciones realizadas ........ 54

2.2. ESTUDIO DEL EFECTO DEL CMU SOBRE LAACTIVIDAD FOTOSINTETICA DE LAS HOJASDE PLANTAS CULTIVADAS 55

2.2.1• Estilación de la concentraciónde CMU en las hojas 55

2.2.2. Aslnilaci&n del 1¿fC02 58'

2.3. ESTUDIO DEL EFECTO DEL CMU SOBRE LAREACCIÓN DE HILL EN CLOROPLASTOS AIS-LADOS DE HOJAS DE PLANTAS CULTIVADAS ... 63

2.3*1* Aislamiento de cloroplastos 64

2.3*2. Determinación del contenido en

clorofila 65

2.3.2.1. Area foliar específica . 67

2.3.2.2. Análisis de clorofilas . 67

2.3.2.3* En la suspensión de

cloroplastos 68

2.3*3* Condiciones de la reacción 68

2.3*4. Obtención de los resultados 72

- VI -

Página

2.4. ESTUDIO BEL EFECTO DEI. CMD SOBRE LAFOTOSÍNTESIS DEL ALGA CHLORELLAPYHENOIDOSA 74

2.4.1. Características del cultivo deChlorella Pyrenoidosa 74

2.4.2. Método de cultivo utilizado 75

2.4.3. Normalización del contenido clo-rofílico de los cultivos para lasdeterminaciones fotosintéticas .. 78

2.4.4. utilización del electrodo de ox¿geno en la determinación de laactividad fotosintética de unasuspensión de Chlorella Pyrenoi-dosa 80

2.4.4.1. Fundamento del electro-do de oxigeno 80

2.4.4.2. Descripción del equipo . 83

2.4.4.3. Calibrado del equipo ... 86

2.4.4.4. Hedida del desprendi-miento de oxigeno enuna suspensión de algaChlorella Pyrenoidosa .. 90

2.5. ESTUDIO DEL EFECTO DE LOS EXTRACTOS DEHOJAS DE PLANTAS TRATADAS CON CMU SOBRELA ACTIVIDAD FOTOSINTÉTICA DE CHLORELLAPYRENOIDOSA 92

2.5.1. Preparación del extracto de hojas 92

2.5.2. Ensayo del efecto del extracto .. 92

- VII -

Página

2.5.3. Curvas de calibrado 93

2.5.if. Determinación de la concentra-ción de CMU en la hoja 93

3. RESULTADOS 9^

3.1. EFECTO DEL CMU SOBRE EL DESARROLLO DEPLANTAS CULTIVADAS .„ 95

3.1.1. Absorción continua de CMU . 95

3.1.2. Absorción durante una seaana .... 95

3.2. EFECTO DEL CMU SOBRE LA ACTIVIDADFOTOSINTETICA DE LAS HOJAS DE PLANTASCULTIVADAS 108

3.2.1. Concentración de CMU en lashojas 108

3.2.2. Asimilación del 1¿fC02 120

3.3. EFECTO DEL CMU SOBRE LA REACCIÓN DEHILL EN CLOROPLASTOS AISLADOS DE HOJASDE PLANTAS CULTIVADAS 131

3.3.1. Relación superficie/peso de hojay contenido en clorofila 131

3*3.2.. Curva de calibrado de la relaciónDPIP oxidado/D05if0 131

3*3*3' Condiciones de la reacción ...... 134

3*3*k. Obtención de las funciones decorrelación entre la capacidadfotorreductora de los cloroplagtos y la concentración de CMU ... 141

3.k. EFECTO DEL CMU SOBRE LA ACTIVIDADFOTOSINTETICA DE CHLORELLA PYRENOIDOSA . 150

- VIII -

Página

3.5. EFECTO DE LOS EXTRACTOS DE HOJAS DEPLASTAS TRATADAS CON CMU SOBRE LAACTIVIDAD FOTOSINTETICA DE CHLORELLAPTRENOIDOSA 153


3.5.2. Obtención de las funciones decorrelación entre la actividadfotosintética y la concentraciónde CMÜ 161

3.5.3. Efecto de los extractos de hojasde plantas tratadas durante 2hhoras 168

3.5.if. Efecto de los extractos de hojasde plantas tratadas durante 7días 165

3.5.5. Efecto de los extractos de hojasde plantas tratadas durante 7dias con diferentes concentrado,nes de CMU y mantenidas la sema-na siguiente en solución nutritjLva (sin CMD) 181

3.5.6. Estimación de la concentraciónde CMÜ en las hojas de plantastratadas 188

¿f. DISCUSIÓN DE EESÜLTADOS 196

k.U EFECTO DEL CMÜ SOBRE EL DESARROLLO DELAS PLANTAS 196

lf.2. EFECTO DEL CMU SOBRE LA ABSORCIÓNRADICULAR 201

- IX -

Página

if.3. EFECTO DEL CMU SOBRE LA FOTOSÍNTESIS ... 203

4.3.1. En hojas de planta completa 203

4.3.2. En cloropTastos aislados de hojas . 20?

4.3.3. En Chlorella 215

if.if. EFECTO DE LOS EXTRACTOS DE HOJAS DEPLANTAS TRATADAS CON CMU SOBRE LA FOTO-SÍNTESIS DEL ALGA CHLORELLA PYRENOIDOSA. 220


4.4.2. Evaluación de la concentraciónde CMU alcanzado en las hojasde plantas tratadas ............. 224

4.5. PROPUESTA DE UN BIOENSAYO PARA EVALUARRESIDUOS DE COMPUESTOS INHIBIDORES DELA A.F 227

5. CONCLUSIONES 230

6. BIBLIOGRAFÍA 233

ANEXO I : ABREVIATURAS Y SÍMBOLOS 254

ANEXO II : ÍNDICE DE TABLAS Z37

ANEXO III : ÍNDICE DE FIGURAS 269

- X -

Besumen

En el presente trabajo, se ha estudiado el efe¿to inhibidor del «ornaron o CMB (3-(p-clorofenil)-1,1dimetil urea), sobre la actividad fotosintética de seisespecies de plantas superiores (cebada, avena, trigo,maíz, judia y toaate) y sobre el alga unicelular Chlo-rella pyrenoidosa. En las plantas superiores, se ha ejstudiado el proceso de absorción radicular del CMÜ uti-lizando CMO-'^C COBO trazador y se ha determinado elefecto de diversas concentraciones de este herbicidasobre la asimilación fotosintética del CO2 por las ho-jas. También se ha estudiado el efecto inhibidor delCMU sobre la reacci&n de Hill en fragmentos de cloro—-plastos aislados de las hojas de las respectivas plan-tas. Los resultados indican que existe una correlaci&nentre la concentraci&n del herbicida y el grado de in-hibición de la fotosíntesis para concentraciones com-prendidas entre 1CT8 H y 10-* M.

En las plantas superiores, se ha estudiado, aáemás, el efecto de la absorción radicular de distintasconcentraciones de CMU durante cuatro semanas sobre elcrecimiento y desarrollo de las plantas,, asi como lacapacidad de detoxificaci&n de las distintas especiestras la absorción de diversas concentraciones de CMÜ.

También se ha estudiado el efecto inhibidor delCMU sobre el desprendimiento de O¿ en suspensiones deChlorella pyrenoidosa sometidas a iluminación. Los re-sultados muestran que, utilizando el método polarográ-fico para la medición del O¿, se pueden detectar con-centraciones de CMÜ variables comprendidas entre 1O"1OMy 10-^ M.

Como consecuencia de este trabajo, se propone unbioensayo para la detecci&n de residuos de productosinhibidores de la fotosíntesis, utilizando como elemento sensor el alga Chlorella pyrenoidosa.

1. INTRODUCCIÓN

- 2 -

1.1. OBJETO E INTEBES DEL TEHk.

Entre los compuestos químicos que se utilizan enla agricultura moderna por sus propiedades herbicidas,destacan por su importancia aquéllos que afectan a laactividad fotosintética de los vegetales. Como es sabido, la sensibilidad de las diversas especies vegetalesante los productos herbicidas es diferente y depende,entre otros factores, de las características anatómicasy fisiológicas de aquéllas.

El grupo de herbicidas de las "ureas sustituidas*es uno de los que se caracterizan por su efecto inhibidor de la fotosíntesis y concretamente, el monur&n, CHDó 3-(p-clorofenil)-1,1-diaetil urea), que fue el primerode los productos de este grupo en que se apreciaron estas propiedades (Bucha y Todd, 1951), y que ha sido ampliamente utilizado en estudios básicos sobre fotosín-tesis (Ashton y col., 1961; Calvin y Bassham, 1962; Gingras y Lemasson, 1963, 1965), sirve perfectamente comorepresentante de un amplio grupo de compuestos herbicidas que ejercen su acci&n por inhibición de la activi-dad fotosintética de los vegetales.

En el presente trabajo se estudia el efecto dediversas concentraciones de CMU sobre el crecimiento ydesarrollo de seis especies cultivadas elegidas entrelas Dicotiledóneas (judia y tomate) y las Gramíneas(cebada, avena, trigo y maíz), así como los aspectos fisiológicos relacionados con la absorción radicular deeste producto y su efecto sobre la asimilación fotosintética del CO2. utilizando CMU marcado con í2fC, se trata de evaluar la concentración que alcanza el herbici-da en el limbo foliar en función de la concentraciónque tenia en la solución nutritiva de la que era abéorbido por las raices. De esta manera, se intenta corre-

-3 -

lacionar el poder inhibidor de las diversas concentra-ciones del coapuesto, con la actividad fotosintética delos cloroplastos in vivo. Por medio de estos estudios,se puede deducir el diverso comportamiento fisiológi-co de las distintas especies consideradas en este tra-bajo.

En otra serie de experimentos, se trabajará confragmentos de cloroplastos aislados de las hojas de lasmismas especies vegetales y se estudiará el efecto in-hibidor del CMU sobre la reacción de Hill o capacidadreductora de estos fragmentos a la luz.

Por medio de estas experiencias se pretende es-tablecer la posible correlación existente entre losefectos que se observan "in vitro" e "in vivo" por efec.to del CMU sobre la actividad fotosintética en ambos -casos. También con el estudio del efecto del CMU sobrela reacci&n de Hill en cloroplastos aislados, se pre-tende evaluar la posibilidad que ofrece este método para servir de bioensayo en la detecci&n de residuos deherbicidas inhibidores de la reacción de Hill.

En otra serie de experiencias se estudiará larespuesta del alga Chlorella ante diversas concentra-ciones de CMU, evaluando el desprendimiento de Q¿ de es.te alga como consecuencia de su actividad fotosintéti-ca. La finalidad de este trabajo radica en estudiar losniveles de sensibilidad que ofrecerla un bioensayo ba-sado en la utilizaci&n de este microorganismo como sen.sor de compuestos inhibidores de la fotosíntesis, paraaplicarlo, en la práctica, al análisis de residuos deeste tipo de compuestos en productos vegetales o " ensuelos que, como se sabe, pueden constituir un impor-tante problema, tanto desde el punto de vista ecológi-co como económico.

- k -

1.2. DESCRIPCIÓN Y PROPIEDADES QUÍMICAS DEL MONÜRON(CMÜ).

,. H OVA-4-B- (CH3)2

(C9H,,ON2C1)

3-p(clorofenil)-1,1-diaetilurea P.M. 198,7

Caracteres: Polvo blanco que cristaliza del metanol enforma de prismas rectangulares nuy finos.Olor característico.

pH : El pH de la solución acuosa es ligeramenteácido.

Pnri de fusion: 170,5-171,5°C, según Buena y Todd (1951)

Presión de vapor: Es de 5 x 10"* mm de Hg si se determLna a 25°C y de 3,4 x 106 mm de Eg si ae determina a 50°C.

Valoración: Una solución metan&lica de CMÜ al 1 % pre-senta un máximo de absorción en el u.v. a247 nm.

Solubilidad: Es poco soluble en disolventes polares ymuy poco soluble en aceites y agua. La BQ1¿Lbilidad en p.p.m. en distintos disolventes,según la firma Du Pont de Nemours, viene expresada en la Tabla I.

TABLA I. Solubilidad del CMÜ en diferentes disolventes

Disolvente

Acetona

Benceno

Estearato deButilo

Aceite de semi-lla de algodón

Aceite dieselnS 3

Agua

Temperatura(°C)

27

Z7

27

27

25

25

Solubilidad(p.p.m.)

52.000

2.900

1.500

1.100

230

230

- 6 -

Identificación: Cromatografía en capa fina.Soporte: Placas de Kieselgel 60 F254 Merck

20 x 20; 0,25 a*.

Fase móvil:I: Cloroformo, Nitrometano 1:1

(v/v)II: Hexano, Acetona 3:1

(v/v)

Recorrido: 15 cm.

Tiempo de elución:I: 1 hora

II: 4 horas

Concentración: 20 \il de solución ustanblicade CHU al 1 % .

Revelador: Luz u.v. de 254 na. Se observafluorescencia amarilla sobrefondo violeta.

Rf:I: 0,54

II: 0,27

Estabilidad: Es estable a la oxidación y a la hidrólisisen condiciones normales de conservación, pe.ro, a elevadas temperaturas, pusde hidroli-zarse, propiedad que puede utilizarse parasu análisis químico (Lowen y col., 1964).

Se degrada por la luz.

No es inflamable ni corrosivo.

Toxicidad: Es baja en mamíferos. La DL50 en ratas esde 3,5 g por Kg de peso. No irrita la pielni produce reacciones alérgicas (Hodge ycol., 1958).

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Presentación: Dada su poca solubilidad en el agua, esteproducto se encuentra en el comercio en for.na de polvos «ojabíes (50-80 #) .

Conservación; Al abrigo de la luz.

Usos : Se utiliza, a dosis elevadas, cono esterili-zante del suelo en áreas no cultivables ya dosis más bajas, COBO herbicida selecti-vo de preemergencia en cultivos de espárragos, aguacates, vid, cebolla, algodón, cí-tricos, pina y caña de azúcar (Day, 1955)»

Dosis : De 15 a kO Kg/ha para erradicación de plan-tas perennes.

De 5 a 10 Kg/ha para las anuales. Conoherbicida selectivo en preenergencia, de0,5 a 2 Kg/ha.

- 8 -

1.3. EFECTOS DEL CMP SOBRE LOS ^

1.3.1. Historia de su utilización como herbicida.

La erradicación de las malas hierbas es un pro-blema que siempre h a preocupado al hombre. Desde muyantiguo se han aplicado diversos sistemas para evitaro disminuir al máximo su aparición y desarrollo en loscultivos de especies vegetales de interés humano o enáreas no cultivables de interés público o privado (víasde comunicación, conducciones petrolíferas, edificaciones, etc.).

A finales del siglo pasado, se empezaron a uti-lizar para este fin los sulfatos de amonio y de diver-sos metales pesados como Zn y Fe entre otros.

El desarrollo de la síntesis química en .<1 segúndo tercio de este siglo contribuyó a un avance importan,te en el tratamiento de las malas hierbas. El primerproducto orgánico de síntesis utilizado como herbicidafue el DNOC ó 2-metil-4,6-dinitrofenol en el año 1932.Diez años más tarde, Zimmerman y Hitchcock (1942) des-cubrieron las propiedades del 2-4-D como regulador delcrecimiento vegetal y, a partir de este momento, se sin.te tizaron numerosos compuestos orgánicos y se ensaya-ron sus propiedades herbicidas.

Los trabajos de Thomson y col. (1946) sobre losefectos herbicidas de las fenllureas sustituidas atraje,ron la atención de Bucha y Todd (1951), que emplearonpor primera vez el monurón. Este compuesto habla sidosintetizado un año antes en los laboratorios de la So-ciedad Du Pont de Nemours (EEUU) sin que hubiera dadoun resultado satisfactorio en el estudio farmacológicocon vistas a su utilización como medicamento en vetérinaria (coccidiosis del pollo).

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La selectividad de este herbicida a dosis baja ysu efecto esterilizante sobre bacterias y hongos a do-sis más elevada, fueron descritos por MeCall (1932), contribuyendo con sus trabajos a su amplia difusión.

En la actualidad, su importancia COBO herbicidaselectivo ha ido decayendo ante la aparición en el co-mercio de otros numerosos compuestos. Se sigue utili-zando como control de preemergencia en cultivos de al-godón, caña de azúcar, pina tropical y espárrago a concentraciones de 1 a 5 Kg/ha (Brian, 1976).

' La contribución más importante sobre su mecanismo de acción se debe a las investigaciones de Cooke(1956) y Wessels y Van der Veen (1956) que describieronsu efecto inhibidor sobre la reacción de Hill.

Numerosos científicos han utilizado este compresto para el estudio de los aspectos fundamentales del mecanisco de transferencia electrónico, en la fotosínte-sis entre los que cabe destacar a Jagendorf y Avron(1959), Sweetser y Todd (1961), Ashton y col. (1961),y Gingras (1966) entre otros. Actualmente, este coapuejsto es muy utilizado en investigaciones básicas en fotosíntesis sobre el transporte electrónico entre el Fotosistema II (PS II) y el Fotosistema I(PS I) (Stuart yGaffron, 1972 a, b; Sumida y üeda, 1973; Ruraisnki, 1975y Vierke, 1979).

1.3.2. Absorción y traslocación del CMÜ en plantas su-periores.

Los herbicidas se pueden absorber via radicularo foliar, dependiendo del modo de aplicación y de lascaracterísticas fisico-químicas del producto. üna>ezabsorbido, debe ser traslocado hasta su lugar de acciónpara inducir una respuesta biológica, respuesta que -dependerá de muchos factores, siendo los más importantes:

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el estado de desarrollo de la planta, la longitud de lasraices (en el caso de absorción radicular), caracterís-ticas de las hojas (para el caso de 3a absorción foliar),disponibilidad de nutrientes minerales en el suelo, y elmetabolismo característico de cada especie vegetal.

£1 monurón se absorbe fácilmente por el sistemaradicular y de allí ss traslocado a las hojas, como hancomprobado Buena y Todd Ü 9 5 D en experiencias realizadas en invernadero, y Kc Cali (1952) y Haun y Peterson(1954) en sus trabajos en campo, observando que era másefectivo cuando se aplicaba en el suelo que por aplica,ci&n foliar.

£1 asonur&n puede absorberse también por hojas yestomas (Muzik y col., 1954, Pickering, 1965)» aunquesu efecto herbicida es mucho menor debido, principalmente, a que la traslocaci&n a partir de la hoja es muypequeña. Numerosos autores, entre los que se pueden citar a Crafts (1959, «962, 1967), Crafts y Yamaguchi(1958, I960), Fang y col. (1955), Leonar-, y col. O966JMinshall (1954), Muzik y col. (1954), Pereira y col.(1963). Smith y Sheets (1966), Yamaguchi e Islam(1967),han estudiado la absorci&n y traslocaci&n del monur&nen una amplia variedad de especies vegetales, siendo laopini&n unánime de que este herbicida se absorbe rápi-damente por vía radicular y a una velocidad mucho me-nor por otros órganos, siendo traslocado casi exclusi-vamente por vía apoplástica.

Es preciso tener en consideración que el lugarde acción del monurón es el cloroplasto, y éste estárodeado de protoplasma, por lo que el herbicida debeatravesar el plasmalemma y el protoplasaa hasta llegaral cloroplasto y, por tanto, además de una traslocaciónvía sistema apoplástico, tendrá que haber una pequeñatraslocación vía simplasto. Según Ashton y Crafts(1973)» dada la proximidad entre la pared celular y loscloroplastos, este movimiento podría realizarse por

- 11 -

una simple difusión pasiva.

Con respecto al proceso de absorción, existe unadiscrepancia entre distintos autores. Para Donaldson(1967), la absorción tendría ligar por simple difusiónpasiva, siendo «uy rápida durante la primera hora 7 es.tabilizándose a partir de este momento. Sin embargo ,García (1972) 7 Sancho (1975), observaron que no exis_tía una relación lineal entre las concentraciones demonurón acumuladas en las hojas y la concentración demonurón en la solución nutritiva, lo que explicaron comola evidencia de un transporte activo que hace aumentarla concentración del monurón en el jugo celular, inclusohasta diez veces la existente en la solución nutritiva.

Como resumen podríamos aceptar que el monurón seabsorbe principalmente por vía radicular por un procesode difusión pasiva 7 un transporte activo que dependede la concentración del herbicida en la solución nutritiva 7 es más evidente para bajas concentraciones delmismo, 7a que, concentraciones mayores alteran el metabolismo normal de las células e impiden este tipo detransporte, se trasloca casi exclusivamente vía apopla¿to, aunque debe atravesar el simplasto para llegar a sulugar de acción. Por vía follar, la absorción es muchomenor 7 la traslocación, incluso en las condiciones másfavorables, es muy pequeña.

1.3.3. Efectos del CMÜ sobre la morfología y el desarro-llo de las plantas.

£1 monurón no parece actuar sobre el poder germinativo de las semillas, como se deduce de los trabajosde Me Cali (1952), pero si sobre las plántulas una veznacidas.

Diversos autores, entre los que podemos citar a

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Christoph y Flsk (1 95^), Grant (196*0 y Wuu y Grant (1966)observaron que el CMÜ produce aberraciones erónosómicase inhibe la división mitótica, siendo esta inhibiciónmás intensa en el ápice del tallo que en los meristemosradiculares.

Sobre la planta completa, los efectos de estecompuesto son más apreciables en los tejidos fotosinté-ticos. La primera descripción sobre los efectos fitotó-xicos del CMÜ se debe a Buena y Todd (1951), que obser-varon un envejecimiento prematuro de la parte marginalde las hojas con aparición posterior de una clorosis -progresiva y un retardo del crecimiento, para finalizarcon la muerte de la planta. Trabajando sobre planta completa, Minshall (1957) describe dos tipos de síntomas :uno "agudo11 y otro "crónico1*. £1 primero se caracterizapor la aparición, a los tres o cuatro dias de efectuadoel tratamiento, de unas manchas necróticas en las hojasprecedidas por el desarrollo de áreas de color verdeclaro. Para que aparezcan es necesaria una concentra-ción foliar interna de 100 y.g/& de hoja fresca. £1 se-gundo se caracteriza por la aparición de unas manchassimilares a las antes descritas, otras plateadas yotras grisáceas, marchitamiento de tallos y peciolos ,amarilleamiento rápido, abscisión y clorosis parcial,estando estos síntomas específicos influenciados por laespecie vegetal, las dosis administradas, las condicio-nes ambientales y el tiempo transcurrido después deltratamiento. Estos síntomas, en el caso "crónico", ne-cesitan varios días para desarrollarse y aparecen a con.centraciones foliares internas menores de 50 g/g depeso fresco.

Se describen también por Ashton y Crafts (1973)dos tipos de clorosis, una rápida que recuerda al enve.jecimiento normal pero que aparece mucho antes y se localiza de preferencia en las proximidades de las venas

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primarias, y otra parcial que afecta a la hoja completa.Se ha observado que los efectos tóxicos del monurón sonmás intensos cuando se favorece la transpiración de lahoja. Minshall (1960), al medir el agua perdida por lashojas de judia cuyos peciolos hablan estado en una soluci6n acuosa de monurón, observó que, para 15 ng de monuron por gramo de hoja fresca, se reduela la transpira-ción en un 50 % con respecto a las hojas controles. £1autor no pudo explicar bien este fenómeno, atribuyendolo a una influencia directa sobre la apertura de los es,tomas más que al efecto del monurón sobre la fotolisisdel agua. Investigaciones posteriores, Ashton (1965) yDetroux (1966), demostraron que el efecto del CKD sobreel crecimiento de las plantas no se debe a su posible |nfluencia en el mecanismo de la transpiración.

Los tejidos no fotosintéticos también se venafectados, de modo adverso, por este herbicida. £1 efecto del CMU sobre las raices de diferentes especies ve-getales ha sido estudiado por Musik y col. (1954),Minshall (I960) y Voderberg (1961), comprobando que tie.ne un efecto directo tanto sobre la raíz intacta comosobre las escindidas, aunque éste es mayor y se mani— •fiesta a menor concentración de herbicida cuando lasraices son clorofílicas como las del Hydrocharls mor—susranae.

En tejido calloso no fotosintético de tabaco, -Jordan y col. (1966) mostraron que este herbicida pue-de inhibir el crecimiento de otros órganos diferentes alas raices por mecanismos en los que no interviene lafotosíntesis.

Podemos concluir, por tanto, que el CMU ejercesu efecto fitotóxico, de preferencia, en el tejido fo-tosintético de las plantas, observándose estos efectostanto en tratamiento agudo como en crónico, y princi-palmente en las hojas, con aparición de manchas de

distintos tipos, clorosis y envejecimiento acelerado jara continuar por marchitamiento de tallos y peciolos ,abscisi&n y muerte prematura de la planta.

1.3.4. Efecto del CMÜ sobre la respiración y el metabo-lismo general de los vegetales.

Se han publicado muy pocos trabajos sobre elefe£to del CMÜ en la respiracibn de los vegetales. Es dedestacar el de Lotlikar y col. (1968) que demuestra queeste herbicida puede inhibir, de modo apreciable , lafosforilaci&n ozidativa a concentraciones comprendidasentre 10~2 M y ICH*- M, reduciéndose en un 4 0 % aproxi-madamente la esterificaci&n del fósforo inorgánico enhojas de repollo, mientras que la incorporación de oxi,geno a las mitocondrias de la misma especie vegetal sereducía en aproximadamente un 20% en igualdad de con-diciones.

En lo que respecta a su efecto 60bre el metabo-lismo intermediario, existe también poca información,pero parece evidente que afecta de modo adverso a losniveles de producción de hidratos de carbono en 3as plantas, como se deduce de los trabajos de Cooke (1955) queobservó un gran descenso del contenido de azúcares enlas plantas tratadas con monurón. A similares resulta-dos llegan Walsch y Grow (197D utilizando especies se.leccionadas de algas marinas como sustrato y diferentesconcentraciones de diversos herbicidas derivados de laurea, encontrando que la inhibición llegaba a ser hastadel 60% e incluso superior en las especies más suscep-tibles.

Son de destacar también las investigaciones so-bre la inhibición de la biosinteeis de lipidos comple-jos y sobre el conjunto de lipidos totales realizada -por Sumida y Ueda (1973)) en las que se observa que el

efecto inhibidor de este herbicida es también muy apre.ciable.

1.5.5. Efecto del CMÜ sobre la fotosíntesis.

£1 efecto del CMÜ sobre la fotosíntesis se des-cubrió poco después de sus propiedades herbicidas. Amediados de la década de los cincuenta (Wessels y Van darVeen, 1956) y principios de la de los sesenta (Ashtony col., 196I), comprobaron que las hojas de los vege-tales perdían su capacidad de asimilar CO^ cuando setrataban con CMÜ. Su efecto inhibidor sobre la reacdfnde Eill fue también estudiado por numerosos autores, entre los que podemos citar a Cooke (1956), Bishop (1958),Jagendorf y Avron (1959)» Gingras y Lemasson (1963, -1965), Burainski (1975) y Vierke (1979), siendo la hi-pótesis más ampliamente aceptada la qué afirma que elCMÜ inhibe la fotolisis del agua al bloquear el trans-porte de electrones entre los dos fotosistemas.

Dado que en nuestro trabajo, vamos a estudiar eepecialmente los efectos del CMÜ en el transporte elec-trónico a nivel de la reacción de Hill y de la fotocarboxilaci&n, descriUraaos estos procesos con más detalle.

1.3.5*1• Descripción del proceso fotosintético.

El principal aporte de energía en la bioesferaproviene de la conversión de la energía solar en ener-gía química, que se realiza en los cloroplastos de al-gas y plantas verdes.

En los cloroplastos tienen lugar dos tipos dereacciones: unas luminosas y otras oscuras. En las prj.meras, se capta la energía luminosa que, a través deuna serie de procesos, se utilizará en la formación de

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ATP y poder reductor (NADPE) que, a su vez, serán uti-lizados en la fase oscura para reducir el C0 2 7 trans-formarlo en hidratos de carbono. Para este fin, existenen los tilacoides de los cloroplastos pigmentos encar-gados de captar la luz que se encuentran agrupados en"unidades fotosintéticas" independientes denominadas fj£tosistemas. Parece ser que tanto en algas como en plantas superiores, existen dos tipos de fotosistemas, de-nominados I y II (PS-I y PS-II) que cooperan de formasecuencial en la transferencia de electrones desde elagua al NADP (Boardam, 1970). Ambos fotosistemas contig,nen clorofila a, clorofila b y carotenoides, pero enproporciones diferentes. Las clorofilas tienen dos má-ximos de absorción, uno en el rojo (entre 6¿fO y 670 nm)y otro en el azul (entre 410 y kkO nm), mientras quelos carotenoides absorben en la zona azul y verde (en-tre 410 y 500 nm).

Aunque no se conoce exactamente el número de mo-léculas que intervienen en un fotosistema tipo, la opi-nión más extendida, es la que admite que participan unas250 moléculas de clorofila (a y b) y unas 50 de carote-noides.

La energía de los cuantos de luz que llega a lasmoléculas de los pigmentos que integran los fotosiste-mas produce una excitación de los electrones corticales,siendo el estado de excitación tanto mayor cuanto menorsea la longitud de onda de la radiación luminosa. Laenergía absorbida se transmite de unas moléculas a otraspor resonancia, siendo de un 100 Jé la eficiencia de latransmisión para las moléculas de clorofila y de un kQ%para las de los carotenoides a la clorofila. £1 aceptorfinal de la excitación es una molécula de clorofila a(asociada probablemente a proteínas), que constituye, elcentro de reacción. En la figura 1 se representa, en for.ma de esquema en Z, el funcionamiento de los dos foto-

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-0,6V TE1o (volt)

-0.AVÍ

-0,2Vf

ov+

•02V4

'0.51.'-}

•0.8V4

¿Ftrredoxina ligada)

F*rr*desina

NADP*

FerredwinaN A 0 P redu ctasa

FIG.1ESQUEMA EN Z DEL TRANSPORTE ELECTRÓNICO FOTOSINTETICO.(T0MA00 OE SMITH 19771

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sistemas que constituyen el aparato fotosintético deIa6 algas y las plantas verdes.

En el PS-I, el centro de reacción está consti-tuido por el P-700, que es una molécula de clorofila aque decrece en la absorción de la luz de 700 na cuandose ilumina. Cuando el P-700 recoge la excitación de lospigmentos que lo acompañan en el PS-I, uno de los elec-trones corticales alcanza un potencial suficiente comopara ser transferido a la ferredoxina (Fd), que es unaproteina de bajo peso molecular (12.000 aproximadamen-te), transformándose en P-700+, oxidante débil con unpotencial de tipo medio del orden de -0.6 v. Según Bearden y Malkin (1972), parece ser que el compuesto inter-mediario "Y" entre el P-700 y la ferredoxina soluble, esotro compuesto denominado "ferredoxina ligada" (bFd) ,que actúa como oxidante del P-700 en presencia de la luz.La ferredoxina reducida es capaz de reducir al nicotin-adenln-dinucle&tido fosfato (NADP) que, a su vez, conla ayuda de la energía suministrada por el ATP, es ca-paz de reducir el carbono carboxilico del ácido fosfo—glicérico (P6A), que es la primera molécula en la queaparece fijado el carbono atmosférico.

El déficit de electrones creado en la moléculade P-700 es repuesto por otro fotosistema, el PS-I1 que,a su vez, toma los electrones de la molécula de agua(a través de un oxidante Z), liberándose oxigeno maleen.lar. La oxidaci&n del agua y el desprendimiento de unamolécula de oxigeno requieren la absorción secuencialdecuatro cuantos y la acumulación de cuatro equivalentesde oxidación (Cheniae, 1970; Cheniae y Martin, 1973). ELmecanismo por el cual se oxida el agua, todavía no "seconoce, aunque está establecido que se necesita manga-neso, probablemente, en forma de complejo manganeso-proteína y Cl" (Boardman, 1975 y fienger, 1978).

£1 centro de reacción del PS-II parece ser otra

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aolécula especial de clorofila a, que absorbe a 682 nm(P-682) y que, al excitarse, translfere un electrón aun compuesto fuertemente reductor que ha sido Identifi-cado cono C-55O por Knaff y Arnon (1969), capaz de rejoner los electrones al PS-I a través de una serle de -transportadores tales COBO la plastoqulnona (PQ) y laplastoclanlna (PC).

Debido a la calda de potencial existente en estetransporte de electrones, se desprende energía que seaprovecha para fosforllar una molécula de ADP y crearun enlace rico en energía en forma de ATP que se utili-zará posteriormente en la reducción del PGA. El déficitde electrones creado en el P-700 puede ser repuesto taabien a partir de la ferredoxina reducida a través deuna serie de citocroaos que, al devolver el electrón alP-700 cerrarían un ciclo análogo al que ocurre en lasbacterias y, en la calda de potencial, se producirá ATPpor la fosforilación del ADP (fosforilación cíclica)aunque no se produzca poder reductor.

Como resumen del proceso fotosintético, podemosdecir que, a través de una serle de reacciones que ocurren en los cloroplastos, la energía luminosa es capta,da por los fotoslstemas y almacenada en compuestos ri-cos en energía. En este proceso, se rompe la moléculade agua con liberación de 0¿ y los electrones resultantes son elevados hasta un potencial suficiente para redueir a la molécula de C02» gastando parte del ATP formado en el proceso fotosintético.

Se pueden distinguir, por tanto, dos tipos dereacciones: unas, en las que interviene la luz, y laenergía luminosa es utilizada en formar ATP y poder re-ductor (NADPH) y otro segundo tipo de reacciones, lasoscuras, en las que los productos formados en las reac-ciones luminosas (ATP y NADPH) son utilizados para reducir el carbono fijado según la ecuación:

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C02 + k H20 — (H-COH) + 3 H20 + 0 2

¿G = 114 Kcal

La incorporación del C02 atmosférico a la mate-ria orgánica se realiza a través de las reacciones delciclo de Calvin (Calvin, 1956, 1962; Calvin y Bassham,1962), en el que la molécula aceptora de C02 es la ri-bulosa difosfato (BuDP), la cual, da origen a dos mo-léculas de PGA, que son reducidas a aldehido fosfogli-cérico en una reacción que necesita dos moléculas deNADPH y de ATP. La regeneración de la RuDP se realiza apartir de las moléculas de triosa fosfato formadas , detal manera que, de cada 6 triosa-fosfato producidas enla fijación de 3 moléculas de C02 por 3' moléculas deBuDP, una sola representa la ganancia neta de los tresátomos de carbono, utilizándose las cinco restantes enregenerar las tres moléculas de BuDP consumidas.

Por cada molécula de C(?2 fijada se requiere gas-tar 3 moléculas de ATP y 2 de NADPH para la reduccióndel carbono y la regeneración de la BuDP. En forma muyesquematizada, se podría resumir el proceso en la si-guiente ecuación:

C02 + 3 ATP + 2 NADPH + 2 H+ —

(CH20) + 3 ADP + 3 Pi + 2 NADP* + 2 HgO

1.3.5.2. Efecto del CMÜ sobre la reacción de Hill.

En 1937» Hill observó que cuando se iluminabauna suspensión de cloroplastos de espinaca en presen-cia de un aceptor de electrones, se cumplía la siguie&te ecuación que lleva su nombre:

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Siendo A el aceptor de electrones y AH¿ su for-ma reducida* El proceso se puede cuantificar valorandoya sea el oxigeno desprendido o la cantidad de aceptorreducido (Hall y Bao, 1972). COBO aceptor de electronesse pueden utilizar distintas sustancias, generalmentecoloreadas, que interceptan el transporte de electro-nes desde el agua hasta el NADP+ a distintos niveles dela cadena de transporte, siendo las aás utilizadas elmetilviol&geno, la p-fenilenodiaaina, el ferricianuroyel diclorofenolindofenol.

La inhibición de la reacci&n de Hill (Hill, 1939)por los herbicidas derivados de la urea, ha sido objetode numerosas investigaciones, entre las que cabe citarlas de Jagendorf y Avron (1939), Banberger y col.(1963XGingras y col. (1963)» Homann y Saffron (1963)» Izaway Good (1965), Izawa (1968), Makeeve-Gur'yanova y Chfeanikov (1968), Me Manon y Borograd (1968), Kylin y col.(1972), Sundberg y Kylin (1972)y Hurainski (1975) . Lamayoría de ellos sitúan el lugar de acción más probablepara este tipo de herbicidas en el Fotosistema II y muypróximo al desprendimiento de' 0¿>. Sin embargo, Asahi yJagendorf (1963) y Sargent y Taylor (1972), han demos-trado que el CMU también puede inhibir el FotosistemaI, pero a concentraciones de herbicida muy superiores alas necesarias para inhibir el PS-II, y como éste le pr¿cede, no parece probable que sea un factor significativo en su3 propiedades herbicidas. En los trabajos deMoreland (1967) y Moreland y Blackmon (1968), utilizan,do una suspension de cloroplastos iluminados, agua comodonador de electrones, DPIP como aceptor de los mismosy CMU como inhibidor de la reacci&n de Hill, se consi-dera que el lugar de acci&n de este compuesto se puede

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situar en el PS-II entre el compuesto Q y la plasto--quinona, hecho que se confirma al observar que ausentala fluorescencia del PS-II, lo que hace suponer que Qse reduce coapletamente y pierde su capacidad de trangferir un electrón al PS-I y al interrumpirse el trans-porte electrónico se lapide la reducción del DPIP.

Se puede establecer una relación lineal entre ellogaritmo decimal de la concentración de herbicida enel medio de reacción para valores comprendidos entre10-^ M y 10-8 H y la inhibición de la reacción de Hill,como han comprobado Gingras y col. (1963) y Sancho -(1975) utilizando cloroplastos aislados de espinaca ycebada respectivamente. Garcia (1972), utilizando clo-roplastos aislados de judia, avena, cebada, alfalfa yespinaca, encuentra que el poder inhibidor del CMÜ enla reacción de Hill depende, además de la concentración*,del herbicida, de la relación molecular CMO/clorofüa yde la especie vegetal considerada.

1.3.5.3. Efecto del CMP en la Fotocarboxilación.

Como ya hemos indicado anteriormente, al inhibirse el transporte de electrones en la fotosíntesis, seimpide la formación del poder reductor necesario parareducir el CO., y, en consecuencia, se impide la forma-ción de hidratos de carbono con el consiguiente agota-miento de las plantas tratadas. Sancho (1975) estudiael efecto del CMÜ en la asimilación del ^C0¿ en plan-tas de cebada y observa que concentraciones de herbici,ca del orden de 10"^ M, incorporados en la solución mj,tritiva, la inhiben totalmente.

Diversos investigadores han comprobado que unsuplemento exógeno de hidratos de carbono a plantas- tra.tadas, retrasa los efectos tóxicos de algunos herbici-das derivados de la urea (Davis, 1966), pero no impiden

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el daño cuando las hojas de la planta tratada son yamaduras, acelerándose incluso el proceso en presen-cia de la luz y siendo más acusado cuanto mayor es laintensidad de la misma (Minshall, 1957).

En resumen, se puede considerar que el efectoherbicida del CMÜ se produce por la inhibición del trangporte electrónico y se puede situar su lugar de accibnen un punto próximo al desprendimiento de oxigeno en elPS-II. Como consecuencia, se impide la formación del ATPy del NADPH, necesarios para la asimilación del CO^.

Sin embargo, hay autores que opinan que ésta noes la única causa que explique los síntomas fitotóxicosdependientes de la luz, y aunque no está comprobado, mu.chos consideran que además debe formarse una sustanciafitotóxica, todavía no identificada, próxima al lugar deliberación del oxigeno fotosintético (Moreland y Black-mon, 1968).

1.3.5.4. Efecto del CMO sobre la actividad fotosint&ti-ca de algas unicelulares.

Los herbicidas derivados de la fenilurea, principálmente el CMO y el DCMÜ, han sido utilizados por numerosos investigadores para- intentar esclarecer diferen-tes aspectos de la A.F. de algas unicelulares.

Merecen citarse, entre otros, los trabajos deBishop (195S), Maloney (1958), Duysens y Ames» (1962),Gingras (1966), Teichler-Zallen y Eoch (1967), Kylin ycol. (1972), Sundberg y Kylin 0972), Stuart y Gaffron(1972a,bVhirainski (1975) y Vierke (1979).

Utilizando CMÜ como inhibidor y Chlorella PyrenqLdosa como organismo fotosintetico, Gingras (I966) estu-dió la inhibición del desprendimiento estacionario de 0 2

en función de la intensidad luminosa, de la temperatura

y de la dependencia espectral y, a través de los cálca-los cinéticos correspondientes, intento explicar el lu-gar y el mecanismo de accibn de este inhibidor. A con tinuaci&n se detallan los resultados obtenidos por esteautor:

a) Inhlbici&n en función de la intensidad luminosa»

Si a una suspension de Calorella, iluminada conuna intensidad de luz débil, se le adiciona CMU en unaconcentración del orden de k x 10"7 M, se produce unainhibición del desprendimiento de 0¿ del 50%, Sí la in.tensidad de la luz utilizada es fuerte, es prer ¿.so unaconcentración de CMU del orden de 2 x 10 M piara obte-ner el mismo efecto (Gingras, 1966).

Esta diferencia de sensibilidad, en función de laintensidad luminosa, podría sugerir una actuación delinhibidor a dos niveles de sensibilidad diferentes, quepudieran deberse a una etapa fotoquímica o bien a unareacción térmica limitante (Gingras y col., 1965).

b) Inhibición en función de la temperatura.

En la hipótesis de una dualidad de lugares de d¿férente afinidad para el CMU, se podría suponer que, enfunción de la temperatura del medio, existiría un des-plazamiento del equilibrio por formación de un complejointermedio que actuarla como inhibidor biológico y se-rla diferente según el tipo de complejo formado, o bienque el inhibidor "per se" inactlvara al mismo interme-diario (p.ej.: un transportador de electrones), partic¿pando en reacciones diferentes.

Sin embargo, de los trabajos de Gingras (1966) sededuce que, tanto en ausencia como en presencia de CMU,la inhibición no presenta sensibilidad térmica y no

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permite, por tanto, pronunciarse sobre la hipótesis deuna dualidad de lugares de inhibición.

c) Dependencia espectral de la inhibición.

COBO ya se coaentb en el punto 1.3.5*1» los ele£trones procedentes de la hidrólisis del agua, en una -primera etapa fotoquímica gobernada por el FotosistemaII (PS-II) sufren una calda de potencial electroquími-co, liberando la energía almacenada en forma de ATP ,siendo elevados al potencial suficiente para reducir «1NÁDP en una segunda reacción fotoquímica ligada al Foto,sistema I (PS-I).

Según la hipótesis de Krojmann (1958), posteriormente comprobada por Hill y Bendall (1959) y Losada ycol. (1961), la fotofosforilación ozidativa es imhibidapor el DCMÜ en cloroplastos aislados, pero puede evitar,se, si se adiciona al medio triclorofenolindofenol reducido por un exceso de glutatión, ya que el déficit deelectrones producido por la inhibición que ejerce elDCMU es compensado con los electrones que suministra eltriclorofenol indo fenol reducido.

Los derivados de la fenilurea,sólo bloquean laprimera reacción fotoquímica y, por lo tanto, la segun-da podrá continuar funcionando, siempre que exista unaporte exógeno de electrones a un potencial electroqutm¿co adecuado.

Si las dos reacciones fotoquímicas son interde-pendientes, los productos de reacción de usa serán nec¿sarios para el funcionamiento de la otra, y la veloci-dad del conjunto estará determinada por la más lenta deellas.

Según los trabajos de Gingras (1966), en que'em-pleó la diferente dependencia espectral de los dos fotosistemas, para intentar explicar el lugar de acción del

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CMÜ, se deduce que la acción de este derivado de la ureainfluye directamente sobre el transporte de electronesque tiene lugar entre el PS-I1 y el PS-I. Gingrass(1966)en sus experiencias, se basó en las conclusiones deEmerson (1958), según las cuales, longitudes de onda> 690 na actúan como factor limitante para el despren-dimiento de oxigeno.

Este autor, realizó sus experiencias con Chlore-lla y estudió la respuesta fotosintética de este orga-nismo al CMÜ determinando el desprendimiento de 0^ por unmétodo polarográfico.

En conclusión, podemos decir, que el CMÜ actúasobre la A.F. de algas unicelulares, inhibiendo el des-prendimiento de 0 2 por bloqueo del transporte de elec-trones entre las dos fotosíntesis, impidiendo la recaigadel substrato del PS-I por PS-II.

1.3.6. Metabolismo del CMÜ en vegetales.

Hasta la fecha, son todavía escasos los estudiosrealizados a nivel bioquímico sobre las vías metabóli-cas de los herbicidas en los vegetales, así como sobreel mecanismo enzimático que interviene en el proceso biológico de su degradación, ¿i consideramos que el efectofitotóxico de un herbicida está en intima relación consus procesos de degradación que regulan la cantidad demoléculas de producto sin transformar que alcanzan sulugar de acción y son capaces de ejercer la acción tóx¿ca, comprenderemos la importancia de su conocimiento.

El primer estudio sobre el metabolismo de los herbicidas derivados de la urea, fue realizado por Fang ycol. (1955) al aplicar carbontl-I^C-CMUa hojas de judiay observar, por cromatografía en papel, el tiempo que

tardaba en formarse un complejo con el CMO y constitu-yentes normales de la celulosa que, por hidrólisis acida,daban el herbicida sin transformar. Freed y col. (I960,informaron que este complejo estaba formado por el CMÜy una proteina de bajo peso molecular o un péptido.Sweetser (1963), trabajando con Chi or ellas "in vitro11,también observó la formación de un complejo entre el FMNy el CMU en presencia de la luz que inactiva el herbicida, hecho que todavía no ha sido comprobado en plantassuperiores.

Sin embargo, el primer paso del proceso de degradación metabólica en los herbicidas derivados de la fe-nilurea, parece ser la N-dealquilación, dado que la eliminación de un grupo metilo en la urea dimetilada redu-ce su fitotoxiddad y por eliminación del segundo grupometilo, ésta desaparece completamente, Axelrod (1956). Elproceso se confirma por la aparición sistemática de losmismos productos de degradación en las diferentes plan-tas tratadas. En la tabla II se pueden observar los re-sultados obtenidos utilizando CMU marcado con ^ C en elanillo aromático en diferentes plantas y con distintasformas de aplicación.

La hidrólisis posterior de las ureas destiladashasta las anilinas correspondientes es difícil de obser-var en plantas pues, o no se llegan a detectar, o la concentración es muy pequeña, posiblemente por su rápida -transformación por conjugación o por oxidación.

En experimentos de laboratorio, se ha comprobadoque, tanto las hojas como las raices e incluso los estomas de las plantas son capaces de producir la N-demeti-laclón del CMU. En condiciones de campo, el lugar en quese verifique la degradación dependerá de la especie ve-getal tratada y de la movilidad del herbicida en la planta. En el caso del CMU que es traslocado rápidamente

TABLA II.- N-dealquilación e hidrólisis del CM0-11fCdespués de la aplicación del compuestomarcado a diferentes especies vegetales.(Ü=CMÜ sin transformar, Msderivado mono-aetilado, D=derivado deaetilado, A=anili,na correspondiente, (A)=metabolito busca,do pero no encontrado). Qeissbühler, 1969.

Especie

Vegetal

Algodón

Soja

Algodón

Plátano

Soja

Maíz

Modo de

aplicación

Solución

nutritiva

Discos .de

hoja incu.

bados con

solución

del herbi

cida

Tiempo de

exposición

Cinco días

n ii

3 horas

Metabolitos

reconocidos

U M,D>A

Ü>M,D (A)

U< M,D>A

ü, M,D>A

U, M > D > A

Ü>M>D, (A)

1

Smith ySheets(1967)

SwansonySwanson(1968)

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a las partes aéreas de las plantas, es de esperar quesea metabolizado de preferencia en las hojas .

En lo que respecta al mecanismo enziaático queinterviene en los procesos de degradación del CMU enlas plantas, se podría suponer que pudiera interveniruna ureasa, sustancia ampliamente distribuida en lasplantas, pero Suaner y Somers (1953), examinando diversos substratos potenciales, entre los que figuraban elCMU y otras ureas sustituidas, no encontraron que sehidrolizaran por la ureasa.

£1 proceso de N-deaetilación es una reacción enzimática oxidativa que requiere oxigeno y NADPH COBO -cofactores (Bródie y col., 1958; Sbuster, 1964). La velocidad de la reacción depende del tipo de sustituyen-tes nitrogenados no alquilicos. Hodgson y Casida (1961),al estudiar "in vitro" la dealquilación de un gran nú-mero de carbamatos, asi COBO CMU y diurón, utilizandoun sistema enzimático obtenido de microsomas hepáticosde rata, observaron que las ureas eran dealquiladas máslentamente que los carbamatos, posiblemente por su esgasa solubilidad en el agua (Gaudette y Brodie, 1959), -aunque también podrían influir propiedades configuracio.nales o estructurales todavía no bien estudiadas.

En trabajos realizados "in vitro" por Posner ycol. (I96D con el mismo sistema enzimático microsomialse encontró que también pueden producirse hidroxilaciones en el anillo. El proceso requiere también O^yHADPHademás de la intervención de una oxidasa (Shuster, 1964).En animales, Ernst y Bohme (1965), Bohme y Ernst (1965),demostraron que en orina de rata, los metabolitos hidroafilados se eliminan principalmente como glucurónido yéter-sulfato y, dado que las plantas contienen una glu-curonil-transferasa similar a la de los animales (Prid-ham, 1965), se puede suponer que 6i se forman metabolitos

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hidroxilados "in vivo" pueden también ser conjugados -por las plantas en forma de glucurónidos.

En resumen, la vía de degradación propuesta paralos herbicidas derivados de la urea, se podría esquema-tizar según se representa en la Fig. 2.

1.3.7. Sensibilidad de las diferentes especies vegeta-les al CMP.

Se ha observado que, cuando se aplica cualquierherbicida, en igual concentración a diferentes especiesvegetales, se obtienen, en general, diferentes respues-tas.

Como ya hemos indicado anteriormente, el herbicida debe alcanzar, a nivel celular, el lugar de acción enuna concentración y durante un tiempo suficientes paraejercer su acción fitotóxica. El número y complejidad delos factores que intervienen en este proceso, asi comola interacción entre ellos es tan grande, que es muy d¿ficil estudiarlos por separado.

A grandes rasgos, se puede considerar que en lasrespuestas de diferentes especies vegetales a un mismoherbicida, intervienen fundamentalmente tres componen-tes: a) ambiental, b) estado de crecimiento de la plan-ta, y c) genético.

La influencia del componente ambiental ha sidoestudiada por Minshall. 0957), comprobando la importan-cia del tipo de suelo, la ecología del ecosistema, laluz y la humedad relativa en la selectividad de la-res-puesta de diferentes especies vegetales a iguales con-centraciones de CMU. Este autor observó que, además . delos factores mencionados, tenia una gran influencia la

estructura química del herbicida, la formulación

- 31 -H OI »

C,CH3

H OI M /

/

H

*CH3

COMPUESTO DEMETILADO

H OR,-N-C-NH2

DERIVADO DELA ANILINA

H O

OERIVAOOCONJUGADO

H O H

R,-N-C-Nv

COMPUESTO DEMETILADO

* CO2+NH3NCONJUGADODERIVADO

NITRITODERIVADO

H O

C

NITRITODERIVADO

FIG.2POSIBLE VIA DE OEGRADACION DEL CMU EN PLANTASSUPERIORES. tR»»p-CLOROFEN!LO).TOMADO DE ASHTON Y CRAFTS (1.973)

- 32 -

empleada, el portador utilizado y la técnica de aplicaci&n.

La sensibilidad al CMÜ según el estado de desa-rrollo de diferentes especies vegetales ha sido estudiado por Steckó (1971) en guisantes, patata y trébol rojo,encontrando como factores importantes modificadores dela respuesta tanto la capacidad del herbicida para p e -netrar a la planta a través de los distintos órganos, cono el mecanismo de acción del herbicida, es decir, suefecto sobre la planta madura en comparación con los ór,ganos en desarrollo de la misma.

Sin embargo, es el componente genético el que condiciona esencialmente la sensibilidad de las diferentesespecies vegetales a los herbicidas. Estos compuestos ,actúan en la planta como un componente extraño y éstadebe desarrollar un mecanismo enzimatico capaz de transformar el compuesto t&xico en otro de toxicidad menor onula. El desarrollo del mecanismo enzimático requiere unperiodo de inducción previo y de la capacidad y veloci-dad para ponerlo en marcha va a depender, en gran medi-da, la selectividad de las diferentes especies al CMÜ.

En resumen, podemos decir que los factores quedeterminan el grado de respuesta, una vez absorbido elCMD por las diferentes plantas, son múltiples y, cabedestacar la capacidad de retención del herbicida por laplanta, la facilidad con que se trasloca a los tejidos,y su estabilidad y actividad potenciales una vez alcan-zado el lugar de acción, factores que estarán a su vezcondicionados por las características físico-químicas -del herbicida, y por la capacidad de la especie vegetalpara metabolizar, generalmente por más de una via dife-rente, el compuesto químico extraño para convertirlo enuno menos tóxico o atóxico.

- 33 -

A fines prácticos, se indican en la tabla IIIlos principales cultivos en los que se utiliza el CMUcomo herbicida, asi cono la dosis y foraa de aplicaciónempleadas, y en la tabla IV se indica la sensibilidad aeste herbicida de algunas especies vegetales considera,das como malas hierbas en algunos cultivos.

-3k -

TABLA III.- Principales plantas cultivadas en lasque se utiliza el CMU COBO herbicida.(Thoason, 1972; Weed Control, 1971;Detroux y Gostinchar, 1967).

Espada Tacotal

ll<odte

Eaparraco

Cana da azúcar

P 1 6 «

Cltrleu

Tld

Araaa sin eultl-rar i» utilidadpública o priva-da: earrataraa,conducción»»patrollfaras,liaaaa fsrraaa,atropiurtoa, pUa.ta* laduatrlalsc

Doaia<Kc/ha)

0,9-US

0,9 - 9

9

ft.5

3-4

3-4

fc,5 - *5

Época d» aplieaeito

Cuando al alcodbntuna 30 ca daalto»

Aataa da qua aparaf.cas la» aalaaatareas, paro no•ata» da laa k aasmnaa prariaa a qoa«•«•ja al •«párrafoni daapuaa dalparlado da cortada

luadlataaantadaapota da laplantación aa laeafia nsavm odaapoaa dal cortay praparaeita dalaaalo an la caSaTiaja o d«"%oea".

lata» da .1* aaarcan.eia da laa aalaahiarbaa paro una•ai acotada lacoa»coa.

Cuanlo loa cítricostlanan, al aanoa,aa aio dt adad aotrataaianto dapri «aarcancU dalaa aala» iUrbaa.

Aplicar a Tifiadoada trac aftoa porlo aanoa, anprUarara, an aaa£(ancla o pocodaapata da la «aa£Canela da laaaala» hiarbaa

Halaa aUrbaaeantroladaa

La aayoria da laaaala» aUrbaaanualaa j laa

la aayarta da laaaalaa aiarbaa dahoja ancha 7las (raaiaaas.

La aayorla da laa•tía» hiarbaaanaalaa.

La •ararla da laa•alaa hiarbasaaoalaa.

La sayorla dalaa aaoalaa.

La aayorla daX u «ásalas

Da f,5 a 11 K(/ha controlan la aayorlada lai aalaa hurbaa asualaa.Sa 10 a 50 Kc/ha controla la aayorUda laa anualaa j laa paran»*

Obaarraelonaa

So pDlmrlzarsobra alalcodba.

Aplicarlo solo naaTaz por astaelte.lo aplicar a losaaparracoa radassaabradoa.

Sa daban nácaruna Z* i 3»aplicael6n antralas hilarasda eafia.

Los tratasiastosintarllaaaraadaban hacarsaduranta la•ataclte.

Sa puada rapatiral tratasuato laprlaarara »l«ul»Jlta. Crltar alcontacto con laahojas.

-35 -

TABLA IV.- Sansibilidad de algunas especles de nalashierbas.al CMU. (BR=efectos fitotôxicos,pero no letales incluso a dosis eievadas.PS, MS, S, TS: efectos letales a dosis aayeleavadas, elevadas, normales o bajas).(Detroux y Gostinchar, 1967).

Especie vegetal

Anagallis arvensis

Artemisia vulgarisCapseUa bursa pastorisChenopodium albumCirsium arvense

Convulvulus arvensis

Equisetum sp.

Fumaria officinalis

Lamium purpureura

Matricaria inodora

Plantago major

Polygonum persicaria

Ranunculis acris

Baphanus raphanistrum

Sinapis alba

Spergula arvensisStellaria media

Taraxacum officinalis

Tussilage farfara

Urtica dioïca

BE

X

X

PS

X

X

X

X

X

X

X

MS

X

X

X

s

X

XX

X

X

X

TS

X

X

•

- 36-

1.4. MÉTODOS DE ANÁLISIS DE RESIDUOS DE CMÜ ENVEGETALES.

El análisis de los residuos de herbicidas en vegetales es un problema que ha atraído la atención denumerosos investigadores en los últimos años. A esterespecto, ss interesante consultar los volúmenes edita,dos por Zweig (1964, 1967), Zweig y Sherma (1972), elmanual de la CIPAC (1970), el de la US.FDA, HEW editadopor Duggan (1969), los Métodos de la A.O.A.C. (197?) yla recopilación realizada por Hance y McKone (1976).

Los métodos utilizados se pueden clasificar endos grandes grupos:

I-Químicos y fisico-quí micos.

II- Bioensayos,

que revisaremos brevemente a continuación.

1.4.1. Métodos químicos y físico-químicos.

1.4.1.1. Espectrofotométrieos.

Los métodos espectrofotométricos se baaan en lamedida de la absorción de la luz o en la medida de lafluorescencia de un compuesto.

Los primeros, utilizan la region del espectro visible comprendida entre 400-800 nm (métodos colorimé—trieos), la región del ultravioleta comprendida entre185-400 nm (absorciometria u.v.) o la región del infrarrojo comprendida entre S00 nm y 16 mp (absorciometriade I.E.), y los segundos utilizan la región del visibleo del u.v. (fluorimetrla).

La fotocolorimetria fue el primer método instru.mental utilizado en el análisis de residuos de herbicidas

- 37 -

y, aunque todavía se utiliza en algunos casos, ha sidoreemplazado por otros métodos más sensibles y específi-cos.

£1 método colorioétrico se basa en la hidrólisisdel CMÜ hasta anilina que, posteriormente, es diazotaday acoplada convenientemente para obtener un diazoderivado coloreado. Como agente acoplante se utiliza la N-&-naftil)etilenodiamina (Young y Gortner, 1953). La reac-ción general podría esquematizarse así:

H-NO , C. nH«NHCHP-CH5-NH¡Ar-NH2 =-• Ar-N2

10 T £ 1

Ar-N=N-

Las anilinas se pueden producir por hidrólisisdel substrato que contiene el residuo del herbicida opor extracción previa del mismo y posterior hidrólisis.En cualquier caso, deben destilarse en corriente de vapor y separarse los productos de la reacción por cromatografla en columna de celulosa (Dalton y Peace, 1962,Ercegovich y Witkonton, 1972).

También se puede formar una base de Schiff col¿reada por reacción de la amina formada por la hidróli-sis del CMU y el p-dimetilaminobenzaldehido (Fukel'many Vol'man, 1968).

Mucho más sensible que el método colorioétricoes el de absorciometria en el u.v., como puede compro-barse por los trabajos de Davidson y col. (1968). Sinembargo, no se puede decir lo mismo de la absorcicmetrfa

-38 -

I.E., pues su utilidad en la determinación de residuosde herbicidas viene limitada tanto por la dificultad desu extracción del material que lo contiene como por lasensibilidad del método (Blinn, 197D.

Entre los métodos fluorimétricos cabe destacarel de Freí y col. (1973)» en el que separa por cromatografía en capa fina la anilina obtenida por hidrólisisdel CMU y el derivado, densilado "in situ", lo valorapor espectrofotometria de fluorescencia.

1.if.1.2. Cromatoeráficos.

1 .¿f. 1.2.1. Cromatografía gaB—liquido.

En la última década, ha alcanzado un gran desa- ¡rrollo la utilización de la cromatografía gaseosa en el £estudio de la valoración cuantitativa de residues de her |_bieldas. Los primeros investigadores que la utilizaron ¿*para este fin fueron Coulson y col. (1959) y Zweig yArcher (I960).

La importancia de esta técnica de valoración radica en su capacidad para separar pequeñas cantidadesde herbicida, a menudo del orden de 1 ng o menores, deuna serie de otros productos que se extraen al mismotiempo de muestras tan complejas como suelos, tejidosvegetales o animales o agua.

Las características del detector y de la columnaa emplear dependen de las propiedades fisico-quimicasdel herbicida a estudiar. En el caso del CMU, los detectores de elección son los de ionización de llama, ó elde captura electrónica, aunque ninguno de los dos es egpecifico de este producto, por lo que es necesaria lautilización de un standard preparado con el herbicidapuro.

- 39 -

En la práctica, los productos extraídos de lasmuestras junto con los residuos del herbicida pueden interferir y dificultar enormemente la valoración y, portanto, disminuir considerablemente el limite de detec-ción del herbicida o de sus metabolitos. Para superaresta dificultad, es necesaria una separación previa fiLsica o química del herbicida a partir del extracto original, antes de proceder a su análisis por cromatogra-fía de gases, separación que suele consumir bastante -tiempo y puede dar lugar a pérdida de algo de herbici-da. A pesar de estas limitaciones, es el método más sensible y más ampliamente utilizado para el análisis deresiduos de herbicidas.

Cono ya hemos dicho, la extracción del residuode herbicida del substrato que lo contiene es el pasoprevio de una serie de manipulaciones que conducen a lavaloración final del compuesto. La técnica de extrac-ción depende del substrato en que se encuentre y de lascaracterísticas físico-químicas del herbicida o de susproductos de degradación (Onley y Tip, 1969), posteriormente, el extracto debe ser purificado y, en algunos casos, es preciso formar un derivado del herbicida o desus productos de degradación para su detección por eromatografia-de gases. Para el CMU, la técnica más gene-ral ha sido la de formar derivados halogenados (Baunoky Geissbuhler, 1968; Kossman, 1971). Una técnica inte-resante también es la utilizada por Cohen y Wheals(1969) para herbicidas derivados de la urea que consiste en hidrolizar los compuestos obtenidos por extrac-ción clorofórmica hasta aminas y formación posterior delos 2-k dinitrofenilderivados que los separan por cro-matografía en capa fina y los valoran por cromatografíade gases, utilizando un detector de captura electrónica.

Otros autores (Young y Gortner, 1953; Dalton yPeace, 1962; Voss y Geissbühler, 1971) realizan la hi-drólisis previa a la extracción con posterior aislamiento y valoración de la amina resultante.

1.4.1.2.2o Cromatografía en papel.

Es un método sencillo y económico pero lento, sinembargo, es útil para estudios cualitativos y para confirmación de la existencia de residuos que se pueden valorar posteriormente por otros métodos más sensibles(Fukel'man y Vol'man, 1968; Major, 1962 y Mitchell, 19&6).

El método se puede utilizar también como semi—cuantitativo si se compara el área de la mancha corre£pendiente al herbicida con la de un standard, por uti-lización de un densit&metro o por pesada. El reactivoutilizado para visualizar el CMÜ o sus derivados es elp-dimetilaminobenzaldehido (Oswieci«ska y Solez, 1969).También se pueden utilizar métodos no destructivos o re,versibles en los que las manchas son recortadas, extraídas con un solvente adecuado y el compuesto valorado -por cualquier método analítico. En este caso, las man-chas se pueden visualizar con vapores de iodo.

1.4.1.2.3. Cromatografía en capa fina.

Es una de las técnicas más utilizadas por su versatilidad y rapidez (Abott y col., 196?; Askew y col. ,1968; El Dib, 1970; Look y White, 1970; Smith y Fitzpatrick, 1971).

Se pueden utilizar cromatoplacas con distintossoportes a los que se puede adicionar un indicador defluorescencia, lo que permite visualizar las manchas ala luz u.v. También es posible la formaci&n de deriva-dos coloreados o no, ya sea por hidrólisis previa del

extracto original y formación del derivado una vez de-sarrollada la placa (Onley y Xip, 1969)» o por cromatografía de las sustancias coloreadas formadas por reac-ción de los productos de hidrólisis y el reactivo c o -rrespondiente (Geissbühler y Qross, 1967). Otros auto-res (Guardigli y col., 1971) fornan el derivado nitradodel CMU antes de realizar la cromatografía y reducen e.ste compuesto a la amina correspondiente, una vez desarroliada la placa, las aminas correspondientes se puedenvisualizar como antes dijimos con p-dimetilaminobenzaldehido (Yip y Howard, 1966). Si las manchas se visualizan por medios no destructivos (luz u.v., vapores deiodo), se pueden raspar, eluir y valorar por otros mé-todos analíticos (Bay y Wilcox, 1967).

1.4.1.2.4» Cromatografía liquido—líquido de alta pre-sión.

Presenta las ventajas sobre la cromatografía degases de que puede variarse la fase móvil y aumentar ,por tanto, la posibilidad de una separación mejor. Kirkland (1969, 197D» fue capaz de separar por este proce,dimiento una serie de herbicidas derivados de la urea,muy difícil de conseguir por otros métodos. £1 inconve,niente es que los detectores, tanto de u.v. como defluorescencia, no son universales ni tan sensibles comolos utilizados en cromatografía gaseosa.

1.4.1.3. Otras técnicas analíticas.

Existen otras técnicas de mucha menor difusión,por su elevado costo, pero de gran utilidad en la valoración e identificación, tanto de la molécula originalde herbicida como de sus productos de degradación. En-tre ellas cabe destacar la espectrometría de masas

(Biros, 1971) y la resonancia magnética nuclear (Keithy Alford, 1970).

1.4.2. Bioensayos.

Un bioensayo consiste en someter a un materialbiológico a la acción de un producto biológicamente a¿tivo y determinar su concentración según la magnitudde la respuesta.

Las ventajas que presentan los métodos biológi-cos radican en la posibilidad de elaborar un bioensayopara cada tipo de herbicida, dependiendo de su mecanis-mo de acción, en un tiempo generalmente inferior al empleado con un método analítico instrumental y con téc-nicas generalmente sencillas y no costosas (Hance y He.Kone, 1976). Otra ventaja importante es que proporcio-nan un método directo de determinación de la cantidadde herbicida biológicamente activo, información que ,con frecuencia, es más útil que el conocimiento de lacantidad total de herbicida existente, que serla el va-lor encontrado por otros métodos, especialmente cuandose valoran residuos en el agua o en suelos.

Cuando el substrato son tejados vegetales, elproblema se complica porque los productos co-extraidospueden interferir en la valoración posterior.

Como bioensayo se pueden utilizar las respuestasbiológicas en las que intervienen plantas completas, -partes de plantas, algas y, en ocasiones, hongos.

Para que el método sea útil desde el punto . devista cuantitativo, la respuesta debe ser reproducibley estar en relación con la concentración del herbicida.En general, la respuesta biológica obtenida con una -muestra desconocida se compara con la respuesta obtenida

para un standard con el que se ha elaborado una curvade calibrado. Algunos autores realizan esta curva decalibrado por simple representación, en papel milime-trado, del porcentaje de respuesta biológica obtenidoen función de la dosis de herbicida, con lo que se ob-tiene una sigmoide en la que la linearidad se alcanzasólo para dosis muy próximas.

Si se representa la respuesta en función del logaritDO de la dosis, la sigmoide se hace lineal para unmargen más amplio de concentraciones, y esta transforma,ción es la más utilizada. Otros autores (Blackman, 1952;Sampford, 1952) prefieren la utilización de las unidadesprobit. En todo caso y para que los resultados sean vá-lidos, es preciso someterlos a un riguroso análisis es-tadístico.

1.4.2.1. Métodos one utilizan plantas completas.

Son los más empleados como bioensayo, pues se pueden utilizar condiciones muy similares a las obtenidasen campo. Uno de los primeros investigadores que usóesta técnica fue Crafts (1935) al comparar el crecimiento de plantas en suelos que contenían una concentraciónconocida de herbicida con las que elaboró tina curva do,sis-respuesta, con el crecimiento de otras plantas ensuelos que contenían una concentración desconocida delmismo herbicida.

La elección del substrato vegetal en este tipode bioensayos, vendrá determinada por la sensibilidaddel mismo al herbicida que se quiere estudiar. Así, laAvena Bativa se ha utilizado mucho para el estudio dela determinación de residuos de herbicidas derivados dala urea, sin que esto quiera decir que esta especie'vegetal sea la más sensible. Un dato importante a consi-

derar en este tipo de bioensayos es el tamaño de la plaita, como ya hemos indicado anteriormente. En el casode los cereales, se suelen utilizar 20 6 30 días des-pués de haber sido plantados. Sin embargo, el tiempo 6j>timo debe elegirse de acuerdo a cada tipo de ensayo. Enel caso de los herbicidas inhibidores de la fotosínte-sis, se debe esperar, como mínimo, el tiempo necesariopara que se consuman las reservas de las semillas, por-que s6lo entonces son representativos los efectos delherbicida sobre el tamaño de la planta.

Como parámetros de evaluación de respuesta, sepueden utilizar el pe60 fresco o seco de las partes a¿reas, el peso o longitud de las raices, o la altura dela planta (Horowitz, 1970). Otros autores (Dowler, 196*9)prefieren utilizar un sistema de evaluaci&n basado enla observación visual de los síntomas fitotóxicos cau-sados por el herbicida. Un método similar es el empleado por Santelman y col. (197D, en el que además de laobservación visual de los efectos fitotózicos produci-dos por el herbicida en la planta, tienen en cuenta laaltura de la misma y su peso fresco y seco.

No hay que olvidar, en los bioensayos con plan-tas completas, la importancia de los factores ambientales que afectan tanto a la sensibilidad como a la f e —producibilidad del método. Entre ellos cabe destacar :la temperatura, intensidad de iluminación, duración deldía, humedad relativa y nutrientes. Este tipo de con-trol tiene el inconveniente de que sólo se puede realizar en cámaras de crecimiento, lo que encarece de modoconsiderable el bioensayo.

1.4.2.2. Métodos cue utiTfoan el crecimiento raizAallo.

El principal inconveniente en el uso convencio-nal de plantas completas es el tiempo empleado para

- 45 -

obtener un resultado, por lo que algunos investigado-res (Mazuryco\1969)han buscado métodos más rápidos queconsisten, fundamentalmente, en hacer germinar las sasilias de las plantas a estudiar en un papel de filtrohumedecido con solución de herbicida y medir la longi-tud del tallo y de las raices después de un intervalode tiempo determinado que, generalmente, son 96 horas.Existen diversas modificaciones a este método, entre lasque la más utilizada es la de Parker (1964).

1.4.2.3. Métodos que utilizan algas.

Las algas parecen ser idóneas como organismo debioensayo para la detección de residuos de herbicidasque actúan como inhibidores de la fotosíntesis. LaChlorella pyrenoidosa ha sido empleada por Gramlich yFrans (1964) para determinar residuos de ácido naftil-acético, 2-4,D y atrazina. Atkins y Tchan (1967) describieron un método en el que se estimaba la inhibición -del crecimiento de la Chlorella st>. en el liquido sobre,nadante de un barro de suelo con una concentración co-nocida de atrazina. Con este mismo método, Addison yBardsley (1968) encontraron que el organismo era sens¿ble para 0,1 p.p.m. de diurón. Sin embargo, Cho y col.(1972) informaron que existe un mutante de la Chlorellaque puede tolerar hasta 200 p.p.m. de CMD, lo que hacesuponer que la presencia de tales mutantes resistentesen el inoculo inicial pudiera afectar significativamente a los resultados globales.

1*4.2.4. Métodos que utilizan otros organismos acuáti-cos.

Diversos autores (Parker, 1964, 1965) han ut£l¿

zado la Lemna st>. o plantas similares como organismos

de bioensayo, relacionando el peso de la fronda, el áreay el color con la concentración del herbicida, coapro-bando que tanto la intensidad como el tipo de luz y deagua utilizados, afectaban la respuesta biológica deeste substrato.

1.4.2.5» Métodos one utilizan hongos.

El Aspereillus niger se ha empleado también conoorganismo de bioensayo para la determinación de resi-duos de herbicidas derivados de la urea (Murray y col.,1969)1 pero su sensibilidad es mucho menor que la de losorganismos fotosintéticos.

•

1.4.3» Consideraciones sobre los métodos de análisis deresiduos de herbicidas.

Después de dar esta visión general de los méto-dos utilizados en el análisis de residuos de herbici-das, es difícil emitir un juicio sobre cuál sería elmétodo de elección para cada caso particular. En realidad, es poco corriente que se establezcan comparacionesentre los bioensayos entre sí o entre éstos y los metodos analíticos, aunque existen algunos autores que hanproporcionado datos de enorme interés en este sentido.Asi, Bailey (1970) encontró que el método de Parker -(1964, 1965)> que utiliza la Lemna. era más sensible -que el método que utiliza la Avena para el monurón. Conuna cepa de Chlorella de alta temperatura, Kratky yWarren (1971 a) encontraron resultados más sensibles enla determinación de residuos de atrazina que los obte-nidos con soja y que ésta, a su vez, era similar a lacebada y al pepino y menos sensible que la remolacha'.También compararon su método (Kratky y Warren, 1971 b)con el del crecimiento raíz/tallo de Parker 0964, 1965)

- k7 -

para la determinación de residuos de k2. herbicidas, comprobando que el método de la Chlorella era el más sen-sible para la valoración de residuos de herbicidas inhibidores de la fotosintesis y que el que mide el creci-miento de la raíz/tallo lo era para la mayoría de losherbicidas, exceptuando estos últimos.

El limite de sensibilidad para obtener el 50% deinhibición es de 1 p.p.m. o menos para 31 herbicidas d¿ferentes por cualquiera de los dos métodos.

Es difícil comparar los métodos biológicos conlos instrumentales, ya que el proceso de extracción necesarlo en estos últimos, puede arrastrar herbicida queno es biológicamente activo, especialmente cuando setrabaja en condiciones de campo. Son de destacar los trabajos de Sikka y Davis (1966), que encontraron una bue,na correlación entre los resultados obtenidos con unbioensayo en Avena para herbicidas derivados de la ureay los obtenidos por espectrofotometrla u.v., aunque elcoeficiente de correlación de la linea de regresión ob,tenida no fue la unidad. También encontraron buena concordancia Fryer y Kirkland (1970), en la evaluación deresiduos de simazina determinados por un bioensayo conBrassica rapa como substrato biológico y la valoraciónpor cromatografía de gases, siendo, a veces, inclusomás sensible el primero. A similares conclusiones lle-gan Santelaan y col. (197O» encontrando que los méto-dos espectrofotométricos y cromatográficos para la de-terminación de residuos de proaetrina, daban valoresque estaban en concordancia con los obtenidos por unbioensayo con la cebada.

Como resumen y de acuerdo con la tendencia ge-neral, se puede afirmar que los bioensayos son los mé-todos más sensibles y que más se aproximan a la reali-dad biológica en la determinación de residuos de -

herbicidas, y que la cromatografía de gases o de líqujldos de alta presi&n son los menos variables. En todocaso, la primera consideración que debe establecerse alelegir un método analítico, es precisar cuál es el grado de especificidad requerido para el análisis y suslimites de detección, contando con los métodos de quese dispone en el laboratorio donde va a efectuarse lainvestigación.

2 . MATERIAL T MÉTODOS .

2.1. ESTUDIO DEL EFECTO DEL CMP SOBRE EL DESARROLLO DEPLANTAS CULTIVADAS.

Se estudiaron los efectos fitot&xlcos producidospor el CMU, absorbido radicularaente, en diferentes ejspeeies de plantas cultivadas en invernadero, en funciónde la concentración del herbicida y del tiempo de tratamiento, comparándolas con plantas testigo sin tratar -mantenidas en iguales condiciones ambientales.

2.1.1. Especies vegetales ensayadas.

Cebada (Hordeum vulgare) L.Avena (Avena sativa) L.Trigo (Triticua aestivum) L.Maíz (Zea mais) L.Judia (Phaseolus vulgaris) L.Tomate (Licopersicum seulentua) L.

2.1.2. Condiciones de cultivo.

Se pusieron a germinar las semillas de las especies indicadas en el apartado 2.1.1, en arena estérilhumedecida con agua. Una vez germinadas, se regaron consolución nutritiva de Bidwell (1974), cuya composiciónse detalla en la tabla V.

Al cabo de dos semanas, en el caso de la cebada,avena y trigo, tres en el del maíz, cuatro para la ju-dia y seis para el tomate, se pasaron las plántulas cuidadosamente a vasos de cultivo que contenían la mismasolución nutritiva (Fig. 3), y se colocaron en una cá-mara de cultivo a una temperatura de 22 ± 1°C y una humedad relativa de 65 + 5%. Durante la experiencia

PLANTA DE JUDIA

ALGODÓN CRASO

TAPÓN DE CORCHO

SOPORTE DE PLÁSTICO

VASO DE PLÁSTICO

SOLUCIÓN NUTFHTIVA

F1G.3DISPOSICIÓN DE LAS PLANTAS EN SOLUCIÓN NUTRITIVA

TABLA V.- Composición de la eolucl&n nutritiva de Bldwell (1974) .

COMPUESTOMacronutrientes

KNO3

0a(H03)2

F.CI3

CONCENTRACIÓNtomol/l

13,3

5,88

5,27

2,67

0,62

COMPUESTOMicronutrientes

H3BO3

MnCl2 . 2H20

ZnCl2

CuCl2 . 2H20

MOO3

CONCENTRACIÓNog/1

2,5

1,5

0,10

0,05

0,05

IVJl

estuvieron sometidas a una iluminación continua de 1A-

W/m suministrados por tubos Gro-lux (Sylvania) de kO W.

Al cabo de tres días, tiempo que se consideró ne

cesarlo para que las plantas estuvieran adaptadas a ej3

te ambiente, se comenzó la experiencia.

Se estudió el efecto fitotóxico de nueve coneen

traciones distintas de CMU* comprendidas entre 10"^ M

y 10" M sobre cada una de las especies vegetales arri

ba indicadas, frente a los testigos sin tratar.

Las soluciones problema se prepararon por dilu-

ción de una solución stock obtenida dal siguiente modo:

Se pesaron, exactamente, 198,7 ag de monurón, química-

mente puro, se introdujeron en un matraz aforado de 1000

ce, se añadieron 2 ce de etanol para disolverlos com—

pletaaSníé y se completó con solución nutritiva de Bid,

well hasta el enrase. La concentración' de esta solución

stock estele'10"' M. , ..

.'£f- Las plantas se dividieron en dos grupos de kO

plañías cada uno. £1 tratamiento se efectuó durante -

Remanas, cambiándose las soluciones respectivas

por semana.

..? Las plantas del primer grupo se CQlo£aron en las

distintas soluciones de OKÜ a razón de^f^lr'b plantas

por cada concentración de herbicida. A las cuatro plan

tas testigo' sólo se añadió solución nutritiva.

Las del segundo frupo, se dividieron de modo

análogo y s« colocaron en iguales condiciones que las

expresadas para el primer grupo durante la primera se-

mana de la experiencia. Al cabo de este tiempo, se pa-

saron a solución nutritiva de Bidwell durante las

tres semanas restantes con el fin de estudiar la recu-perad £>n de las plantas al eliminar el compuesto tóxi-co.

2,1.3. Observaciones realizadas»

Con objeto de estudiar el efecto fitotoxico delCMU sobre el desarrollo de las plantas a nivel macros-cópico, se realizaron observaciones periódicas durante1 mes.

Como Índice de desarrollo se eligió el número total de hojas (o de foliólos en el caso de la judia), yaque este parámetro era de fácil e inequívoca determinaci&n.

Se prefirió este Índice al de longitud del tallopor la dificultad que representa el tener esta medidaen las plántulas de cereales.

A la vez que se determinaba el número de folio-Ios o de hojas, se observaba la existencia o no de sintomas de marchitamiento y de expresión clara de letali,dad.

- 55 -

Z.Z. ESTUDIO DEL EFECTO DEL CMÜ SOBRE LA ACTIVIDAD FOTO-SINTÉTICA DE LAS HOJAS DE PLANTAS CULTIVADAS.

Se estudió el efecto del CMU a concentracionesvariables entre 1O~4 M y 10 M, después de 1 y 7 diasde absorción radicular, sobre la actividad fotosintética (A.F.) de las hojas de las plantas de cebada, arena,trigo, maíz, judia y tomate, cultivadas según se citóen el punto 2.1.2.

La aplicación del CMU se realizó en plantas decebada, trigo y avena a las 2 semanas; en maiz a las3 semanas, en judia a las ¿t semanas y en tomate a las6 semanas de desarrollo.

Para determinar la A.F. se utilizó ^C02 aplicado según el método descrito por Fernández (1975, 1978).

2.2.1. Estimación de la concentración de CMU en Tas hojas.

Una vez germinadas las plántulas y alcanzado eltamaño indicado en 2.1.2, se pasaron a vasos de cuTLtivo con solución nutritiva durante tres dias.

Para estudiar la concentración que alcanzaba elCMU en las plantas que lo hablan absorbido radicular-mente, se utilizó CMU marcado con 1¿fC (monurón-2-I^C)de 3,88 uCí/uaol de actividad especifica (1,kZ x 105bq/pmol), comprobada por la medida de la D.O. a 2¿t6 nm(K s 10,593 fig/cc) y por contaje en centelleo liquido.

Las soluciones de CMU-^C se prepararon a partirde una solución stock. En la tabla VI se expresan losvalores de la concentración radiactiva de las diferen-tes soluciones de CMü'^C utilizadas.

Se emplearon 14 plantas por experiencia, colo-cándose dos plantas en cada uno de los vasos de cultivo

TABLA VI.- Concentración radiactiva de las diferentes soluciones de CMU-^C.(As : 3*88 aCi/nmol)

Concentración

molar

(mmol/cc)

1 x lO-4

1 x 10"5

1 x 10"6

1 x 10~7

1 x 10"8

0

Concentración

radiactiva

(dpn/cc)

8,61 x 105

8,61 x 10k

8,61 x 103

8,61 x 102

8,61 x 10

-

- 57 -

que contenían las diferentes concentraciones de CMÜ-T3y las cuatro restantes en 2 vasos que contenían solu—ci6n nutritiva.

Durante la semana que duró la experiencia se majatuvieron en cámara de cultivo en las condiciones de T§,humedad relativa e iluminación indicadas en 2.1.2.

La estimación de la concentración alcanzada porel CMU en las hojas de las distintas plantas se realizóteniendo en cuenta la cantidad de CMU detectada por con,taje en centelleo líquido (c.l.) de una muestra de hojay la humedad de la misma. Para ello, se tomó una mues-tra de hoja de un peso fresco comprendido entre 50 y100 mg (determinado exactamente), se introdujo en unvial de contaje en c.l., se desecó en estufa a 60°C durante 2k horas, hasta peso constante. A la muestra de-secada se añadió 1 ce de NO,H al 35% y se digirió enbaño «aria a 90°C durante 5 horas. Una vez frío se añadieron 15 ce de Instagel, se agitó vigorosamente hastala disolución completa del material vegetal y se proce,dio a contar en centelleo liquido (Fernández, 1975,1978).

Para conocer el porcentaje de la actividad quecorrespondía al CMU dentro de la actividad total dete¿tada en cada muestra, paralelamente se tomó otra mues-tra de hoja que se maceró con etanol y el extracto, unavez concentrado, se cromatografió en capa fina en pla-cas de gel de sílice Merck, sin indicador de fluores-cencia, de 0,25 •• de espesor, lavadas con metanol yactivadas en estufa a 60°C durante 1 hora, utilizandocloroformo mitrómetaño (1:1) como eluyente.

Para detectar el CMU- ^C sin degradar, asi comosus productos de transformación, se realizó una autarradiografia con películas de Bayos X Kodak R-B-54, y seprocedió al raspado y contaje de las diferentes manchasradiactivas detectadas.

Multiplicando la actividad total detectada en lamuestra por el % correspondiente a la actividad delCMU obtenida en el análisis radiocromatográfico, se ob_tuvo la actividad correspondiente al CMU de la vuestra,y dividiendo esta por la As del CMU- C, y por el con-tenido acuoso de la muestra, se obtiene la concentra--ci6n que se estima alcanza el CMU en la hoja.

2.2.2. Asimilación del 1¿fC02.

Para medir la actividad fotosintética de las hojas de las distintas especies a estudiar, se utilizó elmétodo descrito por Fernández (1975, 1978).

El procedimiento consiste en hacer pasar, durante 30 segundos, una corriente de aire con i'HJOg (300p.p.a., As: k mCi/mmol), a través de una aicrocámara -transparente, en cuyo interior se encuentra la parte dela hoja en que se va a determinar la actividad fotosiiitética.

El ^C02 se genera a partir de ^COjBa de unaactividad especifica conocida (en nuestro caso k mCi/mmol) y se calcula la cantidad necesaria para producirla concentración de C0 2 deseada en el volumen total deaire que se vaya a utilizar.

Para las condiciones de nuestro laboratorio (710•a de presión atmosférica y 20°C de temperatura), seutilizan 2,31 mg de ^CO^Ba para producir 1 litro de

1^aire con 300 p.p.m. de

La cantidad deseada de ^CO^Ba se deposita enun vial que se cierra herméticamente.

Se produce el vacio previo <r se inyectan 5 cede ácido láctico 2 N.

- 59 -

£1 COg desprendido está en equilibrio entre elliquido y la atmósfera del interior del vial.

Por medio de una jeringa provista de una llave de2 vias se hace pasar aire a través de una columna de calsodada (para retener el C0¿) y por el vial que contieneel 1ítCÜ2, para arrastrarlo y llenar un balón de polietileño provisto de una boca con obturador (Fig. 4 ) .

Con objeto de controlar la concentración radiac.tiva de la mezcla de aire producido y su posible variaci&n en el tiempo, se toma una muestra a tiempo cero,otra a mitad y otra al final de la experiencia, que serecogen sobre etanolamina y se valoran por centelleo l£quido.

La concentraci&n radiactiva del aire del balón(expresada en dpm/cc) se determina directamente divi-diendo las cpm obtenidas por la eficiencia del contaje.

La microcámara propiamente dicha, representada -en la Fig. 5> tiene una superficie de k cm y una pro-fundidad de 5 cm.

£1 aire marcado, al entrar en la cámara, se distribuye homogéneamente y sale por un tubo que contienecal sodada para absorber el 12fC0¿>.

£1 gas se hace pasar únicamente por el envés dela hoja.

La parte superior de la cámara es transparentepara dejar pasar la luz hasta la hoja.

Con objeto de delimitar la zona de hoja que» abarca la microcámara, en los bordes de ésta, existen unospivotes de acero inoxidable que dejan una marca en lahoja al presionar las pinzas sobre ambas placas.

Durante la experiencia, la cámara se ilumina con60.000 luxes por medio de un foco de 500 W (Osram—•

- 60 -

SUCCIÓNACIDO LÁCTICO (2N)

5=3 "co.

BALÓN DE P0LIE7ILEN0

LLENAOO DE LA JERINGALLENADO DEL BALÓN

FIG. 4PREPARACIÓN DEL AIRE MARCAOO CON K C 0 2

- 61 -TAPA DE PLEXIGLÁS TRANSPARENTE

GOMAESPUMA(NO POROSA!

LANA DE VIDRIO

CAL SODADA

FIG. 5ESQUEMA DE LA MICROCAMARA UTILIZAOA PARA LAMEDIDA DE LA ACTIVIDAD POTOSINTETICA EN HOJASDE DIVERSAS PLANTAS CULTIVADAS.

- 62 -

Nitraphot). Después de 30 segundos, se corta la ilumi-nación y la porción de hoja sometida a experimentaciónse deseca a 90°C durante 2k horas. Acto seguido se procesa la muestra para contaje en e l . por medio de unadigestión con NO3H al 35%» según se indicó en el punto2.2.1.

A partir de las cpm obtenidas en cada vial decentelleo liquido, se puede determinar la actividad fotosintética de las diferentes hojas expresada en micromoles de COg asimilado por cm de hoja y por hora, aplicando la fórmula:

cpm • 3600Af = — — — — —

e • As* S. t.

en la que:

Af = actividad fotosintética.

cpm= cuentas por minuto.

e = eficiencia del contaje.

A6 = actividad especifica del ^COg expresadoen desintegración por minuto (dpa) pormicromol de C02.

S = superficie de la hoja expuesta expresadaen ca .

t = tiempo de exposición de la hoja al flujode aire marcado, expresado en segundos.

- 63 -

2.3. ESTUDIO DEL EFECTO DEL CMP SOBRE LA REACCIÓN DEHILL EN CLOROPLASTOS AISLADOS DE HOJAS DE PLANTASCULTIVADAS.

Se utilizó el 2-6 diclorofenol indofenol (DPIP)COBO indicador de 6xido-reducci&n por la doble ventajade poseer un potencial de bxido-reduccibn de + 0,217 V(Y. Kouchkousiy, 1963), lo que le hace susceptible dereducirse o por el citocroao b de potencial Eg = +0,05V, o por la plastoquinona reducida de potencial E¿ = OV, y por peraitir valorar la reacción de Hill colorioétricamente, ya que el DPIP oxidado es azul y al redu-cirse se decolora.

= 0,217

:0:H

DPIP(oxidado)

Azul

DPIPH2

(reducido)Incoloro

El CMü Inhibe la reacción de Hill, y por tanto,Inhibirá la reducción del DPIP en presencia de cloro—plastos iluminados.

Basándose en este principio, se intentó determinar la relación existente entre la concentración de CMDy el grado de inhibición de la reacción de Hill,en fragaentos de cloroplastos aislados de cebada, avena, tri-go, maíz, judia y tomate.

2.3.1. Aislaaiento de cloroplastOB.

Se siguió el método de Whatley y Arnon (1963)*

Se partió de 50 g de hojas frescas, mantenidas abaja temperatura (0-5°C), de las que se suprimieron lasnerviaciones principales.

Se añadieron 100 ce de CINa al 2%t solución quees hipotónica con respecto a la célula que se quiera -romper, pero isotónica con respecto a los cloroplastos.

Se trituró en batidora, se filtró a través de gasa doble y se recogió el filtrado en baño de hielo.

£1 filtrado se centrifugó a 300 g durante 2 mi-nutos para eliminar los restos de paredes y núcleos.

En el sobrenadante quedaron los cloroplastos jtmto con mitocondrias, ribosomas, enzimas solubles, etc.

Este sobrenadante se .olvió a centrifugar durante 7 minutos a 1000 g para sedimentar los fragmentos decloroplastos. El sedimento se resuspendió en CINa Z%con ayuda de un algodón hidrófilo sujeto al extremo deuna varilla.

Se repitió la centrifugación durante 10 minutosa 1000 g. Completada ésta, se consideró que los cloro-plastos estaban suficientemente lavados.

- 65 -

Se tiró el sobrenadante y el sedimento se resuspendió en una soluci&n de CINa al 0,2% hipot&nica conrespecto a los cloroplastos, por lo que se rompen libe,rando los granos.

£1 volumen de CINa al 0,2% añadido, se calculóteniendo en cuenta el % de clorofila deseado y el vo-lumen necesario para la experiencia.

Los cloroplastos aislados se conservaron en bañode hielo en un recipiente forrado con papel de aluminiopara preservarlos de la luz.

£1 proceso seguido para el aislamiento de clore»,plastos se representa en la Fig. 6.

No se utilizó la solución tampón tris 0,2 M enel aislamiento de cloroplastos (como indican Arnon ycol., 1954), ni la solución de fosfatos 0,1 M en las cubetas de medida, por haberse determinado previamente -que no influían en la reducción del DPIP por los cloroplastos.

Antes de comenzar a trabajar con los cloroplas-tos recién aislados se calculó el contenido en cloro-fila de la suspensión.

2.3.2. Determinación del contenido en clorofila.

La determinación del contenido en clorofilas serealizó en la solución de cloroplastos y en hojas deplantas frescas.

De esta forma, se puede relacionar la actividadfotosintética de los cloroplastos, determinada por lareacción de Hill con la superficie foliar que ocuparían"in vivo" y, por tanto, comparar los resultados obtenidos por este método con los obtenidos para la asimila-ción del ^002.

- 66 -

50gr. DE HOJAS \

-TRITURACIÓN CON 100ml CINaAL 2V .

-FILTRACIÓN RECOGIENDO EL FILTRADOEN BAÑO OE HIELO

-CENTRIFUGACIÓN A 300? DURANTE2 MINUTOS

SEDIMENTO(SE DESECHA)

SOBRENADANTE

-CENTRIFUGACIÓN ADURANTE 7MINUTOS

SEDIMENTO

SEDI*

SOBRENADANTE1SE DESECHA)

-RESUSPENSION CINa, 2V.-CENTRIFUGACIÓN A 1000^

DURANTE 10 MINUTOS

ENTO}

:N>SOBRENADANTE

-RESUSPENSIOM CINa, 0,2'/.

CLOROPLASTOSI

FlG. 6ESQUEMA DEL PROCESO DE AISLAMIENTO DE FRAGMENTOS DECLOROPLASTOS EN HOJAS DE PLANTAS CULTIVADAS

- 67 -

2.3.2.1. Area foliar especifica.

El área foliar especifica de las hojas frescas,

se determinó de la siguiente manera: En un pliego de

papel miliaetrado se dibujó el contorno de una hoja cu

yo peso se determinó previaaente, y se recortó.

También se recortó un cuadrado de papel de super

ficie conocida ( 5 x 5 ca). Se pesaron los dos recortes,

se calculó la superficie de la hoja y, coao consecuen-

cia, se obtuvo la reíasí.ón superficie/peso fresco (área

foliar especifica).

2.3.2.2. Aaálisis de clorofilas.

La estiaación del contenido en clorofila por uní

dad de superficie de hoja se realizó de la siguiente aa

ñera:

Se pesaron 0,1 g de hojas frescas y se aaceraron

con 5 ce de acetona al 80% y 0,025 g de (X^Mg; se fil.

tro el macerado a través de papel Whatman N° 1 y se la

vó el papel de filtro con acetona al 80% hasta obtener

un volumen final de 25 mi, realizándose todo el proceso

en un baño de hielo.

La densidad óptica de las auestras se determinó

en un colorímetro a 645» 652 y 663 am frente a un blan

co de acetona al 80% .

El contenido en clorofila, expresado en ag/litro,

se calculó aplicando la ecuación de Arnon (1949):

Cl total (ag/1) =8,02 DO663 + 20,20 D06¿f5

La cantidad de clorofila por unidad de superfi-

cie foliar se deduce a partir del peso de la hoja, vala

men de solución, concentración de clorofila y la -

- 68 -

relación peso/ superficie determinada previa-mente .

2,3.2.3» En la suspensión de cloroplastos.

Se toman 0,1 ce de la suspensión salina de cloro,plastos, recién preparada, y se diluyen con 20 ce de acetona al 80 # . La suspensión, después de agitada, se flltra a través de papel Whatman N2 1.

SI filtrado se recoge en una cubeta de espectro,fotómetro y se determina su densidad óptica a 652 nm -frente a un blanco de acetona al 80% .

El contenido en clorofila, expresado en mg/cc dela suspensión original, viene dado al multiplicar la -densidad óptica medida por el factor 5,8 (Whatley y Arnon, 1963).

La concentración final de clorofila se ajustó a0,319 mg/cc para el trabajo experimental.

2.3.5.Condiciones de la reacción.

Se estudió el efecto de cinco concentraciones deCMÜ, comprendidas entre 1,46 x 10"** M y 1,46 x 10~8 Msobre los fragmentos de cloroplastos aislados de hojasde cebada, avena, trigo, maiz, judia y tomate.

A cada cubeta, según el tratamiento, se le aña-dieron los componentes que se detallan en la tabla VH.

Una vez preparadas las cubetas y medida la den-sidad óptica inicial, se colocaron en un baño transpa-rente termostatizado a 25°C y se introdujo una agujahasta el fondo de cada tubo, por la que se hizo borbo-tear nitrógeno con el doble fin de agitar la suspensióny mantener una atmósfera inerte.

TABLA VII.- Componentes añadidos a cada cubeta según tratamiento .

Suep.

cloroplastos

(ce)

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

Agua

(ce)

4

2

2

2

2

2

DPIP

0

0,25

0,25

0,25

0,25

0,25

Conc. CMU en la

solución madre

(M)

0

3,75 x 10~8

3,75 x 10~7

3,75 x 10°6

3,75 x 10~5

3,75 x 10"4

Sol.

CMU(ce)

0

1,75

1,75

1,75

1,75

1,75

Vol.

final

(ce)

4,5

4,5

4,5

4,5

4,5

4,5

Conc. CMU en el

volumen final

(M)

0

1,46 x 10~8

1,46 x 10"7

1,46 x 10"6

1,46 x 10~5

1,46 x l€Tk

- 70 -

El baño se iluminó lateralmente, por ambos cos-tados, mediante dos paneles de tres focos (Osram-Nitraphot R) de 500 W cada uno que permitieron, en conjunto,tener una iluminación de 75.000 luxes.

El baño está provisto de doble pared por la quecircula agua para evitar la transmisión del calor porparte de los focos a las cubetas. El conjunto del baño,disposición de las cubetas y sistema de iluminación serepresenta en la Fig. ?, .

Después de un periodo de iluminación variable ,se midió la densidad óptica del contenido de las cube-tas a %0 nm.

Para el .estudio de la cinética de reducción delDPIP se iluminó durante 0,5; 1; 1,5; 2; 3; 4 6 5 minu-tos, mientras que, para las distintas experiencias, sienpre se realizaron las lecturas después de un minuto deiluminación.

Con objeto de comprobar la reducción del DP IPindependientemente de la fotosíntesis, se repitió eltestigo forrando las cubetas con papel de aluminio, ytambién se repitió con cloroplastos hervidos.

Para cada tratamiento se hicieron sólo cinco repeticiones per la necesidad de efectuar las lecturasde la densidad óptica en el menor tiempo posible des-pués del periodo de iluminación.

Para evitar errores, las cubetas correspondien-tes a un mismo tratamiento no se leyeron consecutivansnte, y durante el tiempo que duró la lectura, las restantes cubetas se mantuvieron en la oscuridad.

- 71 -

FIG.7CONJUNTO DE BAÑO Y SISTEMA DE ILUMINACIÓN PARA ELESTUDIO DE LA ACTIVIDAD FOTOSINTETICA EN CLOROPLASTOSAISLADOS

2.,3'k* Obtención de los resultados.

Con objeto de calcular la correspondencia entrela densidad óptica leída y el DPIP reducido, se hizo unacurva de calibrado para cada planta, con la misma con-centración de clorofila, variando la concentraci&n delDPIP oxidado desde el valor inicial de 0,25 micromolesen k,5 ce hasta cero.

Con los datos experimentales obtenidos, se ajust& la ecuaci&n de la recta, trazando la linea de regre,si&n por el método de los mínimos cuadrados, para com-probar si estadísticamente todos los valores halladossatisfacían a la ley de Beer Lambert para las concen-traciones consideradas.

Se comprobó que el coeficiente de correlación -era muy próximo a la unidad y que se cumplía la citadaley, por lo que:

D.O. = K x C

siendo:

D.O. = Densidad óptica leída a 540 nm frente aun patrón de DPIP totalmente reducido yanálogo contenido en clorofila.

K = Pendiente de la recta.

C = Concentraci&n de DPIP oxidado en la muejs

tra.

La cantidad de DPIP oxidado en las cubetas vieneexpresada por la relación:

DODPIP oxidado = —a.

y la cantidad de DPIP que se ha reducido, en cada caso,se obtiene sustituyendo el incremento de DO en la expresi6n:

DPIP reducido = ^

La experiencia se repitió cinco veces para cadaconcentración y cada planta.

Por cada mol de DPIP reducido, en la reacción deHill, se desprenden 0,5 moles de oxigeno. De este modo,se pueden determinar los micromoles de oxigeno despreiididos en cada tubo de reacción durante el minuto que dura la eliminación.

Al conocer la correspondencia entre los 0,5 cede la suspensión de cloroplastos incorporados a la rea¿ción y los cm^ de hoja fresca a que corresponden, losresultados se pueden expresar como micromoles de oxige,no desprendido por hora y por cm de hoja fresca.

Z.k, ESTUDIO DEL EFECTO DEL CMP SOBSE LA FOTOSÍNTESIS .DEL ALGA CHLORELLA PYRENOIDOSA.

Se estudi6 el efecto inhibidor de nueve concen-traciones diferentes de CMÜ, comprendidas entre 10"^M y10 M, sobre la fotosíntesis del alga Chl. pyrenoido-sa.

2.íf. 1. Características del cultivo de Chl» pvrenoidosa.

Chl or ella es un alga, unicelular, clorofícea, in-«6vil, de tamaño comprendido entre 40 u y 10/i, que. encondiciones favorables, crece rápidamente y se reprodu,ce por división asexual en 2, kt 8 6 16 autoesporas, -proceso que puede controlarse tanto por condiciones internas como externas (Lorenzen, 1956, 1957; Kuhl y Lo-renzen, 1964).

La división puede producirse en la oscuridad, -siempre que la Chlorella haya incrementado su masa ce-lular en la luz.

Los parámetros fundamentales a considerar paraun cultivo correcto de este alga son:

a - Medio liquido con una composición y concen-tración adecuadas de nutrientes minerales.

b - Cantidad suficiente de anhídrido carbónico.

c - Energía luminosa suficiente en la zona delespectro visible para asegurar el crecimiento autótrofo del cultivo.

d - Temperatura adecuada.

e - Agitación continua para asegurar la exposi-ción en 3a luz de todas las células de cultivoy evitar, de este modo, su sedimentación.

- 75 -

En un cultivo con iluminación constante, la ci-nética de crecimiento obedecerla a una sigmoidea conuna primera fase de crecimiento exponencial, una segúnda de crecimiento lineal y una tercera, asintótica, enla que el crecimiento del número de células con respec,to al tiempo, tiende a cero.

Las características, tanto fisiológicas como bioquímicas de las Chlorellas, varían enormemente durantelas diferentes fases de crecimiento, por lo que resultade extrema importancia controlar todas las condicionespara conseguir resultados experimentales reproducíalesen el laboratorio.

2.4.2. Método de cultivo utilizado.

Se partió de un cultivo de Chl. pyrenoidosa proporcionado por el Dr, Rodríguez López (Instituto MarañónC.S.I.C.) que se conservó en tubos de agar inclinado,con un medio nutritivo cuya composición ha sido elabo-rada por el mismo Dr. Rodriguez López.

La preparación del medio de cultivo se realiza apartir de una solución stock de macronutrientes y micronutrientes, cuya composición se detalla en la tafcfla VIII.

Las soluciones stock, preparadas independiente-

8,

30».mente, se esterilizaron en autoclave a 120°C durante

El medio de cultivo se preparaba inmediatamenteantes de su utilización, mezclando, asépticamente, encámara de flujo laminar los volúmenes necesarios de las

respectivas soluciones stock en las siguientes propor

clones:

- 76 -

TABLA VIII.- Composición de las soluciones stockdel Dr. Rodriguez López para elcultivo del alga Chlorella.

i1

?RIE

NTE

SM

ICRO

NÜG

Soluciones

stock

A

B

C

D

E

F

Composición

NC3K

NagHPO^. 2H20

NaHaPOif. IH2O

Mg SO^ . 7H20

Ca Cl2 . 2H20

EDTA

Fe SQk . ?H20

KOH 1 N

SO^Mn . 1H20

SO^Zn . 7H2O

CuSO^ . 5H20

H.BOj

(N^f)Mo7O2íf.4H2O

Conc entrac i ón

10,111 g/1

8,111 g/1

0,690 g/1

24,65 g/1

1,47 g/1

26 g/1

25,3 g/1

2,31 g/1

170 mg/1

290 mg/1

2,5 ng/1

610 mg/1

125 mg/1

- 77 -

Sol. A 100 ceSol. B 10 ceSol. C 10 ceSol. D 1 ceSol. F 1 ce

H20 destilada, c.s.p. 1000 ce

pH del medio: 7,5 .

Para preparar la sol. D, se añadieron 0,385 g desulfato ferroso anhidro y 0,93 g de EDTA Merck a 80 cede agua destilada. Se calentb a ebullici&n hasta diso-lución completa. Una vez frió, se completó con agua des.tilada hasta 100 ce. 1 ce de esta soluci&n contiene lacantidad indicada de Fe disuelto.

Para los cultivos stock en agar inclinado, ae utilizó el mismo medio nutritivo al que se añadió el 1 Sí deagar para solidificarlo, el 1 % de glucosa y el 0,1% depeptona, con el fin de observar posibles contaminacio-nes bacterianas. Los tubos se conservaron a. 20°C some-tidos a un ciclo de 1¿t horas de luz y 10 de oscuridad,siendo la luz artificial suministrada por tubos Gro-luxde Sylvania, efectuándose la resiembra cada ocho sema-nas.

A partir de los cultivos sólidos, se prepararonprecultivos líquidos en matraces Erlenmeyer de 250 ce,convenientemente aireados, que contenían 200 ce de so-lución nutritiva. Los precultivos líquidos se mantuvieron a 25°C y se sometieron al mismo ciclo de luz-oscutldad de \k/\0 horas para conseguir que la divisi&n celular quedara restringida a un corto periodo de tiempo ,con lo que se sincroniza el cultivo y se consigue que,en cada momento sea lo más homogéneo posible, estimán-dose que, al principio de la fase luminosa, por lo -

- 78 -

menos el 98% de las células contadas en la primera hora de la fase oscura participan en el proceso de divi-sión y se encuentran en la misma fase de su ciclo vital(Kuhl y Lorenzen, 1964).

Al cabo de 48 horas, los cultivos han crecido 3osuficiente como para poder ser distribuidos homogénea yasépticamente a cada uno de los tubos de una batería enlos que se continúa el cultivo. La característica y dis,posición de los tubos de cultivo se pueden apreciar enla Fig. 8.

£1 inoculo inicial consistía en 10 ce del precujtivo que se añadían asépticamente a los tubos de cultivoque contenían 400 ce de medio estéril. Periódicamente ,se extraían 350 ce del cultivo y se reemplazaban por medio estéril con objeto de mantener a las células en lafase exponencial de crecimiento.

£1 control del crecimiento del cultivo se efec-tuaba diariamente por recuento del número de células/ce y densitornetria a 475 nm. Siendo el n2 standard decélulas en la última hora de la fase oscura de aproxi-madamente 0,5 x 10 /ce y su D.O.: 0,075.

Los tubos de cultivo eran renovados y resembra-dos a partir de un precultivo nuevo cada cuatro semanas.

2.4.3. Normalización del contenido clorofílico de loscultivos para las determinaciones fotosintéticas.

Con objeto de que todas las experiencias de fotosíntesis se realizaran en cultivos con el mismo contenído en clorofila, se media la concentración de ésta enel cultivo y se ajustaba por dilución con medio esté-ril, hasta que el contenido fuera de 20 ag/1.

- 79 -

IT

\ y

A-COMPRESOR

B - FRASCO LAVADOR VACIO PARA RECOGERPOSIBLES RETORNOS DE SO4H2

C- FRASCO LAVADOR COM 5 0 ^ 2 CONCENTRADOO-FILTRO MILLIPORE ESTÉRILE-LINEA DISTRIBUIDORA DE AIREF-ILUMINACIÓNa-LLAVEb-FILTRO MILLIPORE.C-TUBO AIREADOR

d-SALIDA OE AIRE CON FILTRO MILLIPOREe-ENTRADA PARA DILUIR EL CULTIVOf - LLAVE DE SALIDA DEL CULTIVO

FIG. 8DISPOSITIVO PARA EL CULTIVO SÍNCRONO DE CHLORELLAPYRENOIOOSA

- 80 -

La determinaci&n del contenido en clorofila en elcultivo inicial se realizaba de la siguiente manera:

Se toman 2 ce de la suspensi&n original de Chlo-rellas y se centrifugan durante 15' a 3000 r.p.m. Elprecipitado se resuspende en 3 ce de metanol hirviente.Se centrifuga de nuevo durante 5' a 3000 r.p.m. y el sobrenadante se pasa a un matraz aforado de 10 ce de capacidad. £1 precipitado se resuspende en otros 5 ce de metanol hirviente y se centrifuga de nuevo durante otroscinco minutos. El sobrenadante se añade al anterior y ssenrasa hasta 10 ce con metanol.

Se mide la densidad óptica en un fotoeolorimetroa 65O nm y 665 nm respectivamente, utilizando metanolcomo blanco.

La concentraci&n en clorofila total se calcula ap£.cando la siguiente ecuaci&n:

Cl total = kO x D.0.665 + 25f5 x D.O.65O

2.4.if. Utilización del electrodo de oxigeno en la deter-minación de la actividad fotosintética de unasuspensión de Chlorella pyrenoldosa.

La actividad fotosintética del alga Chlorella -pyrenoldosa y el efecto inhibidor de diferentes concen-traciones de CMÜ sobre la «isaa, se determinó con unelectrodo de oxigeno tipo Clarke.

Z.k.h.1. Fundamento del electrodo de oxigeno.

El método polarográfico de determinaci&n de laconcentraci&n de oxigeno en una soluci&n se basa en medir la corriente que pasa a través de un sistema de

- 81 -

electrodos inmersos en una solución en funci&n del voltaje aplicado, dependiendo esta magnitud de la concen-tración de los solutos, una descripción del fundamentodel método polarográfico es la realizada por Arditti yDunn (1969).

£1 electrodo utilizado en nuestro estudio fue elY5I Modelo 53 > tipo Clarke, que consiste en un cátodode Pt 7 un ánodo de Ag inmersos en una solución saturada de C1K para el que magnitudes comprendidas entre 0,5V y 0,8 V son proporcionales al contenido de oxigeno enla solución.

Al aplicar al electrodo de Pt un voltaje polarizante de -0,6 7, el electrodo de Ag reacciona con losiones Cl~ para formar ClAg, liberándose electrones enel proceso.

Estos electrones pueden utilizarse por el elec-trodo de Pt para reducir al 02. £1 proceso genera unacorriente que es funci&n lineal de la presión de 0 2 enla solución que baña los electrodos. Un circuito eléc-trico (Fig. 9) amplifica esta corriente para que puedaleerse o registrarse.

Las reacciones que tienen lugar en los electro-dos son las siguientes:

Electrodo de Ag:

ifAg + 4C1" — ifClAg + 4e~

Electrodo de Pt:

2H+ + Ze" + O2 — H202

H202+ 2H+ + 2e" — 2H20

En total:Wg + 4C1" + kB* + 02 —

2H20

- 82 -

I-=-1.5V

I

PLATA PLATINO

1

•AAArR2

SAL1OA AL REGISTRO

(Imv)

R1 = RESISTENCIA

R2-RESISTENCIA

V» VOLTÍMETRO

F1GJ9CIRCUITO ELÉCTRICO DEL ELECTRODO OE OXIGENO(AROITTI Y OUNN 1.969)

- 83 -

El voltaje de polarizaclbn utilizado es de -O,6Va -0,75 V y se mantiene por un reostato variable.

£1 electrodo (Fig. 10) está cubierto por una delgada membrana de teflbn de 0,25 mm de espesor, permea-ble a los gases, que lo aisla eléctrica y químicamentede la soluci&n. £1 oxigeno que difunde a través de lamembrana despolariza el cátodo y peralte que circule lacorriente. Este oxigeno se consume rápidamente, perma-neciendo la presibn del mismo dentro de la membrana -prácticamente a cero, por lo que la difusi&n de estegas a través de la membrana es proporcional a la pre-sión diferencial a ambos lados de la misma y 3a relaci&nexistente entre la corriente y la cantidad de oxigenoes estequiométrica, estableciéndose una relación linealentre la presibn externa de oxigeno y la corriente delelectrodo que es, a su vez, proporcional a la cantidadde oxigeno que alcanza el electrodo y tiene la misma -tension de oxigeno que el liquido del que procede.

Z.Ur.k.2.. Descripción del Equipo.

El equipo (Fig. M), consta de un amplificadorelectr&nico que proporciona el voltaje de polarizaci&nconstante para los cuatro electrodos de oxigeno que pueden seleccionarse independientemente, y puede operar para una escala completa de oxigeno a 760 mm de Hg y parauna escala completa de aire a la presibn atmosférica.

A T§ constante, comprendida entre 20°C y íj.O°C ,el tiempo de respuesta del electrodo es de unos 10 se-gundos para el 90% de la escala total.

Los electrodos se introducen en unas cubetas dereacci&n provistas de un agitador magnético situado enel fondo que asegura la uniformidad de la temperaturay la homogeneidad de la suspension. Una vez alcanzado

CATOOO

ÁNODO,

ORIFICIO PARA LLENAREL ELECTRODO

ELECTROLITO

ÁNODO DE PLATA

MEMBRANA

ANILLO DE GOMA

CÁTODO DE PLATINO

F1G.10ELECTRODO DE OXIGENO TIPO CLARKE

- 8 5 -

lilü Ü0 F

* E

G

•

A-REGISTRO

B-AMPLIFICAOORC-ELECTRODOSD- 8AÑ0 TERMOSTATICO

E-AGITADOR MAGNÉTICOF- VARILLA MAGNÉTICAG-TERMOSTATO DE CIRCULACIÓN

FIG. 11ESQUEMA OEL EQUIPO COMPLETO

- 86 -

el equilibrio, se encaja el conjunto de electrodo-portaelectrodo en la cubeta de reacción y se eliminan completamente las burbujas de aire por la ranura lateral delportaelectrodo.

£1 sistema se ilumina con cuatro lámparas Nitra.phot, Osram de 500 W cada una, situadas dos a cada la-do del conjunto formado por el sistema del agitador-baño y separados del mismo por dos paneles de agua circulante que evita las radiaciones caloríficas de los fo-cos.

Una perspectiva del equipo completo se puede -apreciar en la Fig. 12,

2.if.if.3. Calibrado del eauipo.

£1 calibrado se realizó determinando la lecturade la escala del electrodo de una muestra de agua saturada de aire a una determinada temperatura cuyo conte-nido de oxigeno disuelto es conocido.

La valoración del oxigeno disuelto en el aguasaturada de aire para las diferentes temperaturas serealizó por el método iodometrico de Winkler (1965).

£1 método de Winkler se basa en la oxidación delhidroxido manganeso a manganico en solución fuertementealcalina. Por acidificación, y en presencia de ioduros,el hidróxido manganico se disuelve y se libera I¿ enuna cantidad equivalente al oxigeno originalmente d i -suelto. El I 2 libre se valora con una solución patrónde tiosulfato sódico, añadiendo almidón como indicadorhacia el final de la valoración.

1 ce de tiosulfato s'odico equivale a 1 mg/litrode oxigeno disuelto, cuando se ha partido de 200 ce demuestra original.

-87-

EQUIPO COMPLETO DEL ELECTROOO OE OXIGENO

El procedimiento a seguir en la valoraci&n es elsiguiente: Se saturan 200 ce de una soluci&n tamp&n deC02HNa/C0,Na2 0,1 M (85:15) con aire, por medio de unaireador durante 30 minutos a las temperaturas de 10°C,15°C, 20°C y 25°C respectivamente y se valoran por elmétodo anteriormente citado. Los valores experimentalesobtenidos figuran en la tabla IX.

Se seleccion& como temperatura de trabajo la de25 C porque fue la que proporcion& la mejor respuestafotosintética de las Chlorellas. A esta temperatura y760 mm Hg, la soluci&n tamp&n de C0^ESa./C0^a2, 0,1 M -(85:15) contiene 8,4 ftg/cc de oxigeno disuelto.

La escala del electrodo se ajusta al 100#con 3ce de la soluci&n tamp&n en las condiciones indicadas .Una divisi&n de la escala corresponderá, por tanto, a0,084 jug/cc de 0 2 disuelto a una presi&n de 760 mm Hgy

La presi&n atmosférica en nuestro laboratorio -era de 710 mm Hg por lo que, corrigiendo los datos ob-tenidos para las condiciones ambientales según la f&rmula:

S f = S p T

S1 = Solubilidad del oxigeno a 760 mm.S s Solubilidad del oxigeno a la presi&n de

trabajo.

P* s Presi&n a 760 mm/Hg.

P s Presi&n en las condiciones de trabajo.

se obtiene que una divisi&n de la escala del electrodo corresponde a 0,0784 MS/cc de oxigeno disuelto enla soluci&n tamp&n.

- 89 -

TABLA IX.- Solubilidad del oxigeno en el agua saturadade aire y en sol. tamp&n de0,1 M (85:15).

°c

10

15

20

25

Oxigeno disuelto

en el agua

mg/1 a 760 mm Eg(Resultados teóricos*}

11,3

10,2

9,2

Oxigeno disuelto

en solución tampon

mg/1 a 760 mm Hg(Resultados experimentales)

12

9,8

8,7

*(Standard Methods for the examination of Waterand Waste Water, 1973).

- 90 -

2.A-.4.4. Medida del desprendimiento de oxigeno en ana

suspensifen de alga Chlorella pyrenoidosa.

Se tomb una cantidad suficiente de suspensi6n de

Chlorella pyrenoidosa de la que se ellain6 el medio de

cultivo original por centrifugación a 3000 r.p.a. duran,

te 15 minutos. Las algas se resuspendieron con ayuda de

una torunda de algodón en un volumen calculado de solu

ci&n tamp&n de C0^HNa/C0^Na2 0,1 M (85:15) para que el

contenido en clorofila total correspondiera a 2.0 /ug/cc.

La suspension se conservb hasta media hora antes

de comenzar la experiencia en un Erlenmeyer forrado de

papel de aluminio en baño de hielo.

La temperatura optima de respuesta fotosintéti-

ca del alga Chlorella, fue de 25°C.

£1 procedimiento seguido en cada una de las de-

terminaciones fue el siguiente:

1) Se colocan 3 ce de soluci&n tamp&n de CO,HNa/

C0,Na2 0,1 M (85:15), saturada de aire a 25°C en la cu

beta de reacci&n; se conecta el agitador, se introduce

el electrodo y, una vez equilibrada la temperatura, se

eliminan las burbujas de aire por la ranura lateral del

portaelectrodo. En estas condiciones se ajusta la esca

la y el registro a 0 y 100.

2) Se retira el electrodo y se vacia completasen

te la cubeta con ayuda de una pipeta Pasteur conectada

a una trompa de vacio.

3) Se colocan en la cubeta 2 ce de suspension de

Chlorellas y 1 ce de agua o de la soluci&n cuyo conte-

nido en CMU se quiera estudiar.

k) Se introduce el electrodo, se conecta el agítador y se forra el conjunto del baño, cubeta y

electrodo con un papel negro hasta que se estabilicela temperatura.

5) Se elimina completamente el exceso de aire -por la ranura lateral del portaelectrodo.

6) Se inyecta 0¿ b N2, dependiendo del conteni-do en O-, inicial existente en la muestra a valorar, hasta conseguir que la aguja indicadora marque el 50% dela escala, operación que se realiza por medio de una jeringa provista de una aguja hipodérmica suficientementelarga.

7) Se somete el cultivo a 6 periodos alternati-vos de luz y oscuridad de 5 minutos cada uno durante -los cuales la variación del contenido en 0¿ de la sus-pensibn de algas se registra gráficamente.

Un control de la experiencia se realiza siguiendo la misma técnica pero utilizando 2 ce de cultivo deChiorellas previamente hervidas.

£1 valor del desprendimiento o de la absorciónde 0 2 por las células, se obtiene a partir del valor me,dio de las pendientes correspondientes a las gráficasregistradas en los tres periodos de luz y oscuridad res,pectivamente, y este valor se refiere a su vez a 3a unidad de clorofila y de tiempo, teniendo en cuenta quecada unidad de la escala representa 0,0734 us de Op di.sueltos en 1 ce de suspensión.

¿.5. ESTUDIO DEL EFECTO DE LOS EXTRACTOS DE HOJAS DEPLANTAS TBATADAS CON CMU SOBfiE LA ACTIVIDAD FO-TOSINTETICA DE CHLÓRELLA PYEENOIDOSA.

Con objeto de determinar la concentración que alcanza el CMÜ en hojas de plantas tratadas, se utilizacomo bioensayo el efecto que produce un extracto acuosoobtenido a partir de estas hojas, sobre la A.F. (des-prendimiento de 0 2 a la luz) de una suspensi&n de Chlorelia pyrenoidosa.

2.5.1. Preparación del extracto de hojas.

Para realizar los extractos de las hojas de plantas testigo y de las sometidas al tratamiento con CMUse procedió de la siguiente «añera:

1) Se pesan 2,5 g de hojas de la especie a ensayar y se trituran en un mortero con 1/3 de su peso dearena para desgarrar los tejidos y cantidad suficientede agua para conseguir, en total, 25 ce de extracto.

2) Se centrifuga durante 10 minutos a 3000 rpay se filtra la solución a través de papel de filtro -Whatman n2 1 y de Millipore de kO u , recogiendo el ex-tracto en condiciones estériles en un aatraz forrado -con papel de aluainio, que se conserva en baño de hielohasta «edia hora antes de comenzar la experiencia.

2,5*2. Ensayo del efecto del extracto.

Media hora antes de coaenzar la experiencia secoloca el aatraz a 25°C (temperatura a la que se va aefectuar 1« reacción} y, al cabo de este tieapo, se ag¿ta para hoaogeneizar y se toaa 1 ce de extracta de hoja

que se deposita en la cubeta de reacción del electrodo,la cual contiene 2 ce de suspensión de algas en el taa-pón adecuado y se procede según se indica en ¿.k.k.k.

2.5.3. Curvas de calibrado.

Se obtienen extractos de hojas de las plantas sintratar de cada una de las especies a ensayar. Se preparauna serie de cubetas de reacción con 1 ce de extracto y2 ce de suspensión de Chlorella a las que se añade CMUen concentraciones variables comprendidas entre 10-10 My \0Tk M.

Los resultados de desprendiaiento de oxigeno porunidad de tieapo, en cada una de las suspensiones, se re-fieren a la cubeta testigo que tenia 1 ce de extracto dela aisaa planta pero no contenia CMU, y se expresan en %.

Con los valores obtenidos (referidos al testigo)en función de las concentraciones de CMU, se obtienenlas curvas de regresión, las cuales servirán para obte-ner la concentración de CMU existente en un extracto probleaa que produzca un determinado nivel de inhibiciónde desprendiaiento de oxigeno con respecto al testigo.

2.5.k. Determinación de la concentración de CMU en la hola.

Una vez conocida la concentración de CMU en lacubeta de reacción del electrodo de oxigeno (utilizandolos datos de la curva de calibrado), se calcula la con-centración de CMU en la hoja, teniendo en cuenta: el pesofresco de la hoja de partida, el contenido acuoso de éstay el voluaen final de la dilución del extracto (25 mi).En los casos en que el extracto resulta demasiado con-centrado, se tona una cantidad alicuota aenor de 1 ce,que se tiene en cuenta en los cálculos de la concentra-ción final.

3. RESULTADOS

- 95 -

3.1. EFECTO DEL CMU SOBRE EL DESARROLLO DE PLANTASCULTIVADAS.

3.1.1. Absorción continua de CMU.

Los resultados del efecto de la absorción conti-nua de diversas concentraciones de CMU en solución nu-tritiva, por vía radicular, sobre el desarrollo de lasplantas de cebada, avena, trigo, maíz, judia y tomate -durante cuatro semanas, se expresan en las tablas X (ce,bada), XII (avena), XIV (trigo), XVI (maiz), XVIII (ju-dia) y XX (tomate).

Los valores, que son media de cuatro repeticiones,indican el número de hojas al final de la 1§, 28, 3§ y¿t§ semana de tratamiento, asi como los dias transcurri-dos desde el comienzo del mismo hasta la aparición desíntomas de marchitamiento y hasta la expresión clara deletalidad en los casos en que ésta se observaba.

3.1.2. Absorción durante una semana.

El efecto del CMU administrado durante una solasemana sobre plantas que se mantuvieron posteriormenteen solución nutritiva durante tres semanas más, se ex-presa en las tablas XI (cebada), XIII (avena), XV (trigo), XVII (maiz), XIX (judia) y XXI (tomate).

Las cifras de las tablas indican, al igual queen el apartado 3.1.1» el número de hojas que iban apare,ciendo al final de cada semana y los dias que transcu-rrían desde el comienzo del tratamiento hasta la apari-ción de síntomas de marchitamiento.

TABLA X.- Efecto del CMU sobre la aparición de hojas y síntomas de marchitamiento enplántulas de cebada a lo largo de cuatro semanas. Las plántulas estuvieronen solución nutritiva con diversas concentraciones de CMU durante todo eltiempo que dur6 la experiencia. Los valores son media de cuatro repeticio-nesTx: media; c.v.; coeficiente de variabilidad).Edad inicial de las plántulas: \k días.

Concentraciónde CMU en Ja

solución(M)

010-12

10-nio-i°10-9lo"»lo"?10"6

10-5

Numero de hojas al final de la:

Semanala

X

2222222222

c.v.

oooooooooo

Semana23

X

655,56,256663,75

c.v.

0,1660.1620.1050,0800.1360,1360,1920,133

Semana3S

X

11,599,25911108

c.v.

0,112

0,0900,0540,0900,0140,0810,102

Semana49

X

1914,513,514,752012,510,5

c.v.

0,1350,1430,0950,1150,1080,0890,122

Aparición desíntomas demarchita—

miento

Olastranscurridosdesde elcomienzo deltratamiento

25159731

Expresiónde la

letalidad

Díastranscurridosdesde elcomienzo deltratamiento

181483

TABLA XI.- Efecto del CMO sobre la aparición de hojas y síntomas de marchitamiento enplántulas de cebada a lo largo de cuatro semanas. Las plántulas estuvieron

l i ó titi di t i de CMÜ d u r t la priap l á n l d g pen solución nutritiva con diversas concentraciones de CMÜ durante la prima-

solamente y las tres restantes en solución nutritiva sin CMDTToson media de cuatro repeticiones (x: i i t ddd ;son me

variabilidad;.Edad inicial de las plántulas; IJL días.

ciones de CMÜ durante lasolución nutritiva sin Cmedia; c.v.: coeficiente de

Concentraciónde CMO en 3asolución

(M)

Número de hojas al final de la:

Semanala

c.v.

Semana

c.v.

Semana

c.v.

Semana4a

c.v.

Aparición desíntomas demarchita-alento

transcurridos transcurridosDíasnscur:desde elcomienzo deltratamiento

Expresiónde la

letalidad

Díasiscurr

desde elcomienzo deltratamiento i

1010

r'2rii

io-1 0

10-9lo"8

lo"?lo"6

10-5

2222222222

OOOooooooo

665,25555,7554,75

0,1360,1360,0950,1630,1630,1660,1630,201

11,7511,75888,25

11,7586,75

O,0,1450,1020,1020,1160,145OtW20,141

191718,51916,7519,7512,758,25

0,1350,0480,0690,1350,1020,0860,1340,116

28181531

241883

TABLA XII.- Efecto del CMO sobre la aparición de hojas y síntomas de marchitamiento enplántulas de avena a lo largo de cuatro semanas. Las plántulas estuvieronen solución nutritiva con diversas concentraciones de CMU durante todo eltiempo que durb la experiencia. Los valores son media de cuatro repetidones (x: media; c.v.: coeficiente de variabilidad). ~Edad inicial de las plántulas: \k días.

Concentraciónde CMU en la

soluci&n(M)

0io-12

lo"11

io-10

10-9io-8

10-710-610-5icr*

Número de hojas a l f inal de la :

Semana19

X

2222222222

c.v.

oooooooooo

Semana23

X

3,753,53,53,253,53,253

c.v.

0,2550,16íf0,16k0,1530,1 Sk0,1530,272

Semana33

X

5,55,55,255,255,25"?^

5

c.v.

0,102f0,1 Ok

0,0950,0950,0950,1030,163

Semana

X

8,58,58,2586,7565

c.v.

0,0670,0670,1160,1020,11*10,1360,163

Aparición desíntomas de

marchita-mientoDías

transcurridosdesde e l

comienzo deltratamiento

28251713106

Expresiónde la

letal idad

Díastranscurridos

desde e lcomienzo del

tratamiento

2817\k9

Co

TABLA XIII.- Efecto del CMÜ sobre la aparicl6n de hojas y síntomas de marchitamiento enplántulas de avena a lo largo de cuatro semanas. Las plántulas estuvieron ensolución nutritiva con diversas concentraciones de CMU durante la primarasepana solamente y las tres restantes en solución nutritiva sin CMU.Losval ore 8 son media de cuatro repeticiones (x: media; c.v.: coef, variabilidad)Edad Inicial de las plántulas; 14 días.


solución(M)

0i o - 1 2

l o - 1 1

i o - 1 0

10-9i o - 8

10-7i o - 6

10-510-*


Semana19

X

2222222222

c.v.

oooooooooo

Semana29

X

3,753,53,53,53,753,53,253

c.v.

0,2550,1640,1640,1640,2550,1 640,1530,272

Semana3§

X

5,55,55,255,255,55,2554

c.v.

0,1040,1040,0950,0950,1040,1660,1630,204

Semana49

X

8,58,58.58,258,25865,25

c.v.

0,0670,0670,8070,1160,1160,1020,1360,095

Aparición desíntoma8 de


transcurridosdesde el


272018106

Expresiónde la

letalidad

Díastranscurridos

desde e lcomienzo del

tratamiento

149

ISO

TABLA XIV.- Efecto del CMU sobre la aparlci&n de hojas y síntomas de marchitamiento enplántulas de trigo a lo largo de cuatro semanas. Las plántulas estuvieronen solución nutritiva con diversas concentraciones de CMU durante todo el

o que dur6 la experiencia. Los valores son media de cuatro repeticio-nes lx: media; c.v.: coeficiente de variabilidad).Edad inicial de las plántulas: 1 if días.


solucibn(M)

0io-12

io -"io-10

10-9io-8

10-7i o - 6

10-5

Número de hojas a l final de la :

Semanaia

X

2222222222

c.v.

oooooooooo

Semana2&

X

kif

if

3,753,753,753,5

«a»

C.V.

0,20if0,20if0,20if0,2550,2550,2550,16if

Semana3S

X

6666,2565,75

c.v.

0,13é0,1360,1360,0800,1360,166

Semana¿is

X

8,258,2588,57,757,25

c.v.

0,1160,1160,1020,0670,1230,132

A parlei6n desíntomas demarchita-miento

Díastranscurridos

desde elcomienzo deltratamiento

2518121053

Expresiónde la

letalidad

Díastranscurridos

desde e lcomienzo deltratamiento

2118128

8i

TABLA XV.- Efecto del CMÜ sobre la aparición de hojas y síntomas de marchitamiento enplántulas de trigo a lo largo de cuatro semanas. Las plántulas estuvieron ensolución nutritiva con diversas concentraciones de CMD durante 3a primera se-mana solamente y las tres restantes en solución nutritiva sin CMU. i.os Trataresson media de cuatro repeticiones (x: media; c.v.: coeficiente de variabilidad).Edad inicial de las plántulas: 14 días.

Concentraciónde CMÜ en 3a

solución(M)

0io-1 2

lo"11

io- 1 0

10-9lo"»10-7io-6

10-5io-*


Semana

X

2222222222

c.v.

oooooooooo

Semana29

X

k4,754,54,54,5443.75

c.v.

0,2040,2010,1280,1280,1280,2040,2040,133

Semana39

X

666,256,256,7565.5

am

C.V.

0,1360,1360,0800,0800,1410,1360,104

Semana4»

X

8,258,2588,258,57,75

c.v.

0,1160,1160,1020,1160,0670,123

Aparición desíntomas demarchita-mientoDías



282021\854

Expresiónde la

letalidad

Olas;ranscurridO£desde e l


28\28

I

o

I

TABLA XVI.- Efecto del CMU sobre la aparición de hojas y síntomas de marchitamiento enplántulas de maíz a lo largo de cuatro semanas. Las plántulas estuvieron ensolucl&n nutritiva con diversas concentraciones de CMU durante todo el tiem-po que durb la experiencia. Los valores son media de cuatro repeticiones(7: media; c.v.: coeficiente de variabilidad).Edad Inicial de las plántulas: 21 días.


solución(M)

0io-12

i o - n

io-10

10-9io-8

10-7io-6

10-5

Número de hojas a l f inal de l a :

Semanaia

"x

if

4if

if

if

if

if

if

if

if

c.v.

OOOOOOOOOO

Semana

X

6,25666,2565,755,75

c.v.

0,0800,1360,1360,0800,1360,1660,166

Semana39

X

8,25888,256,756,56,25

c.v.

0,1160,1020,1020,1160,1lf10,0880,080

SemanaifS

X

8,58,258,258,576,56,5

c.v.

0,0670,1160,1160,0670,1160,0880,088

Aparición desíntomas demarchita-

miento

Díastranscurridos


¿721171171

Expresiónde la

letalidad

Díastrans currüos


2818113

oro

TABLA XVII.- Efecto del CMlí sobre la aparición de hojas y síntomas de marchitamiento enplántulas de maíz a lo largo de cuatro sananas. Las plántulas estuvieron ensolucibn nutritiva con diversas concentraciones de CMO durante la priaeraseaana solamente y las tres restantes en solución nutritiva sin CMU. Los va.lores son media de cuatrorepeticiones (x: media; c.v.: coef. de variabilidad).Edad inicial de las plántulas: 21 días.


solución(M)

0io- 1 2

lo"11

io- 1 0

10-910'8

10-710"6

10-510"*


Semanala

X

kkkkhkkkkk

c.v.

oooooooooo

Semana23

X

6,25666,256,25665,75

c.v.

0,0800,1360,1360,0800,0800,1360,1360,166

Semana

X

8,25888,258876,25

c.v.

0,1160,1020,1020,1160,1020,1020,1160,080

Seaanai*a

8,58,258,258^8,5876,5

c.v.

0,0670,1160,1160,0670,0670,1020,1160,088

Aparición desintoma8 de

marchita-miento

Díastranscurridos


¿721\k71

Expresiónde la

letalidad

Díastranscurridos


me

26113

TABLAXVni.- Efecto del CMU sobre la aparición de hojas y síntomas de Marchitamiento enplántulas de ludia a lo largo de cuatro semanas. Las plántulas estuvieron

l i ó nutriti di t i d CMU dp g pen solución nutritiva con diversas concentraciones de CMU durante todo eltiempo que duró la experiencia. Los valores son media de cuatro repeticio-nes (x: media; c.v.: coeficiente de variabilidad).Edad inicial de las plántulas: 28 días.

Concentración

de CMU en la

solución

(M)

0l o " 1 2

ID"11

l o " 1 0

10-9lo" 8

10-710"6

10-5

Número de hojas a l f inal de l a :

Semana19

X

6666666666

c.v.

9bb0000000

Semana23

x"

9,59.59.259.59,25998,75

c.v.

0,0600,0600,0540,0600,0540,0900,0900,109

Semana38

x"

19,519,519201918,7518,512,75

c.v.

0,0290,0290,1350,1080,1350,0510,0690,134

Semana49

X

24,524,524.2524,252424

c.v.

0,0230,0230,0200,0200,0340,034

Aparición desíntomas de




28252113831

Expresiónde l a

le ta l idad

Díastranscurridos

desde e lcomienzo dsl

tratamiento

ZZ

116

4

TABLA XIX.- Efecto del CMU sobre la aparición de hojas y síntomas de marchitamiento enplántulas de ludia a lo largo de cuatro semanas. Las plántulas estuvieronen solución nutritiva con diversas concentraciones de CMU durante la prime-ra semana solamente y las tres restantes en solución nutritiva sin CMO. Losvaxores son media de cuatro repeticiones (x: media; c.v.:coef.variabilidad)Edad inicial de las plántulas: 28 días.

Concentraciónde CMÜ en Da

solución(M)

0

10-1110-1010-910~8

10-710-610-5

io-*


Semana1§

X

6666666666

c.v.

oo

oo

o

oo

oo

o

Semana2§

X

9,59,59,259,59,259,2599

c.v.

0,0600,0600,0540,0600,0540,0540,0900,090

Semana33

X

19,519,51919191918,7512,75

c.v.

0,0290,0290,1350,1350,1350,1350,0510,134

Semana

X

24,523,324,522,7523,524,2522,2515

c.v.

0,0230,0230,0230,0230,0230,0200,0200,054

Aparición desíntomas demarchita-

miento

Díastranscurridosdesde e lcomienzo <ÜL

tratamiento

282521831

Expresiónde la

letalidad

Díastranscurridos


221364

oVJ1

TABLA XX.- Efecto del CMU sobre la aparici&n de hojas y síntomas de marchitamiento enplántulas de tomate a lo largo de cuatro semanas. Las plántulas estuvieron ensolución nutritiva con diversas concentraciones de CMU durante todo el tiempo

?ue dur& la experiencia. Los valores son medias de cuatro repeticionesx: media; c.v.: coeficiente de variabilidad)Edad Inicial de las plántulas; 42 días.

Concentraciónde CMU en l a

soluci&n(M)

0lo"1 2

lo"11

io-1 0

10-9io-8

io-710"6

10-5

Número de hojas al f inal de l a :

Semana19

X

12121212121212121212

c.v.

oooooooooo

Semana29

X

40,539,540,7540,253836,530

c.v.

0,0140,0320,0230,0120,0370,0350,027

Semana3«

X

63,56465,563,56055,550,5

c.v.

0,0300,0670,0190,0200,0130,0340,049

Semana4«

X

6868,563,2568,25686052,75

mm

C.V.

0,0120,0180,0140,0140,0120,0130,028

Aparici&n desíntomas demarchita-miento

filastranscurridos


282111411

Expresiónde la

letalidad

Díastranscurridos


21842

I

o

TABLA XXI.- Efecto del CMU sobre la aparición de hojas y síntomas de marchitamiento enplántulas de tonate a lo largo de cuatro semanas. Las plántulas estuvieron ensoluci&n nutritiva con diversas concentraciones de CMU durante la primerasemana solamente y las tres restantes en soluci&n nutritiva sin CMU. LOB vaiores son media de cuatro repeticiones (x: media; c.v.: coeficiente da variabilidad).Edad inicial de las plántulas: 42 días.

Concentración

de CMU en la

soluci&n

(M)

0

lo"12

io-11

io-10

10-9io-8

10-7io-6

10-5io-*


Semana1«

X

12121212121212\21212

c.v.

0000000000

Semana2&

X

40,54040,53837,537,53430

c.v.

0,014

0,020

0,031

0,037

0,034

0,034

0,024

0,027

Semana3»

X

63,56464656463,560

c.v.

0,030

0,067

0,067

0,012

0,0670,020

0,013

Semana49

X

686970,5696867,7563

c.v.

0,012

0,011

0,018

0,011

0,012

0,014

0,012

Aparici6n desíntomas demarchita-miento

Díastranscurridosdesde el


27

14

4

1

1

Expresi&nde la

letalidad

Díastranscurridos


25842

I

o

I

- 108 -

3.2. EFECTO DEL CMU SOBBE LA ACTIVIDAD FOTOSINTETICADE LAS HOJAS DE PLANTAS CULTIVADAS.

3.2..\. Concentración de CMÜ en las hojas.

La cantidad de CMU absorbida radicularmente porcada una de las especies vegetales ensayadas, a las 2.khoras y 7 días de absorción, se determinó por contajedel CMU"^C incorporado a cada planta.

En las tablas XXII y XXIII se indican los valo-res obtenidos en cada experiencia, que son media de -cuatro repeticiones, para las diversas especies vegetales después de 2.k horas y 7 dias de absorción re spec tivaaente.

Estos valores se representan gráficamente en lasfiguras 13 (cebada), 1 ¿f (avena), 15 (trigo), 16 (maíz),17 (judía) y 18 (tomate).

En la tabla XXIV se expresan los valores de lasconcentraciones relativas alcanzadas por el CMU en lashojas de las diversas plantas tratadas con respecto ala concentración de CMU que existia inicialmente en lasolución nutritiva después de 2h horas y 7 dias de ab-sorción radicular.

Estos valores se representan gráficamente en lasfiguras 19 (24 horas) y 20 (7 dias).

TABU XXII.- Conc»ntr«cl6g il» CWD an la» hol»» da cabada, avana, trlgo, aaiz, judla y toaata daajuaa da ZU hor»a da abaorclAnradlcularan aoluctonaa con dlfarantaa conoantraclonaa da CMU (Loa valoraa ao» ••dt« da cuatro rapatlclonaa y«•tin obtaaldoa taulando an cuanta la caattdad da CHU y al contanld» acuoao dataralnado an cada auaatra (Tt aedla;c.v.i eoaflfilanta da varlabllldad)

Conoantr.

•olar dal

CHO ao la

aol.outitt.

(MOl/aü)

to"?

10-6

10-5

10-*

CoDCantraoUn aolar da CHO an la bo Ja (aaol/al)

Cabada

?

a.iiB x io"6

1,53 M lu'5

2,71 x 10~5

8,50 s IO~5

s.v.

0,50

0,38

0,20

0,32

Avaaa

X

3,98 x I0"6

1,66 x I0"5

1,20 x SO"*1

5,79 * I0'1»

e.v.

O.kl

0,25

0,12

0,15"

Trt io

g

5,5* * 10"'

3,62 * W 5

1,02 x I0"11

3,55 « 10-*

s.v.

0,01,5

0,07*

0,36

0,39

Hals

*

3,01 x 10"*

6,51 * KT6

1,49 x W 5

8,71 xI0"5

o.v.

0,80

0,61

0,13

0,01*7

Jttdta

Î

1,05 x Id*

«,28 x ld"6

a.i,!» x io"5

1,93 x IO"4*

e.V.

0,05

0,37

0,1*

0,15

Tout a

X

2jO3 x 10"6

|,«5 * 10"5

8,10x 10"5

1,83 * 10-*

C.V.

0,2*

0,27

0,36

0.1*

O

TABU XXIII.- CoBCutMCltn da CHU «o la* bojae da cabada, avana, trlgo, uilz, Judla y tout« daaputa da f dl«» da abaorcl6nradloular an aoluelonaa o<m dlfarantaa concantraclonas da CHU (Loa valoraa »on aadla dacuatro rapatlclwtaa yaatin obtanldoa taolandoan cuanta la cautldad da CHU j al «ntanldo acuoao dataralnado an cada auiaatra (x: awdUie.V.: coaftclaota da variabllldad)

Coacaatr.

•alar dal

CHU an la

•cLuutrit

( ••ol /a l )

ID"?

io-6

10-5

10-*

COBO»otr«»lfin a»lar da CHU an 1« boja ( a a o l / a l )

C a b a d a

r

5.6? x 10"6

»,»6 i I0"5

1,03 x lO"1"

6,86 x to*4

C.V.

0,29

0,22

O.lih

O.tf

iTIDt

Ï

«»,55 x 10"6

2,38 x 10"5

1,38 x Itf"*

1fl7 x 10"3

0.».

0,32

0,55

0,38

0,50

Irlio

ï

«,59 x 1O-*

8,95 x IO"5

1,55 x BO"1»

9,29 x 10-*

O.T.

0,29

0,26

0,26

0,85

Ha i s

X

4,86 x 10"*

9.59 x 10"'

|,5«»xlO-s

0.88 x 10"*

s.v.

0,50

0,18

0.58

0,61

Judla

X

2.S6 x lu"6

1,49 x 10"5

»,96 x 10"5

»,6? x to"*

O.T.

0,19

0,21

0.15

0,21

TOB«ta

X

2,58 x 10"s

1,93 x I0"5

1,26 x 10-*

9,82 x 10-*

e.v.

0,i>7

0,W

0,52

0.31

OI

TABLA XXIV.- Relación de la concentracl&n de CMU alcanzada en las hojas de lasdiferentes plantas respecto a la concentracl&n existente Inlclalmenteen la solucl&n nutritiva.

Conc.de CMUen l a

solucl&nmnol/ml

lo"?

«O"6

10-5

10-*

Concentracl&n relativa de CMU en la hoja (CMU en hoja)/(CMU en sol.nutritiva)

Cebada

24 h

24,87

15,37

2,71

0,85

7 días

56,7

29,6

10,30

6,86

Avena

24 h

39,8

18,6

12,05

5,79

7 días

45,5

23,8

13,8

10,7

Trigo

24 h

54

36,2

10,25

3,55

7 días

65,9

39,5

15,5

9,29

Maíz

24 h

30,16

6,51

1,49

0,871

7 días

48,6

9,59

1,54

0,88

Judia

24 h

10,5

6,0

2,44

1,93

7 días

25,6

14,9

9,96

2,67

Tonate

24 h

20,32

18,5

8,10

1,83

7 días

25,8

19,3

12,6

9,82

- 112 -

10"=

<-»o

< íor4

10"

UJ

2oUJ

aat

o 10"

oo

10-7-

10-7 10-6 10-5 10r i 10"CONCENTRACIÓN MOLAR DE CMU EN LA SOLUCIÓNNUTRITIVA

24H0RAS7 O Í A S

F1G.13HISJOGRAMA DE LAS CONCENTRACIONES DE CMUEN LAS HOJAS OE P L A N T A S DE C E B A D A QUE LOABSORBIERON RADICUL Á R M E N T E D U R A N T E2¿ HORAS Y 7 0 I A S

- 113 -

10-2

S 10-3O

Iff*

io

CE icr5

o

oCEz1Uuou

10"

Iff"' 1O"6 10-5 J(T6 10*3CONCENTRACIÓN MOLAR DE CMU EN LA SOLUCIÓNNUTRITIVA

24 HORAS' ' 7 OÍAS

FIG. 14HISTOGRAMA DE LAS CONCENTRACIONES DE CMUEN LAS HOJAS DE PLANTAS OE AVENA QUE LOABSORBIERON RAOICULARMENTE DURANTE2¿ HORAS Y 7 DÍAS

<o

UJ

suui ir !

ao:.j

o 10~6.zo

8

IO~7 Iff-S UTS JO" ¿ JO*3

CONCENTRACIÓN MOLAR OE CMU EN LA SOLUCIÓNNUTRITIVA

2¿ HORAS

7 DÍAS

FIG. 15HISTOGRAMA OE LAS CONCENTRACIONES OE CMUEN LAS HOJAS OE PLANTAS OE TRIGO QUE LOABSORBIERON RAOICULARMENTE DURANTE24 HORAS Y 7DIAS

CONCENTRACIÓN MOLAR OE CMU EN LA HOJA

o i^

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I

- 116 -

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JO"r 6 .

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10i-7.

t - 7 JO"6 JO' 5 10" 10-3CONCENTRACIÓN MOLAR DE CMU EN LA SOLUCIÓNNUTRITIVA

24 HORAS

7 O.IAS

FIG. 17HiSTOGRAMA DE LAS CONCENTRACIONES OE CMUEN LAS HOJAS OE PLANTAS OE JUDIA QUE LOABSORBIERON RAOICULARMENTE D U R A N T E2.4H0RAS Y 701AS

- 117 -H

OJA

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2 ,0-5.o 'O *tua

i -fi

O '°2Ou< ,n-7.

CO

NC

EN

TR

/

/

/

/

/

/

/

10-7 10-6 10" 10" 10-3

CONCENTRACIÓN MOLAR DE CMU EN LA SOLUCIÓNNUTRITIVA

2UHORAS

7 DÍAS

FIG. 18HISTOGRAMA OE LAS CONCENTRACIONES DE CMUEN LAS HOJAS OE PLANTAS OE TOMATE QUE LOABSORBIERON RAOICULARMENTE DURANTE24HORAS Y 7 OÍAS

• It8 -

I0"7 10"6 10'5

CCMU] EN LA SOLUCIÓN10-3

— — — CEBADA— — — AVENA

JUDIA

— . — MAÍZ_ . . _ . . _ TRIGO— — — TOMATE

FIG. 19RELACIÓN ENTRE LA CONCENTRACIÓN DE CMU EN LASOLUCIÓN Y LA CONCENTRACIÓN DE CMU ALCANZADOEN LAS HOJAS DE LAS DIFERENTES PLANTAS DESPUÉSDE ABSORBERLO RAOICULARMENTE DURANTE 24HORAS

- 119 -

,0-2.

10-3

o

iu

J(T«

,0-7

1

1

I

1

(

4

Ár

*i

io"7 tor6io" 5 10" 10"r3

TCMU] EN LA SOLUCIÓN

— — — CEBADA— — • — — AVENA

JUDIA— • — • — MAÍZ. . . . _ . _ TRIGO—»—»——• TOMATE

.FIG. 20RELACIÓN ENTRE LA CONCENTRACIÓN OE CMU EN LASOLUCIÓN Y LA CONCENTRACIÓN OE CMU ALCANZADOEN LAS HOJAS DE LAS DIFERENTES PLANTAS DESPUÉSOE ABSORBERLO RAOICULARMENTE DURANTE 7 OÍAS

- 120 -

3.2.2. Asimilación del

La acción de distintas concentraciones de CMÜsobre la carboxilación, se estudió por determinacióndel 1^002 asimilado por las plantas de las diversas especies vegetales que previamente habían absorbido porvia radicular CMU a 4 concentraciones diferentes durante 24 horas y 7 días, según se describe en el apartado

Se utilizaron dos plantas de cada una de las e,§pecies vegetales para cada concentración de CMU, siendolos resultados media de cuatro determinaciones.

En las tablas XXV (24 horas de absorción)y XXVI(7 días de absorción) se expresan los valores mediosobtenidos.

La relación existente entre la concentración deCMU alcanzada en la hoja de las diferentes especies ve,getales y 3a actividad fotosintética de la misma despuésde 24 horas y 7 días de absorción radicular, se expresaen las tablas XXVII (cebada), XXVIII (avena), XXIX (tr¿go), XXX (maíz), XXXI (judía) y XXXII (tomate) y se representa gráficamente en las figuras 21 (24 horas) y22 (7 días).

Los valores de la concentración de CMU en lashojas se obtienen a partir de la tabla XXII (24 horas)y XXIII (7 días) y los de la A.F. relativa a partir delas tablas XXV (24 horas) y XXVI (7 días).

TABLA XXV.- Efecto de la absorción radicular de CMU durante Zh horas sobre la acti-vidad fotosintétlca de las hojas de las diferentes plantas tratadas.Los valores (en %) en cada especie están referidos a la actividad foto-sintética del testigo no tratado y son media de k repeticiones(x: media; c.v.: coeficiente de variabilidad).

Conc.del CMU

en lasoluciónmmol/ml

0

10-7

10-6

10-5

Actividad fotosintética relativa {%)

Cebada

100

80,61

k7,87

6,12

0,51

c.v.

0,078

0,13

0,10

0,10

0,051

Avena

X

100

82,/fíf

52,33

3,32

0,76

c.v.

0,10

0,06

0,09

0,12

0,28

Trigo

X

100

87, k

38,20

2,81

0,12

c.v.

0,10

0,08

0,07

0,10

0,07

Maíz

X

100

72,22

2íf,P5

5,9

0,9

c.v.

0,11

0,09

0,10

0,12

0,12

Judia

X

100

83,81

56,88

15,05

0,30

c.v.

0,07

0,08

0,12

0,11

0,09

Tomate

X

100

84,1

60,3

17,69

0,67

c.v.

0,07

0,06

0,05

0,09

0,08

I

TABLA XXVI.- Efecto de la absorcibn radicular de CMÜ durante 7 dlaa sobre la actividadfotoeintética de las hojas de las diferentes plantas tratadas.Los valores (en %) en cada especie están referidos a la actividad foto-sintética del testigo no tratado y son media de k repeticiones (x: media;c.v.: coeficiente de variabilidad).

Conc.

d e l CMÜ

en l a

loluci&n

ramol/ol

0

10-7

lo"6

Cebada

X

100

33,92

2,85

c.v.

0 ,

0 ,

0 ,

09

10

09

X

100

61,

10,

Actividad

Avena

3íf

2

c.v.

0,06

0,09

0,05

fotosintética relativa (%)

Trigo

X

100

75,*f8

5,*f8

c.v.

0,09

0,10

0,09

Maíz

X

100

^0,29

9,6

c.

0,

o

0

V .

10

,09

J 2

X

100

66,

2,

Judia

87

99

c

0 ,

0 ,

o,

. V .

07

06

11

Tomate

X

100

46,32

3,13

c.

0

0

0

V .

,08

,07

,06

TABLA XXVII.- Relación entre la concentración de CMÜ alcanzada en la hojade cebada y la actividad fotoslntética relativa de la misma .

24 h

(CMU en la hoja)(wBol/ml)

2,48 x 10~6

1,53 x 10~5

2,71 x 10"5

8,50 x 10"5

A.F. relativa(%)

80,61

47,87

6,12

0,51

(CMU en la hoja)(mmol/nl)

5,67 x 10"6

2,96 x 10"5

-

-

7 días

A.F. relativa(%)

33,92

2,85

-

-

5

TABLA XXVIII.- Relaci&n entre la concentraci&n de CMU alcanzada en la hojade avena y la actividad fotosintética relativa de la «isma.

¿h h

(CMD en la hoja)(maol/tal)

3,98 x 10"6

1,86 x 1O~5

1,20 x 10"*

5,79 x 10"*

• •

A.F. relativa(%)

82,/fif

52,33

3,33

0,76

7 días

(CMU en la hoja)(mmol/nl)

4,55 x 10"6

2,38 x 10"5

-

-

A.F. relativa(%)

61,3^

10,2

-

ro-p-

TABLA XXIX.- Relacl&n entre la concentración de CMU alcanzada en la hojade trigo y la actividad fotosint&tica relativa de la •isoia .

(CMU en la hoja)(mmol/al)

5,54 x 1O~6

3,62 x 10"5

1,02 x 10"**

3,55 x 10"*

2k h

A.F. relativa(*)

87,40

38,20

2,81

0,12

7 días

(CMU en la hoja)(aaol/ml)

6,59 x 10"6

8,95 x 10"5

-

-

A.F. relativa

(%).

75,48

15,48

-

-

roVJ)

TABLA XXX.- Relación entre la concentración de CMÜ alcanzada en la hojade mala y la actividad fotosintética relativa de la adama .

24 h

(CMU en la hoja)(nmol/ml)

3,01 x 10""6

6,51 x 10~6

1,49 x 10"5

8,71 x 10~5

A.F. relativa

72,22

24,05

5,90

0,90

7 días

(CMU en la hoja)(mmol/ml)

4,86 x 10"6

9,59 x 10"6

-

-

A.F. relativa

40,29

9,60

-

-

TABLA XXXI.- Eelaci&n entre la concentracl&n de CMÜ alcanzada en la hojade Judia y la actividad fotoslntétlca relativa de la Misma.

2h h

(CMU en la hoja)(mnol/ml)

t,O5 x 1O~6

6,28 x 10"6

2,Mf x 10"5

1,93 x \O~h

A.P. relativa<*>

83,81

56,88

15,05

0,30

7 días

(CMU en la hoja)(«mol/al)

2,56 x 10"6

5,¿f9 x 10"5

-

-

A.F. relativa(*)

66,87

2,99

-

-

TABLA XXXII.- Relación entre la concentración de CMU alcanzada en la hojadf. tomate y la actividad fotoeintética relativa de la aietna .

(CMU en la hoja)(aaol/al)

2,03 x 10~6

1,85 x 10"5

8,10 x 10~5

1,83 x 10"*

A.F. relativa(#)

8«t,1

60,3

17,69

0,67

7 dlae

(CMU en la hoja)(mmol/al)

2,58 x 1O~5

9,93 x 10" 5

-

-

A.F. relativa(%)

^6,32

3,13

-

-

CO

I

- 129 -

ooV Iai

AT

IVO

AL

Ulaeteo

u:

100]

40-

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«

-

* - \ v

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\

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1••

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\'*il ii 1

\

••JL

••

L 1

io*7 i o - 6 io"5 ib"4

CONCENTRACIÓN MOLAR DE C M U10-3

CEBAOAAVENAJUOIAMAIZTRIGO

TOMATE

FIG.2!INFLUENCIA OE LA CONCENTRACIÓN ALCANZADA POR ELCMU EN LAS HOJAS DE DIFERENTES VEGETALES QUE LOABSORBIERON RADICULARMENTE DURANTE 24 HORAS,SOBRE LA ACTIVIDAD FOTOSINTETiCA UE ESTAS. VALORESRELATIVOS AL TESTIGO.

- 130 -

oo

Ui

o>

UI

tuO

>u.-

TO'7 ?(T6 10"5 10"4 HT3

CONCENTRACIÓN MOLAR DE CMU

CEBADA> — — AVENA

JUDIA

— — • MAÍZ- • • — TRIGO•— — TOMATE

FIG. 22INFLUENCIA DE LA CONCENTRACIÓN ALCANZADA POR EL CMUEN LAS HOJAS DE DIFERENTES ESPECIES VEGETALES QUE LOABSORBIERON RAOICULARMENTE DURANTE 70IAS, SOBRE LAACTIVIDAD FOTOSINTETICA DE ESTAS . VALORES RELATIVOSAL TESTIGO

3.3. EFECTO DEL CMU SOBRE LA REACCIÓN DE HILL EN CLORO-PLASTOS AISLADOS DE HOJAS DE PLANTAS CULTIVADAS.

'i.'iA. Relación super fie ie/peso de hoja y contenido enclorofila.

En la tabla XXXIII se expresa el valor medio de larelación superficie/peso realizada en hojas de 10 plan-tas de cada una de las especies estudiadas, asi como elvalor medio obtenido en la determinación de la clorofilatotal en las mismas, expresada en mg/cm de hoja.Tambiénse indica el contenido en clorofila expresado en mg/ml.

A partir de los valores obtenidos en la determi-nación de la clorofila total en hojas de plantas fres-cas y en la solución de cloroplastos, se ha calculado lasuperficie foliar equivalente para cada especie vegetalque corresponde a los cloroplastos contenidos en cadacubeta de reacción (0,5 mi de suspensión inicial).

3.3.2. Curva de calibrado de la relación DPIP oxidado/D.0.5U0.

En la tabla XXXIV se expresan los valares obteni-dos en la curva de calibrado en la que se relaciona laconcentración de DPIP oxidado con la D.O. leída a 5kO nm.

Estos valores satisfacen a la ley de Beer—Lambert y, por tanto:

D.O. = K.C

El valor de K obtenido mediante ajuste por mí-nimos cuadrados fue 9,5141 unidades de densidad ópticapor aicromol de DPIP en forma oxidada.

TABLA XXXIII.- Contenido an clorofila de lae hojas de las diferentes especies ensaya-das y su relación con el contenido en clorofila de la suspensión decloroplastO6 en el estudio de la reacción de Hill .

Especievegetal

Cebada

Avena

Trigo

Maíz

Judia

Tomate

Relaciónsuperficie / peso

(cm2 /g)

63,67

58,11

66,89

66,5*f

62,8¿f

90,62

Contenido enclorofila total

Ug/cm2)

O,O3íf6/f

0,02if53

0,02379

0,0if392

0,05^81

0,02íf29

Cloroplastos en Reacción de Hill

Contenido enclorofila en la

cubeta de reacción(mg)

0,159

0,159

0,159

0,159

0,159

0,159

Superficie foliarequivalente

(cm2)

*t,59

6,if8

6,68

3,62

2,90

6,45

VJJ

ru

- 133 -

TABLA XXXIV.- Curva de calibrado del DPIP oxidado.Los valores expresan unidades de D.O.a540 nía. (x: media de cinco repeticio-nes; c.v.: coeficiente de variabilidad).

Conc. de DPIF ox.en la cubeta de

reacciónCumol/ mi)

0,0062

0,0111

0,0166

0,0222

0,0277

0,0333

0,0388

0,0444

0,0500

0,0555

D.O.

X

0,063

0,101

0,141

0,188

0,238

0,299

0,350

0,401

0,439

0,499

c.v.

0,4065

0,1821

0,0325

0,0843

0,0721

0,1038

0,0673

0,0323

0,0251

0,0213

Ajuste: D.O. = K x DPIP ox.

K: 9,5141r: 0,998 D.O. =9,5141 (DPIP ox.)

3.3.3. Condiciones de la reaccl6n.

La capacidad fotorreduetora de los cloroplastosse estudio segün las condiciones de reacci&n que se de,tallan en el apartado 2.3.4.

Se utilizaron 5 concentraciones diferentes deCMU, efectuándose dos lecturas en el colorímetro a 3kOna por cada tubo, una inicial y otra después de un mi-nuto de iluminación.

La cantidad de DPIP reducido en cada caso se ot>tiene sustituyendo el Incremento de densidad óptica enla expresión:

ADODPIP reducido =

La experiencia se repitió 5 veces para cada concentraci&n. Los resultados obtenidos, valores medios yvalores relativos al testigo, se pueden observar en 3astablas XXXV (cebada), XXXVI (avena), XXXVII (trigo), -XXXVIII (maíz), XXXIX (judia) y XL (tomate). .

Por cada mol de DPIP reducido en la reacci&n deHill se desprenden 0,5 moles de oxígeno, lo que nos permite determinar los micromoles de oxigeno desprendidosen cada tubo de reacci&n durante el minuto que dura lailuminaci&n.

Dado que los 0,5 mi de la soluci&n de cloroplafstos incorporados a la reacci&n se pueden correlacionarcon la superficie de hoja fresca a que equivalen paracada especie vegetal, los resultados se pueden expre-sar como micromoles de oxigeno desprendidos por hora ypor cm^ de hoja fresca.

TABLA XXXV.- Reaccl&n d© H U Í en cloroplastos aislados de hojas de cebada en funcibnde la concentración de CMU. Los valores son media de cinco repeticiones(x: media; c.v.: coeficiente de variabilidad).

Conc. molar

de CMU

0

1,46 x 1O"8

1,46 x 1O"7

1,46 x 1O~6

1,46 x 1O"5

1,46 x 10'*

¿D.O.

X

0,284

0,257

0,252

0,208

0,129

0,017

c.v.

0,010

0,042

0,013

0,086

0,008

0,047

A(DPIP red)

fimol/al

0,0298

0,0270

0,0265

0,0218

0,0135

0,00178

ftmol 0?

(mg clorofila)"

min"1

0,4264

0,3859

0,3783

0t3^23

0,1937

0,0255

Actividad fotosintética

//mol Op

cm"2 h"1

0,8870

0,8026

0,7870

0,6496

0,4029

0,0531

Valorrelativoal testigo

%

100

90,94

88,73

73,24

45,42

5,98

TABLA XXXVI.- Reaccibn de Hill en cloroplastos aislados de hojas de avena en funci&nde_ la concentración de CMU. Los valores son media de cinco repeticiones(x: media; c.v.: coeficiente de variabilidad).

Conc. molar

de CMU

0

1,46 x 10"8

1,46 x 10' 7

1,46 x 10"6

1,íf6 x 10~5

1,46 x to'**

AD.O.

X

0,283

0,257

0,228

0,165

0,090

0,017

c.v.

0,001

0,003

0,001

0,004

0,001

0,001

d(DPIP red)

f mol/al

0,02975

0,02702

0,02397

0,01735

0,00946

0,00178

,nmol 0¿

(mg clorofila)"1

min"1

0,4249

0,3859

0,3422

0,2477

0,1351

0,0255


/umol 0¿

c m-2h-1

0,8838

0,8026

0,7119

0,5153

0,2811

0,0530

Valorrelativo

al testigo%

100

90,82

80,55

58,30

31,80

6,00

TABLA XXXVII.-Reacción de Hill en cloroplastos aislados de hojas de trigo en funciónde la concentración de CMÜ. Los valores son media de cinco repeticio-nes (x: media; c.v.: coeficiente de variabilidad).

Conc. molar

de CMÜ

0

1,46 x 10"8

1,46 x 10"7

1,46 x 10' 6

1,46 x 10~5

1,46 x 10"^

¿D.O.

X

0,252

0,216

0,205

0,170

0,090

0,017

c.v.

0,015

0,023

0,004

0,037

0,034

0,064

¿(DPIP red)

/«mol/mi

0,026

0,022

0,021

0,017

0,009

0,001

/mol 0 2

(mg clorofUa)""1

min"1

0,3781

0,3243

0,3078

0,2552

0,1351

0,0255


/imol 0¿

c^h"1

0,7870

0,6746

0,6402

0,5309

0,2811

0,0531

Valorrelativo

al testigo%

100

85,72

81,35

67,46

35,71

6,74

I

-o

TABLA XXXVIII.- Reacci&n de Hill en cloroplastos aislados de hojas de aalz en funci&n de la concentración de CMO. Los valores son media de cincorepeticiones (7: media; c.v.: coeficiente de variabilidad).

Conc. molar

de CMU

0

1,46 x 1O"8

1,46 x 10"7

1,^6 x 1O~6

1,46 x 10-5

1,46 x \0~k

AD.O.

X

0,210

0,192

0,181

0,123

0,076

0,008

c.v.

0,019

0,062

0,015

0,008

0,004

0,075

A(DPIP red)

//mol/al

0,0221

0,0201

0,0190

0,0129

0,0079

0,0008

/j»ol Op

(mg clorofila)

Bin"1

0,3153

0,2883

0,2718

0,1847

0,1141

0,0120


fimol 0 2

cm-2 h-1

0,6558

0,5996

0,5653

0,3841

0,2373

0,0249

Valorrelativo

al testigo%

100

91,44

86,20

58,58

36,19

3,80

KMOo

TABLA XXXIX.-Reacción de Hill en cloroplastos aislados de hojas de judia en funciónde la concentración de CMU. Los valores son nedia de cinco repeticiones(Y: media; c.v.: coeficiente de variabilidad).

Conc. aolar

de CMU

0

1,46 x 1O~8

1,46 x 1(T7

1,46 x 1O~6

1,46 x 10~5

1,46 x \0~k

¿VD.O.

X

0,2752

0,2568

0,2380

0,1530

0,1160

0,0320

c.v.

0,0254

0,0350

0,0294

0,0209

0,0181

0,0281

¿(DPIP red)

juaol/nl

0,02¿9

0,0Í70

0,0250

0,0160

0.0&2

0,0033

//mol O2(mg clorofila)

min"1

0,4132

0,3856

0,3573

0,2297

0,1741

O,O48O

Actividad fotosintátlca

/imol 0¿

c-^h"1

0,8595

0,8020

0,7433

0,4778

0,3623

0,0999

Valorrelativo

al testigo%

100

93,31

86,48

55,59

42,15

11,62

V>4VO

TABLA XL.~ Reacci&n de Hill en cloroplastos aislados de hojas de tomate en funci&nde la concentraci&n de CMU. Los valores son media de cinco repeticiones(x: media; c.v.: coeficiente de variabilidad).

Conc. molar

de CMU

0

1,46 x 10~8

1,46 x 10"7

1,46 x 10"6

1,46 x 10~5

1,46 x 10~4

A D.O.

X

0,3220

0,2750

0,2380

0,1530

0,0760

0,0080

c.v.

0,037

0,003

0,008

0,015

0,023

0,075

A(DPIP red)fmol/ml

0,0338

0,0289

0,02502

0,0160

0,0080

0,00084

fimol 0¿

!mg e l oro fi la) "'min"*1

0,4835

0,4129

0,3573

0,2284

0,1141

0,0120


/umol 02

cm"2 h-1

1,005

0,859

0,743

0,475

0,237

0,024

Valorrelativoal testigo

%

100

85,46

73,96

47,28

23,62

2,48

I

I

- 141 -

3.3.4. Obtención de las funciones de correlación entrela capacidad fotorreductora de los cloroplastosy la concentración de CMU.

En la tabla XLI se expresan los valores que re-lacionan la concentración de CMU en la cubeta de reaccióny la actividad fotosintética relativa expresada en %.

La correlación existente entre la actividad fo-torreduetora (A.Fp) de los cloroplastos de cada una delas especies vegetales estudiadas, en función de la concentración de CMU, se expresa en la tabla XLII y se re,presenta en las figuras 23 (cebada), 24 (avena) , 25(trigo), 26 (aaiz), 27 (judía) y 28 (tomate).

Para concentraciones de CMU >10"' M (excepto enque es>10 M), la corr

face a la ecuación de la recta:' . • - • • •

• • • • V í v• ' • *

H = A + B l o g 1 Q C

ntcebada que es>10 M), la correlación existente satis.

••7 •

mientras que para concentraciones de CMU <10 ' M (ex-cepto en cebada que es<10 M), la correlación exis-tente satisface a la ecuación de la hipérbola:

100 logio C + DE + login C

en l a s que:

H s capacidad fotorreductoraC = concentración de CMUA y B s constantes de la rectaD y E = constantes de la hipérbola

TABLA XLI.- Relacibn entre la concentraci&n de CMU en la cubeta de reacción y laactividad fotosintética relativa expresada en % .

Conc. nolarde CMU

0

1,46 x 10~8

1,46 x 10"7

1,46 x 1O"6

1,46 x IO""5

1,46 x \0~k

Actividad fotosintética. Valor relativo al testigo.(*>

Cebada

100

90,94

88,73

73,24

45,42

5,98

Avena

1Ó0

90,82

80,55

58,30

31,80

6,00

Trigo

100

85,72

81,35

67,46

35,71

6,74

Maíz

100

91,44

86,20

58,58

36,19

3,80

Judia

100

93,31

86,48

55,59

42,15

11,62

Tomate

100

85,46

73,96

47,28

23,62

2,48

4*-

I

TABLA XLEI.-Correlaci6n existente entre la capacidad fotorreductora de IB cloropla6tos(reacción de Hill) de las diversas especies vegetales y 3a concentración de CMU.H = capacidad fotorreductora.c s concentración de CMU.r = coeficiente de correlación.

Cloroplastos

de:

Cebada

Avena

Trigo

Maíz

Judia

Tonate

* para**para

Para concentración de CMU2(excepto *)

Ecuación H = A + B log

A

-93,89*

-89,52

-88,41

-97,50

-77,90

-90,07

valores > 10""°valores < 1O~"

B

-27,61*

-25,14

-25,56

-26,95

-23,80

-23,81

> 10-7M

10 c

r

98,18*

99,90

98,82

99,76

98,96

99,86

Para concentración(excepto

D

571,26**

596,06

290,27

615,54

617,90

601,97

•

de CMU<10-7**) MLogio c + Dlogio

c

E

5,65**

5,77

1,98

6,05

6,06

5,71

m 8 5 2z¿ or- nO m S</> z or> s> o2 <"> "n3D ™ O

o o -STJ Z OI- TO> n mm O

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AFr VALOR

* • Ul O> «4 OB CO

o- o o o o eRELATIVO AL TESTIGO (•/•)

— ••—

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100log10C*596.06

5,77*

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\H»-89.52-25.Ulog,nC/ \

\\

\

\

-11 -10 -9 - 8 -7LOGARITMO C

- 6 -5

700

90 to

80 £

70 «í

o>

Ul

OC

30 3

20u.

10

FI6.2AACTIVIOAO FOTOREOUCTORA (AFf) OE LOS CLOROPLASTOS DE AVENA EN FUNCIÓN DE LACONCENTRACIÓN DE CMU. LOS VALORES DE LA AFr ESTÁN REFERIDOS EN V. A LA AFrOE LOS CLOROPLASTOS SIN CMU

•p-vn

— —

1

H T 100logroC* 290.27 /1,9B»log10C \

\

H=-B8,¿1 -25,56log,0C / \V

-10 -9 -8 -7 - 6LOGARITMO C

\

\

5

\

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100

90

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70

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40

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1

FIG. 25ACTIVIDAD FOTOREDUCTORA lAFr) DE LOS CLOROPLASTOS DE TRIGO EN FUNCIÓNDE LA CONCENTRACIÓN DE CMU. LOS VALORES DE LA AFr ESTÁN REFERIDOSEN V. A LA AFr DE LOS CLOROPLASTOS SIN CMU.

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20

10

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AF

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LOGARITMO C

FIG. 27ACTIVIDAO FOTOREDUCTORA IAFr| DE LOS CLOROPLASTOS DE JUDIA EN FUNCIÓN OE LACONCENTRACIÓN DE CMU. LOS VALORES DE LA AFr ESTÁN REFERIDOS EN V. A LAAFr DE LOS CLOROPLASTOS SIN CMU

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100

90

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20

10

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a.

LOGARITMO C

FIG. 28ACTIVIDAD F0T0REDUCT0RA (AFr) DE LOS CLOROPLASTOS DE TOMATE EN FUNCIÓNDE LA CONCENTRACIÓN DE CMU-LOS VALORES DE LA AFr ESTÁN REFERIDOS ENV. A LA AFr DE LOS CLOROPLASTOS SIN CMU.

- 150 -

3.4. EFECTO DEL CMU SOBRE LA ACTIVIDAD FOTOSINTETICA DECHLORELLA PYBENOIDOSA.

En la tabla XLITil se indica el efecto de diver-sas concentraciones de CMU sobre la actividad fotosinté,tica y respiratoria del alga Chloralla Pyrenoidosa.

Los valores expresan ^«oles de oxigeno desprendí,dos o consumidos por minuto y miligramo de clorofila yson media de cuatro repeticiones. Los valores de actividad fotosintética se representan, en forma seailogarit-mica, en la figura 29 y satisfacen a la siguiente ecua-ción de la recta:

AF = A + B logio C

en la que:

AF = actividad fotosintética.C = concentración de CMU.AyB= constantes de la recta.

TABLA XLIII.- Efecto del CMÜ sobre la actividad fotosintetica y respiración del algaChlorella. Los valores (3c) expresan los /moles de O¿ desprendidos oconsumidos por minuto y miligramo de clorofila y son media de cuatrorepeticiones (c.v.: coeficiente de variabilidad).

Conc.de CMUen la

suspensión(M)

0

io- 1 0

10-9

lo"8

10-7

IO"*6

10-5

Actividad fotos intát icafiaol O2.min"l (mg clorofi la)"*

0,3746

0,350

0,275

0,233

0,123

0,06?

0,035

c.v.

0,449

0,0600,272

0,1740,4430,5470,068

%

10095,2275,0263,4833,6418,279,12

Respiración/imol 02*min-' (mg clorofila)"*1

*H

0,33080,33080,312/f0,2940,2750,2480,2110,183

c.v.

0,090

0,240

0,204

0,2330,1720,2730,3210,258

%

10010094,43

88,87

83,31

74,97

63,84

55,50

I«aVJ1

I

\

H»-64,4746-t7,93loglnC

-9,96 -8,96 -7/96 -6,96 -5J96 -4 96

SIN EXTRACTO

-3.96

100

90

80

o70 *

i-in

60 íü

5 0 ^<>

40 P

30

20 <

10

I

FIG.29ACTIVIDAD FOTOSiNTETlCA OE CHLORELLA PYR. EN FUNCIÓN DE LACONCENTRACIÓN OE CMU

- 153 -

3.5. EFECTO DE LOS EXTRACTOS DE HOJAS DE PLASTAS TRATA-DAS CON CMU SOBRE LA ACTIVIDAD FOTOSINTETICA DECHLORELLA PYRENOIDOSA.

3.5.1. Curvas de calibrado.

La evaluación del contenido de CMU en el extrac-to de hojas de las diferentes especies vegetales estu-diadas, se realizó a partir de sendas curvas de calibrado en las que se relacionaba la concentración de CMU 7el grado de inhibición de la actividad fotoslntética encultivos de Chlorella Pyrenoidosa que contenían extrac-tos de hoja de las diferentes especies.

Los valores obtenidos, expresados en «moles deO¿ desprendidos o consumidos por minuto y miligramo declorofila, son media de cuatro repeticiones y se expre-san en las tablas XLIV (cebada), XLV (avena), XLVI (tr¿go), XLVII (maíz), XLVIII (judia) y XLIX (tomate).

TABLA XLIV.- Curva de calibrado para la evaluación del contenido de CMÜ en el extrac,to de hojas de cebada, teniendo en cuenta el efecto sobre la actividadfotosintética y respiratoria del alga Chlorella. Los valores (x) expre-san los /<moles de 0¿ desprendidos o consumidos por minuto y miligramode clorofila y son media de cuatro repeticiones (c.v.: coeficiente devariabilidad).

Conc.de CMÜ

en lasuspensión

(M)

0

lo"10

10-9

10"8

10-7

lo"6

10-5


yumol 02*min (mg clorofila)"

*F

0,29**

0,284

0,274

0,234

0,119

0,068

0,045

c.v.

0,233

0,220

0,196

0,259

Os568

0,456

0,400

%

100

96,73

93,37

80,03

40,01

23,32

15,5

mm

Respiración

/mol 02»min (mg clorofila)

0,367

0,367

0,350

0,330

0,312

0,275

0,229

0,193

c.v.

0,216

0,182

0,060

0,240

0,204

0,172

0,295

0,182

%

100

100

95,26

90,00

85,00

75,01

62,50

52,50

VJI-p-

TABLA XLV.- Curva de calibrado para la evaluación del contenido de CMÜ en el extrac-to de hojas de avena, teniendo en cuenta el efecto 60bre la actividad fo,tosintética y respiratoria del alga Chlorella. Los valores (x) expresanlos «moles de 0¿ desprendidos o consumidos por minuto y miligramo de cíoroflla y son media de cuatro repeticiones (c.v.: coeficiente de variabi-lidad) .

Conc.de CMÜen la

suspensión

(M)

0

io-10

lo"9

10-8

10-7

10-6

10-5

10-*

Actividad fotoslntética

>imol Og'min"' (mg clorofila)

xF

0,331

0,326

0,308

0,286

0,220

0,138

0,066

-

c.v.

0,240

0,054

0,057

0,220

0,347

0,335

0,456

-

%

100

98,72

93,39

86,72

66,70

41,83

20,01

-

Respiración

//mol 02-min"1 (mg clorofila)"

0,331

0,331

0,331

0,294

0,278

0,257

0,248

0,239

c.v.

0,240

0,240

0,073

0,233

0,272

0,209

0,273

0,295

%

100

100

97,22

88,88

83,33

79,77

75,00

62,50

\J1

TABLA XLVI.-Curva de calibrado para la evaluación del contenido de CMÜ en el extractode hojas de trigo, teniendo en cuenta el efecto sobre la actividad foto-sintética y respiratoria del alga Chlorella. Los valores (x) expresan los/¿moles de O¿ desprendidos o consumidos por minuto y miligramo de cloro-fila y son media de cuatro repeticiones (c.v.: coeficiente de variabili-dad).

Conc.de CMÜen la

suspensión(M)

0

10"10

10-9

lo"8

10-7

i o - 6

10-5

Actividad fotosintéticaHimol 02'min" (mg clorofila)"

xF

0,331

0,321

0,308

0,278

0,196

0,072

0,030

o.v.

0,240

0,073

0,057

0,20lf

0,350

0,456

0,384

%

100

96,89

93,76

84,38

59,38

21,87

9,30

Respiración/»BO1 0¿ «min-W clorofila)"

*B

0,331

0,331

0,321

0,312

0,303

0,294

0,275

0,257

c.v.

0,240

0,240

0,073

0,204

0,160

0,233

0,272

0,202

%

100

100

97,22

94,44

91,66

88,88

83,33

77,77

I

I

TABLA XLVII.- Curva de calibrado para la evaluación del contenido de CMÜ en el extrac-to de hojas de maíz . teniendo en cuenta el efecto sobre la actividad fotosintética y respiratoria del alga Chlorella. Los valores (x) expresanlos /imoles de 0¿ desprendidos o consumidos por minuto y miligramo de cíorofila y son media de cuatro repeticiones (c.v.: coeficiente de variabi-lidad).

Conc.de CMÜen la

suspensión(H)

0

io-10

10-9

io-8

10-7

lo"6

10-5

io-*


fimol 02'min" (mg clorofila)

xF

0,286

0,275

0,256

0,237

0,205

0,145

0,060

c.v.

0,220

0,203

0,200

0,249

0,365

0,204

0,543

%

100

96,40

89,30

82,15

71,44

50,00

21,43

Respiración

/iinol 02»min* (mg clorofila)"

xfi

0,312

0,312

0,294

0,279

0,266

0,248

0,229

0,206

c.v.

0,204

0,204

0,233

0,205

0,164

0,273

0,295

0,365

%

100

100

94,11

89,64

85,29

79,41

73,53

65,88

VJ1

TABLA XLVIII.- Curva de calibrado para la evaluación del contenido de CMU en el extrac,to de hojas de judía, teniendo en cuenta el efecto sobre la actividadfotosintética y respiratoria del alga Chlorella. Los valores (x) expre,san los /«moles de O¿ desprendidos o consumidos por minuto y miligramode clorofila y son media de cuatro repeticiones (c.v.: coeficiente devariabilidad).

Conc.de CMtfen la

suspensión(M)

0

io-10

10-9

10"8

10-?

10-6

10-5

Actividad fotosintéticafimol 02*min (mg clorofila)"*

V0,350

0,347

0,340

0,304

0,221

0,164

0,045

0,011

c.v.

0,449

0,155

0,184

0,162

0,346

0,285

0,400

0,043

%

100

99,47

97,48

8", 43

63,87

47,53

12,77

3,76

Respiracióniiimol Og-min^feclorofila)"1

0,339

0,339

0,330

0,321

0,303

0,287

0,266

0,239

c.v.

0,1840,1840,240

0,073

0,160

0,223

0,164

0,251

%

100

100

97,34

94,69

89,38

84,66

78,46

70,50

VJ100

TABLA XLIX.- Curva de calibrado para la evaluación del contenido de CMU en elto de hojas de toaate. teniendo en cuenta el efecto sobre la actividadfotosintética y respiratoria del alga Chlorella. Los valores (x) expresan los jumóles de 0¿ desprendidos o consumidos por minuto y miligramode clorofila y son media de cuatro repeticiones (c.v.: coeficiente devariabilidad).

Conc.de CMÜen la

suspensión(M)

0

lo"1 0

10-9

io- 8

10-7

io-6

10-5

Actividad fotosintéticajumol 02«mln""l (mg clorofila)"*

h0,312

0,249

0,221

0,215

0,185

0,112

0,063

0,025

c.v.

0,20if

0,2?4

0,349

0,321

0,260

0,509

0,450

0,472

%

100

79,99

72,00

68,00

60,00

36,00

20,00

8,00

Respiraciónftmol Og'min"* (mg clorofila)

*R

0,294

0,294

0,284

0,275

0,266

0,257

0,239

0,220

c.v.

0,233

0,233

0,220

0,172

0,164

0,202

0,251

0,347

%

100

100

96,59

93,53

90,47

87,41

81,29

74,82

I

Vil

TAELA L.- Correlaci&n existente entre la capacidad fotosintética de Chlorella Pyre.noidosa y la concentración de CMU, en extractos de hoja3 de las diversasespecies vegetales.

AF = actividad fotosintéticaC = concentración de CMUr = coeficiente de correlaci&n

Extracto

cíe •

Cebada

Avena

Trigo

MaízJudiaTomate

Sin extracto

Para concentraciones de CMÜ>10~7»9^

Ecuación

A

-97,42

-91,53-126,00

-75,27-86,79-56,96

-84,47

AS s A f O LUgjQ q

B

-21,24-22,50-26,27-20,36-21,76-16,00

-17,93

r

97,1399,9298,4698,11

98,9199,01

99,07

Para concentraciones de CMU<1O"7»96100 l o g i n c! + D

E •»• l o g j o c¡

D

815,85696,19746,95425,41776,12496,76

—

£

8,096,827,373,697,733,71

—

sI

- 161 -

3.5-2. Obtención de las funciones de correlación entre

la actividad fotosintétlca y la concentración de

CMU.

La correlación existente entre la capacidad fo-

tosintética de Chlorella Pyrenoidosa y la concentración

de CMU en extractos de hojas de las diversas especies

vegetales, se puede ajustar a una recta de ecuación:

AF = A + B log^Q C

para concentraciones de CMU >10""'^ M

y a una hipérbola de ecuación:

_ 100 1O31Q C + D

E + logio C

para concentraciones de CMÜ<10~^° H

en las que:

AF = actividad fotosintética

C = concentración de CiMU

A yB= constantes de la recta

DyE = constantes de la hipérbola

Los coeficientes de las correspondientes curvas

de regresión para los extractos de las diversas plantas

estudiadas, se expresan en la tabla L y se representan

gráficamente en las figuras 30 (cebada), 31 (avena),32

(trigo), 33 (maiz), 3^ (judia) y 35 (tomate).

— — — (

AFS>00 logioC+0)5,858.09*log10C

N ^ AF= 97,42-21,24 !og,0C

\

\

\

-

-10,96 -9,96 -8,96 -7,96 -6.96LOGARITMO C

-5,96 -4,96 -3,96

100

90

00

70 O

60

50

TE

ST

40 ^

30 ¿ce

20 ¿

10

i

FIG.30ACTIVIDAD FOTOSINTETICA DE CHLORELLA PYR. EN FUNCIÓN DE LA CONCENTRACIÓNDE CMU EN EXTRATOS DE HOJAS OE CEBADA

100logioC»696.t96.82*log,0C

— - )\—i-.

X-^ AF=-91.53-22.50 loq,nCX /

v\k.

\

\

\

\

-10.96 -9,96 -8,96 -7,96 -6,96 -5,96

LOGARITMO C

-4,96 -3,96

100

90

80 .

70 g

60 IS

50

30

u.'20 <

10

FIG.31ACTIVIDAD FOTOSINTETICA DE CHLORELLA PYR. EN FUNCIÓN DE LA CONCENTRACIÓNDE CMU EN EXTRACTOS DE HOJAS DE AVENA

-10.96 -9,96

AFl100logioC*7¿6,957,37*log,0C

AF*-126-26,27log,nC

-8.96 -7,96 -6,96 -5.96

LOGARITMO C

-4,96 -3,96

FIG.32ACTIVIDADAD FOTOSINTETICA DE CHLORELLA IJYR . EN FUNCIÓN DE LA CONCENTRACIÓNDE CMU EN EXTRACTOS DE HOJAS DE TRIGO

/ A F m 3.69*log,0C

-9.96

AF*-75.27-20.36 tog,0C

-8,96 -7.96 -6,96 -5,96LOGARITMO C

-4.96 -3.96

asVJl

FIG.33ACTIVIDAD FOTOSINTETICA DE CHLOREl.LA PYR. EN FUNCIÓN DE LACONCENTRACIÓN DE CMU EN EXTRACTOS DE HOJAS DE MAÍZ

A F 100lopioC*776l2i 7,73*log,oC

\

— _

AF=

V / ,

—•

-B6.79-2l(76log,ftC

\

\

\

-10,96 -9,96 -8,96 -7.96 -6,96 -5,96

LOGARITMO C

-4.96 -3,96

100

90

80 5s

o70 9

60 £

50 <

30 tu

20 ""

10

I

I

FIG. 34ACTIVIDAD FOTOSINTETICA DE CHLORELLA PYR. EN FUNCIÓN DE LA CONCENTRACIÓNDE CMU EN EXTRACTOS DE HOJAS DE JUDIA

I/ 3.7 •tog,¿C

.

AF=-56,96-16.00 log,ftC

•

- ^ — — — 100

-10,96 -9.96 -8.96 -7,96 -6.96

LOGARITMO C-5,96 -4.96 -3,96

90

80

70

60

50

40

30

20

10

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1

167

i

FIG. 35ACTIVIDAD FOTOSINTETICA DE CULOKELLA PYR. EN FUNCIÓN DE LA CONCENTRACIÓNOE CMU EN EXTRACTOS DE HOJAS DE TOMATE

- 168 -

3.5.3. Efecto de los extractos de hojas de plantas tra-tadas durante Zk horas.

£1 efecto del extracto de las hojas de las dis-tintas especies vegetales que absorbieron radicularmente diferentes concentraciones de CMU durante Zk horas,sobre la actividad fotosintética y respiratoria del al,ga Chlorella, se indica en las tablas LI (cebada), LII(avena), Lili (trigo), LIV (maíz), LV (judia) y LVI(tomate).

Los valores expresan amóles de oxigeno despren-didos o consumidos por minuto y miligramo de clorofilay son media de cuatro repeticiones.

3'5-h. Efecto de los extractos de hojas de plantas tra-tadas durante 7 días.

El efecto del extracto de las hojas de las distintas especies vegetales que absorbieron radicularmentediferentes concentraciones de CMU durante 7 días sobrela actividad fotosintética y respiratoria del alga Chlo-rella, se indican en las tablas LVII (cebada), LVIII -(avena), LIX (trigo), LX (maíz), LXI (judia) y LXII(toaate).

Al igual que en el punto anterior, los valoresexpresan amóles de oxígeno desprendidos o consumidos porminuto y miligramo de clorofila y son media de cuatrorepeticiones.

TABLA LI.- Efecto del extracto de hojas de plantas de cebada que absorbieron radicu-laraente CMU sobre la actividad fotosintetica y respiratoria del alga Chlorelia. Las plantas estuvieron durante 24 h en solución nutritiva con dife-rentes concentraciones de CMU. Los valores (x) expresan los /«moles de 0¿>desprendidos o consumidos por Minuto y miligramo de clorofila y son mediade cuatro repeticiones (c.v.: coeficiente de variabilidad).

Conc.de CMUen la

soL nutritiva(M)

0lO"10

10-9

lo" 8

10-7

lo" 6

10-5

10-*

Actividad fotosintetica/mol Og'inin""1 (mg clorofila)"

0,2%0,2840,2740,2430,166

0,0980,036

c.v.

0,2330,2200,1960,2160,286

0,2390,816

%

10096,72

93,3983,3356,70

33,3513,34

Respiración/iraol Og'min-l (mg clorofi la)"

*R

0,3670,3500,3300,2940,266

0,2380,220

0,183

c.v.

0,2160,0600,2400,2330,164

0,2510,347

0,258

%

100959080

72,5

6560

50

TABLA LII.- Efecto del extracto de hojas de plantas de avena que absorbieron radicularmente CMU sobre la actividad fotosintética y respiratoria del alga ChloreHa.Las plantas estuvieron durante £Í/i_h en solución nutritiva con diferentesconcentraciones de CMU. Los valores (x) expresan los //moles de O¿ desprejndidos .o consumidos por minuto y miligramo de clorofila y son media decuatro repeticiones (c.v.: coeficiente de variabilidad).

Conc.de CMUen la

sol. nutritiva(M)

0

io-1 0

10-9

io-8

10-7

io-6

10-5

io-


fimol 02*min"* (rag clorofila)"

*F

0,331

0,327

0,312

0,285

0,220

0,138

0,056

C.V.

0,240

0,054

0,160

0,220

0,3470,3350,577

%

100

97,91

91,74

85,5766,06

41,38

17,15

f triol 02 # m

*R

0,330

0,330

0,312

0,303

0,266

0,248

0,239

0,220

Respiración

in"1 (mg clorofila)"1

C.V.

0,2/fO

0,240

0,20íf

0,160

0,164

0,273

0,251

0,347

%

100

100

94,491,6

80,5

75,0

7¿,¿

66,6

TABLA Lili.- Efecto del extracto de hojas de plantas de trigo que absorbieron radicu-larmente CMU sobre la actividad fotosintética y respiratoria del algaChlorella. Las plantas estuvieron durante 24 h en solución nutritiva condiferentes concentraciones de CMU. Los valores (x) expresan los /"moles deO¿ desprendidos o consumidos por minuto y miligramo de clorofila y sonmedia de cuatro repeticiones (c.v.: coeficiente de variabilidad).

Conc.de CMU

en lasol.nutritiva

(M)

0

io-10

10-9

10-8

lo"?

10"6

10-5


/mol O2.min (mg clorofila)"

xp

0,331

0,321

0,312

0,281

0,205

0,073

0,031

c.v.

0,240

0,073

0,204

0,223

0,365

0,70?

0,165

%

100

97,78

94,55

85,11

63,01

22,19

9,52

Respiración

/nmol O2.min (mg clorofila)

*R

0,331

0,321

0,312

0,294

0,275

0,257

0,239

0,220

c.v.

0,240

0,073

0,204

0,233

0,272

0,202

0,251

0,347

%

100

97,22

94,55

88,88

83,33

77,77

72,22

66,66

TABLA LIV\- Efecto del extracto de hojas de plantas de maíz que absorbieron radicularmente CMÜ sobre la actividad fotosintética y respiratoria del alga Chlor¿lia. Las plantas estuvieron durante 24 h en soluci&n nutritiva con dife—rentes concentraciones de CMO. Los valores (x) expresan los //moles de 03desprendidos o consumidos por ojinuto y Miligramo de clorofila y son mediade cuatro repeticiones (cy.: coeficiente de variabilidad).

Conc.de CMUen la

eol .nutr i t iva(M)

0

io- 1 0

10-910-810-710-610-5

10"*

Actividad fotosintética/<mol O2.min (mg clorof i la)"

xF

0,286

0,2790,2750,256

0,177

0,123

0,049

c.v.

0,220

0,2050,2030,2000,2590,3870,4430,406

%

100

98,2396,5989,3081,0561,9042,8617,86

Respiración/«mol O2.min (og clorofi la)"

*R

0,312

0,312

0,294

0,269

0,25if

0,222

0,198

0,17k

c.v.

0,20if0,20íf0,2330,19<t0,1990,3480,3520,201

%

100

100

86,21

81,41

71,15

63,46

55,95

TABLA LV.- Efecto del extracto de hojas de plantas de .judia que absorbieron radicularmente CMU sobre la actividad foto¿;intética y respiratoria del alga Chlore-lla. Las plantas estuvieron durante 24 h en solución nutritiva con diferentes concentraciones de CMU. Los valores (3T) expresan los /«moles de 0¿ des-prendidos o consumidos por minuto y miligramo de clorofila y son media decuatro repeticiones (c.v.: coeficiente de variabilidad).

Conc.de CMUen la

sol .nutr i t iva(M)

0i<r10

10-9

?o-8

10-7

lo"6

10-5

io-*

Actividad fotosintéticamol O2.min" (mg clorofila)*"

*F

0,350

0,342

0,338

0,295

0,219

0,149

0,061

c.v.

0,4490,1530,182

0,235

0,342

0,212

0,082

%

100

98,95

97,06

84,81

62,09

41,98

19,80

Respiración/'mol O2.min- (mg clorofila)

0,339

0,339

0,330

Ot3i2

0,294

0,266

0,2390,211

c.v.

0,184

0,184

0,240

0,204

0,233

0,164

0,251

0,321

%

100

100

97,30

92,03

86,72

78,46

70,50

62,24

TABLA LVI.- Efecto del extracto de hojas de plantas de tomate que absorbieron radicu-larmente CMIT sobre la actividad fotosintética y respiratoria del algaChlorella. Las plantas estuvieron durante 24 h en solución nutritiva condiferentes concentraciones de CMU. Los valores (x) expresan /«moles de Opdesprendidos o consumidos por minuto y miligramo de clorofila y son mediade cuatro repeticiones (c.v.: coeficiente de variabilidad).

Conc.de CMUen la

sol.nutritiva(M)

0

lo"10

10-9

10-8

io-7

io-é

10-5

10-*


/' 02-min-^ (mg clorofila)

*F

0,312

0,239

0,216

0,201

0,16?

0,092

0,034

0,012

c.v.

0,204

0,251

0,323

0,357

0,284

0,326

0,542

0,475

%

100

77, ¿7

68,67

63,88

53,70

29,49

11,10

4,40

Respiración

/mol O2.mln"-1 (mg clorofila)

*R

0,294

0,284

0f2?)

0,266

0,257

0,239

0,220

0,205

c.v.

0,233

0,220

0,196

0,164

0,202

0,251

0,347

0,364

%

100

96,59

92,17

90,47

87,41

81,29

74,82

69,72

I

TABLA LVII.- Efecto del extracto de hojas de plantas de cebada que absorbieron radicu-larmente CMÜ sobre la actividad fotosintética y respiratoria del algaChlorella. Las plantas estuvieron durante 1 semana en solución nutritivacon diferentes concentraciones de CHU. Los valores (x) expresan los /«atolesde 0¿ desprendidos o consumidos por minuto y miligramo de clorofila y sonmedia de cuatro repeticiones (c.v.: coeficiente de variabilidad).

Conc.de CMUen la

sol.nutrit iva

(M)

0

io- 1 0

10-9

10-8

10-7

10-6

10-5

10"*

Actividad fotosintéticaJJBOI O2.min (mg clorof i la)"

*F

0,294

0,278

0,266

0,215

0,1íf7

0,086

c.v.

0,2330,203

0,164

0,321

0,204

0,360

%

100

9^,73

91,8373,3750,0329,42

Respiraciónnmol Og.rain" (mg clorofi la)"

*R

0,367

0,330

0,303

0,294

0,266

0,238

0,220

0,183

c.v.

0,216

0,21fO

0,160

0,197

0,164

0,251

0,3^7

0,258

%

100

90

82,580

72,5

65

60

VJ1

I

TABLA LVIII.- Efecto del extracto de hojas de plantas de avena que absorbieron radicularmente CMU sobre la actividad fotosintética y respiratoria del algaChlorella. Las plantas estuvieron durante 1 semana en solución nutritiva con diferentes concentraciones de CMU. Los valores (x) expresan los//moles de O2 desprendidos o consumidos por minuto y miligramo de clorofila y son media de cuatro repeticiones (c.v.: coef. de variabilidad).

Conc.de CMU

en la

sol.nutritiva

(M)

0

lo"10

10-9

lo"8

10-7

10-6

10-5

10-*


//mol O2.min (mg clorofila)"

*F

0,331

0,312

0,295

0,248

0,166

0,071

C.V.

0,2¿f0

0,204

0,230

0,274

0,283

0,408

%

100

95,2890,7475, M>49,2719,90

Respiración

/imol Op.min (mg clorofila)"*

*R

0,331

0,331

0,321

0,294

0,257

0,239

0,220

0,215

c.v.

0,240

0,090

0,073

0,233

0,202

0,251

0,347

0,321

%

100

100

97,22

88,8877,7772,2266,66

64,44

I

-o

I

TABLA LIX.- Efecto del extracto de hojas de plantas de trigo que absorbieron radicu»larmente CMU sobre la actividad fotosintética y respiratoria del algaChlorella. Las plantas estuvieron durante 1 semana en solución nutritivacon diferentes concentraciones de CMU. Los valores (x) expresan los/imolesde Ü£ desprendidos o consumidos por minuto y miligramo de clorofila y sonmedia de cuatro repeticiones (c.v.: coeficiente de variabilidad).

Conc.de CMUen la

sol.nutritiva(M)

0

lo"10

10-9

io-8

10-7

10"6

10-5

io-*


/<mol Op.n

xF

0,331

0,319

0,278

0,256

0,177

0,060

-

-

nin (mg clorofila)

c.v.

0,240

0,073

0,203

0,200

0,387

0,384

-

-

%

100

95,83

84,09

77,38

53,65

18,30

-

-

Respiraci&n

/imol O2.min (mg clorofila)

xfi

0,331

0,331

0,294

0,275

0,248

0,229

0,205

0,183

c.v.

0,240

0,240

0,233

0,272

0,273

0,295

0,364

0,258

*

100

97,22

88,88

83,33

75,00

69,44

61,11

55,50

-Ni

-vi

TABLA LX.~ Efecto del extracto de hojas de plantas de maíz que absorbieron radicular,mente CMU sobre la actividad fotosintética y respiratoria del alga Chlore.lia. Las plantas estuvieron durante 1 semana en solución nutritiva con d¿ferentes concentraciones de CMU. Loe valores (x) expresan los /moles de0¿ desprendidos o consumidos por minuto y miligramo de clorofila y son media de cuatro repeticiones (c.v.: coeficiente de variabilidad).

Conc.de CMUen la

sol.nutritiva(M)

0io- 1 0

10-910"8

10-7

io-6

10-5

10-*

Actividad fotosintética;<«ol 02-min"' (mg clorofila)

xF

0,286

0,275

0,265

0,249

0,190

0,125

0,037

c.v.

0,220

0,272

0,163

0,273

0,180

0,444

0,073

%

100

97,08

92,90

86,97

66,/f7

43,46

13,02

Respiración/imol 02-min-l (mg clorofila)

*R

0,3120,312

0,2850,2590,2390,2190,205

0,174

c.v.

0,20íf

0,204

0,221

0,20if

0,251

0,342

0,362

0,201

%

100100

91,34

83,01

76,60

?0,19

65,70

55,77

OO

I

TABLA LXI.- Efecto del extracto de hojas de plantas de judia que absorbieron radicularmente CMU sobre la actividad fotosintética y respiratoria del alga Calore,lia. Las plantas estuvieron durante 1 semana en sol. nutritiva con dife-rentes concentraciones de CMU. Los valores (x) expresan los /«moles de 02desprendidos o consumidos por minuto y miligramo de clorofila y son mediade cuatro repeticiones (c.v.: coeficiente de variabilidad).

Conc.de CMUen la

sol.nutritiva(M)

0

io-10

10-9

10-8

10-7

10-6

íO'*5

10"*


/<mol O2.min-1 (mg clorofila)"1

*F

0,350

0,340

0,328

0,277

0,193

0,123

0,045

c.v.

0,449

0,186

0,239

0,175

0,182

0,443

0,816

%

100

97,59

94,03

80,00

54,97

35,49

12,19

Respiraci&n

/'tnol O2.min~1 (mg clorofila)"

*R

0,339

0,330

0,312

0,294

0,266

0,233

0,135

0,166

c.v.

0,184

0,240

0,204

0,233

0,164

0,174

0,263

0,283

%

100

97,34

92,03

86,72

78,46

68,73

54,57

48,96

VO

t

TABLA LXII.- Efecto del extracto de hojas de plantas de tomate que absorbieron radicu-larmente CMU sobre la actividad fotosintética y respiratoria del algaChlorella. Las plantas estuvieron durante 1 semana en solución nutritivacon diferentes concentraciones de CMU. Los valores (x) expresan los/<molesde 0 2 desprendidos o consumidos por minuto y miligramo de clorofila yson media de cuatro repeticiones (c.v.: coeficiente de variabilidad).

Conc.de CMUen l a

so l .nutr i t iva(M)

0

io-1 0

10-9

lo"»

lo"?io-6

10-5

Actividad fotosintética/<mol O2.min (mg clorofila)

xp

0,312

0,237

0,206

0,177

0,157

0,049

0,025

c.v.

0,20ft

0,2^9

0,365

0,387

0,225

0,406

0,471

%

100

75,27

65,57

57,08

49,89

16,44

7,95

Respiraci&n

/<mol O2.min (mg c lorof i la )"

*R

0,294

0,275

0,266

0,2570,2390,220

0,193

0,167

c.v.

0,233

0,172

0,164

0,202

0,251

0,347

0,182

0,284

%

100

93,53

90,47

87,50

81,25

75,00

65,62

56,25

OO

o

- 181 -

3.5»5« Efecto de los extractos de hojas de plantas tra-tadas durante 7 días con diferentes concentracio-nes de CMU y mantenidas la semana siguiente ensolución nutritiva (sin CMU).

£1 efecto del extracto de las hojas de las dis-tintas especies vegetales que absorbieron radicularmen-te diferentes concentraciones de CMU durante 7 días yse mantuvieron la semana siguiente en solución nutriti-va (sin CMU), sobre la actividad fotosintética y respi-ratoria del alga Chlorella, se expresa en las tablasLXIII (cebada), LXIV (avena), LXV (trigo), LXVI (maíz),LXVII (judia) y LXVIII (tomate).

Como ya se indicó anteriormente, los valores ex-presan «moles de oxigeno desprendidos o consumidos porainuto y ailigraao de clorofila y son aedia de cuatrorepeticiones.

TABLA LXIII.- Efecto del extracto de hojas de plantas de cebada que absorbieron radicularmente CMU sobre la actividad fotosintetica y respiratoria del alga""Chlorella. Las plantas estuvieron durante 1 semana en soluci&n nutritivacon diferentes concentraciones! de CMU y la semana posterior en soluci&nnutritiva sola. Los valores (x) expresan los /imoles de O¿ desprendidos oconsumidos por minuto y miligramo de clorofila y son media de cuatrorepeticiones (c.v.: coeficiente de variabilidad).

Conc.de CMU

en lasol.nutritiva

(M)

0

io-10

10-9

io-8

10-7

10-6

10-5

10-*

Actividad fotosintetica

/imol Oo.min (mg

*F

0,294

0,280

0,271

0,239

0,157

0,091

-

-

c.v.

0,233

0,203

0,196

0,251

0,225

0,326

-

-

clorofila)

%

100

95,

92,

81,

53,

31,

-

-1

55

37

48

63

13

//mol O^.m

XR

0,367

0,350

0,330

0,312

0,284

0,238

0,220

0,183

Respiraci&n

in"1 (mg

c.v.

0,216

0,060

0,240

0,204

0,220

0,251

0,347

0,258

clorofila)

%

100

95

90

85

77,5

6560

50

cx>rv>

TABLA LXIV.- Efecto del extracto de hojas de plantas de avena que absorbieron radicularmente CMO sobre la actividad fotosintetica y respiratoria del alga ChloriTlia. Las plantas estuvieron durante 1 semana en solución nutritiva con dTferentes concentraciones de CMU y la semana, posterior en solución nutritTva sola. Los valores (x) expresan los /uñóles de O¿ desprendidos o consumidos por minuto y miligramo de clorofila y son media de cuatro repeticio-"*nes (c.v.: coeficiente de variabilidad).

Conc.de CMÜen l a


0

io"10

10-9

io-8

lo"?

10-6

10-5

ICT*

Actividad fotosintetica/imol O2.min- (mg clorofila)

xF

0,331

0,3190,301

0,262

0,186

0,066

c.v.

0,2^00,0730,160

0,163

0,258

0,¿*08

%

100

96, k 691,01

79,31

56,35

20,07

Respiración/imol O2.min (mg clorofila)

*R

0,331

0,3310,321

0,303

0,278

0,238

0,220

0,206

c.v.

0,2¿f0

0,240

0,073

0,160

0,203

0,251

0,347

0,365

%

100

100

97,22

91,66

83,33

72,22

66,66

62,22

I

Co

TABLA LXV.- Efecto del extracto de hojas de plantas de trigo que absorbieron radicularmente CMU sobre la actividad fotocintética y respiratoria del alga Chlore"lia. Las plantas estuvieron durante 1 semana en solución nutritiva con dTferentes concentraciones de CMU y la semana posterior en soluci&n nutritTva sola. Los valores (x) expresan los /uñóles de O¿ desprendidos o consumidos por minuto y miligramo de clorofila y son media de cuatro repeticio-nes (c.v.: coeficiente de variabilidad).

Conc.de CMUen la

sol.nutritiva. (M)

0

10"10

lo"8

10~6

10"^



*F

0,331

0,310

0,271

0,193

0,068

c.v.

0,240

0,073

0,060

0,196

0,182

0,381

%

100

96,42

93,87

82,14

58,64

18,84

Respiración


*R

0,331

0,331

0,321

0,294

0,257

0,229

0,205

0,183

c.v.

0,240

0,240

0,173

0,233

0,202

0,295

0,364

0,258

%

100

100

97,77

88,88

77,77

69,44

61,11

55,5

O)-p-

TABLAS LXVI.- Efectos del extracto de hojas de plantas de .maíz que absorbieron radicu,larmente CMU sobre la actividad fotosintética y respiratoria del algaChlorella. Las plantas estuvieron durante 1 semana en solución nutriti-va con diferentes concentraciones de CMU y la semana posterior en solu-ción nutritiva sola. Los valores (X) expresan los («moles de O¿ despren-didos o consumidos por minuto y miligramo de clorofila y son media decuatro repeticiones (c.v.: coeficiente de variabilidad).

Conc.de CMU

en la

sol.nutritiva(M)

0

io-10

10-9

lo"8

lo"?

io-6

10-5


(umol O2.min (mg clorofila)"

0,286

0,276

0,274

0,253

0,195

0,123

0,035

c.v.

0,220

0,274

0,270

0,202

0,186

0,432

0,069

%

100

97,18

95,91

88,63

67,83

42,85

12,79

Respiración

íiool Og.min (mg clorofila)"

h0,312

0,312

0,294

0,275

0,257

0,233

0,220

0,157

c.v.

0,204

0,204

0,233

0,272

0,202

0,174

0,347

0,225

%

100

100

94,11

88,23

82,35

74,58

70,58

50,00

00\J1

TABLA LXVIL- Efecto del extracto de hojas de plantas de judia que absorbieron radicu-larmente CMÜ sobre la actividad fotosintetica y respiratoria del algaChloreUa. Las plantas estuvieron durante 1 semana en soluci&n nutritivacon diferentes concentraciones de CMU y la semana posterior en soluci&nnutritiva Bola. Los valores Cx) expresan los /imoles de 0¿ desprendidos oconsumidos por minuto y miligramo de clorofila y son media de cuatro re-peticiones (c.v.: coeficiente de variabilidad).

Conc.de CMÜ

en lasol.nutritiva

(M)

0

io-10

10-9

10"8

10-7

10"6

10-5

io-*

Actividad fotosintetica—1 / \—1juaol Op.min (mg clorofila)

*F

0,350

0,344

0,329

0,288

0,203

0,120

0,045

-

c.v.

0,449

0,189

0,240

0,229

0,359

0,440

0,816

-

%

100

98,53

94,55

83,03

57,38

34,34

12,30

-

,,mol 0 2

*R

0,339

0,330

0,321

0,303

0,278

0,230

0,183

0,166

Respiración

.rain" (mg clorofila)

c.v.

0,184

0,240

0,073

0,160

0,203

0,297

0,258

0,283

%

100

97,34

94,69

89,38

82,00

67,84

53,98

48,96

ODON

TABLA LXVIII.- Efecto del extracto de hojas de plantas de tomate que absorbieron ra-dicularmente CMU sobre la actividad fotosintética y respiratoria delalga Chlorella. Las plantas estuvieron durante 1 semana en solución nu,tritiva con diferentes concentraciones de CMU y la semana posterior ensolución nutritiva sola. Los -valores (x) expresan los /'moles de 0¿desprendidos o consumidos por minuto y miligramo de clorofila y sonmedia de cuatro repeticiones (c.v.: coeficiente de variabilidad).

Conc.de CHUen la


0

io-1 0

10-9

lo"8

io-7

io-6

10-5

lo"*

Actividad fotosintética/itnol Op.min" (rog clorofila)"*

*F

0,312

0,237

0,210

0,183

0,163

0,052

0,022

-

c.v.

0,20¿t

0.2/+9

0,371

0,258

0,280

0,410

0,389-

%

100

76,25

66,77

59,6951,30

17,30

7,40

-

//mol Op.

0,294

0,294

0,275

0,266

0,257

0,236

0,185

0,164

Respiración—1 —1

min (mg clorofila)c.v.

0,233

0,233

0,172

0,164

0,202

0,2490,260

0,281

%

100

100

93,53

90,47

87,41

80,2762,92

55,78

I

CD

- 188 -

3.5.6. Estimación de la concentración de CMU en lasho.ias de plantas tratadas.

A partir de las ecuaciones de regresión obteni,das para cada especie vegetal, se calculó la concen-tración estimada de CMU en las hojas de las plantastratadas.

Para ello se utilizaron los valores de la acti,vidad fotosintética de cultivos de Chlorella colocadosen un medio con extracto de las hojas de las plantastratadas durante 2k horas y una semana.

Estos valores se expresan en las tablas LXIX(cebada), LXX (avena), LXXI (trigo), LXXII (naíz), -LXXIII (judía) y LXXIV (tonate).

TABLA LXIX.- Concentración estimada de CMU en las hojas de plantas de cebada despuésde diferente tiempo de absorción radicular. Los valores están obtenidosa partir de las siguientes ecuaciones:

Para C > 1O"7»96 M

Para C < IQ-7,96 M

Teniendo en cuenta los resultados de AF de las Tablas LI (24 h), LVII(1 semana) y LXIII (1 semana en solución de CMU y la semana siguienteen solución nutritiva sólo).

AF = -97,42-21,24 log 1 o C100 logioC + 815,85

= 8,09 +

Conc.de CMU

en la solución

(M)

lo-'0

10-9

lo"8

ID"7

10~6

10-5

Concentración en la hoja después de:

24 h

4,25 x 10"9

2,49 x 10"8

1,023 x 10"7

8,88 x 10"7

7,02 x 10"6

6,15 x 10"5

i semana

1,35 x lo"8

3,92 x lo"8

3,02 x 10"7

2,79 x 10"6

2,50 x 10"5

1 semana+

1 semana

?t78 x 10"9

3,43 x lo"8

1,25 x 10"7

1,57 x 10"6

1,35 x 10-5

veces en la solución

24 h

42,50

24.90

10,23

8,88

7,02

6,15

1 semana

39,2

30,2

27,9

25,0

1 semana+

1 semana

77,80

34,30

12,50

15,70

13,50

00VO

TABLA LXX.- Concentración estimada de CMU en las hojae de plantas de avena después dediferente tiempo de absorción radicular. Los valores están obtenidos apartir de las siguientes ecuaciones: "~

Para C >10-7,96 M

Para C <10"7»96 M

Teniendo en cuenta los resultados de AF de las Tablas LII (24 h), LVIII (1semana) yLXJV(1 semana en solución de CMU y la semana siguiente en soluciónnutritiva sólo)

AF = -91,53 - 22,50 log,0 C

A F _ 100 logiOC-f 696,196,62 +

Conc.de CMU

en la solución(M)

io-1 0

10-9

io-8

10-7

lo"6

10-5

Concentración en

24

4,634,453,26

2,68

U88

h

•

X

X

X

X

X

10"**

10-7

10-6

10-5

l£i hoja

1 semana

9,958,496,26

5,57

3,69

X

X

X

X

X

-

10-910-710-7

lo'6

10-5

después de:

1 semana

1 semana

7,49 x

6,73 x

5,48 x

4,69 x

3,63 x

-

10-9

io-»lo"?

lo"6

10-5


24 h

46,30

44,50

32,90

26,80

18,80

1 semana

99,50

84,90

62,60

55,70

36,90

-

1 semana

1 semana

74,90

67,30

54,80

46,90

36,30

-

VOO

TABLA LXXI.- Concentración estimada de CMU en las hojas de plantas de trigo despuésde diferente tiempo de absorción radicular. Los valores están obtenidosa partir de las siguientes ecuaciones:

Para C > 10"?»96 M

Para C < 1O"7»96 M

Teniendo en cuenta los resultados de AF de las Tablas Lili (2¿f h), LIX(1 semana) y LXV (1 semana en solución de CMU y la semana siguiente ensolución nutritiva solo).

AF = -126 - 26,27 logio C

AF = 1 0° 1Q510 C» 746,95

7,37 +

Conc.de CMÜen l a solución

(M)

io-1 0

10-9

10-8

10-7

io-6

10-5

Concentración en

2í

8,94

8,59

6,26

5,29

4,82

2,35

f h

X

X

X

X

X

X

10-9

10-8

10-7

io-6

10-5

la hoja

1 semana

1,80

1,36

9,00

7,81

5,06

X

X

X

X

X

-

10-8

10-7

10-7

lo"6

10-5

después de :

1 semana

1 semana

1,36 x

9,36 x

7,96 x

6,11 x

5,01 x

-

10-8

lo"8

10-7

10-6

veces

24 h

89,40

85,90

62,60

52,90

48,20

23,50

en la solución

1 semana

180

136

90

78,10

50,60

-

1 semana

1 semana

136

93,

79,

61 ,

50,

-

60

60

10

10

vD

I

TABLA LXXII.- Concentración estimada de CMU en las hojas de plantas de maíz después dediferente tiempo de absorción radicular. Los valores están obtenidos apartir de las siguientes ecuaciones:

Para C > 10-7,96 M

Para C < 10-7,96 M

AF = -75,2.7 - 20,36 logjp C

100 logio C +AF =

3,69 +

Teniendo en cuenta los resultados de AF de las Tablas LIV (2¿t h), LX (1semana) y LXVT (1 semana en solución de CMU y la semana siguiente ensolución nutritiva solo).

Conc.de CMU

en la eoluci&n(M)

lo"10

10-9

io-8

lo"?

ID"6

10-5

io-*

1,

2

6

6

51

Concentraci&n en

Zh

20

,75

,96

,66

h

_.

X

X

X

X

XX

10-7

10-7

10-7

10-6

10-5

1

3

2

1

1

la hoja

1 semana

,82

,56

,63

,k8

,33

_

X

X

X

X

X

10-7

10-7

lo'6

10-5

io-*

después de:

1 semana

1 semana

1,30 x

2,96 x

2,11 x

1,23 x

1,27 x

10-7

10-7

lo"6

10-5

io-*

veces

Zk h

—

120

27,50

6,96

6,66

5,21

1

en la solución

semana

-

182

35,

26,

13,

60

30

80

30

1 semana

1 semana

-

130

29,

21,

12,

12,

60

10

30

70

vO

TABLA LXXIII.- Concentración estimada de CMU en las hojas de plantas de .ludia despuésde diferente tiempo de absorción radicular. Los valores están obtenidosa partir de las siguientes ecuaciones:

Para C > 1O"7»96 M

Para C < 1O~7»96 M

Teniendo en cuenta los resultados de AF de las Tablas LV (24 h), LXI(1 semana) y LXVII (1 ssmana en solución de CMU y la semana siguienteen solución nutritiva sblo).

AF = -86,79 - 31,76 log 1 0

100 logiQC* 776,12"•-izn-

Conc.de CMÜ

en la solución(M)

io-10

10-9

10-8

10-7

lo"6

10-5

Concentración en la

24

6,56

5,34

4,32

4,15

3,99

1.19

h

X

X

X

X

X

X

10-9

lo"8

10-7

lo"6

10-5

10

hoja

1 semana

1,34

1,26

9,19

9,01

7,98

3,37

X

X

X

X

X

X

10-8

10-7

10-7

lo"6

10-5

10

después

1

1

9,

9,

5,

4,

4,

2,

de:

semana

semana

65

66

21

85

01

27

X

X

X

X

X

X

10-9

10-8

10-7

10-6

10-5

10 f

24

65

53

43

41

39

11

veces

h

,60

,40

,20

,50

,90

.90

en la solución

1 semana

134

126

91,

90,

79,

33,

90

10

80

70

1 semana

1 semana

96,

96,

52,

48,

40,

22,

50

60

10

50

W

70

I

VO

TABLA LXXIV.- Concentración estimada de CMU en las hojas de plantas de tomate despuésde diferente tiempo de absorción radicular. Los valores están obtenidosa partir de las siguientes ecuaciones:

Para C > 1O"7»96 M

Para C < 1O"7'96 M

AF = -56,96 - 16 logio C

100 logiQC + 496,763,71 +

AF =

Teniendo en cuenta los resultados de AF de las Tablas LVI (24 h), LXII (1semana) y LXVIII (1 semana en solución de CMU y la semana siguiente ensolución nutritiva sólo).

Conc.de CMUen la solución

(M)

io- 1 0

lo"9

10-8

10-7

lo"6

10-5

10-*

Concentración

24

1,90

1,65

9,30

4,02

•1 ,31

1,15

4,85

h h

X

X

X

X

X

X

X

lo-8

10-7

10-7

10-6

10-5

10-*

10-*

5,

h,

2,

6,

4,

2 ,

en

1 t

31

29

48

96

58

92

l a hoja

semana

X

X

X

X

X

X

-

lo"8

10-7

lo"6

lo"6

10-*

10-3

iespués de:

1 semana

1 semana

3,26 x

3,10 x

1,70 x

5,67 x

3,59 x

2,16 x

-

lo"8

10-7

lo"6

10-6

lo"*

10-3

24

190

165

93

40

\3

11

4


h

, 20

, 1 0

,50

,85

1 semana

531

429

248

69,60

45,80

29,20

-

1 semana

1 semana

326

310

170

56,

3%

21 ,

-

» ' •

70

90

60

DISCUSIÓN DE RESULTADOS

- 196 -

4. DISCUSIÓN DE RESULTADOS.

4.1. EFECTO DEL CMO SOBRE EL DESARROLLO DE LAS PLANTAS.

Las observaciones realizadas sobre la influenciadel CMU en el desarrollo de las diferentes especies vegetales estudiadas, tanto en tratamiento agudo coao encrónico, concuerdan con los datos obtenidos por Minsbsül(1957), Smith y Sheets (1967) y Ashton y Crafts (1973).

De la observación de los resultados obtenidos JHra el tratamiento crónico, se puede deducir que, cuan-do la concentración de CMU en la solución nutritiva esmuy pequeña (del orden de 10 M ó 10"11 M), no exis-te ningún efecto apreciable sobre el desarrollo de lasmisaas, cualquiera que sea la especie vegetal tratada.Para concentraciones del orden de 10 M, parece queexiste, de forma invariable, un efecto estimulante, enprácticamente todas las especies vegetales tratadas yque se manifiesta por un desarrollo mejor de la plantacon un mayor número de hojas en comparación con el tes¡tigo sin tratar.

Cuando se utilizan concentraciones de CMO del orden de 10 7 M se empiezan a observar, entre los 25 y los28 días de tratamiento, la aparición de síntomas fito-tóxicos caracterizados por manchas de color verde claroen las márgenes y porciones apicales de las hojas s e —guidas de otras grisáceas o plateadas y un amarillea—miento de las mismas sin llegar a un marchitamiento total.

Este fenómeno es mucho más acusado cuando se utilizan concentraciones de CMO del orden de 10 M, obsej?vándose ya diferencias apreciables de sensibilidad oresistencia características para cada especie vegetal.

- 197 -

Así, mientras que la cebada y el trigo presentan sínto,mas fitotóxicos a los 15 y 18 dias de comenzar el tra-tamiento, el maíz, la judia y el tomate, los presentana los Z\ dias del comienzo del mismo, siendo la avenala especie más resistente (25 dias).

Si se utilizan concentraciones de CMU todavía su,periores (1O~' M), los efectos fitot5xicos se oanifie£stan claramente para todas las especies tratadas en pe-riodos que oscilan entre los 9 días de tratamiento parala gramínea más sensible (cebada), y 17 dias para lamás resistente (avena). Para esta concentración, existeya expresión clara de letalidad con marchitamiento to-tal y abscisión en cebada (a los 18 dias), trigo y to-mate (a los 21 dias), judia (a los 22 días), maíz y ave,na (23 dias) con detención, tanto del crecimiento comode la aparición de nuevas hojas.

A partir de concentraciones de CMU del orden de10 M la fitotoxicidad de este herbicida es muy acusada para todas las especies vegetales estudiadas, siendoespecialmente sensible el tomate, en el que aparecen -síntomas de marchitamiento a los k dias de tratamiento,y en la cebada, que aparecen a los 7 dias del comienzodel mismo; en el maíz tardan 11 dias en aparecer y 13en la avena. Para esta concentración de CMU, no se desarrollan prácticamente las plantas y sólo aparecen nue-vas hojas, aunque muy escasas en número, en avena ytrigo. En la judia, aparecen algunos folíolos, pero lasplantas no se desarrollan.

En todos los casos, la expresión clara de la le,talidad puede observarse entre los 3 y los 18 dias apartir del comienzo del tratamiento.

Para concentraciones de CMU aún mayores, del orden de 10~* M, los síntomas fitotóxicos aparecen en la

- 198 -

18 semana de tratamiento, excepto en el caso de la ave.

na, que se manifiestan a los 10 días del comienzo del

mismo, oscilando la expresión clara de letalidad entre

los 4 y 6 días para las Dicotiledóneas (judia y toma-

te) , 8 para la cebada, que es la gramínea más sensible

al CMÜ, y 11, 12 y 1 ¿f para el maiz, trigo y avena res-

pectivamente. En ningún caso, las plantas se desarro-

llan ni aparecen hojas nuevas.

Cuando se utiliza una concentración del orden de

10 M, la fitotoxicidad aparece desde el 1er* dia de

tratamiento, excepto en el caso del trigo y de la ave-

na, que aparece a los 3 y 6 dias respectivamente del

comienzo del mismo. £1 marchitamiento es muy rápido y

se observa expresión clara de letalidad.

En resumen, se puede concluir que, en trataaien

to crónico, concentraciones de CMü inferiores a 10" K

no producen efecto fitotóxico objetivable en las espe-

cies vegetales estudiadas.

Concentraciones del orden de 10" M producen ,

en general, estimulación de las mismas con aumento, tari

to de su desarrollo general como del número de hojas .-Q -8

Concentraciones comprendidas entre 10 7 H y 10 M pro

ducen efectos fitotóxicos sin llegar al marchitamiento

total ni a la abscisión de las hojas, lo que ocurre -

cuando se emplean concentraciones del orden de 10 'Mo

superiores, siendo las Dicotiledóneas estudiadas (judía

y tomate), más sensibles al CMU que las Gramíneas. De

estas últimas, la más sensible ha sido la cebada seguí,

da del maíz, y las más resistentes la avena y el trigo.

Para concentraciones de CMÜ superiores a 10"' M, ya

existe expresión clara de letalidad en todas las espe-

cies vegetales estudiadas, siendo variable el tiempo de

supervivencia de cada una de ellas.

- 199 -

En el caso del tratamiento agudo (durante una gecana), se puede observar claramente un efecto detoxificante y estimulante en las plantas de trigo y judia para la concentración de 10"° M. Para las otras especiesvegetales ensayadas, se observa un efecto detoxifican-te, pero no estimulante, para concentraciones de CMUdel orden de 10 M con retraso en la aparición de sintosías de marchitamiento.

Las.plantas, en ambos casos, adquieren un desa-rrollo similar o ligeramente superior al testigo, conun número parecido de hojas.

Para concentraciones del orden de 10 r M, se ob,serva un retraso, tanto de la aparición de síntomas decarchitamiento cono en la expresión de la letalidad para todas las especies tratadas, siendo aás manifiestala detoxificación en plantas de cebada, trigo y judia,en las que el número de hojas al final de la experien-cia es muy similar al de las plantas testigo.

Este mismo efecto se observa para todas las Gramineas cuando se utilizan concentraciones de CKU del -orden de 10 M, mientras que en las Dicotiledóneas -(judia y tomate), los síntomas fitotóxicos son irrever,sibles. Sin embargo, para esta concentración de CMU, lasGramíneas no llegan a sufrir una detoxificación completa y, tanto el crecimiento general como el número dehojas, son menores en comparación con las plantas sintratar.

Para concentraciones de CMÜ mayores a 10 M nose observa recuperación en ningún caso.

En resumen, podemos considerar que tras el tra-tamiento agudo, durante una semana, con diferentes concentraciones de CMÜ, se observa una detoxificación va-riable según las especies ensayadas, más acusada en las

-200 -

Gramíneas y que se hace más manifiesta para aquellasconcentraciones de CMÜ en que los sintonías fitotóxicos,por tratamiento crónico, se comenzaban a hacer claramente evidentes (10 M y 10"' M ) , alcanzándose, en el ca,so de las Gramíneas, un desarrollo casi normal.

Para concentraciones de CMU del orden de 10 M,la detoxificación existe, pero las plántulas están tandañadas, que tanto el desarrollo general COQO el núme-ro de hojas, son inferiores al noraal, e incluso en ju,día y tomate, el efecto fitot&xico producido ya esirreversible. Esta concentración podría considerarse 3alímite por encima de la cual, ya no es posible una de-toxificaci&n en ninguna de las plantas tratadas.

- aoi -

4.2. EFECTO DEL CMÜ 30BHE LA ABSORCIÓN BADICULA3.

De la observación de los resultados que se expre,san en las Tablas XXII y XXIII, se puede deducir que elmonurón se absorbe fácilaente, por vía radicular, entodas las especies vegetales ensayadas.

La velocidad de absorci&n del herbicida se cara,cteriza por una fase inicial rápida seguida de otra lenta hasta alcanzar un punto, característico para cada e,specie vegetal y para cada concentración de CMÜ, en quela velocidad de absorci&n tiende a cero (Smith y Sheets,1967).

Como ya observaron García (1972) y Sancho (1975)»trabajando en plantas de Judía y cebada, no se puedeestablecer una proporcionalidad directa entre la con-centración de CMU alcanzada en las hojas y la que existía inicialnsente en la soluci&n nutritiva, siendo tan-to mayor la absorción relativa cuanto cenor es la con-centración inicial del herbicida.

Se comprueba también (Tabla XXIV), que para iguales concentraciones de CKÜ en la solución nutritiva, -existen diferencias apreciables de concentración de herbicida en las hojas de las diversas especies vegetales,tanto a las 2k horas coso a la semana de tratamiento ,diferencias que son más acusadas cuanto aenor es la concentración inicial de CMU, siendo a las 2.k horas de tratamiento del orden de unas 10 veces para la judia, 20para el tomate, 25 para la cebada, 30 para el maíz, kOpara la avena y 5h para el trigo.

Al aumentar la concentración de CMÜ en la solu-ción nutritiva, la diferencia de concentración en lashojas de las diversas especies vegetales tratadas sehace aenor, hecho que podría explicarse por la diferert

te capacidad raetabólica de cada una de las especies ve,

getales ensayadas, lo que a su vez, explicaría la dife.

rente sensibilidad de las especies vegetales al efecto

fitot&xico de este herbicida (Steckó, 1971).

De la presente discusibn y como puede observar-

se de los resultados obtenidos en las tablas antes aen

cionadas y en las fisuras correspondientes, la veloci-

dad de absorción disminuye al aumentar la concentración

de CMU en la solución y al ausentar la duración de la

experiencia. Este hecho confirmaría la hipótesis de los

autores arriba mencionados sobre la existencia de un

transporte activo para la incorporación del CMU a las

raíces. Este transporte activo estaría inhibido a con-

centraciones elevadas de CMU a causa del mecanismo de

acción de este herbicida. Como ya coaentaaos en el pun,

to 1.3.;4, el CMU afecta de nodo adverso a los niveles

de producción de hidratos de carbono en las plantas -

(Cooke, 1955)» y en las algas aarinas (Walsch y Grow,

I97D, llegando incluso a producir inhibiciones supe—

riores al 60% en las especies más susceptibles. Dissü

nuye, por tanto, el contenido energético necesario pa-

ra todos aquellos procesos que requieren energía aeta-

bólica. Este es el caso de la absorción activa, y por

tanto, cabe pensar que una disminución del contenido en

hidratos de carbono haga disminuir ostensibleoente e

incluso anule el transporte activo. Observación que es_

tá de acuerdo con los trabajos de Minshall (I960).

- 203 -

if.3. EFECTO DEL CMP SOBRE LA FOTOSÍNTESIS.

¿f.3.1. En hojas de planta completa.

La asimilación de CO, es muy sensible a la pre-sencia de CMÜ, según comprobaron desde hace ya dos dé-cadas V/essels y Van Der Ween (1956), Minshall (1957),-Ashton y col. (1961) y Davis (1966).

Trabajando con ^C02 en plántulas de cebada, Sancho (1975) observo que existia una inhibición gradualde la fotocarboxilaci&n en funcibn de concentracionescrecientes de CMU, siendo ésta completa para concentraciones de herbicida del orden de 10"^ M.

De los resultados de nuestras experiencias, ex-presados en las Tablas XXV y XXVI, puede observarse queexiste un efecto análogo con diferencias significativasentre las diversas especies vegetales ensayadas.

Concentraciones de CMÜ del orden de 10 ' M, ab-sorbido radicularmente durante 2h h, producen una inhibici&n de la asimilación de CO^ en las plantas de cebada, avena, trigo, judía y tomate que oscila entre el2 0 % y el 13% respecto al testigo no tratado. En lasplantas de maíz, la inhibici&n fue del 2.8%, diferenciaque es significativa (P: 95%) con respecto a las demásespecies tratadas.

Para concentraciones de CMÜ del orden de 10 M,se observan amplias diferencias de A.F. entre las diversas especies vegetales estudiadas. Asi, mientras que enjudia y tomate, la A.F. relativa es del orden del 6 0 %respecto al testigo no tratado, en cebada y avena esaproximadamente del 50%, en trigo del 3 8 % y en maizdel 2.k%. Al parecer, esta concentración es una de lasmás relevantes en cuanto a la objetivaci&n de diferen-cias de sensibilidad al CMÜ entre las distintas especies tratadas.

- 204 -

Se puede observar que, para esta concentración,

las especies menos sensibles son el tomate y la judia,

no existiendo diferencia estadísticamente significati-

va entre ellas, mientras que si existe (P: 95%) con

las Gramíneas.

Concentraciones de CMU del orden de 10"^ H son,

en general, muy toxicas, y aunque las diferencias de

A.F. relativa entre las especies vegetales no son muy

elevadas, son estadísticamente significativas (P: 99%) .

Los valores encontrados oscilan entre aproximadamente

un 18% para judia, un 16% para tomate, un 6% para -

cebada y del 4% al 3 % para maíz, avena y trigo.

Para concentraciones de CMU del orden de KJ 1" M,

la A.F. queda completamente inhibida en todas las espe,

ciss vegetales ensayadas, confirmando los resultados -

obtenidos por Sancho (1975).

Cuando el tratamiento se prolonga por espacio de

una semana, se puede observar que para las plantas que

han absorbido radicularaente CMO a concentraciones del

orden de 10 ' M, el valor más elevado de Á.F. corres-

ponde al trigo (75%)t seguido de la judía y avena

(aproximadamente el 65%), siendo las especies más sen

sibles el naíz (50%), el tomate (46%) y la cebada

(34%). Las diferencias encontradas son significativas

(P: 99%) para la cebada, maíz y tomate, y significati

vas con una probabilidad del 95% para la avena.

Si coaparamos estos resultados con los corres-

pondientes a la aparición de manifestaciones fitotoxi-

cas, observadas visualmente, comprobamos que es a esta

concentración cuando comienzan a objetivarse por trata

miento crónico. Al cabo de una semana, la A.F. de las

distintas plantas tratadas, se ha reducido aproximada-

mente a la mitad y equivale a una concentracibn teórica

- 205 -

de herbicida en la hoja de unos 5 x 10 M para las

Gramíneas, 2,5 x 10" M para la judia y 2,5 x 10"^ M

para el tomate (Tabla XXIII). Se observa también, que

el efecto fitot&xico producido a esta concentración de

herbicida no es irreversible, pues se puede conseguir

la detoxificaci&n progresiva de las plantas hasta recu,

perar, al cabo de un oes, las condiciones normales de

desarrollo.

Con concentraciones de CMÜ del orden de 10 M,

se observa una notable disminución de la A.F. en las

hojas de las diferentes especies vegetales tratadas ,

mostrándose como más resistentes la avena y el maiz -

(10%) y más sensibles el trigo (6%), cebada, judia y

toaate (3%).

Si compararnos estos datos con los síntomas fito

tóxicos observados, se coaprueba que existe correlación

para todas las especies vegetales estudiadas, lo cual

es l&gico, pues, a las Zh horas de tratamiento, ya se

ha alcanzado en las hojas una concentraci&n suficiente

de herbicida para que la actividad fotosintética de las

mismas se haya reducido en un 50% e incluso más, para

el trigo y el maíz. La concentraci&n te&rica de CMÜ al

canzada en las hojas es de lO"-7 M o superior en todos

los casos estudiados, por lo cual, cabría pensar que

pudiera ser ésta la concentración necesaria para produ

cir efectos letales en la judía y el tomate, mientras

que en las Gramíneas, es posible todavía una detoxifi-

caci6n objetivamente observable aunque incompleta.

El hecho de que, para esta concentraci&n de CMÜ

en soluci&n nutritiva, exista una diferencia menor de

concentraci&n te&rica de herbicida en las hojas de las

diferentes especies vegetales que la que existe cuando

la concentraci&n es del orden de 10-7 M, estaría de -

acuerdo con la hip&tesis, ya mencionada, de la existencia

- 20é -

de un transporte activo que se inhibiría para concen-

traciones elevadas de CMÜ a causa del mecanismo de ac-

ci&n de este herbicida.

Las plantas que se han mantenido con concentra-

ciones de CMÜ del orden de 10"^ M y 10"^ M no sobrevi-

ven, en la mayoría de los casos, a la semana de trata-

miento, y en aquellas plantas en que no se ha observado

expresión de letalidad, la A.F. de sus hojas se puede

considerar casi nula y está en el límite de detecci&n.

Esto se debe a que las concentraciones teóricas alcan-

zadas en las hojas respectivas son del orden de 10™^ M

en cebada, avena, trigo, judia y tomate y de 1,54

M en maíz. Como puede observarse, los valores de concen

tracion tebrica de herbicida encontrados en las hojas

de las diferentes especies tratadas, cada vez son más

pr&xiaos.

Concentraciones del orden de 10~4 M en la solu-

ción nutritiva, alcanzan ya, desde las 2k h de trata-

miento, concentraciones en la hoja próximas o superio-

res a "\Q M que producen efectos letales en todas las

plantas.

Como resumen, podemos decir que se observa una

concordancia, en funci&n del tratamiento, entre la apa

rici&n de síntomas fitot&xicos y la inhibición de la

fotocarboxilaci&n en plantas de las diversas especies,

sometidas al mismo tratamiento.

Las diferencias entre especies son más aprecia-

bles, por tratamiento agudo para concentraciones deCMÜ

en la soluci&n nutritiva del orden de 70 M, y por tra

tamiento crónico, para concentraciones en la soluci&n

del orden de 10~7 M.

- 207 -

Como ya hemos comentado en diversos apartados,

el hecho de que unas plantas sean más sensibles que

otras a este herbicida y que para análogos trataaien-

tos, las concentraciones alcanzadas en hojas de dife-

rentes especies sean distintas, así como su A.F., pue-

de deberse a la variabilidad metab&lica inherente a

cada especie vegetal tratada.

k.3.2. En cloroplastos aislados de hojas•

Los resultados obtenidos al tratar fragmentos

de cloroplastos aislados de hojas de diferentes espe-

cies vegetales con diversas concentraciones de C M ,

expresados en la Tabla XLI, muestran una acción inhibi,

toria gradual de la reacci&n de Hill, que es función de

la concentración de herbicida y diferente según la es-

pecie vegetal considerada.

Se puede observar que, para todas las especies

tratadas, la capacidad fotorreductora de los cloroplas

tos es sensible a concentraciones de CMU del orden de—3

10 M con una respuesta inhibidora coaprendida entre

el 10% y el 15%, existiendo una diferencia signifi-

cativa (P = 99%) entre los cloroplastos de judia, que

son los más resistentes para esta concentración,y los

ie trigo y tosíate, que son los más sensibles.

Al aumentar la concentración de inhibidor, dis

minuye la capacidad reductora de los cLoroplastos y así,

para concentraciones del orden de 10"' M, se observa

una disminución que oscila entre aproximadamente un

26% para el tomate, un 20% para avena y trigo, un \k%

para maíz y judia y un \í% para cebada, con una dife

rencia significativa (P = 99%) entre la cebada y la

avena, trigo y tomate.

- 208 -

Cuando se utilizan concentraciones de CMU del

orden de 10 M, la capacidad reductora de los cloro-

plastos, disminuye notableaente, encontrándose que, pa

ra judía y tossate, ésta es la concentración que produ-

ce el PI50» dato que concuerda con los encontrados por

Wessels y Van Der Veen (1956), Bishop O958), Gingras

y col. (1953), Gingras y Lemasson (1965), García(1972)

y Sancho (1975).

Para avena y naíz, la inhibici6n ha sido de apro

xiaadamente el kO %, para trigo del 33 % y para cebada,

que se muestra coao aás resistente, del 27%, existien

do una diferencia significativa (P = 99%) entre los

valores encontrados para esta especie y los correspon,

dientes a avena, aaiz, judia y toaate.

Concentraciones de CMU del orden de 10"^ M, pro

ducen inhibición superior al 30% en todos los cloro—

plastos tratados. Como se ha observado a lo largo de

toda la experiencia, los cloroplastos de cebada y judía

son los aás resistentes, mientras que los de tomate son

los aás sensibles, siendo intermedios, y de un orden -

parecido, los de avena, trigo y maíz. La diferencia en

contrada entre la inhibición de la capacidad fotorre—

ductora de los cloroplastos de cebada y los de las de-

más especies estudiadas ha sido significativa (P = 99 %\

Concentraciones de CMU del orden de 10 M, pro

ducen una inhibición de la capacidad fotorreductora de

los cloroplastos de judia de aproximadamente el 89% ,

en los de cebada, avena y trigo de un 9 W y es supe-

rior al 96% para los de maíz y tomate. Para esta con-

centración se puede considerar que la inhibición es ca

si coopleta, existiendo una diferencia significativa

(P = 99%) entre la producida en cloroplastos de judia

y en los de las demás especies estudiadas.

- 209 -

Se ha encontrado una correlación entre la acti-vidad fotorreductora (Afr) de cada una de las especiesvegetales estudiadas y la concentración de CMÜ (TablaXLII).

Esta correlación es lineal y satisface a la ecuación de la recta:

H = A + B

para concentraciones de CMU>.10 ' M, excepto en el ca-so de la cebada que lo es para concentraciones de OÍU>. 10 M; mientras que, para concentraciones de CMÜ<\0-7 M, con la excepción ya mencionada de la cebada,que es la especie que se ha mostrado significativamente más resistente (P = 99%). Para la mayoría de lasconcentraciones estudiadas, la correlación existentesatisface a la ecuación de la hipérbola:

100 logtQ C + DS + logio C

en la que:

H = Capacidad fotorreductoraC = Concentración de CMUA y B= Constantes de la rectaD y E s Constantes de la hipérbola

Si coaparamos los resultados obtenidos con lospublicados por los autores antes mencionados» se puedeobservar que, en general, el PI50 se ha calculado di-rectamente a partir de la concentración de inhibidorañadida a la mezcla de reacción, lo que no prueba cuáles la concentración real de herbicida en el interiordel cloroplaeto capaz de actuar en la reacción de in-hibición pues, una parte de este herbicida puede

- 210 -

asociarse a coapuestos que no intervienen en la reac-

ción fotoquímica y que, por lo tanto, no participan en

la respuesta inhibitoria.

El cooportaBiento de los inhibidores de la rea¿

ci6n de Hill, ha sido evaluado por Hansch (1969) por

análisis de regresión múltiple, incluyendo en sus ecua

ciones térainos relativos a factores o constantes ele£

tr6nicos, estéricos, de polaridad y de coeficiente de

partición y ha establecido una relación entre el PI ex

presado en función de la reacción de Hill y los parárae

tros fisico-quíaicos de un determinado grupo de herbi-

cidas, lo que permite considerar a la reacción de Hill

coso un sistema "in vitro" capaz de identificar la fi-

totoxicidad potencial de un grupo de productos químicos

e indica la sensibilidad que podría esperarse si la ao

lécula de herbicida alcanzase los cloroplastos sin su-

frir ninguna alteración previa. Sin eabargo, "in vivo",

existen auchos factores que pueden iapedir que la solí*

cula original del herbicida alcance los cloroplastos,

COBO son: comportamiento y disponibilidad del inhibidor

en el suelo, absorción radicular, traslocación en la

planta, biotransformación con posibilidad de dar lugar

a aetabolitos más tóxicos que el producto de origen y

sensibilidad específica inherente a cada especie vege-

tal y que García (1972) expresa como relación CMU-cloro

fila necesaria para producir el PI50 en cada especie -

considerada.

Esta sensibilidad específica no se Manifiesta so

lo frente a los distintos inhibidores; ya los cloroplas

tos sin tratar muestran una AFr diferente. Coao puede

observarse en las Tablas XXXV (cebada), XXXVI (avena),

XXXVII (trigo), XXXVIII (maíz), XXXIX (judia) y XL (to,

aate), los valores de AFr de los cloroplastos sin tra-

tar de cada una de las especies vegetales mencionadas,

- 211 -

expresados en wnol 0-, (ag clorofila ) • nsin son res-pectivaaente: O,k¿Gk; 0,¿*2 9; 0,3781; 0,3153; 0,4132 yO»^835f valores que se han considerado como el 1005o derespuesta.

Los cloroplastos de tomate que presenta una AFrmayor, son los más sensibles a la acción dsl CMÜ, mien-tras que los de cebada y avena, que tienen una AFr si-milar, presentan una sensibilidad muy diferente, pro—pia de cada especie, para este inhibidor de la reaciónde Hill.

De lo dicho anteriormente se comprende la difi-cultad que existe para coaparar los resultados obteni-dos al determinar el efecto del CMÜ en la A.F. de hojasde planta coapleta en los que intervienen todos los faj:tores mencionados, con los encontrados en la reacciónde Hill. Asi, mientras que por absorción radicular, sehan mostrado más sensibles al CMU las Dicotiledóneas, yla cebada, en cloroplastos aislados, la cebada y la judia son las especies más resistentes.

Concentraciones de CMU del orden de 10 ' M, ab-sorbidas radicularmente durante 2h h, que correspondena una concentración en las hojas de unos 10 M a5 x 10"' M, producen una inhibición en la asimilaciónde C0 2 en plantas de cebada, avena, trigo, judia y to-mate que oscila entre el 20% y el 13% con respecto altestigo no tratado, y del 23% en las de maíz, ai entrasque una concentración de ese orden en la cubeta que contiene los cloroplastos, en la reacción de Hill, produ-ce aproximadamente el 50% de inhibición para la mayo-ría de las especies tratadas, con excepción de la ceba,da que, como hemos comentado, se muestra más resisten-te. Esto indica que del total de CMÜ que alcanza la ho

ja, no todo es biológicamente activo ni se une por igual

- 212 -

a los centros activos e incluso, puede haberse biotrans

formado dando origen a coapuestos de diferente toxici-

dad que podrían explicar las diferencias de resisten—

cia o sensibilidad encontradas para las distintas espe

cies en los distintos estudios realizados.

A conclusiones análogas llegaríaaos si coopara-

aos concentraciones mayores de CMU, del orden de 10 M,

aunque en este caso, habría que considerar también, la

influencia de otros efectos tóxicos que este herbicida

produce sobre la absorción y el transporte activo que -

tienen su origen en el efecto producido sobre el ceta-

bolistao glucídico y que ya se ha discutido en el punto

4.2. Este efecto se pone bien de manifiesto en las Ta-

blas LXXV y LXXVI, en que se comparan la A.F. relativa,

en planta completa, con la respuesta que se obtendría

en la Reacción de Hill si a la cubeta de reacción se

añadiera la concentración de CMU que teóricamente se

alcanza en las hojas de las diversas especies después

de 24 h y 7 días de tratamiento.

Es necesario señalar una característica de los

inhibidores de la reacción de Hill, que es la reversi-

bilidad de su acción, es decir, que pueden ser eluidos

fácilmente de los cloroplastos, con recuperación de la

actividad de Hill, lo que sugiere que este inhibidor se

une al centro de reacción en el cloroplasto por enlaces

de hidrógeno (Hansch, 1969). Este hecho explicaría la

detoxificación observada en las plantas sometidas a tra

taaiento agudo durante una seaana, cuando la concentra

ción de herbicida en la solución nutritiva es<10""' H

y que se ha discutido en el punto 4.1.

En conclusión, podemos decir que el CMU es un in

hibidor de la reacción de Hill y que actüa interrum-

piendo el transporte electrónico, por lo que impide la

I AMI. A LXXV . - Efecto comparativo do la inhibición On la Actividad FotaalnttfMca (A.* , ) | » r dlveraau conci ulraclonea d* CMU *n f m^miLi» <la cli>m|>l.i^tu9(Keaucion do H i l l ) y en liojan da plaiktaa trutad*a con CMU üiiiiti.bo 24 lora* .

Loa valorea de A.F» relat iva en cloroplautua alalatl*»*., jura iaa coiicuntraclunea uti i lzatfaa, eat lit calculados |«r • xtrapulttvfd'ti. nt i 1 i- mulol*s «cuaoionea do Ja Tibia XL1I,

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TABLA LXXV1*>- E foe to cuMparativo d« l a i n h i b i c i ó n do l a Act lv l t lad Fotoui i i te t ica ( A . F . ) por d lvuraa* citncentracionoa «lo CMU e» fragmento* d» cloro|>l u(Koaccldn d« H U Í ) y on lio j a s da p lantas t r a t a d a * con CMU durante 7 «lian.

Loa valorea de A.tV* r e l a t i v a on clvro|»Ia»toa alctladaii, |»era l a s concent rac ione* u t i l i z a d a * » e « t i n calculados f o r extra|H»]act¿ii, u t l l i ^I B A acuaulnnoa da l a Tabla JliLlI.

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46,32

3,13

- 215 -

reducción del DPIP por el citocromo b o la plastoqui-nona reducida. La acción inhibidora es función de laconcentración de herbicida, quedando totalmente inhibí,da para concentraciones en la cubeta de reacción supe-riores a 10"^ M.

El efecto es reversible, pudiendo recuperárselacapacidad fotorreductora por elución de los cloroplas-tos.

Es de señalar que este método proporciona un sistema "in vitro" sencillo y útil, que permite identifi-car la toxicidad potencial de un herbicida o grupo deherbicidas, e indica la sensibilidad que podría espe-rarse si la aolécula original de herbicida alcanzase -los cloroplastos. Sin embargo, los valores encontradosno pueden correlacionarse estrechamente con los propor,cionados por un método "in vivo", debido a los innuae-rables factores que impiden que la molécula de herbicida sin transformar alcance los centros activos del cíoroplasto.

4.3.3. En Chlorella.

Desde que en el año 1919» Warburg introdujo elalga unicelular Chlorella en sus estudios sobre foto-síntesis, son numerosos los autores que han utilizadoeste organismo en sus trabajos de investigación. En loque respecta a aspectos concretos de su utilización cj)mo bioensayo, cabe destacar los trabajos realizados porGingras O966), Addison y Bardsley (1968), Kratky yWarren (1971 a, b), Sargent y Taylor (1972), Stuart yGañón (1972 a, b) y Cheniae y Martin (1973), aunque, enrealidad, están enfocados principalmente a la determi-nación de residuos de herbicidas en suelos pero no entejidos vegetales.

- 216 -

En nuestro trabajo, hemos tratado una suspension

de Chlorella pyrenoidosa con diversas concentraciones de

CMU, observando que se produce una inhibición gradual

de su actividad fotosintética que, como puede observar

se en la Tabla XLIII, es función de la concentración de

herbicida.

Concentraciones de CMÜ del orden de 10 M pro

ducen una inhibición del desprendimiento neto de 0¿ por

la suspensión de algas de alrededor del 5 %, lo que nos

induce a decir que el método polarográfico, utilizando

Chlorella, es más sensible que el de la reacción de HilL,

que eaplea cloroplastos aislados de hojas de plantas -

tratadas.

Concentraciones de CMÜ del orden de 10 7 M pro-

ducen una inhibición del desprendimiento de 0 2 de un

25 56.

Al ir aumentando la concentración de herbicida,

la A.F. del alga Chlorella disminuye, hasta llegar a

un 9% para concentraciones de CMÜ del orden de 10™^ M.

Cuando la concentración de CMÜ es del orden de

10"^ M, se puede considerar que el desprendimiento ne,

to de O, es prácticamente nulo.

Se ha encontrado una correlación entre la A.F.

del alga Chlorella y la concentración de CMÜ que satis

face a la siguiente ecuación de la recta:

A.F. = A + B logjo C

en la que:

A.F. = Actividad fotosintética

C = Concentración de herbicida

A y B = Constantes de la recta que, en nuestrocaso, adquieren los valores de -84,4746y -17»93 respectivamente.

- 217 -

Es difícil establecer una comparación entre los

resultados encontrados por nosotros y los de la biblio

grafía por la diversificacibn de los métodos siallticos

utilizados, asi como por las diferentes procedencia y

cepa de las algas, contenido en Clorofila y condiciones

de cultivo, luz y teaperatura empleadas en cada ensayo.

Si realízanos un estudio analógico, podemos ob-

servar que Geoghegan (1957) y Maloney (1958), utilizan

do un método turbidiaétrico, encontraron que concentra

ciones de CMU del orden de 2,5 x 10 M inhibían el ere

ciaiento noraal de 33 especies diferentes de algas, dejs

pues de permanecer durante 1 semana con este herbicida.

Addison y Bardsley (1968), por el mismo aétodo, anali-

zaron residuos de diurfen y atrazina en extractos de sue,

los y lo compararon con el aétodo del creciaiento de la

avena, demostrando su utilidad en cuanto a que permite

detectar pequeñas concentraciones t&xicas, desde el puii

to de vista biológico de estos herbicidas.

Cheniae y Martin (1973), trabajando con Chlore-

lla vulgaris sin tratar con inhibidor y utilizando un

método polarográfico, han encontrado unos valores de -

desprendimiento de Op fotosintético de 15»9 «soles de

C^/og Clorofila/ain, que son bastante pr&xiaos a los

nuestros, que corresponden a 22,2 emoles de C^/mg Clo-

rofila/ain.

En los trabajos de Gingras (1966), que emplea -

también un método polarográfico, se obtiene el PI50 d e

la A.F. de una suspensi&n de Chlorella, oantenidas a

20°C para concentraciones de C M de 3 x 10"' M, que sen

también del aisao orden que las encontradas por noso-

tros.

Con respecto a la actividad respiratoria en la

oscuridad, se observa en la Tabla XLIII que la depen—

- 218 -

dencia de la concentración no es tan fuerte coso en el

caso de la fotosíntesis, asi, el efecto tóxico empieza

a observarse a partir de 10 7 M de CMU y disminuye de

forma gradual, pero no tan aarcada como para la A.F.,

alcanzándose el PICQ P-ra concentraciones de herbicida

de 10"* M, concentración para la cual la respuesta fo-

tosintética es despreciable.

El hecho de que los efectos del CMU sean arucho

más careados sobre el desprendimiento de 0^ a la luz,

que sobre la respiración en la oscuridad, nos ha peraú

tido seleccionar la respuesta fotosintética de Chlore-

lla como base para el desarrollo de nuestro bioensayo.

Si se compara el efecto inhibidor del CMU sobre

la A.F. de algas con el correspondiente obtenido con cío

roplastos aislados de las hojas de las especies estu—

diadas (Tabla LXXVIi), se observa que la Chlorella es

bastante más sensible que los cloroplastos aislados, ya

que se manifiesta una cierta sensibilidad para concen-

traciones de CMU del orden de 10-10 M y es significat¿

vamente marcada para concentraciones de herbicida de 10"9

M, siendo la inhibición producida en la A.F. superior

al 90^ para concentraciones de herbicida de 10*5 M.

En cloroplastos aislados de hojas de las diver-

sas especies tratadas, la sensibilidad al CMU comienza

a notarse de forma marcada para concentraciones 100 ve.

ees mayores (10~? H). A concentraciones de CMU de 10~5

M, la reducción en la A.F. oscila entre el 60% y el ?0%.

En resumen, podemos decir que, el método polaro-

gráfico utilizando Chlorella como organismo de bioensa

yo, es útil y sensible para detectar pequeñas concentra

ciones tóxicas de herbicida, siendo su sensibilidad na

yor que la del que utiliza cloroplastos aislados y más

realístico en cuanto a que determina "in vivo" los -

efectos tóxicos de los inhibidores.

TABLA LXXVII.- Comparacl&n de la A.F. relativa al testigo obtenido en Chlorella(Método polarográfico) y cloroplastos de diversas especies (reac-ción de Hill), tratados con diversas concentraciones de CMU.

Los valores de A.F. relativa en cloroplastos aislados para las -concentraciones utilizadas están calculados, por extrapolación -utilizando las ecuaciones de la Tabla XLII.

^sEspecies

Tratamien t o \

0

io-1 0

10-9

io-8

10-7

io-6

10-5

Cebada

100

-

-

97,33

90,33

71,83

44,16

16,55

Cío

Avena

100

-

-

91,45

86,46

60,48

36,18

11,04

roplastos E

Trigo

100

-

-

83,67

81,61

69,95

39,39

13,83

lisiados de

Maíz

100

-

-

94,59

89,50

64,20

37,25

10,30

Judia

100

-

-

93,86

88,70

64,90

44,10

17,30

Tomate

100

-

-

86,47

76,60

52,79

28,98

5,17

Algas

100

95,22

75,02

63,48

33,64

18,27

9,12

-

VO

I

- 220 -

k.k. EFECTO DB LOS EXTRACTOS DE HOJAS DE PLANTAS TRA-TADAS CON CMÜ S035B LA FOTOSÍNTESIS DEL ALGACHLORELLA PYRENOIDOSA.

k»k.1. Curvas :de calibrado.

Al comparar los resultados del efecto del CMUsobre una suspensión de Chlorella (Tabla XLIII), conlos correspondientes a la suspensión de Chlorella conextractos de las diversas plantas estudiadas (TablasXLIV, 1XV, XLVI, XLVII, XLVIII y XLIX), se observa quela A.F. de la Chlorella es diferente dependiendo delefecto que produce el extracto de cada una de las espe,cies vegetales sobre la A.F. de este organismo.

Estas diferencias se reflejan en la Tabla LXXVIIEen la que se han resumido los resultados de las Tablasarriba mencionadas.

Debido a que los extractos de las hojas de lasdiferentes especies poseen una coloración distinta porsu diferente contenido en clorofila, la D.O. resultan-te en la suspensión de Chlorella es mayor que cuando nohay extracto de planta añadido. Además, como fácilmen-te se puede comprender, la concentración del extractode hoja ha de ser grande con el fin de poder detectarel CMU.

Dado que en la determinación de la A.F. de Calorelia pyrenoidosa por el método del electrodo de 02,1ailuminación de las Chlorellas en la cubeta de reacciónviene afectada por la coloración del extracto, la ilu-minación que reciben las Chlorellas de la suspensionesmenor que cuando no tienen extracto y, por ese motivo,el desprendimiento neto de O, es menor.

TABLA LXXVIII.- Efecto de diversas concejil Í .-K; i miou de CMU sobre e l desprendimientode O2 en suspensiones do Giil on/Lla pyrenoidosa sin ext rac to y conext rac tos de hojas pruc&di i¡i.¡u de d iversas especies vege ta les .

^ v Especies

Trata;:lento\.

0

lo" 1 0

10-9

10~8

io-7

10" 6

10"5

10"' '

Cebada

100

96,73

95,37

30,03

•'fO,O1

23,32

15,50

-

lias con ex

Avena

100

98,72

93,39

86,72

66,70

•'41,83

20,01

-

tracto;; ;1>

100

96,89

93,76

S',,38

59,38

21,87

9,30

-

).i,'i<; d t i ]

l-.alz

IÜO

96,'iO

^'9,30

^ , 1 5

71,V,

50,00

2l,/i3

-

)lan tas de

Judía

100

99, h?

97,'+8

63,87

'i7,53

12,77

3,76

Tomate

100

79,99

72,00

68,00

60,00

36,00

20,00

8,00

Algassin

exti'acto

100

95,22

75,02

63 ,'.8

33,64

18,27

9,12

-

I

ro

- 222 -

Los extractos 39 han obtenido a partir del ais-

-ao peso de hoja de partida, por lo que, los diferentes

extractos resultantes tienen diferente concentración en

clorofila, y el grado de atenuacibn luminosa que produ,

cen, taabién es diferente y, por tanto, también lo se-

rá la respuesta fotosiatética.

Este efecto se refleja claramente en las Tablas

XLIII, XLIV, XLV, XLVI, XLVII, XLVIII y XLIX en las cue

puede observarse que la A.?, de las algas viene afecta

da cuantitativamente de raodo diverso para cada una de

las plantas.

Asi, para Chlorslla sola, se ha estandarizado "b.

r3s'cuesta, sin inhibidor, "ara un desuresdí—iento neto

:,í.r- -sra la cebaaa. Z,55*¡ ?ara la avena, -,55' para

el tri^o, 0,2¿b para el r.aís, 0,3?0 para la judía y

0,312 para el to:r.ate. Las diferencias observadas entre

la A.?, relativa de las algas sin extracto y con e:ctra£

"0 ás las diferentes plantas han sido estadísticamente

significativas, con una probabilidad del 95 ?« para la

avena y el trigo y con una probabilidad del 99 ?¿ para

la cebada, aaiz y tosíate. Con respecto a la judía, no

se liai encontrado diferencias estadísticamente signifi-

cativas.

La correlaci6n existente entre la capacidad fo-

tosintética de Chlorslla pyrenoidosa y la concentración

de CHU añadida a extractos de hojas dé las diversas e,s

pecies vegetales (Tabla L) satisface a la ecuación da

la recta:

A.?. = A + 3 10^10 C

•cara concentraciones de CMU >1O~7»96 \¡

- 223 -

y a l a de l a hipérbola:

, _ 100 1osio C + DA. r . = —¿ + lCg]Q *->

- 7 96p a r a c o n c e n t r a c i o n e s de CMU 1 1 0 / > 7 K

en l a s q u e :

A.F. = actividad fotosintetica relativa

C = concentración de CMUA y 3 = constantes de la recta

D y 3 = constantes de la hipérbola

A partir de las ecuaciones ¿e regresión corres;

"* O" o~.' "~**~c""' ~ de O" "ó" K"1' Ca7'3a**a en "!33 ""^s^sct^ v: s lionas

en función del tratamiento ef-ctuado.

Sn conclusión, se puede decir que, para utilizerel al¿a Chlorella pyrenoidosa en la determinación áelos residuos de herbicidas presentes en hojas de plan-tas, se necesita realizar previamente una curva de ca-librado utilizando extractos de plantas de la caisrra ajspecie que se quiere analizar, sin tratar con CMU. Lautilización de este extracto es tatnbién necesaria paracontrarrestar si efecto de cualquier sustancia naturalque pudiera estar presente en el sisao y que afectara,de forma indirecta, la A.F. de Chlorella ya que, obte-niendo sieapre el extracto de la ciisaa forsa, la i n -fluencia de esta hipotética sustancia sería análoga. Apartir de los datos obtenidos con los diferentes e:ctra¿tos y distintas concentraciones de CMü se obtienen lascurvas de calibrado que se representan en las figuras

22k -

30 (cebada), 31 (avena), 32 (trigo), 33 (uaiz), 3k (ju

día) y 35 (tosíate) y sirven para calcular corte en trac io.

r.es desconocidas de herbicida presantes en los extrac-

tos de hojas a partir de los datos de A.F. relativa con

respecto al control sin CMU.

La sensibilidad del método vendrá condicionada

por el oscurecimiento producido por el extracto correjs

pondiente. En el caso de que se quisiera estudiar el

efecto de extractos de otros órganos o incluso de sue-

los, habría que proceder, de manera análoga, a realizar

una curva de calibrado por las aisnas consideraciones

nus acabaros ¿e expresar zas arriba.

• ' •= •

tas tratadas durante 2.k h y 7 días con CI:Ü por sbsor—

ci5n radicular y los correspondientes a las Tablas LIIí

a la LXIV en los que se refleja la concentración ¿a CMU

alcanzada en las ho^as deducidas de las tablas an~eri£

res por aplicaci&n de las ecuaciones correspondientes,

sesún se indicb en el punto 3.5.2, se pone de rnaniíies.

to que la utilización de Ghlorella pyrenoidosa co::o bi^

ensayo, ofrece grandes posibilidades para la detección

de este tipo de herbicida..

Cor,o ya se ha coaprobado con los otros métodos

utilizados, se sigue produciendo un incremento en la

concentración de CMU en las hojas respecto a la concen

tración que tenia el CMJ en la solución nutritiva y que

es variable sesú^ la especie vegetal ensayada y el ti-

po de tratamiento utilizado, resultados que son del

- 22? -

raisao orden que los obtenidos por el :r.étodo que utilizael CMU-I^C (Tabla XXIV) según se detall5 en el apar-a-do L. 2.

Con respecto a la sensibilidad del aétodo, se ob_serva que con este biosnsayo, se pueden apreciar concentraciones de herbicida de un orden de magnitud coupren,dido entre 1C0 y 1COO veces inferiores a las que se ob_tienen con isótopos radiactivos. Ssto es debido a quela actividad específica del CMU- C es pequeña y no sepueden obtener concentraciones inferiores a 10"*'' M conactividad suficiente cono para detectar la cantidad deCI-.-J- ~C contenido en las hojas.

~3. ve~tc"*c ¿3 'it"1 * 35.*'*1 el b"* csw ."''Q cor Ch2.C'r*3'"

íicaoiones cro:.'.ato¿raficas, zon obf;szz dalos productos activos, con la consiguiente dificultaden el caso de que existan intermediarios activos desc£nocidos. Por otra parte, el empleo de isótopos radiac-tivos aplicados ceno trazadores para detectar concentraciones del producto en hojas utilizando la técnica de ladilución isotópica, presenta auchas limitaciones y só-lo podría realizarse en laboratorios adecuados.

Comparando la sensibilidad del bioensayo con -Chlorella respecto a los métodos químicos o físico-qulaicos descritos en el punto 1.4.1, ss observa que, apar,te de la ventaja arriba mencionada que supone el tenerel valor biológico del producto directamente, la sensj.bilidad es también c.ayor, ya que en les ss joras casos,utilizando ;r.3tcdos de cromatografía gaseosa con detec-tor de ionización de llana o cromatografía líquido-líquido de alta presión, la detección es del orden da

- 226 -

1 a 10 n¿. 3n lo que respecta a la reproducibilidad del

aétod^, es cuy buena y sblo es preciso vigilar riguro-

samente las condiciones de cultivo del alga selecciona

da y realizar el número suficiente de determinaciones

para que el tratamiento estadístico aplicado sea co—

rrecto.

~ £27 -

if.5. PROPUESTA D3 U:? 3IGZTSAY0 ?A?,A 1VAIUA2 .^SIDUC-3 T5C0MPU2ST0.5 I;IHIBID0rS3 D3 LA A.?.

Teniendo en cuenta las consideraciones del pun-to anterior, se podría establecer un bioensayo en elque, utilizando el 2.13a Chlorella pyrenoidosa couo elesentó sensor, se podría determinar la concentración decualquier producto herbicida inhibidor de la íotosíntesis, ya que los resultados obtenidos en este trabajopara el CMü, pueden ser extrapolados a ocros compuestostales ccr;:o los restantes derivados de la urea (diurón,•r.sb^ror:} o para aquellos otros que producer, ur. sí3Cto~" n' " b"* dC'~ -ob^e •'*"* ~rci 3"ccv't'ti electrónico 211 Is " s c™

_ ?. .:.:::.:asi.7. :;•;• er.ze u3~odo radica 3:1 cue solo

será a"lic3ioZ.2 ousr.do ss ~3n.j"j la csrtesa de cue en eltratamiento herbicida se ha utilizado un solo -jiro decompuesto, y?, que, en el caso de que hubiera teseladosvarios productos con propiedades inhibidoras de la A.?.,el resultado obtenido nos indicaría el efecto global inhibidor, pero no se podrían discriminar los efectos de_bidos a cada uno de los herbicidas por separado.

Para utilizar este procedimiento se requieren -los siguientes elementos:

1) Cultivo síncrono continuo de Chlorella pyrenoi-dosa crecidas en condiciones asépticas (o de al¿una otra alga fotosintética unicelular).

2) Squipo :nsdidor de 0, en soluciones acuosas (elec.

trodo de oxígeno).

- 223 -

3) Coloriaetro para la determinación de la v.O. delos cultivos y dal contenido clorofílico en al-¿as y/o extractos.

4) Material usual de laboratorio.

5) Reactivos adecuados se.eún se indica en los apar,

tados 2.^.2, 2.4.3, 2.4.4.3, 2.4.4.4 y 2.5.1 .

ProcsQlT.lento a seguir:

Sn prir/.er lu~ar, se conprus'oa la respuesta fo~.¿;étioa da la suspensión de al^as seleccionadas co-no

-! a- -.=

* CU •'< :?l '. í= T ^ Y* O íí ", - "• n .-i. 3.

oi6;i del er.sayo áe sic^ractos áe ao.j'as de plantas traia,das cuyo contanido en herbicida se quiera determinar ysegún les valores obtenidos para la .-..?.} referidos altescico, no tratado, se determina la concentración deherbicida contenida en ai extracto. Aplicando la ecua-ción ds regresión correspondiente y a partir de estedato, se puede calcular la cantidad de herbicida pre-sente por unidad ds peso del íia^erial vegetal estudia-

uu .

Para la realización práctica de este tipo ds tra

ba.jo bastará con tener en cuenta los puntos 2,4.1,

apartado Matarla! y Métodos.

CONCLUSIONES

- 230 -

5. CONCUJSIOii'SS.

Cono consecuencia de ios resultados obtenidos,

hemos llegado a las siguientes conclusiones:

12) Con respecto a los efectos producidos por la absqrci6n radicular de Cí-.TJ sobre el desarrollo de lasplantas estudiadas, se observa que los síntocas íitotóxicos eapiszan a manifestarse para concentra-ciones de CI'íü en la solución nutritiva > 10"*^ M, sisrido las especies Dicotiledóneas aás sensibles que lasGramíneas: dentro de éstas, la avena y el trigo secoaportan coso las r.:ás resistentes. Para c one entra,c" or"3s > 10 ' '•' "rn 3*ii3*v5 e x "c** e s"' 6* c^a^a de let7*I.i¿?-5. en t2iz?. i'z v.r~o-:i^^ •.'="•;•:?.!-:-3 estudiadas ,

zí '.'.".'." ""Ti.r.". " ' .- z'.-jT."'." r.3 ;-u~.'2r~"L"r3ncis ds cactr.

¿SLi, SU.-.•;,j;;-. ;;'5;;33 i"i~o~5:ricc.3 3e.isibl33, e incluso,

la JD::csn~raci5;-. de VO" M se observa un claro efe

to estimulante sobra el desarrollo de las plantas.

22) Tras un r>eríodo de absorción radicular de CMU deuna seaana, si se trasladan las plantas a una solu,ción sin CMU , se puede observar una detoniíicacionde éstas, siempre que la concentración del herbiej.da en la solución nutritiva haya sido inferior a10""° M, ya que para concentraciones iguales o supjíriores, el efecto es irreversible.

32) Con respecto al proceso de absorción radicular delCMÜ y la acumulación de este herbicida en las hojasde las plantas, se observa que existe un proceso deabsorción activa,que hace que la concentración quese llegue a alcanzar en las hojas sea varias veces

- 231 -

superior a la concentración del producto en la so-

lución nutritiva de la que procede.

3ste proceso de absorción activa alcanza distinta

intensidad según la especie (es más acusado en el

trigo y la avena y aenos en la judía y el touate)y

se pone de manifiesto, con eiás claridad, para las

concentraciones bajas de CKU, ya que para concentra

ciones elevadas de este herbicida, la inhibición -

íotosintétics. producida actúa indirectaaente sobre

la capacidad de absorción activa de las células.

i2) Con respecto a la acción del CMU sobre la asimila-

ción íDvOsi-t3^i;a del CD0 por las hojas de las ái,

versas ^."ocies. SÍJ Dbsir-i que los efectos ir.hibi

!, siedo el ?.

; para asta con-

csntració:':, aur.que varia para las diversas especies

ve¿etal.?3. Concer.'racior.es de CMU > 10"^ M son suy

tóxicas y el grado de inhibición de la fotosínte-

sis oscila alrededor del 90%, siendo en este caso

las Gramíneas ~ás sensibles que las Dicotiledóneas,

tal ves por el 3ayor poder de concentración activa

del herbicida en la hoja de aquéllas, según se in-

dicó en el punto anterior,

52) A nivel de cloroplastos aislados o fragmentos de -

éstos, el efecto inhibidor sobre la reacción ¿e Hill

es análogo para todas las especies estudiadas, e:¿s_

tiendo una correlación directa entre el poder inhi

oidor y la concentración de herbicida para valores

coaprendidos entre 10"-3 M y 10"^ V..

El efecto dcsis-respuesta para cloroplastos aisla-dos, es de un orden parecido al observado er. las

hojas de las plantas, si se tiene en cuenta la -concentración que el herbicida alcanza en las ho-jas tras un proceso de absorción radicular.

62) SI poder inhibidor del CMU sobre el desprendimien-to fotosintético de CU del alga Chlorella pyrenojldosa, se manifiesta entre concentraciones del or-den de W~ M y 10'^ M, pudiéndose establecer unacorrelación lineal entre la A.?, del alga y el 1¿gariteo de la concentración de herbicida. La sensi.bilidad del método polarográfico para la evalúa—ci5n ds ccncsnOraciones de CMU por detecci&n del.";., de3pr-3:t:lidD an cultivos de algas, es del orden.".;• '=-0 veces 3-.rc?rirr a la sensibilidad del r.é-codo\-.'..:.-:.::; :ri:r :;Í .-;; utiliza an Is. reacción ce Hill

) Aprüvs:han¿o la alta sensibilidad del método pola-rogriíi^o par?, la determinación del desprendir.ien--0 de O? fotosintético en Chloreila, se puede astablscsr un bioensayo ^ara evaluar residuos de herbicidas inhibidores de la fotosíntesis, en suelos orestos vegetales, teniendo este aétodo la ventajade expresar directamente la actividad biológica delproducto herbicida sin necesidad de recurrir a se-paraciones o purificaciones por métodos quilicos ofísico-quícieos.

El csétodo es sensible, rápido, reproducible y sen-cillo, pudiéndose adaptar a análisis rutinarios sinrequerir la utilización de equipos ds elevado coste.

6. BI3LI03HA?¿¿

- 25k -

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- 255 -

A N S X 0

Abrevia turas y símbolos

0 'ti"OU

ADP : Aáenosir. - 5' -difosfato

AI? : Aaenosin - p' ~ trifosfato

b?d : ?9rrsdo;íina usada (bound Jarre do::in)

G.MU : Monurón 3 - ?(clorofeniD-1 ,1 -di^etilursa

D?I? : 2,5 - dicloroíenol Ir.u2f2r.cl

?i : J'erreáo:cir:a

?I-CT : ?lavin .^ononuclsotido

NAD? : Nicotin - adsnin - dinucleStiáo fosfato

?C : Plastocianina

?GA : Acido íosfoslicerico

?i : Ortoíosíaco (inorgánico)

PS : Plastoct t inona

3uD? : Ribulosa - 1 , 5 - d i fos fa to

Unidades y '.".asrnitudes

bq : Becquerelio (desintegración por segundo)

C : Concentración

°C : Grado centígrado

Ci : Curio, 3s ia anticua unidad de actividad y re-

presenta la cantidad de material radiactivo en1 P

el que ocurren 2,22 :c 10'- desintegraciones porsinuto, la cual ha sido sustituida por el bq.

-A3 : Incremento de la eneróla libre

DL=Q : Dosis letal v.edia

Varios

Potencial ::or\.5.1

A.?. : Actividad fotosintética

A?r : Actividad íotorreductora

As : Actividad específica

e l . : Centelleo liquido

e : Eficiencia del contaje

?S-I : Fotosiste^a I

INDIOS D2 TABLAS

- 253 -

índice de 'Tablas

Parirá

I -Solubilidad del CMlí en diferentes di sol.

venv2s .................................. 511,

II ~N-deslquilaoi&n 3 hidrólisis áel CHU- "C

después da la aplicación del coapuesto

marcado a diferentes especies vestales.. 23

III - Principales plan~as cultivadas on laa qua

se utiliza el X.TJ co~o herbicida ¿±

~'j ** S en s ib i"' i ¿^ d de l rv-""1- e^^ecies de . r-j o

- ' - :-U-:as soluciones de ZÍ7¿

- Co.r.pcr.3.ir-e3 aílaáidos a cada cubeta sejiún.tratamiento ,..,.. £9

- Composición ds las soluciones stock del

Dr. íodri^uez Ló~ez Tcara el cultivo del

alsa Chlorella ?b

- Solubilidad del oxigeno en el a¿na satu-

rada de aire y en solución tarpán. de

CO-H Na/C03Xa2 0,1 H (35:15) 39

• 3fecto del C.MU sobra la apariciór. de ho-jas " sintonías de r.iarchita..siento en "olántulas de cebada "cor trabamiento crónico . o¿

- 259 -

yfocir.a

XI - Zíecto del CMU sobre la aparición de

hojas y síntoaas de aarchitasiento en

plántulas de cebada por tratamiento

asuáo 97

XII -Síecto del CMU sobre la aparición de

hojas y síntomas de marchitamiento en

plántulas de avena ?or tratamiento cró-

nico , 93

XIII -Efecto del CMU sobre la aparición de

hojas ,7 sinto;:.iao de aarchitaráento en

plántulas de avena por tratamiento arudo. . 99

XIV -Zfecto del 'S.''J sobre la aparición ::e

'.10"as " si." z.; _'i"o le :.architaî3r::~ ?n

eren ico , 1 CO

- - i *• — ±. e c - o ce» -. J 3 c - r e 1. a a par . c i. ~ n "k e

hojas y sín"O~as de :::archita-.;ier.~o en

plántulas es triso per tratamiento agudo . . 101

XVI -3:"ecto del 3M*J sobre la aparición de

hojas y síntomas de aarchitaaiento en

plántulas de ;:.aís por tratamiento crónico. 1C2

XVII -Efecto del CMU sobre la aparición de

hoja.3 y síntomas de .Tiarchitaîento en

plántulas de .-.-¡ais por -rataaiento a¿;udo , 103

XVIII - 3íecto del CMJ sobre la aparición de

hojas y síntomas de carchitapiento en

plántulas de judía por ratasiiento crónico. ]QU

XIX -Zieazo del CMU sobre la aparición de


plántulas de judia por tratamiento aûdo .. 105

- 260 -

XX -3íecto del C'/.'J sobre la aparición da

hojas y sintonías de marchitamiento e:i

plántulas de tocata por tratamiento

crónico 106

XXI - 3íec~o del CMü sobre la aparición de


plántulas de tomate por tratamiento

agudo 10?

XXII ~Concentración de wfi en las hojas de

te después de 2^ "-;r?.í de a':sc¡rcií" ra

^ z7 ^ í o - — - - - u. . —iJ. o

lar en soluci-i-es c-

traciones de J./J 110

XXI7 - Relación de la ooncan^ración de ClfU al-

canzada en las ho.jas de las diferentes

plantas respecto a la concentración e.\"i¿

tente ir.isiai'.:er.te en. la solución :iutri~

tiva 111

XXV -3fecto de la absorción radicular de GXU

durante Zk horas sobre la actividad ío-

tosintetica ce las ho^'as de las diferen-

tes wlar.tas tratadas 121

-Zfecto de la absorción radicular de CXü

durante 7 dias sobra la actividad foto-

sinóética de las ho;'as de las diferentes

llantas tratadas 122

- 261 -

XXYII — Salación sntrs la concaniracio:! áe CMU

alcanzad?, en la hoja de cebada y la

actividad íotosintética relativa d3 la

raisaa , 125

XXVlII-P.elación entre la concentración de CMU

alcanzada en la hoja de avena y la acti-

vidad íotosintetica relativa da la aisrza, I2í¿

XXIX -lalación entre la o ene an trac ion de CKü

alcanzada an la hoja da trigo y la acti-

vidad fotO3intáti;a ral-?."iva de la ais™a. 125

.•— vA -• „**.5^ac*on sn^r1-? -3i cenc¿n~raci.^n 33 v.>.iu

vidad fotcsin^ética relativa de la. i:is.-a. 123

/CCüIII-Contanido en clorofila da las hojas de

las diferanves aspecLes ensayadas y su

relación con al cor.~snido en clorofila

da la suspensión de clcroplastos en el

estudio de la reacción de Hill 152

XXXIV - Curva de calibrado del DPI? oxidado -¡33

XXXV - Jiaacción de Hill en cloroplastos aisla-

dos de hojas de cebada en función de la

155

- 262 -

XXX7I - Reacción ds Hill en cloroplastos aisla-dos de hojas de avena en función de lacor.C3ntrs.oi6n de CITJ 136

XXXVTI-íaacci&n de Hill en cloroplastos aisla-

dos de aojas de trico en función de la

concentración de CMU • 137

XXXVni-JSeaccibn de Hill en cloroplastos aisla-dos de hojas de zalz en función de lacono entras i 5-i de C:¡U 15.3

XXXIX - íeacció:-. de Mili en cloroplastos aisla-d 3 s d -5 '.: o; a .3 d 3 Juila e n fu n c i ó :i á e 1 acor.c 5.1-r :.-;i';-.-: ?e 31.U -¡59

XII -Colación ír.",r: Ir, o one 5.1 oración ds CI-.TJen la cubeta da reacción 7 la actividadío~o.3i:itévisa relativa expresada en r"ó

XLII -Correlación eiristar.'e entre la capacidadfotorreductora de los cloroplastos (reac_ción ds Hill) de las diversas especiesvegetales .7 la concentración de CMü ....

XLI7.I - 3fecto del CMü sobre la actividad foto-sintética .7 respiratoria del al ¿ahlorChlorelia

1 LO

XL.~/ - Curva de calibrado para la evaluación

del contenido de CMü en el extracto áe

hojas de cebada, teniendo en cuenta el

efecto sobre la actividad fotosintética

y respiratoria de.l alsa C'aloreila ....... 15-

- 263 -

Página

XLV - Curva ds calibrado para la evaluación

d3i contenido da CMü en el extracto ds

hojas ds avena, teniendo en cuenta el

efecto sobre la actividad fotosintéti-

ca y respiratoria dsl alga Chlorella .... 155

XL7I - Curva de calibrado para la evaluación

dsl contenido de 01-33 en el extracto de

hojas ds triso, teniendo en cuenta si

afecto sobre la actividad íotosintetica

y respiratoria del alga Chlorella ...... 156

MLVUI — 3urv?. '.'.s calibrado tiara la evaluación

dsl ccnte-iido d-5 y.'.'] sn si extracto ds

.:.;;r,.; :; ::%:.z, zs'.~.~~¿'.~.lo e n c u e n t a e l

Í:';-; •; =:.:?= 1?. ;..; :iviiad fotosintstica

7 :.-3.r:ir-.t::ria ¿al ai ¿a Chlorella 1=7

ül-VIII-"v.rva :13 c".librado Tara la evaluación

dsl contenido de 21"ru en si extracto de

hoja-; ds judía, teniendo en cuenta el

9ísc~o soars la actividad fotosintética

v respiratoria del al¿a Chlorslia ...... 153

XLT.i - Curva ds calibrado para la evaluación

del contenido da CMIÍ en el extracto de

hojas de totiats, tenisndo en cuenta si

sfscto sobre la acbividad fotosintstica

7 respiratoria del al- a Chlorslia 159

L - Correlación existente entre la capacidad

fotosintética de Chlorella pyrenoidosay

la concentración ie CMT en extractos de

hojas de las diversas ss"c-3cies vsretalss. 150

- 26k -

i.! -Sfecto del extracto de hojas de plantas

de cebada que absorbieron radicular'iienoe

distintas concentraciones de C.-7J durante

2-'-i h, sobre la actividad fotosintética y

respiratoria del aira Chlorella 1 ¿9

LII - Síacto del extracto de hojas de plantas

de avena que absorbieron raiicular;_ente

distintas concentraciones de CMÜ durante

2'~ h, sobra la actividad fotosir.tética y

respiratoria del alsa Chlorella 170

'-Z1Z - I i"3oto del e::cracto de hojas de plantas

Z3 tri~"? ÍV.9 absorbieron rs.dicular::ent-3

-"" 3Vi.: *r.s : .-.can^raciones de CMU durante

- Í _ - . . - - , „ .V. •.-. -v — / _ ^. Cí. — - ^ , ^ v 3 '~ - >- « v'

Jj";;to .:"::! e:c;raot;o de hoj?.s de llantas

¿e ",:ai :".xs absorbieron radicular.rente

distingas concentraciones de C;-ÍIT durante

Zf3C-o del extracto de ho.jas de "olantas

distintas concentraciones de CKU durante

2- :i, sobre la actividad fooosintética y

^:ec"O asi s:ccracoo ae no.]as ae pxanoas

de to.r.a~3 que absorbiaror radicular^ente

distincas cor.centracicnss de C/.U durante

21i h, sobre la actividad fO"Osir.tética 7

respira-oria del al^a Chlorells.

- 265 -

LVII ~Z¡3cto del extracta da hojas de plantas

de cébala que absorbieron radicularsente

discintas concentraciones de CMü durante

1 sesaana, sobre la actividad fotosintéti,

ca y respiratoria del alga Chlorella .... 175

LYIIX - 3íecto del extracto de aojas de plantas

de avena que absorbieron radicular-iente

distintas concentraciones ie C'A'ú durante

1 semana, sobre la actividad fotosintstj.

ca y respiratoria del alga Chlorsila .... 175

II.'' -If ¿oto del extracto ds hojas de plantas

d-3 trijo que absorbisron radicular^iente

di.í:ir.~r,5 00r.c3ntracicp.33 de CMU durante

-••? :?>r.a, sobre la actividad fotosinc-áti-

cs, y respiratoria del alga Ghiorslla .... 177

111 -Zíí-cto del siftracto de ho. as de llantas

de uais que absorbieron radicularr.3r.te

distintas concentraciones de CXü durante

1 semana, sobre la actividad .fotosintsti

ca 7 respiratoria del alga Chlorella .... 17o

LXI - Zíecto del siítracto de ho;as de plantas

de Judia que absorbieron radicularraente

distintas concentraciones de CMü durante

1 35 2ar.a, sobre la actividad fotosintétj.

ca 7 respiratoria del alga Chlorella .... 179

L X U -Sfecto del extracto de hojas de plantas

de tOTiats qua absorbieron radicular.ae.nte

distintas concentraciones d-3 CMü durante

1 semana,sobre la actividad fotosintéti-

ca y respiratoria del alga Chlorella .... icG

- 266 -

LXili - Sfscto del extracto de hojas de planeas

de cebada que absorbieron radicularr.9r.te

distingas concentraciones de CMU durante

] semana y la seaana posterior solución

nutritiva sólo, sobre la actividad íoto-

sintática y respiratoria dsl al¿"a C-llore

U a 132

LXI7 -3fecto del extracto de hojas de plantas

as avena cue absorbieron radicular^er.te

distintas concentraciones de CMU durante

1 semana y la se::ana posterior solución

nutritiva sólo, sobre la actividad :"oto¿5

tética y respiratoria c?l al,;s Chlcrella .. 1 55

"..." -ZÍ3C-0 del e::~racto de hojas de plantasr3 n •*-/»-! - r-* -<•• c» « r> c: ."iT ^ i — "in r*1 5 ^ -~Mi *i r: •-"-* o^-i *•

1 ssrana "* la semana posterior solución

nutritiva sólo, sobre .la ac cividad ío^osin

tética y respiratoria del alga Chlorella . 13-i

LICÍI -Afecto del e-tracto de hojas de plantas

de :uaís que absorbieron radicularr-ente

distintas concen-raciones de CMU durante

1 semana y la semana posterior solución

nutritiva solo, sobre la actividad íotosir.

tética y respiratoria del alia Chlorella .. ] ¿5

da judía cue absorbieron raaicu.lar'j:ente

distintas concentraciones de CMU durante

1 ser.ana, y la semana 'oosterior solución

nutritiva sólo, sobre la actividad fotosin

tética y respiratoria dsl alga Chlorella .. 1S6

- 267 -

LXVIIl-Zjfecto del extracto as hojas de plantas

de tomate que absorbieron radicular'-zente

distintas concentraciones de CJiU durante

] seaana y la seaana posterior solución

nutritiva sólo, sobre la actividad íotosin

tática y respiratoria del alga Chlorslla .. 137

LAIX -Concentración satinada de CMü sr. las ho

jas d-j plantas da cebada después de di-

ferente tiempo de absorción radicular ... 139

LXX - Concentración estibada de C.'-Í'J en las h£

jas de plantas de avara después de di-

ísr~nt-3 tiempo de absorción radicular ... 190

LXXI - Concentración = 3vi.r.ada ;!e C.-7J en las r.¿

~as de ^la"i"as es tri^o ú^sz^iss de di i'9

""'3 3.03o^ci

Z.XXII ~ Conosnbración 3sti.".:ada ds Z'A'ú en ls= "no

jas de plantas de "ais después de dife-

rente- tier.:po ¿3 absorción radicular 192

LXXIII-Concentracion estibada de CMU en las h_o

jas de plantas de judía después de dife

renta tiempo da absorción radicular 193

LXXI7 - Goncanbración ss-inada de Cl-l'J en las h¿

jas de plantas de or.ate después .de di-

fers.ito ~ie:ipo de absorción radicular ... 194

LXX7 - Zí-jczo comparativo de la inhibición de

la actividad fotosintética (A?) por di-

versas concentraciones de CMU en fra.3—

rentos de clorepiastos (P.sacción de Hill)

y er. hojas de plantas -rabadas durante

2'-i horas 213

- 263 -

LXXVJ. - Sí-soto comparativo de la inhibición cis

la Actividad íovosintática (A?) por di.

versas concentraciones de Cl-'J en írar-

rrientos da cloroplastos (Peacción efe Hill)

y an hojas do plantas tratadas con CMü

durante 7 días 21 Ii

LXXVII-Cseparación c!s la A.?, relative, al t33_

ti¿o obtenido en Chlorslla (método pe-

lar o^ráí1 ico) y cloroplas^cs da diversas

especies (Reacción de Hill) tratadas

con diversas c oncer, tras ions- de CMü .... 219

sobr 9 31 ds 3"re r¿d i ii 3 n" o ds O •

A N E X O I I I

- 270 -

A íí 3 X 0 III

índice da Figuras

10

11

12

Ssque^a en Z dsl transporta elsctronico

íotosintético ,

Posible vía de degradación del CMU en

plantas superiores /. .

Disposici6n de las piar.cas en solución

nutritiva

- Preparación dsl aire -.'.arcado con "CC

5 3 C3 *u 31". -v de Í3 *U ~ C " CC A'lar T Útil"" Cá5da ^ a —

"sica 5vi "no^as ds i^"5^3as "" s^.'s.s culzi

vacas

fra-¿r.:entos de clcroplastos en hojas de

7 - Conjunto da bañr< v al ais tama a 3 iiuu:.na-

ción para el 3s~udio d? la actividad

:otosintstica an cloroplas'os aislados .

Dispositivo para el cultivo síncrono

as Chlorslla pyrsnoidosa

Circuito eléctrico del electrodo de

o;íí¿eno

Electrodo de ozízsr.o tipo Clarl:e .......

Ssauasia del eouito completo

Equipo completo del sise-rodo ds o;c.í-

-T3 n o

17

31

50

61

71

79

32

35

- 271 -

Página

13 - Histo.j.ra;:a de las concentraciones deCMü en las hojas de plantas de cebadaque lo absorbieron ridiculamente du-rante 2^ horas y y días 112

] h. — H i s t o v' a 2 a c!e l?sconcentraciones ÚS

CMU en las hojas áe plantas áe avena

que lo absorbieron radicularnsr/ie du-

ran-: a 2^ horas y 7 días.......' 113

15 - Hi3to¿ra.~a c.3 las conoantraclor.es as

CM,7 an las hojas de plantas de erijo

que lo absorbieron radicularr.ente :.u~2'- horas y ? días , ., , -]]krant.

] ~ -• -*'' S t 2 "*"*5. '~a d'? "'a- C C'" C B ° t^ra C 10T15 S d"3

C'iü -i'" " as r 0"'H.3 -19 olarâs cíe rj.aÍ2

qua lo absorbieron radioularênte du-rar.-e 2!- horas y 7 días ,. 155

17 - Histo::ra.'.:a de las conaen~racior.es de

CMU =n las hojas ds plantas de judía

que lo absorbieron radicularaante du-

rance 2'~ horas y 7 días 116

lo - ?¡isto:raâ de las concentraciones deC.'-rj en las hojas de planeas de to.~a~eque lo absorbieron radicularênê du-rante £á horas y 7 días 117

19 - delación entre la concentración de CifJen la solución y la concentración deCMU alcanzado en las hojas de las di:\9rentes plantas después da absorberloradicularênce durar.te 2'-'- horas ,,,.,,.. 11 3

272 ~

.-agina

2.0 ~ delación entre la concentración de CMU

en la solución y la concentración de

CliU alcanzado en las hojas de las diíe

rentas plantas después ds absorberlo

radicular~snte durante ? días i 19

21 - Influencia de la concentración alcanza,

da per el Oíü en las hojas ds diferen-

tes vecetales que lo absorbieron radica

lar:*.er.-e durar. :.e 2.U horas, sobre la ac~

tividad íotosintávica de éstas 129

¿2. - Influencia ce la concentración alcanza

da por el CM'J en las hojas is diferen-

tes earecis? recétales que lo absorbie.

la actividad f z -osinte tica de estas .... Ij;-'

2J - Actividad fotorreductora (A5r) de los

cloroplas~os de cebada en función de la

concentración de CY.U , , ]LL

2'- ~ Actividad fotorreductora (A7r) de los

cloroplastos de avena en función de la

concentración de CMU , 1 á.5

25 - Actividad fo-orreduc'or-i (AJr) de los

cloroplas'os de zri^o en función de la

concentración de GUJ ]'^S

2.Ó - Actividad fctorreductora (AJ'r) de los

el oraplastas da cais en función de la

concentración de CMU ]!¿7

27 - Actividad fo-orreductora (A7r) de los

cloroplas'os de iuiia en función de la

concentración de CMu ]U¿

- 2?3 -

Actividad fotorrsductora (A?r) ds los

cloroplastos as tanate en función da la

concentración de C1IU

Actividad íotosintética de Chlorella

•oyrsnoidosa en función de la concentra—

ción ds c:-:u

Actividad fotosintáiica da Chlor^ll?. t>v

renoidosa en función ds la concentra---

ci&n as CM? en extractos ds hojas de

cebada

- c t "<* i d *' '~ o - c 3" ** 13 i c •"• d C 'r " o^ 21 TÍ"*

- o ~ 0 i '1 n'-,". -3 " VIC i i d 3 ""a 0 O " C 3 n t ~*" "•

ciin de CMF an sictractos da hojas da

152

152

renoiiosa sz funcicion ¿3 Z'A'J s'j. extr

-ica de Chlorslla p

n de la cor.csntra—

actos ds ho las de

-C Z-i Vi'~ :ld ~DZOSXnt 5 ~ C3 d5 ChlOl^B!.^ T'

rsnoidosa er. fun o i ór. de la concentra

ción de CMü en extractos ds hojas da

'.jais .. . > , ..,

Actividad focosinté-ica cls Chlorslla prenoidosa en función ds la concsntración da CHü en e:ítr?.ctos de hojas dejudía

Actividad fotosintética da Ghlorella ?vrenoido^a en función do la concentra-ción de Cl'.ü sn e;;trac^os de hojas detor.ate , .

i o~

16$

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