Avances en el Diagnóstico de las Infecciones por Bacterias Multirresistentes

Málaga, 14 de noviembre de 2017

Luis Martínez MartínezServicio de Microbiología

Hospital Universitario Reina SofíaDepartamento de Microbiología

Univ. de Córdoba

• Identificación

Antibiograma

• Tipificación

PRINCIPALES ÁREAS DE INNOVACIÓN,

DESARROLLO E IMPLEMENTACIÓN

MALDI-TOF:

Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization

Time Of Flight

[MS: Mass Spectrometry]

[RAE] Desorción. 1. f. Tecnol. Emisión de un fluido previamente absorbido por un material.

Welker M, Proteomics 2011, 3143-3153

Tipificación molecular

Determinación de sensibilidad/resistencia

Detección de factores de virulencia

Detección de compuestos no proteicos (LPS)

Virología

Diagnóstico Indirecto

Instrumento muy caro

Base de datos mejorable

Dificultad para aplicar a muestras clínicas directas

Cantidad mínima de microorganismos para el análisis

Variaciones de espectro para algunas especies

[No ofrece] información sobre resistencia

MALDI-TOF PARA IDENTIFICACIÓN. LIMITACIONES

Rápido

Equipo compacto

Versátil (bacterias, levaduras, hongos)

Manejo sencillo

Fiable y reproducible.

Bajo coste de reactivos

Gestión: Menos productos comerciales para

identificación. Muy pocos consumibles

MALDI-TOF PARA IDENTIFICACIÓN. VENTAJAS

Seguro: Elimina las decisiones terapéuticas erróneas

Asequible: Para su compra y uso en cualquier región

Rápido: <30 minutos desde la toma de la

muestra hasta el resultado

Fácil de usar: Uso e interpretación sin tecnología compleja

Desarrollable: Plan para fabricación y distribución

Seguro: Más riesgos que beneficios

Conectable: Capacidad almacenar y transmitir los datos

Prototipo: >=3 copias disponibles para ensayos clínicos

REGLAS

£10m

+

-Detección de β-lactamasa

Detección de PBP2a (SARM)

DETECCIÓN DE MECANISMOS DE RESISTENCIA

CARBAPENEMASAS (2017)

Enterobacteria, Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter spp.

Reference Method: Broth Microdilution (ISO-20776; [basically the

same that CLSI guidelines])

a. Cation-adjusted Mueller-Hinton Broth

b. No additives (in particular, no polysorbate-80 or other surfactants) for testing

c. Microdilution trays must be made of plain (not treated) polystyrene

d. Sulphate salts of polymyxins must be used (DO NOT use colistin

methanesulfonate: inactive in vitro)

INCONVENIENCE: DIFFICULTIES FOR IMPLEMENTATION IN ROUTINE WORK

STUDIES IN PROGRESS FOR VALIDATION OF:

DISK DIFFUSION

GRADIENT DIFFUSION

AGAR DILUTION

JPBWG: COLISTIN TESTING

• Métodos fenotípicos convencionales

• Inmunocromatografía

• Ensayos colorimétricos

• Citometría de flujo

• Bioluminiscencia

• Dispositivos de microfluídica

• Métodos Proteómicos:

MALDI-Tof

Espectrometría Raman

• Métodos genómicos

PCR [muestra directa]

Fragmentación de ADN bacteriano

PCR-microarrays

Secuenciación masiva

NUEVOS MÉTODOS

• INÓCULO NO ESTANDARIZADO

• INÓCULOS POLIMICROBIANOS NO CONTROLADOS

• pH DE LA MUESTRA

• MUESTRA QUE YA CONTIENE ANTIMICROBIANO(S)

• “NO APLICABLE” A MUESTRA DIRECTA DE SANGRE

• INCUBACIÓN SIMILAR A LOS MÉTODOS

CONVENCIONALES

ANTIBIOGRAMA A PARTIR DE MUESTRA DIRECTA

EUCAST disc diffusion

ROSCO ESBL and carbapenemase detection kits

Mast Carbapenemase Activity Test (CAT-ID) disc

Inhibition zones:

Digital photo images (6 h)

Standard reading (18 h)

Reading 6 h:

Accurate method for ESBL-Enterobacteriaceae

Carbapenemase detection not reliable

Other antimicrobials: Only preliminary reports

MICROSCOPÍA DIGITAL

CURVAS DE CRECIMIENTO DE CADA CÉLULA BACTERIANA

MEDIANTE SEGUIMIENTO CON MICROSCOPIA COMPUTARIZADA

ANÁLISIS DE LOS CAMBIOS EN LA MASA, LA MORFOLOGÍA Y LA

VELOCIDAD DE DIISIÓN BACTERIANA

EL PATRÓN DE CADA AISLAMIENTO SE COMPARA CON LOS

PATRONES DE UNA BASE DE DATOS (… DE LA EMPRESA)

P. aeruginosaCIPROFLOXACINO

SMARTICLES ®

MEDIDA DE LA MASA BACTERIANA

Ultraresolución de la medida de la masa

bacteriana por la oscilación en el cambio de

frecuencia de un dispositivo de microfluídica

Se requieren 104 bacterias/ml

Hemocultivos, muestras de orina

Signal ratio of the 730-cm-1 SERS peak (r730)

Check-MDR CT103 XL

Bogaerts P et al. Int J Antimicrob Agents 2016, 189

TIPIFICACIÓN MOLECULAR

ANÁLISIS DE LA RELACIÓN CLONAL

Modelo de transmisión

Detección de reservorios

Expansión de brotes

Eficacia de medidas

PFGE: Met-R S. aureus

Rep-PCR: K. oxytoca

• Identificación [ de nuevos

microorganismos]

• Detección de genes de resistencia

• Detección de genes de virulencia

• Tipificación molecular

• Evolución bacteriana

• Metagenómica (m.o. no cultivables)

• Desarrollo de nuevas herramientas

para el diagnóstico microbiológico

Secuenciación masiva: Aplicaciones

Greub G Clin Microbiol Infect 2013, 19:781-782

TIPIFICACIÓN BASADA EN SECUENCIACIÓN DE

GENOMAS COMPLETOS

Pérez-Vázquez M et al, JAC 2016 , 3392-3399

K. pneumoniae OXA-48

España, CNM

Enterobacter cloacae OUTBREAK

Reuter Set al. JAMA Intern Med 2013

XDR, MDR, and epidemic high-risk clones

(ST-111, ST-175, ST-235)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

XDR MDR ModR MultiS

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

XDR MDR ModR MultiS

% h

igh

-ris

k c

lon

es

Clo

nal

div

ers

ity

Cabot et al AAC 2012

Resultado

Microbiológico

Informe al

clínico

responsable

directo del

paciente

Uso de la

información

en beneficio

del paciente

Sistema eficaz

de información