8/9/2019 Articulo Enriquecimiento Del Vibrio en Un Medio Simple

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A P P L I E D M I C R O B I O L O G Y , J u n e 1 9 7 4 , p . 1 1 2 4 - 1 1 2 6C o p y r i g h t 0 1 9 7 4 A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y V o l . 2 7 , N o . 6P r i n t e d i n U . S . A .

E n r i c h m e n t o f V i b r i o p a r a h a e m o l y t i c u s i n a S i m p l e MediumDOKI CHUN, JAE KYU CHUNG, AND SUNG YONG SEOL

D e p a r t m e n t o f B a c te r i o l o g y , Kyungpook N a t i o n a l U n i v e r s i t y S c h o o l o f M e d i c i n e , Taegu, KoreaR e c e i v e d f o r p u b l i c a t i o n 1 3 March 1 9 7 4

A medium w h i c h c o n t a i n e d 3% NaCl a n d 0 . 2 % T e e p o l i n V / 5 M phosphateb u f f e r was p r e p a r e d a n d was e v a l u a t e d t o b e a u s e f u l e n r i c h m e n t medium f o r t h ei s o l a t i o n o f V i b r i o p a r a h a e m o l y t i c u s i n m a r i n e s p e c i m e n s . G l u c o s e s a l t Teepolb r o t h p r o d u c e d a p o o rer r e s u l t t h a n d i r e c t c u l t u r e .

V i b r i o p a r a h a e m o l y t i c u s c a n b e i s o l a t e dw i t h o u t d i f f i c u l t y f r o m m a r i n e s p e c i m e n s a n dhuman s t o o l s o n t h i o s u l f a t e c i t r a t e b i l e s u c r o s e( T C B S ) a n d b r o m o t h y m o l b l u e ( B T B ) T e e p o la g a r s , b u t e n r i c h m e n t i s s o m e t i m e s n e c e s s a r yf o r i s o l a t i o n f r o m s p a r s e l y - i n f e c t e d m a t e r i a l s .R e p o r t e d e n r i c h m e n t m e d i a c o n t a i n n u t r i e n t sw h i c h f a v o r t h e g r o w t h o f n o t o n l y V .p a r a h a e m o l y t i c u s b u t a l s o m a r i n e a n d e n t e r i cb a c t e r i a ( 4 , 5 ) . We n o t e d i n a p r e v i o u s r e p o r tt h a t V . p a r a h a e m o l y t i c u s p r o p a g a t e s i n p h o s -p h a t e - b u f f e r e d s a l t s o l u t i o n m o r e r e a d i l y t h a nE s c h e r i c h i a c o l i a n d S a l m o n e l l a ( 1 ) . W i t h t h i sf i n d i n g , w e s u s p e c t e d t h a t t h e e n r i c h m e n t o f V .p a r a h a e m o l y t i c u s i n m a r i n e s p e c i m e n s a n dhuman s t o o l s c a n b e o b t a i n e d i n p h o s p h a t eb u f f e r c o n t a i n i n g N a C l , a n d p r e p a r e d a m e -d i u m c o m p o s e d o f N a C l a n d p h o s p h a t e b u f f e r .We a l s o a d d e d T e e p o l , a n e u t r a l d e t e r g e n t ,w h i c h i s m o r e i n h i b i t o r y t o E . c o l i a n d V .a l g i n o l y t i c u s t h a n t o V . p a r a h a e m o l y t i c u s . T h i sr e p o r t e v a l u a t e s t h i s m e d i u m , i n c l u d i n g p r e l i m -i n a r y e x p e r i m e n t s o n t h e i n g r e d i e n t s o f t h em e d i u m .MATERIALS AND METHODS

S t r a i n s . V . p a r a h a e m o l y t i c u s 9 3 3 7 i s K a n a g a w ah e m o l y s i s p o s i t i v e a n d w a s s u p p l i e d b y Y . M i y a m o t o ,K a n a g a w a P r e f e c t u r a l P u b l i c H e a l t h L a b o r a t o r y , J a -p a n . V . a l g i n o l y t i c u s w a s i s o l a t e d f r o m a s e a f i s h a n dE . c o l i 0 6 w a s i s o l a t e d f r o m a human s t o o l i n t h i sl a b o r a t o r y , a n d b o t h d e m o n s t r a t e d t y p i c a l c h a r a c t e r -i s t i c s .E n r i c h m e n t m e d i a . S a l t p e p t o n e w a t e r ( S P ) a n dg l u c o s e s a l t T e e p o l b r o t h ( G S T B ) w e r e p r e p a r e d a sd e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( 4 , 5 ) . SP ( 4 ) c o n t a i n e d 3% N a C li n 1 % p e p t o n e w a t e r ( p H 7 . 2 ) , a n d GSTB ( 5 ) c o n -t a i n e d 0 . 3 % b e e f e x t r a c t , 1% p e p t o n e , 3% N a C l , 0 . 5 %g l u c o s e , 0 . 0 0 0 2 % m e t h y l v i o l e t , a n d 0 . 4 % T e e p o l i nd i s t i l l e d w a t e r ( p H 8 . 5 ) . B a s e d o n p r e l i m i n a r y e x p e r i -m e n t s s h o w n i n R e s u l t s , s a l t T e e p o l b u f f e r ( S T B ) w a s

p r e p a r e d t o c o n t a i n 3% N a C l a n d 0 . 2 % T e e p o l ( S h e l lC h e m i c a l C o . ) i n 1 / 1 5 M p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 8 . 5 ) .

P r o c e d u r e s . To d e t e r m i n e t h e o p t i m u m c o n c e n -t r a t i o n o f N a C l a n d T e e p o l i n m e d i a , 0 . 1 m l o fa p p r o p r i a t e d i l u t i o n s o f a 2 4 - h c u l t u r e o f t e s t o r g a -n i s m s i n n u t r i e n t b r o t h w i t h 3% N a C l w a s i n o c u l a t e di n t o 5 m l o f t e s t m e d i a . B e f o r e a n d a f t e r i n c u b a t i o n a t3 7 C f o r 2 4 h , 0 . 1 m l o f d e c i m a l d i l u t i o n s o f t e s t m e d i aw a s s p r e a d o n s o l i d m e d i a , a n d c o l o n i e s w e r e c o u n t e da f t e r 2 4 h o f i n c u b a t i o n . C o u n t s o f V . p a r a h a e -m o l y t i c u s a n d V . a l g i n o l y t i c u s w e r e m a d e o n BT BT e e p o l a g a r , a n d E . c o l i c o u n t s w e r e made o n M a c -C o n k e y a g a r . A l l c o u n t s w e r e c a r r i e d o u t i n t r i p l i c a t ef o r e a c h m e d i u m , a n d mean v a l u e s w e r e c a l c u l a t e d .F o r t h e t e s t o f f i e l d a n d c l i n i c a l s p e c i m e n s , a s m a l la m o u n t o f m a r i n e a n d human f e c a l m a t e r i a l s w a ss u s p e n d e d i n a s m a l l amount o f p h y s i o l o g i c a l s a l i n e .A f t e r s h a k i n g t h o r o u g h l y , t w o l o o p s f u l s w e r e s t r e a k e do n TCBS a g a r . F o r t h e e n r i c h m e n t , 0 . 2 m l o f s u s p e n -s i o n w a s i n o c u l a t e d i n t o 5 m l e a c h o f t e s t m e d i a . A f t e r2 4 h o f i n c u b a t i o n a t 3 7 C , t w o l o o p s f u l s w e r ei n o c u l a t e d o n TCBS a g a r p l a t e s , a h d s u s p e c t e d c o l o -n i e s w e r e t h e n t r a n s f e r r e d o n n u t r i en t a g a r s l o p e sc o n t a i n i n g 3% N a C l , a n d c h a r a c t e r i z e d b y t h e c r i t e r i ao f H u g h a n d S a k a z a k i ( 2 ) .

RESULTSE f f e c t o f NaCI and T e e p o l on g r o w t h o ft e s t o r g a n i s m s . T h e o p t i m u m c o n c e n t r a t i o n o fN a C l o n t h e g r o w t h o f V . p a r a h a e m o l y t i c u s w a ss t u d i e d , a n d 3% N a C l w a s f o u n d t o p r o d u c e t h eb e s t r e s u l t o n g r o w t h i n p h o s p h a t e b u f f e r a n dp e p t o n e w a t e r , w i t h w e a k e r g r o w t h i n l o w a n dh i g h c o n c e n t r a t i o n s o f N a C l . A m a j o r i t y o f t h et e s t s t r a i n w a s s t e r i l i z e d i m m e d i a t e l y a f t e r t h ei n o c u l a t i o n i n N a C l - f r e e m e d i a ( T a b l e 1 ) . Thes t u d y o n t h e e f f e c t o f T e e p o l s h o w e d t h a tT e e p o l i s i n h i b i t o r y o n t h e g r o w t h o f t e s t o r -g a n i s m s i n b o t h p h o s p h a t e b u f f e r a n d p e p t o n e

w a t e r c o n t a i n i n g N a C l ( T a b l e 2 ) . H o w e v e r , t h ei n h i b i t o r y e f f e c t i n p h o s p h a t e - b u f f e r e d NaCls o l u t i o n w a s l e s s m a r k e d w i t h V . p a r a h a e m o l y -1 1 2 4

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ENRICHMENT OF V . PARAHAEMOLYTICUST A B L E 1 . E f f e c t o f N a C i o n g r o w t h o f V i b r i o

p a r a h a e m o l y t i c u sN a C I co n c n B u f f e r a P e p t o n e w a t e r a( 7 ) O 0 2 4 0 2 4 "

0 9 C 0 1 5 01 1 1 0 8 5 , 0 0 0 1 6 0 2 , 3 0 0 , 0 0 03 1 3 0 1 4 0 , 0 0 0 1 6 0 4 , 5 0 0 , 0 0 05 1 3 5 8 8 , 0 0 0 1 5 5 2 , 8 0 0 , 0 0 07 1 4 0 2 , 7 0 0 1 4 5 1 7 0 , 0 0 0

a B u f f e r = P h o s p h a t e b u f f e r , V I 5 M , p H 8 . 5 . P e p t o n ew a t e r = 1 % , p H 7 . 2 .b I n c u b a t i o n ( h o u r s ) a t 3 7 C .c Number o f v i a b l e c e l l s p e r 0 . 1 m l .T A B L E 2 . E f f e c t s o f T e e p o l o n g r o w t h o f t e s to r g a n i s m s

T e e p o l a B u f f e r ' P e p t o n e w a t e r bO r g a n i s m c o n c n - -( % ) o f 2 4 0 2 4

V . p a r a h a e m o l y t i - 0 . 4 6 4 d 1 0 , 5 0 0 1 1 2 9 8 2 , 0 0 0c u s 9 3 3 7 0 . 2 5 6 1 7 , 0 0 0 1 0 1 1 , 1 6 2 , 0 0 00 7 5 5 5 , 0 0 0 1 2 1 1 3 , 2 0 0 , 0 0 0

V . a l g i n o l y t i c u s 0 . 4 8 4 1 , 7 0 0 5 4 5 6 2 , 0 0 00 . 2 8 9 7 , 6 0 0 4 8 8 7 2 , 0 0 00 8 2 2 4 , 0 0 0 4 9 8 , 5 0 0 , 0 0 0

E . c o l i 0 . 4 9 0 5 8 0 5 3 2 8 1 , 0 0 00 . 2 8 3 6 1 0 4 8 4 8 8 , 0 0 00 9 8 1 2 , 8 2 0 5 2 5 , 3 6 0 , 0 0 0a S u p e r , S h e l l C h e m i c a l C o .' E a c h medium c o n t a i n s 3% N a C l .c H o u r s o f i n c u b a t i o n a t 3 7 C .d Number o f v i a b l e c e l l s p e r 0 . 1 m l .

t i c u s t h a n w i t h V . a l g i n o l y t i c u s a n d E . c o l i ,w h e r e a s t h e e f f e c t i n p e p t o n e w a t e r w i t h N a C lw a s a l m o s t i d e n t i c a l f o r t h e t h r e e t e s t o r g a -n i s m s . No m a r k e d d i f f e r e n c e o f e f f e c t w a s n o t e db e t w e e n 0 . 2 a n d 0 . 4 % T e e p o l . W i t h t h e s e r e -s u l t s , w e p r e p a r e d ST B b y a d d i n g 3% N a C la n d 0 . 2 % T e e p o l i n p h o s p h a t e b u f f e r .Growth o f t e s t o r g a n i s m s i n m i x e d c u l t u r e .To know t h e g r o w t h o f t h e t e s t o r g a n i s m s i nm i x e d c u l t u r e i n e n r i c h m e n t m e d i a , a m i x t u r eo f a s m a l l n u m b e r o f V . p a r a h a e m o l y t i c u s a n d al a r g e n u m b e r o f V . a l g i n o l y t i c u s o r E . c o l i w a si n o c u l a t e d i n S T B , S P , a n d GSTB, a n d v i a b l ec e l l s w e r e c o u n t e d a f t e r i n c u b a t i o n ( T a b l e 3 ) . I nS T B , e v e n t h o u g h t h e g r o w t h o f t e s t o r g a n i s m sw a s v e r y p o o r , V . p a r a h a e m o l y t i c u s o u t n u m -b e r e d V . a l g i n o l y t i c u s o r E . c o l i . I n SP a n dG S T B , t h r e e t e s t o r g a n i s m s s h o w e d l u x u r i a n tg r o w t h , w i t h s l i g h t l y b e t t e r g r o w t h o f V . p a r a -h o e m o l y t i c u s t h a n t h e o t h e r o r g a n i s m s .

I s o l a t i o n o f V . p a r a h a e m o l y t i c u s f r o m f i e l d

a n d c l i n i c a l s p e c i m e n s . T a b l e 4 c o m p a r e s t h er e s u l t s o f e n r i c h m e n t o n t h e i s o l a t i o n o f V .p a r a h a e m o l y t i c u s i n m a r i n e s p e c i m e n s c o l -l e c t e d a t r a n d o m . T h e e n r i c h m e n t i n ST B a n dSP s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d t h e r a t e s o f i s o l a t i o nm o r e t h a n d i r e c t c u l t u r e , w i t h s i m i l a r r e s u l t sb e t w e e n STB a n d S P , b u t t h e e n r i c h m e n t i nGSTB y i e l d e d a l o w e r i s o l a t i o n r a t e t h a n d i r e c tc u l t u r e . I n t h e s t u d y w i t h c l i n i c a l s p e c i m e n so b t a i n e d f r o m h o s p i t a l s a n d h e a l t h c e n t e r s , f i v ec a s e s among 8 7 8 f e c a l s p e c i m e n s w e r e f o u n dp o s i t i v e a f t e r e n r i c h m e n t i n S T B , a n d S P , a n dt w o c a s e s w e r e p o s i t i v e b y d i r e c t c u l t u r e .

DISCUSSIONThe r e s u l t s i n t h i s s t u d y c l e a r l y i n d i c a t e d

t h a t ST B i s a u s e f u l e n r i c h m e n t medium f o r t h ei s o l a t i o n o f V . p a r a h a e m o l y t i c u s f r o m m a r i n eT A B L E 3 . G r o w t h o f t e s t o r g a n i s m s i n m i x e d c u l t u r ei n e n r i c h m e n t m e d i a

O r g a n -i S M S a O r g a n -.Medium m i x e d i s m s 0' 2 4w i t h VP c o u n t e d

S a l t T e e p o l VA VP 1 0 0 C 1 8 0 , 0 0 0b u f f e r VA 7 , 6 0 0 < 1 0 , 0 0 0EC VP 1 3 0 1 2 7 , 0 0 0EC 9 , 1 0 0 1 4 , 0 0 0S a l t p e p t o n e VA VP 2 5 0 3 , 4 0 0 , 0 0 0EC 1 , 0 8 0 6 , 5 0 0 , 0 0 0EC VP 2 1 0 4 , 1 3 0 , 0 0 0EC 1 , 0 6 0 2 , 9 2 0 , 0 0 0G l u c o s e s a l t VA VP 8 5 2 , 3 0 0 , 0 0 0T e e p o l b r o t h VA 3 9 0 3 , 9 0 0 , 0 0 0EC VP 1 0 7 4 , 2 3 0 , 0 0 0EC 1 , 3 5 0 4 , 1 2 0 , 0 0 0

a VP = V . p a r a h a e m o l y t i c u s , VA = V . a l -g i n o l y t i c u s , EC = E . c o l i .b H o u r s o f i n c u b a t i o n a t 3 7 C .c Number o f v i a b l e c e l l s p e r 0 . 1 m l .T A B L E 4 . I s o l a t i o n o f V i b r i o p a r a h a e m o l y t i c u s f r o m1 1 0 m a r i n e s p e c i m e n s

N o . o f N o . o f C o l o n i e s o nN o . o f c o l o n i e s c o l o n i e s e n r i c h m e n t m e d i a bp e r p l a t e b y d i r e c tc u l t u r e a ST B SP GSTB

2 0 0 5 4 01 1 - 2 0 2 7 4 01 - 1 0 4 1 6 2 6 0 2 40 6 7 3 6 4 2 8 6N o . p o s i t i v e 4 3 7 4 6 8 2 4I s o l a t i o n r a t e ( % ) 3 9 . 1 6 7 . 3 6 1 . 8 2 1 . 2

a On TCBS a g a r p l a t e .ST B = s a l t T e e p o l b u f f e r , SPGSTB = g l u c o s e s a l t T e e p o l b r o t h . = s a l t p e p t o n e ,

1 1 2 5OL 2 7 , 1 9 7 4

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CHUN, CHUNG, AND SEOLs p e c i m e n s . The e n r i c h m e n t i n GSTB y i e l d e d ap o o r e r r e s u l t t h a n d i r e c t c u l t u r e , p r o b a b l y d u et o t h e o v e r g r o w t h o f m a r i n e b a c t e r i a i n t h i sn u t r i e n t - r i c h m e d i u m . GSTB o r i g i n a l l y d e -s c r i b e d w a s p H 9 . 4 ( 5 ) , b u t we a d j u s t e d t h e f i n a lp H t o 8 . 5 , s i n c e K u a n d Chun ( 3 ) r e p o r t e d t h a tt h e g r o w t h o f V . p a r a h a e m o l y t i c u s w a s m a r k -e d l y s u p p r e s s e d a n d s o m e s t r a i n s f a i l e d t o g r o wa t p H 9 . 4 . We f o u n d t h a t t h e i n h i b i t o r y e f f e c t o fT e e p o l w a s a l m o s t i d e n t i c a l w i t h V . p a r a h a e -m o l y t i c u s a n d V . a l g i n o l y t i c u s i n p e p t o n ew a t e r c o n t a i n i n g N a C l , b u t t h e i n h i b i t i o n w a sm o r e m a r k e d w i t h V . a l g i n o l y t i c u s i n p h o s p h a t eb u f f e r c o n t a i n i n g N a C l . T h e r e f o r e , t h e a d d i t i o no f T e e p o l i n GSTB w a s n o t t h o u g h t t o p l a y ar o l e i n t h e i n h i b i t i o n o f V . a l g i n o l y t i c u s , acommon m a r i n e b a c t e r i u m .We h a v e n o t e d t h a t t h e p r o p a g a t i o n o f V .p a r a h a e m o l y t i c u s i n 3 % N a C l s o l u t i o n ( u n p u b -l i s h e d d a t a ) , a n d i n 3% N a C l a d d e d w i t h 0 . 2 %T e e p o l ma y b e u s e d f o r t h e s a m e p u r p o s e w i t hS T B . S i n c e ST B d o e s n o t c o n t a i n i n g r e d i e n t sw h i c h s u p p o r t t h e a c t i v e g r o w t h o f V . a l -g i n o l y t i c u s , a l a r g e a m o u n t o f m a r i n e m a t e r i a l sma y b e u s e d f o r t h e e n r i c h m e n t o f V . p a r a h a e -m o l y t i c u s , w i t h w h i c h much b e t t e r r e s u l t s a r e

o b t a i n e d t h a n S P . T h e e v a l u a t i o n o n t h e e n -r i c h m e n t o f V . p a r a h a e m o l y t i c u s i n f e c a l s p e c i -m e n s n e e d s m o r e e x t e n d e d o b s e r v a t i o n .ACKNOWLEDGMENT

T h i s r e s e a r c h w a s s u p p o r t e d b y t h e U . S . Army R e s e a r c ha n d D e v e l o p m e n t G r o u p ( F a r E a s t ) , D e p a r t m e n t o f t h eA r m y , u n d e r g r a n t D A - C R D - A F E - S 9 2 - 5 4 4 - 7 1 - G 1 7 5 .We t h a n k Y . M i y a m o t o , K a n a g a w a P r e f e c t u r a l P u b l i cH e a l t h L a b o r a t o r y , J a p a n , f o r t h e s u p p l y o f V . p a r a h a e -m o l y t i c u s .

LITERATURE CITED1 . C h u n , D . , S . Y . S e o l , R . T a k , a n d C . K . P a r k . 1 9 7 2 .I n h i b i t o r y e f f e c t o f g l y c e r i n o n V i b r i o p a r a h a e m o l y t i c u sa n d S a l m o n e l l a . A p p l . M i c r o b i o l . 2 4 : 6 7 5 - 6 7 8 .2 . H u g h , R . , a n d R . S ak az a k i . 1 9 7 2 . M i n i m a l n u m b e r o fc h a r a c t e r s f o r t h e i d e n t i f i c a t i o n o f V i b r i o s p e c i e s , V i b r i oc h o l e r a e , a n d V i b r i o p a r a h ae m o l y t i c us . P u b l . H e a l t hL a b . 3 0 : 1 3 3 - 1 3 7 .3 . K u , C . S . , a n d D . C h u n . 1 9 7 1 . S t u d i e s o n t h e g r o w t h o f

V i b r i o p a r a h a e m o l y t i c u s a n d V i b r i o c h o l e r a e ( i n K o -r e a n ) . K o r e a n C e n t . J . M e d . 2 0 : 4 4 1 - 4 4 8 .4 . L e C l a i r , R . A . , H . Z e n - Y o j i , a n d S . S a k a i . 1 9 7 0 . I s o l a t i o na n d i d e n t i f i c a t i o n o f V i b r i o p a r a h a e m o l y t i c u s f r o m c l i n -i c a l s p e c i m e n s . J . C o n f . P u b l . H e a l t h L a b . D i r e c t .2 8 : 8 2 - 9 2 .5 . S a k a z a k i , R . 1 9 6 5 . V i b r i o p a r a h a e m o l y t i c u s , i s o l a t i o n a n di d e n t i f i c a t i o n , p . 1 - 1 3 . N i h o n E i y o K a g a k u C o . P r e s s ,T o k y o .

1 1 2 6 A P P L . M I C R O B I O L .