AÑO 3 NO. 1

REVISTA TRIMESTRAL CIENTÍFICA, PUBLICADA POR EL PROGRAMA DE

ASEGURAMIENTO PARA LA CALIDAD ENTRE LABORATORIOS

EMPRESA CERTIFICADA INTERNACIONALMENTE EN

ISO 9001:2008

AÑO 3 NO. 1

Incluída en IMBIOMED, http://www.imbiomed.com

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Editorial Medlab Pacal

PRIMER LUGAR. MEJOR TRABAJO LIBRE 1er Encuentro Internacional sobre Control de Calidad en el Laboratorio Clínico.

Año 3 No.1

Dr. Sergio I. Alva EstradaDirector General

L.A.E. Aimee Alva MartínezDirectora Administrativa y de Planeación.

Dra. en C. Patricia Flores GuzmánEditor

Dra. en C. Patricia Flores GuzmánCaribel Palomar CollCorrector de Estilo

Lic. Flor del Alba Ochoa EspinosaArmando Esparza GómezPublicidad

D.C.G. Karina Montoya BecerraDiseño Editorial

Consejo EditorialDr. Sergio I. Alva EstradaDr. Sergio Alva MartínezDr. Francisco Durazo QuirozDr. Andrés Romero RojasQFB Carlos Ponce HernándezM. en C. Rosa María Sánchez ManzanoQBP Carlos Aquino SantiagoQBP Mercedes Cabañas CortezDra. en C. Patricia Flores GuzmánM. en C. Vicente de María y Campos OrteguiDr. Felipe García Malo Bautista

Esta revista se imprimió en la Ciudad de México en los talleres de: Impresos Villa Florito S.A de C.V. Laguna de

Términos #528 Col. Anáhuac, Del. Miguel Hidalgo, Méx. D.F. C.P. 11320 Tel. (55) 5260 4010

Directorio En el inicio del tercer año de la publicación de nuestra revista, es para nosotros un orgullo publicar los primeros

trabajos en extenso que se presentaron en modalidad de poster en el 1er. Encuentro Internacional sobre Control de Calidad en el Laboratorio Clínico. La designación del mejor trabajo libre presentado en noviembre pasado, resulto ser una decisión más difícil de lo considerada en un inicio, debido a la calidad de los diversos temas sometidos. Para nosotros, resulta agradable y digno de ser reconocida la tarea que realizaron los participantes en la convocatoria. El proceso de seleccionar, designar y analizar los datos a presentarse puede llegar a ser una tarea engorrosa, muchas veces realizada después del trabajo laboral. Por ello, una forma de corresponder a los participantes de la convocatoria, es presentar su trabajo, independientemente si se encontraron dentro de los tres primeros lugares, empezando por este número de la revista y a lo largo del año.

Los datos que se generan así como la experiencia adquirida por cada centro de diagnóstico, debe ser compartida; de igual forma, el artículo final de este número nos brinda información sobre la diagnosis del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). El contagio por este virus ha avanzado rápidamente hasta llegar a ser una de las mayores plagas de nuestro tiempo, afectando actualmente entre 30.6 y 36.1 millones de personas en todo el mundo. Más de 2.08 millones de personas mueren por causa del VIH/SIDA por año en todo el mundo. La pandemia ha dejado efectos en la cultura, economía y política y ha conducido a “el mayor revés en el desarrollo humano” en años recientes (1). Por ello, conocer las herramientas de las que podemos disponer para dar una mejor calidad de vida a los pacientes de SIDA, debe ser parte del tratamiento. El CENAREM nos ha permitido publicar la información sobre el fundamento del método de determinación del tropismo del virus de VIH con el que cuentan; siempre, el primer paso debe ser la información, y es así como nuestra revista interviene.

¡Excelente inicio de año para todos!

1. Kempen JH. Indian J Ophthalmol 2008; 56:385-390.

ATENTAMENTEPacal MedLab.

CONTENIDO

TROFILE™ Y TROPISMO

Proveedor de ensayos de aptitud reconocido por ema para los alcances

indicados en el escrito con númeroPEA-CLI-04, a partir de 2010-01-25.

SEGUNDO LUGAR. MEJOR TRABAJO LIBRE 1er Encuentro Internacional sobre Control de Calidad en el Laboratorio Clínico.

TERCER LUGAR. MEJOR TRABAJO LIBRE 1er Encuentro Internacional sobre Control de Calidad en el Laboratorio Clínico.

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22REVISTA Pacal MedLab, Año 3, N° 1 enero – marzo 2011, es una publicación trimestral editada por el Programa de Evaluación de la Calidad. Alhelí No. 78, Col. Nueva Sta, María Del. Azcapotzalco, C.P. 02800, Tel. 5341-3014 / www.pacal.org, [email protected] responsable: Dra. en C. Patricia Flores Guzmán. Reservas de Derechos al Uso Exclusivo en trámite ISSN en trámite. Impresa por Grupo Fauvi, José Cardel N° 138 Ampliación San Pedro Xalpa Azcapotzalco, México, D. F., C.P. 02710. Tel. +52(55) 5511 9635.Este número se terminó de imprimir el 30 de Diciembre de 2010 con un tiraje de 2,500 ejemplares.Las opiniones expresadas por los autores nonecesariamente reflejan la postura del editor de la publicación.Queda estrictamente prohibida la reproducción total o parcial de los contenidos e imágenes de la publicación sin previa autorización del PACAL.

181er Encuentro Internacional sobre Control de Calidad en el Laboratorio Clínico.

TRABAJO PARTICIPANTE

4 54 5www.pacal.org www.pacal.org

1.1 ObjetivoEl objetivo fundamental del implemento de estas normas es describir y, por tanto, documentar la NC ISO 15189 en el laboratorio clínico del CEMAC, basado en el cumplimiento de la NC ISO 9001 2000, apoyado en las recomendaciones de la OACI y de esta norma, cuyo alcance, comprende la estructura organizativa, documental y actividades técnicas que realiza el Laboratorio Clínico del CEMAC, bajo un SGC, implantado sus requisitos de manera que satisfaga las exigencias de

sus clientes. La actividad fundamental del Laboratorio Clínico es desarrollar la medicina preventiva con los titulares de licencia, garantizando el examen psicofísico de selección y control de salud, así como el peritaje médico, a los tripulantes técnicos con la mayor profesionalidad y eficiencia en correspondencia con los últimos avances científicos–técnicos, realizando acciones de adiestramiento, promoción, prevención, restablecimiento de la salud e investigación en el campo de la Medicina de Aviación, y en otros usuarios autorizados por la dirección, realizando el laboratorio los siguientes ensayos como parte de estas actividades:

Esquema 1. Ubicación del Laboratorio dentro de la estructura organizativa del CEMAC.Nota: El Laboratorio Clínico se enmarca dentro del departamento de Pruebas.

1º Primer lugar. Mejor Trabajo Libre. 1er Encuentro Internacional sobre Control de Calidad en el Laboratorio Clínico.

Primeras experiencias en Cuba en la aplicación de la NC 15189 en el Laboratorio Clínico de Aeronáutica

Civil de Cuba.Autores:Lic. María de Lourdes Morera*, Ing. Manuel Navas*, Dr. Pablo González Martínez*

Colaboradores: Ing. Nuria Dávila**, Ing. Rita Sosa, **.

Asesora: Msc. Aurora Karina Robles Martínez.****Centro Médico de la Aviación Civil de Cuba e Instituto de Aeronáutica Civil de Cuba.** Instituto de Normalización de Cuba.***IMECCA.

Autor para correspondencia:Lic. María de Lourdes [email protected]@cemac.cacsa.avianet.cu

Resumen:

En el Centro Médico de la Aviación Civil de Cuba, se implementó y monitoreó con asesoría del Instituto Nacional de Normalización (ININ), sobre la base de integración

del Sistema de Gestión de Calidad de las ISO 9001, ya implementado y certificado por Veritas, en la corporación de Cubana de aviación, la norma NC 15189:2008 Laboratorios Clínicos Requisitos particulares para la calidad y competencia en el laboratorio del mencionado centro, que tiene como función realizar el examen Médico de Control de salud a todos sus titulares de licencia.

Se presentan en el trabajo las experiencias adquiridas y las modificaciones realizadas al manual para la aplicación de los requisitos técnicos debatidos ampliamente en el curso de Administración de Laboratorios Clínicos, efectuado en Guadalajara en el año en curso y perteneciente a la IMECCA.

Nuestras conclusiones indican que, en nuestra región, el programa PACAL es el que más se ajusta a los requerimientos técnicos de la norma y a nuestras necesidades económicas.

1. IntroducciónEl Laboratorio Clínico del Centro Médico de la Aviación Civil (CEMAC), tiene diseñado e implantado un Sistema de Gestión de la Calidad (SGC) para todas las actividades que realiza y que influyen directamente en la confiabilidad de sus resultados analíticos. Los fundamentos básicos del SGC están sustentados en las NC ISO 9001 2008 “Sistemas de Gestión de la Calidad. Requisitos y NC- ISO 15189 Laboratorios Clínicos. Requisitos Particulares de Calidad y Competencia”.

6 76www.pacal.org

2. Materiales y métodos,Siguiendo la metodología de las NC ISO 9001:2000 y NC ISO 15189:2008, aplicadas a nuestro centro, el organigrama de nuestro laboratorio quedó definido como se muestra a continuación:

La alta dirección del Laboratorio está formada por el Director del CEMAC y Jefe del laboratorio, quien además es el Jefe técnico, también por el Representante de La Calidad, persona que es responsable de la supervisión y monitoreo de la eficacia del sistema de gestión del laboratorio (equivalente a RESPONSABLE DE CALIDAD, según lo establece la ISO15189: 2008.

Política de La Calidad del Laboratorio Clínico“El Laboratorio Clínico del Centro Médico de la Aviación Civil de Cuba, perteneciente a la Corporación de la Aviación Cubana SA, realiza análisis bioquímicos y hematológicos para el diagnóstico clínico como parte del examen médico que se le practica a sus tripulantes técnicos, de cabina y al personal de tierra. Para dar un servicio competente y con calidad cuenta con especialistas de alta calificación científico técnica comprometidos junto a la alta dirección a desarrollar, mantener y mejorar el Sistema de Gestión de La Calidad basado en el cumplimiento de los requisitos de la norma NC-ISO 15189:2008, ISO 9001:2008 y requisitos legales

ESTRUCTURA ORGANIZATIVA DEL LABORATORIO CLÍNICO

aplicables para alcanzar la condición de laboratorio acreditado”. Fdo. Pablo González MartínezDirector General del Centro Médico

3. Resultados y Discusión.

Logramos estructurar un sistema de mejora continua que evalúe cuantitativamente las etapas pre analíticas, analíticas y post analíticas. En la tabla No. 1 enmarcamos los indicadores a evaluar y, en correspondencia con estos, los resultados se visualizarán en forma gráfica.

Tabla No 1. Indicadores de la calidad del laboratorio del CEMAC

Resultado 94%

Satisfactorio menor del 4%.

Satisfactorio 99%.

8 98 9 www.pacal.orgwww.pacal.org

Gráfico 1. Productividad del Laboratorio

En las fases pre analíticas, analíticas y post analíticas han sido excelentes nuestros resultados, cuya evidencia se ha obtenido de encuestas realizadas. Nos fortalecimos después del curso de la IMECA en cuanto a la parte de requisitos técnicos y adoptamos esquemas que han mejorado nuestro trabajo, como han sido el incluirnos en el PACAL, y asimilar la puesta en marcha de la teoría de la 6 Sigma.

No hemos tenido más de 2 muestras hemolizadas en la fase en curso, ni hemos tenido en las encuestas No conformidades, señaladas por nuestros clientes, en referencia al área del Laboratorio, ya que hemos aplicado el principio de la mejora continua y las evaluaciones periódicas a nuestro sistema que creemos podemos mejorarlo aún más. Tenemos deficiencias serias en el suministro estable de reactivos y en la firma de contratos con los importadores.

4. Recomendaciones.Incluir a nuestro país de forma oficial en el Programa PACAL, para facilitar la excelencia en la parte de Requisitos técnicos de esta norma.

5. Bibliografías consultadas.NC 15189:2008. Laboratorios Clínicos, Requisitosparticulares para la calidad y competencia.NC NC ISO 9001 2000. Importancia de la Relevancia Médica en ISO 15189:2003. Rev Mex Patología Clin 2007; l 54(2): 59-7.EN – ISO -5725/hasta 6.NC- ISO Guía desde 30-35

Serie 1 Introducción.

La enfermedad cardíaca coronaria (CAD, por sus siglas en inglés), es una de las principales causas de muerte, la cual se

caracteriza por la acumulación de depósitos de ácidos grasos a lo largo de la capa más profunda de las arterias coronarias, ocluyéndolas. Los depósitos de grasa pueden desarrollarse en la infancia y continuar creciendo y engrosándose a lo largo de la vida. Este engrosamiento, llamado aterosclerosis, hace más estrechas las arterias y puede disminuir u obstruir el flujo de sangre al corazón.1

Los ácidos grasos son transportados por las lipoproteínas, como las de baja densidad (LDL), las cuales son un importante factor de riesgo para desarrollar CAD. Las LDL, se clasifican por el diámetro que tienen, dentro de las cuales se encuentran las sd LDL (diámetro 25 nm) que son particularmente aterogénicas, ya que una persona con niveles elevados de sd LDL tiene 3 veces mayor riesgo de sufrir un infarto de miocardio (IM).2 Esto se debe a que un 40% de las sd LDL se infiltran endotelialmente, por lo que las sd LDL sirven como un indicador de riesgo de cardiopatía isquémica.

Las LDL son un grupo heterogéneo de partículas que varían en su contenido de colesterol 3-5 lo que genera que se observen dos fenotipos: un patrón A, que contiene a las partículas grandes y flotantes, con una gran cantidad de colesterol en las LDL, y un patrón B que contiene en su mayoría pequeñas y densas partículas LDL formadas por una disminución de colesterol en el centro de las partículas5.

Se ha sugerido que en comparación con las grandes y flotantes partículas de LDL, las sd LDL son altamente aterogenicas como resultado de su alta penetración en la pared arterial, su baja afinidad de unión al receptor

Julio Lara-Riegos1*, Martha Mena-Reynoso1,

Roque Gamboa-Llanes1, Jorge Castro-Mañé1,

Rubén Yza-Villanueva2, Vanessa Villegas-

Hernández1.1 Laboratorio de Análisis Clínicos, Facultad de

Química, Universidad Autónoma de Yucatán2 Unidad Cardiometabólica Centro Médico

de las Américas, Asociación Mexicana para

la Prevención de la Aterosclerosis y sus

Complicaciones zona Sureste

*Correspondencia: Calle 41 No. 421 x 26 y

28. CP 97150. Tel 999 9 22 57 16 ext 115.

Email: [email protected]

PALABRAS CLAVE: lipoproteínas, pequeñas y densas partículas de colesterol LDL, enfermedad coronaria.

Verificación de la cuantificación de las pequeñas y densas

partículas de colesterol de baja densidad (sd LDL)

Segundo lugar. Mejor Trabajo Libre. 1er Encuentro Internacional sobre Control de Calidad

en el Laboratorio Clínico.2º

10 111110 www.pacal.orgwww.pacal.org

Verificar la cuantificación de las sd LDL por el método de precipitación aplicable a un autoanalizador incorporarlo a los análisis de rutina.

- Método directo para la determinación de C-LDL.Este método para la determinación directa del colesterol de baja densidad (LDL), emplea la solubilización micelar directa del colesterol de baja densidad (LDL), por un detergente no iónico y la interacción de un compuesto de azúcar y lipoproteínas (VLDL y quilomicrones). Al añadir un detergente en el método enzimático (reacción de acoplamiento de colesterolesterasa-colesteroloxidasa), la actividad relativa del colesterol en las fracciones de lipoproteínas aumentan en el siguiente orden: HDL< quilomicrones < VLDL < LDL. En presencia de Mg++, un compuesto de azúcar reduce pronunciadamente la

de LDL, su prolongada vida media en plasma y su baja resistencia al estrés oxidativo. Muchos estudios han reportado un incremento de 2 a 3 el riesgo de CAD entre pacientes que tiene el patrón B 6,7.

Existen diferentes principios y métodos para el aislamiento de las fracciones de sd LDL. El tamaño de las partículas usualmente son medidas por gradientes de gel de electroforesis, este procedimiento requiere tiempo de corrimiento electroforético prolongado, tinciones y los resultados obtenidos no son cuantitativos.

También se pueden aislar por ultracentrifugación que es la técnica estándar para cuantificar las sd LDL; sin embargo, esta técnica es demasiado laboriosa para su uso rutinario en el laboratorio debido que requiere de equipamiento especial y tiempo de corrida prolongado.Es conocido que una combinación de cationes divalentes y polianiones precipitan las lipoproteínas que contienen a las apolipoproteinas B (Apo B). Utilizando cloruro de magnesio y heparina de sodio se logra la precipitación parcial de las lipoproteínas que contienen Apo B, y la parte densa de las LDL permanecen en el sobrenadante al realizar el procedimiento. Este método de precipitación puede ser aplicado como examen de tamizaje, prueba clínica y otras propuestas que requiera de un rápido análisis de un gran número de muestras.

OBJETIVO

MATERIAL Y MÉTODOS

-Determinación de pequeñas y densas partículas de LDL.Las sd LDL se determinaron según la técnica descrita por Tsutomu Hirano et al.9, a 0.3 mL de suero control se adicionó un reactivo precipitante (0.3 mL) conteniendo 150 U/ml de heparina de sodio y 90 mmol/L de MgCl2, se mezcló y se incubó por 10 min a 37°C. Las muestras

-Verificación

Linealidad: Para realizar la evaluación de la linealidad, se prepararon diluciones de las muestras de los pacientes analizados rutinariamente en el laboratorio, que presentaron una baja concentración del analito a ser evaluado en una de ellas y una concentración alta. Una vez definidas las muestras a utilizar, la asignación final

RESULTADOS

reacción enzimática de medición de colesterol en VLDL y quilomicrones. Al combinar un compuesto de azúcar y un detergente, se puede efectuar la determinación selectiva del colesterol LDL en suero. En presencia de oxígeno, el colesterol se oxida por la colesterol oxidasa a Δ4-colestenona y peróxido de hidrógeno. La intensidad cromática del colorante azul de quinonaimina formado, es directamente proporcional a la concentración de colesterol LDL. Se determina midiendo el aumento de la absorbancia a 583nm. Se utiliza un método homogéneo, enzimático, colorimétrico, de punto final.8

se colocaron en un baño con hielo y se dejaron reposar por 15 min. Posteriormente se centrifugaron a 35, 747 G por 15 min a 4°C. Se removió una alícuota del sobrenadante y se analizó de manera directa por el método anteriormente descrito para C-LDL.

del valor se obtuvo calculando la media aritmética de un triplicado. A las diluciones se les asignó un número de forma arbitraria, donde 1 correspondió a la menor concentración, y 5 a la mayor. La media de la concentración hallada empleada para su respectiva asignación dentro de la escala arbitraria, se muestra en la Tabla 1.

Tabla 1. Resultados de la concentración en las diferentes diluciones realizadas.

Grafica 1. Muestra las medias de las replicas de las concentraciones de sd LDL en el eje Y, contra las diluciones, en el eje X.

A partir de estos datos, se construyó la gráfica 1, con la media aritmética de las réplicas sobre el eje Y (ordenadas), en función de la concentración sobre el eje X. Se calculó la ecuación de la recta para los puntos dados, así como el coeficiente de correlación.

Los datos obtenidos por el método ecuación de la recta, fueron:

y = bx + ay = 0.696(x) + 13.328

Resumen de las reacciones en la prueba colorimétrica enzimático homogéneo.

aSodio N (2-hidro-3.sulfopropilo)-3,5-dimetoxianilina

12 1312www.pacal.org 13 www.pacal.org

Precisión: Para evaluar la precisión en el laboratorio se aplicó lo siguiente: Se realizó el examen con una muestra de paciente, analizada 20 veces en forma continua, intraserial o intracorrida. Se calculó la media, la desviación estándar y el coeficiente de variación expresado en porcentaje10, los resultados se presentan en la tabla 4.

del error total permitido (ET); esto es, la DE del método propuesto fue de 1.04 inferior a una DE de 3 reportada por el fabricante, DE intraserial o DE intradía ≤ 0,25 (ET) (12). 10

Veracidad: Para determinar si la solución de heparina de sodio y cloruro de magnesio precipito solamente a las grandes y flotantes partículas de LDL, se decidió comparar, de manera cualitativa, en una electroforesis, el patrón de bandeo reportado por Hirano et al9 (Figura 1).

Las lipoproteínas pueden ser precipitadas selectivamente con combinaciones particulares de cationes divalentes y polianiones (ej. sulfato de heparina, dextran sulfato o fosfotungstato de sodio en combinación con Mn+2, Mg+2, o Ca+2). La combinación de heparina y magnesio no precipita todas las Apo B contenidas en las lipoproteínas y deja a las sd LDL en el sobrenadante.

Existen diversas metodologías basadas en diferentes principios para la medición de las partículas sd LDL, muchas de los cuales requieren de equipos especiales y de alto costo, la mayoría no disponibles en los laboratorios clínicos; este trabajo presenta evidencia de un método de precipitación10 aplicable a un autoanalizador verificado en el laboratorio de Análisis Clínicos de la Facultad de Química de la UADY, ofreciendo una opción para la medición de manera rutinaria y a un mayor número de muestras, las cuales, a concentraciones elevadas, indican un riesgo de 3-4 veces más de enfermedad cardiovascular para los pacientes analizados.2,7,11

CONCLUSIONES

Donde b es la pendiente, a es el intercepto, y x es la media de las réplicas. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 2.

Finalmente, se comparó el sesgo (desviación) o el porcentaje de error tabla 3, para cada dilución, con el error permitido para la prueba, de acuerdo con la información del fabricante, donde el sesgo (desviación) y el % de error deben ser menor al permitido.10

Tabla 3. Comparación del sesgo con el porcentaje de error de las cinco diluciones realizadas.

Gráfica 2. Se observa en el eje Y las medias de los valores obtenidos y, en el eje X, el valor teórico.

Tabla 2. Valores obtenidos al aplicar la ecuación de la recta.

El error analítico reportado por el fabricante en cuanto al LDL-Colesterol plus 2nd generación, del laboratorio de Roche es de 12%. Lo cual indica que el método de las sd LDL se encuentra dentro del intervalo de error al observarse un 10 %.10

El error analítico reportado por el fabricante en cuanto al LDL-Colesterol plus 2nd generación, del laboratorio de Roche es de 12%. Lo cual indica que el método de las sd LDL se encuentra dentro del intervalo de error al observarse un 10 %.10

Tabla 4: Resultados de la evaluación de la precisión en el laboratorio.

Criterio de aceptabilidad: Los resultados de la corrida intraserial informan un coeficiente de variación (CV) 3.79 inferior al reportado por el fabricante, que es de 4%, por lo que la cuantificación de sd LDL cumple el criterio de aceptabilidad.

De acuerdo a criterios de aceptabilidad del Clinical Laboratory Improvement Amendments (CLIA), la desviación estándar (DE) obtenida fue menor a ¼

Figura 1. Banda de LDL en acetato de celulosa, en equipo Genio. Se observa una banda correspondiente a LDL en suero sin precipitar en un sujeto con patrón A (26.5 nm), y esta está ausente en el sobrenadante obtenido por precipitación heparina-Mg.9


Este trabajo fue Financiado por el Programa de Impulso y Orientación a la Investigación (PRIORI) UADY, ClaveFQUI-10-01 y la empresa Roche. Los autores declaran no tener conflicto de intereses con la casa comercial.

AGRADECIMIENTOS

REFERENCIAS CITADAS

1.University of Virginia, Health system (consultado en Marzo, 2010) http://www.healthsystem.virginia.edu/uvahealth/adult_cardiac_sp/coronary.cfm James O. 2.Lamarche B, et al. Small, dense low-density lipoprotein particles as a predictor of the risk of ischemic heart disease in men: prospective results from the Quebec Cardiovascular Study. Circulation 1997; 95:69-75.

3.Otvos JD, et al. Measurement issues related to lipoprotein heterogeneity. Am J Cardiol 2002; 90 (8A): 22i–29i.

4.Sniderman AD. How, when, and why to use apolipoprotein B in clinical practice. Am J Cardiol 2002; 90 Suppl:48i–54i.

5.Kwiterovich PO. Clinical relevance of the biochemical, metabolic and genetic factors that influence low-density lipoprotein heterogeneity. Am J Cardiol 2002; 90 Suppl:30i– 45i.

6.Austin MA, et al. Low-density lipoprotein subclass patterns and risk of myocardial infarction. JAMA 1988; 260: 1917-1921.

7.Austin MA, et al. Atherogenic lipoprotein phenotype: a proposed genetic marker for coronary heart disease risk. Circulation 1990; 82: 495-506.

8.Test para calibrador. Técnicas de Laboratorio Roche, 2007, Ref: 10759350.

9.Hirano T, et al. A novel and simple method for quantification of small dense low-density lipoprotein. J Lipid Res 2003; 44:2193–2201.

10.Guía para la validación y la verificación de los procedimientos de examen cuantitativos empleados por el laboratorio clínico, abril 2008 (ema).

11.St-Pierre AC, et al. Comparison of various electrophoretic characteristics of LDL particles and their relationship to the risk of ischemic heart disease. Circulation 2001; 104:2295-2299.

INTRODUCCIÓN

El Control de Calidad en Microbiología Clínica comprende el monitoreo permanente de medios de cultivo, equipos, procedimientos y personal, como parte fundamental

del óptimo funcionamiento de un laboratorio.

Los hemocultivos constituyen una de las prioridades del Laboratorio de Microbiología Clínica para el diagnóstico y tratamiento de las bacteriemias. La obtención, procesamiento e incubación de hemocultivos y todos los procesos que incluyen: la identificación de los aislamientos, pruebas de susceptibilidad, y los resultados, son actividades dentro de las cuales, parámetros de control de calidad deben ser evaluados y monitorizados (1, 2, 7).

El registro de los datos del diagnóstico microbiológico permite conocer la prevalencia de los distintos agentes patógenos causantes de procesos infecciosos; por lo cual, en los últimos diez años se han desarrollado diferentes sistemas de hemocultivos (radiométricos, espectrometría de infrarrojo y cambios de pH), con el fin de aumentar sensibilidad y rapidez en la detección del crecimiento bacteriano (3). El Bactec 9240 es un equipo que detecta el CO2 producido por el crecimiento de los microorganismos dentro de los frascos de cultivo. El control de calidad que debe establecerse en estos sistemas es la funcionalidad de los medios de cultivo, utilizando cepas control (ATCC) y el funcionamiento del instrumento, que incluye programas de mantenimiento (temperatura y R.C.C de las estaciones), calibración y verificación (4). Asimismo, como parámetros del aseguramiento de la calidad: % de contaminación, número de hemocultivos, volumen e inoculación de la muestra.

Control de Calidad en Hemocultivos en Equipo Automatizado

QFB Ibarra-López Alicia, QFB Rodríguez-Galicia Verónica, QBP Téllez-Morán Claudia Verónica, QFB. Vázquez–Larios María del Rosario, Dr. Rivera-Martínez Eduardo.Instituto Nacional de Cardiología “Ignacio Chávez” (INCICh)Departamento de Microbiología Clínica

Autor para correspondencia:QFB Verónica Rodríguez Galiciavero _ [email protected] Nacional de Cardiología “Ignacio Chávez”Departamento de Microbiología ClínicaTel. 55 73 29 11 Ext. 1270Fax. 55 73 09 94

Tercer lugar. Mejor Trabajo Libre. 1er Encuentro Internacional sobre Control de

Calidad en el Laboratorio Clínico.3º


OBJETIVO GENERAL•Describir el control de calidad en el proceso de hemocultivos en equipo automatizado.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS•Describir los parámetros para realizar control de calidad en hemocultivos.•Determinar los hemocultivos verdaderos positivos, verdaderos negativos, falsos positivos, falsos negativos y contaminantes.•Calcular la especificidad y sensibilidad clínica del equipo automatizado.

MATERIALESMuestra: 5,449 Frascos de hemocultivos obtenidos de pacientes del INCICh durante el periodo de enero a diciembre del 2009.

Medios de Cultivo: BACTEC Peds/Plus F, Anaerobic Lytic/10, Plus Aerobic F. Se verificó el certificado de calidad, número de lote, fecha de entrega y fecha de caducidad; así también, se determinó la funcionalidad de los medios de acuerdo a las cepas ATCC recomendadas por el fabricante y el Instituto de Estándares de Laboratorios Clínicos (7).

Equipo Automatizado: BACTEC 9240, Se verificó el mantenimiento diario (temperatura de incubación, funcionamiento de las estaciones [detección de hemocultivos positivos, negativos y anónimos, estaciones vacías, alarmas (hemocultivos positivos, control de temperatura y errores del sistema), respaldo de la información], así como el cambio semanal del filtro y mantenimiento preventivo cada 6 meses.

METODOLOGIAMedios de cultivo: Para determinar la funcionalidad de los medios de cultivos se utilizaron las cepas control (ATCC) siguientes: Streptococcus pneumoniae 6305, Pseudomonas aeruginosa 27853, Bacteroides fragilis 25285, Escherichia coli 25922, Alcaligenes faecalis 8750, Haemophilus influenzae 19418, Candida albicans 18804, Streptococcus pyogenes 19615, Staphylococcus aureus 25923 y Neisseria meningitidis 13090). Cada una de las cepas se deben resuspender en solución salina

estéril, a una concentración de 0.5 Mac Farland, realizar diluciones seriales 1:10 (en total 3 diluciones), inocular 0.1 mL de la suspensión final en el frasco correspondiente e incubar de acuerdo a la metodología; el método se consideró verificado sí todos los aislamientos son detectados.

Subcultivos d e frascos positivos: Los subcultivos se realizaron en Agar sangre, chocolate y Mac Conkey (incubación a 35°C, tensión de CO2 al 5% de 18–24 horas.); simultáneamente se realizaron tinciones (gram, naranja de acridina) y en base a la morfología microscópica se procedió a la identificación y susceptibilidad antimicrobiana.

Subcultivos de frascos negativos: Después de 7 días, se siembran en Agar Chocolate (incubación: temperatura 35°C, atmósfera de CO2, por 48 horas) y para frascos con protocolos de 14 días también se realiza tinción de naranja de acridina.

Sensibilidad= No. verdaderos positivos/ No. verdaderos positivos + falsos negativos * 100Especificidad= No. verdaderos negativos/ No. verdaderos negativos + falsos positivos * 100Verdaderos positivos = Frascos detectados como positivos por el sistema.Verdaderos negativos = Frascos no detectados como positivos por el sistema.Falsos positivos = Frascos detectados por el sistema como positivos con subcultivo y tinciones negativos.Contaminantes = Aislados sin significado clínico.Falsos negativos = Frascos no detectados como positivos por el sistema con subcultivo ciego positivo al final del programa de incubación.•Errores mayores = Frascos no detectados como positivos por el sistema de las series tomadas al paciente (subcultivos).•Errores menores = Frascos detectados como positivos por lo menos en uno de los series tomadas al paciente (subcultivos).

RESULTADOSSe muestran en la siguiente tabla:

•Falsos negativos: Todos se catalogaron dentro de errores menores, encontrando Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis.

•Contaminantes: Estafilococos coagulasa-negativa, Bacillus sp.

•Falsos positivos: Estos se debieron frecuentemente a que algunos pacientes presentaban leucocitosis o niveles de glucosa elevados, lo que incrementa la pCO2 en el interior del frasco.

CONCLUSIONESLos datos obtenidos en el año 2009, se encuentran dentro de los rangos establecidos internacionalmente, lo cual refleja un funcionamiento óptimo del laboratorio en el área de hemocultivos, así como un eficaz y constante control de calidad a lo largo de todo el proceso.

Es de suma importancia tener siempre presente el porcentaje de falsos negativos y dentro de que rubro se están catalogando, para crear medidas que disminuyan al mínimo los errores; en nuestro caso todos se catalogaron dentro de errores menores, lo cual significa que, al ser detectados en por lo menos uno de los frascos de las series pertenecientes al paciente, fue posible brindarle atención oportuna al mismo con el tratamiento antimicrobiano indicado para el microorganismo identificado. Cabe mencionar que algunos de estos casos se debe a que las bacterias son aerobias estrictas y no es posible que se desarrollen en alguno de los frascos. Otro punto a analizar es el porcentaje de contaminantes, el cual no debe sobrepasar el 3%; el porcentaje obtenido fue menor, por lo que podemos decir que el personal del área de salud está realizando de forma eficiente la toma de muestras, así como las soluciones empleadas para realizar la asepsia son eficaces.

En conclusión, los parámetros mencionados son indispensables para el control de calidad interno del laboratorio para proporcionar resultados oportunos y confiables para el beneficio del paciente.

BIBLIOGRAFIA

1.Procedimientos en Microbiología Clínica. Recomendaciones de la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica. Editores E Cercenado y R Cantón, 2003. http://www.seimc.org/documentos/protocolos/microbiologia/cap3.htm).

2. Schawabe LD, et al. Evaluation of Bactec 9240 Blood Culture system by using high-volume aerobic resin media. J Clinic Microbiol 1995; 33(9):2451-2453.

3. Qian Q, et al. Direct Identification of bacteria from positive blood cultures by amplification and sequencing of the 16S rRNA Gene: Evaluation of Bactec 9240 Instrument True-Positive and False –Positive Results. J Clinic Microbiol 2001; 39(10): 3578-3582.

4. Fluorescent series user s manual. Becton Dickinson. Microbiology s systems BectonDickinson and company, Bactec. March 1999.

5. Elder BS, et al. 2009. Verification and validation of procedures in the clinical microbiology laboratory. CUMITECH 31: 1-7.

6. Alfa M, et.al.1995. Continuos Quality Improvement for Introduction of Automated BloodCulture Instrument. J. Clinical Microbiol. 33(5):1185-1191.

7. Baron EJ, et al. 2005. Cumitech 1C, Blood Cultures IV. Coordinating ed. EJ Baron. ASM Press, Washington, D.C.


Trabajo Participante1er Encuentro Internacional sobre Control de Calidad en el Laboratorio Clínico.

Hallazgos en el laboratorio en pacientes con neumonia atipica

o ¿influenza?

IBQ. Rodolfo Vázquez Gómez, LQC. Ma. Luz Bravo Herrera.Laboratorio Clínico del Hospital General de Celaya, Guanajuato.Teléfono: 01-412-156-2449 01-461-212-1326Autor para correspondencia: IBQ Rodolfo Vázquez Gómez.Correo electrónico: [email protected]

INTRODUCCIÓN

En abril del 2009 se comunicaron los primeros casos de la nueva influenza A H1N1 en el hemisferio norte, que rápidamente adquirió

caracteres de Pandemia (1). Se trata de una variante antigénica de influenza A H1N1 que no había sido previamente detectada en cerdos o humanos. Su genoma contiene un segmento humano, uno aviar, un porcino americano y otro segmento porcino eurasiático (2).

El virus afectó en mayor número a personas jóvenes entre 6 y 48 años, al contrario de lo comunicado en la influenza estacional de los últimos años (3).

PLANTEAMIENTODesde el mes de mayo del pasado año 2009, se presentaron en el Hospital General de Celaya pacientes con un cuadro clínico de Neumonía Atípica corroborado, entre otros parámetros, radiológicamente; algunos de estos pacientes llegaron en estado avanzado de la enfermedad, pues tuvieron que atenderse directamente en terapia intensiva, algún otro llegó a hospitalización y posterior a su agravamiento (compromiso respiratorio) fueron atendidos en terapia intensiva (4).

Palabras clave: Neumonía Atípica, Influenza.

JUSTIFICACION.Los pacientes considerados en este estudio, acudieron al Hospital general de Celaya, durante los meses de Mayo a Agosto de 2009, periodo en el cual estaba en su punto más álgido el problema de la influenza en nuestro país y en el mundo, la información era escasa, por lo que se hacia urgente contribuir en algo al diagnóstico, tratamiento y recuperación de los pacientes que acudían con este problema de salud.

OBJETIVOA éstos pacientes se les efectuaron varios análisis en el laboratorio, estudios que pueden estar al alcance de cualquier laboratorio clínico del país y, el objetivo del presente trabajo es analizar los hallazgos encontrados para, de ser posible, establecer un pronóstico del paciente en cuanto a su enfermedad y tomar la decisión de continuar aquí su tratamiento o su traslado a otro nivel para su recuperación.

MARCO TEORICOHay tres tipos de INFLUENZA conocidos A, B, y C, y existen al menos 144 subtipos que son combinaciones que van desde H1N1 hasta H16N9. El tipo A tiene mayor capacidad para infectar a una gran variedad de especies: seres humanos, aves, caballos y cerdos entre otros. El nuevo subtipo identificado en los Estados Unidos (EU) y Canadá corresponde al “AH1N1”, el cual tiene un componente de la influenza porcina; por lo tanto, podemos establecer que este subtipo pertenece a la familia Ortomixoviridiae, tiene forma esférica y estáconstituido por una molécula de RNA cuya cubierta posee 2 glicoproteínas: una de ellas es la Hemaglutinina “HA” (se conocen 16 tipos diferentes) cuya función es unirse a la superficie de las células que invade; la otra que se llama Neuraminidasa “NA” (se conocen 9), que facilita la liberación del virus al interior de las células donde se reproduce. Existen varios tipos de la influenza porcina, sus nombres dependen de las características de estas glicoproteinas, las más frecuentes en el cerdo son la H1 N1 y la H3 N2. Hay además uno de origen euroasiático el H1 N2 alguno de estos tipos virales (probablemente el último), sufrió una mutación, es decir modificó la estructura de su RNA y de las glicoproteinas de su superficie. Este cambio produjó que una infección que pudiera ocurrir bidireccionalmente, de cerdo a humano, adquiriera la capacidad de transmitirse de humano a humano. Para el ataque de esta enfermedad se están empleando 2 medicamentos antivirales: el Zanamivir que debe ser inhalado, y el Oseltamivir que es en tabletas; éste último es una prodroga, lo cual indica que su molécula se transforma en el organismo cambiando su estructura, y su efecto es inhibir a la Neuraminidasa, bloqueando la entrada del virus a la células, impidiendo así su reproducción.

METODOLOGÍAA.- POBLACION Y MUESTRA. En la presente investigación se consideraron los resultados de análisis de laboratorio realizados a 17 pacientes: 8 mujeres (47%), y 9 hombres (53%), cuyas edades fluctuaban entre los 13 y 48 años (edades que se plantearon por las autoridades sanitarias como las más susceptibles de contraer la influenza AH1N1(7), todos ellos fallecidos, y refirieron el inicio de su enfermedad algunos de los síntomas: cuadro gripal y tos intensa, dolor de cabeza, lagrimeo, irritación de ojos, dolor en articulaciones y miembros superiores, fiebre alta(no cuantificada por ellos), dolor leve de garganta, espasmo muscular, e ingresaron con problemas respiratorios de moderados a severos que requirieron hospitalización a los cuales se les dio seguimiento hasta su fallecimiento registrando los datos de los resultados en los estudios descritos.

B.- INSTRUMENTO. A los pacientes se les realizaron estudios de prueba rápida de influenza, resultando negativa, biometría hemática, química sanguínea, pruebas de función hepática, deshidrogenasa láctica, creatinfosfoquinasa, hemocultivo, urocultivo, cultivo de secreción bronquial, entre otros, presentando resultados semejantes en algunos parámetros mencionados o con tendencia al mismo comportamiento, observado esto en los pacientes fallecidos . RESULTADOSLos Hallazgos encontrados en los estudios de estos pacientes son:

De la Biometría Hemática:a.- Recuento de Leucocitos: Se observó Leucocitosis en 3 pacientes (17.5%) y recuento Normal en el 82.5%, sin mostrar variaciones considerables durante su estancia hospitalaria.

b.- Recuento de Plaquetas: Normal Bajo (Menos de 150,000 y mayor de 50,000) en el 47 % de los casos y normal en el 53% restante.

c.- Recuento diferencial de Leucocitos: El 90% presentó Neutrofilia, neutrófilos vacuolados.

Linfopenia en el 88.2% de (sin anormalidades morfológicas en los linfocitos que pudieran orientar hacia una infección viral).

Monocitosis en el 53 %, observando anormalidades morfológicas que hemos clasificado como monocitos en transición a macrófago y están vacuolados.

d.- Hemoglobina: Durante su estancia hospitalaria


mostraron una tendencia a la baja los valores de hemoglobina, disminución mínima no considerada patológica, atribuible a una hemodilución por los líquidos parenterales suministrados.

De la Química Sanguínea y Pruebas de Función Hepática.a.- Deshidrogena Láctica y Transaminasas (AST y ALT): de inicio podemos decir que el 100% de los pacientes presentó una elevación en estos parámetros, siendo muy considerable en la LDH.

b.- Bilirrubinas: El 100% de los pacientes permaneció dentro de los rangos normales, sin alteraciones que pudieran sugerir algún daño hepático.

c.- Glucosa: El 65% de los pacientes presentó elevación de la misma sin tener al antecedente de padecer algún tipo de diabetes. El 35% restante permaneció dentro de los rangos normales.

d.- Urea y Creatinina: 13 pacientes (76.5%) presentaron elevación en estos parámetros que nos indican que la neumonía que cursan es concomitante con una insuficiencia renal secundaria a este padecimiento pues en todos ellos empezó la elevación de estos parámetros días previos a su fallecimiento.

e.- Creatinfosfoquinasa: De los pacientes considerados en este estudio sólo a 11(65%), se les realizo este estudio habiendo presentado elevación el 64%.

f.- Proteínas Totales y albúmina: encontramos un descenso en estos valores en el 95% de los casos. En un inicio se consideró la posibilidad de que esto pudiera deberse a la hemodiluciòn secundaria a los sueros suministrados; sin embargo, hubo pacientes que ingresaron directamente a terapia intensiva, sin haber estado hospitalizados previamente y al realizarles sus estudios se encontró un descenso en estos parámetros.

Hemocultivo, Urocultivo, cultivo de Secreción Bronquial.Los resultados obtenidos en estos estudios fueron NEGATIVOS, no hubo desarrollo bacteriano. Sin embargo, no se descarta la posible presencia de bacterias, cuyo crecimiento se inhibió en los medios de cultivo debido al antibiótico terapia de los pacientes.

DISCUSIÓNI.- A varios pacientes que acudieron al Hospital con datos clínicos sugestivos de influenza y dificultad respiratoria se les hizo la prueba rápida de influenza resultando negativa, además se le determinaron los

parámetros arriba mencionados habiendo resultado normales por lo que nos sugerían no se iban a agravar en su padecimiento y mucho menos a morir, se les internó, pero salieron de alta sin mayor complicación.

Los pacientes considerados nos sugieren cierto compromiso inmunológico (aunque nunca se atendió ningún paciente VIH+), además de los hallazgos que así nos lo indican, cabe mencionar que las mujeres se encontraban menstruando (patrón hormonal alterado=inmunodepresión) y algunas de ellas embarazadas (muriendo también el producto), por otro lado, los familiares cercanos a ellos (por ejemplo el novio de una de ellas), así como sus compañeros de escuela o de trabajo o quienes convivieron con ellos NO SUFRIERON NINGUNA ENFERMEDAD. Luego entonces, urge definir qué condiciones debe reunir el huésped para el desarrollo de la enfermedad y partir de esto para la implementación de una autentica medicina preventiva que logre prevenir y/o erradicar este padecimiento y no necesariamente con una vacuna, que además puede traer problemas asociados como el Síndrome de Guillain-Barré que últimamente han aparecido varios casos en este hospital y como aparecieron en 1976 en Nueva Jersey, E. U., después de una vacunación masiva por la aparición del virus de influenza (5,6)

II.- Al considerar la posible etiología bacteriana de este padecimiento, nos llevó a sospechar la posibilidad de una Tularemia neumónica, que presenta el mismo cuadro clínico presentado por los pacientes.

La Tularemia la produce el microorganismo Francisella Tularensis, suele llamarse fiebre del conejo y aunque tiene gran cantidad de huéspedes, entre los que se incluye a los seres humanos, son susceptibles a ella, más de 50 especies de mamíferos, aves y reptiles ¿Porqué sólo afecta al conejo?. Pues bien, es de sobra conocida la facilidad de reproducción de estos animalitos, tienen un período de gestación muy corto, por lo que en la vida media de esta especie, constantemente se encuentra en celo, y se ha estudiado en animales, por otros padecimientos, que durante el celo, el nivel de estrógenos los inmunodeprime facilitando el desarrollo de enfermedades infecciosas que, en especies como el perro, la aparición de ciertas infecciones se ha curado con la inhabilitación de su fertilidad. Recordemos, las pacientes femeninas consideradas en el presente trabajo, con cuadro de neumonía atípica, se encontraban menstruando o embarazadas en el momento de su agravamiento e ingreso al hospital. Se realizaron estudios de las muestras de secreción bronquial de algunos pacientes para tratar de aislar la Francisella Tularensis, misma que crece en un medio de

cultivo especifico para Microorganismos anaerobios, pero incubado en condiciones aerobias, habiendo obtenido resultados negativos, por lo que tal vez pudiera descartarse esta posibilidad.

CONCLUSIONESI.- Si bien, en un proceso neumónico, como el presentado por los pacientes atendidos en el hospital, es invaluable el aporte de los antibióticos en estos padecimientos, sin embargo, los monocitos de estos pacientes, por la monocitosis observada en el 53% de ellos, han participado activamente con su función de fagocitar al microorganismo causal de la infección, recordemos las vacuolas observadas en ellos y su transición a macrófago descritos en este trabajo, y aquí surge una interrogante ¿Qué tanto beneficio aportará la administración de inmunoglobulina IgM en ellos?, pues recordemos que son más efectivas que las IgG para promover la fagocitosis (7,8), ¿Potenciará la función de los monocitos que pudiera verse reflejada en una mejoría y/o alivio de estas neumonías?, por lo que habrá que considerar la posibilidad del empleo de inmunoglobulina IgM en su tratamiento.

II.- Por los hallazgos descritos y la sintomatología observada también nos sugieren la posibilidad de considerar que estos pacientes hayan padecido SÍNDROME RESPIRATORIO AGUDO SEVERO CAUSADO POR EL CORONA VIRUS (“SARS CoV”), síndrome que no se confirmó o descartó.

III.- De ser estos padecimientos atribuibles al virus de influenza humana A H1N1, hasta donde se ha informado, no se confirmó, entonces tal vez estaríamos en posibilidad de establecer, en base a las alteraciones bioquímicas y hematológicas encontradas en estos pacientes, una forma indirecta de diagnóstico y de igual forma, establecer un criterio para el pronóstico de la enfermedad que se trate, pues recordemos que existen los criterios de Ranson para el pronóstico de la Pancreatitis, el criterio A.P.A.C.H.E., para el diagnóstico y pronóstico de la Apendicitis, entonces podríamos plantear EL CRITERIO HGC-RODCEL PARA EL PRONOSTICO DE ESTA NUEVA NEUMONIA ATIPICA.

BIBLIOGRAFIA1.- Organización Mundial de la Salud. Declaración de la Directora General de la OMS a la prensa [publicado 11 jun 2009].

2.- Novel Swine-Origin Influenza A (H1N1) Virus Investigation Team. Emergence of a novel Swine-Origin Influenza A (H1N1) virus in humans. N Engl J Med 2009;360: 2605-15.3.- Kilbourne E. Influenza Pandemics of the 20th Century. Emerg Infect Dis. 2006; 12 (1): 9-14.

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5. Marks JS, Halpin TJ. Guillain-Barré syndrome in recipients of A/New Jersey influenzavaccine. JAMA 1980; 243:2490-4.

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Trofile™ ytropismo

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1. Introducción a Trofile™ y Tropismo1.1 La entrada del VIH es mediada por receptores de quimiocinas.Para el VIH, el primer paso en su ciclo de replicación es escoger e infectar una célula huésped, el linfocito CD4+. Para esto utiliza una red compleja de interacciones entre sus proteínas virales desplegadas en su envoltura viral y los receptores sobre la superficie de las células CD4+. La envoltura viral está compuesta de dos glicoproteínas, llamadas gp41 y gp120.

Se ha propuesto que la entrada viral ocurre de la siguiente forma: La gp120 tiene una afinidad por el receptor CD4, el cual es expresado sobre la superficie de un subtipo de células T (linfocitos T cooperadores). La unión de gp120 con el receptor CD4 causa distintos

cambios en la forma de la proteína gp120. Este cambio conformacional en la estructura proteica, revela un sitio de unión, previamente oculto, para un co-receptor de quimiocinas (ya sea el CCR5 o el CXCR4) presente en la superficie de la célula blanco. Una vez que ocurre la unión de gp120 a el co-receptor, hay un nuevo cambio conformacional, pero ahora en la proteína gp41, lo que permite que a partir de esta proteína, se inserte un péptido (llamado de fusión) a la membrana de la célula huésped. La introducción del péptido de fusión permite un acercamiento entre el virus y la superficie de célula CD4+, lo suficiente para permitir que la envoltura viral y la membrana celular se fusionen. Una vez que esto pasa, el núcleo viral puede entrar a la célula CD4+ y la infección inicia (Figura 1).

Figura 1. El anclaje, unión al co-receptor y fusión del VIH-1 representan puntos importantes y validados para lograr la inhibición de la infección viral. Esquema adaptado de Moore JP, Doms RW. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 2003; 100:10598-10602.

1.2 La función natural de los receptores de quimiocinas.Las quimiocinas son un conjunto de polipéptidos que tienen una función importante en la respuesta inflamatoria, donde intervienen en la migración y activación de las células fagocíticas y linfocitos.1 Tanto el CCR5 como el CXCR4, son receptores de quimiocinas y regulan la respuesta inmune celular a través de un sistema de segundo mensajero. La función específica del co-receptor para la quimiocina CCR5 no es del todo clara, debido en parte a que en individuos que no expresan estos co-receptores al parecer tienen tanto una función inmune como una expectativa de

vida normales. Sin embargo, contrariamente, ratones modificados genéticamente para que no expresen el gen de CXCR4, mueren en el útero.3

1.3 TropismoEl tropismo del co-receptor es definido como la habilidad de un virus particular de VIH-1 para infectar una célula blanco usando un co-receptor específico.4

En base a esta característica, los virus de VIH-1 pueden ser clasificados en cuatro grupos:


Con Tropismo a CCR5 (Virus R5): Virus o poblaciones virales que pueden usar sólo el co-receptor para quimiocina CCR5 para infectar a las células CD4+.

Con Tropismo a CXCR4 (Virus X4): Virus o poblaciones virales que pueden usar únicamente el co-receptor para quimiocinas CXCR4 para infectar a las células CD4+.

Con Tropismo Dual (Virus Duales): Virus o poblaciones virales que pueden usar ya sea el co-receptor CCR5 o el CXCR4 para infectar a las células CD4+

Con Tropismo Mixto (Virus Mixtos): Poblaciones virales que pueden contener varias combinaciones de virus R5, X4, y/o virus de tropismo duales.

1.4 Relevancia clínica del tropismoPor razones aún no totalmente entendidas en este momento, muchos casos de infección primaria con VIH-1 ocurren con el virus R5.5,6 Esto se cumple aunque la muestra del paciente presente evidencia de que el virus emplee al co-receptor CXCR4 también (por ejemplo, cuando se presentan virus duales/mixtos y/o virus X4).5,6 Durante las primeras etapas de la infección por VIH-1 (como en el caso de las infecciones por VIH-1 clase B), predomina el virus R5, siendo el dominante en casi el 80% de los individuos al inicio de la infección. 7,8 Sin embargo, conforme avanza la infección, se incrementa gradualmente la prevalencia de virus que emplean CXCR4.9 Este cambio se caracteriza por la emergencia de un virus X4 puro; sin embargo, la proporción de la población viral X4 pura es baja, correspondiendo a sólo el 0.1% del total de la población viral en los pacientes de reciente tratamiento7,8 y de 3% a 4% en pacientes ya tratados.9,11 Aproximadamente el 50% de los enfermos con VIH-1 que desarrollan el SIDA, presentan únicamente virus R5 a lo largo del curso entero de la infección de VIH-1.

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1.4.1 Experiencia del tratamiento en pacientesIndividuos infectados con VIH-1 y tratados con terapia antirretroviral altamente activa (HAART, por sus siglas en inglés), no presentan elevados niveles de virus duales/mixtos como ocurre en pacientes de tratamiento reciente, con número de CD4+ iguales en ambos casos. Se desconoce todavía sí los altos niveles de virus que emplean CXCR4 son un producto de la misma terapia de HAART o, por otra parte, un reflejo subyacente del grado de progresión de la enfermedad (Cuadro 1).

1.4.2 Efectos sobre el tropismo viral después del un tratamiento con antagonistas del co-receptor.Los efectos posibles sobre el tropismo de VIH-1 después de un tratamiento con antagonistas del co-receptor, han sido analizados en diversos estudios. De estos se desprenden tres potenciales consecuencias: 1) supresión viral, 2) desenmascaramiento y emergencia de virus que utilizan CXCR4 y, 3) cambio de tropismo.

1. El acoplamiento de un apropiado antagonista del co-receptor, en la cepa correcta de VIH-1, resultaría en una supresión sostenida de la infección viral. Esto ha sido demostrado en los protocolos clínicos donde además de la terapia de soporte optimizada, se administró maraviroc [BID] en pacientes con virus R5 (protocolos MOTIVATE 1 y 2). Los pacientes de este estudio, presentaron cargas virales significativamente disminuidas (en promedio -1.95 y -1.97 log10 de ARN de VIH-1) y un incremento en el número de células CD4+ (+102 y +111 células/mm3) después de 24 semanas de tratamiento (MOTIVATE 1 y 2, respectivamente; ver cuadro 2).11, 12

2. Desenmascaramiento es el término usado cuando una población minoritaria de VIH-1 existe por debajo del nivel de detección para el ensayo Trofile, pero es revelada una vez que la cepa mayor de VIH-1 es suprimida con antagonistas del co-receptor. Por ejemplo, un paciente puede ser designado como portador de virus R5 pero tener una población pequeña de virus que utilizan al CXCR4 (pudiendo ser virus X4 y/o virus duales). Entonces, después de un tratamiento donde la variante de R5 sea suprimida, es posible que la población minoritaria de virus que emplean CXCR4 se expanda para convertirse en la cepa VIH-1 dominante. Aún no queda claro si la emergencia de virus que utilizan CXCR4, en el ejemplo de terapia antagonista a CCR5, se encuentra asociado

con la progresión acelerada de la enfermedad. Si eso es así, entonces monitorear el tropismo durante el tratamiento de antagonistas a CCR5 puede ser clinicamente importante.

3. Conversión es el término empleado cuando una población viral altera el tropismo. Ejemplo de ello es cuando una población viral R5 desarrolla un componente trópico hacia CXCR4. La conversión frecuentemente ocurre durante la etapa tardía de la infección por VIH, como resultado del incremento de virus con tropismo dual. Una pregunta que surge a partir de este evento, es que si una variedad de co-receptores es bloqueado por un antagonismo específico, ¿podría la población vírica cambiar su tropismo para hacer emplear el otro correceptor, que no está afectado por los inhibidores?

Resultados de los protocolos MOTIVATE 1 y 2, donde además de la terapia de soporte optimizada se administró maraviroc a un grupo de pacientes, indican que a la semana 24, aproximadamente 7% de los enfermos tratados (y que tenían el virus R5 al inicio del protocolo), presentaban virus dual/mixtos al momento de una no respuesta al del tratamiento.11, 12 Si esta falta de respuesta al tratamiento fue debida a una conversión o a una emergencia de un virus enmascarado, aún no está determinado.

2. Medición del Tropismo2.1 Trofile™: Un rápido estudio fenotípico para medir el tropismo del co-receptor de VIH-1

El estudio Trofile fue desarrollado por Monogram Biosciences y Válidado por el Clinical Laboratory Improvement Amendments (CLIA), como un método para determinar el tropismo del co-receptor de VIH-1 en los protocolos de manejo de pacientes o su uso en clínicas de los Estados Unidos.13


Trofile es un ensayo que emplea virus recombinantes de ciclo único, donde un pseudovirus es generado a partir de la información provista por los genes de toda la envoltura (env), derivados de la población viral del paciente.

El aislamiento del ARN del VIH-1 de los pacientes, es transcrito reversamente y el cADN de env es amplificado empleando oligonucleótidos específicos por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés). Los productos de la amplificación representan la diversidad de las secuencias de env virales, son entonces empleados para producir un vector de expresión de env, cuya función es generar a las proteínas Env del VIH-1, específicas para cada paciente.

También se produce un vector detective, con el genoma del VIH-1, modificado en la región de env, la cual es removida y remplazada con un cassette de luciferasa (como indicador). La función de este vector es generar partículas virales que carecen de las proteínas de la envoltura viral, resultando en partículas no infecciosas.

Para generar los pseudovirus, tanto el vector de expresión de env como el vector con el genoma de VIH-1, son cotransfectados dentro de una célula productora (en este caso se emplea a la línea celular humana de riñón embriónico, HEK293). Dentro de las células HEK293, el

vector genómico VIH-1 produce a las partículas virales y emplea a los productos del otro vector, a las proteínas Env del paciente, para terminar el ensamblaje de los pseudovirus.

Finalmente, el pseudovirus es recuperado en el sobrenadante de los cultivos celulares es usado para infectar otras dos líneas celulares, las cuales han sido manipuladas mediante ingeniería genética para expresar CD4 y uno de los dos co-receptores para quimiocinas, el CXCR4 o el CCR5. Después de un ciclo individual completo de replicación viral, células CD4/CXCR4 o CD4/CCR5, infectadas exitosamente emite luz, debido a la expresión del gen de la luciferasa dentro del pseudovirus. Los virus R5 pueden infectar la línea celular CD4/CCR5 mientras que la línea celular CD4/CXCR4 permanece sin ser infectada. Contrariamente, los virus X4 puede infectar a la línea celular CD4/CXCR4 y no a la línea celular CD4/CCR5. Los pseudogenes generados a partir de pacientes con VIH-1 mixtos o duales, infectan ambos tipos celulares. La bioluminiscencia producida en células infectadas es una medida directa de la entrada del virus, permitiendo la determinación del tropismo viral. La aplicación de antagonismo del co-receptor, durante la etapa de infección del pseudovirus, confirma la designación del tropismo.

Figura 2. Diagrama esquemático del ensayo de Trofile™. Partículas virales defectivas en su replicación son producidas al co-transfectar a las células HEK-293 con el vector de expresión para env -derivado de la muestra del paciente- y otro vector con la información del genoma del VIH-1, en donde la región env se eliminó y remplazo con un cassette de luciferasa. Las partículas virales ensambladas son cosechadas y empleadas para infectar a células blanco que expresan CD4 y el co-receptor CCR5 o CCXR4. Si el virus del paciente presenta tropismo a R5, será capaz de infectar a las células blanco que expresan el co-receptor CCR5 y no a las que expresan el CXCR4. Contrariamente, un virus con tropismo a X4, infectará a las células que presentan el co-receptor CXCR4 pero no a las que tienen el CCR5. La designación del tropismo puede ser confirmada por la adición de antagonistas al co-receptor durante el ensayo de infección.

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2.2 Ventajas del uso de Trofile- Trofile utiliza la región de la envoltura completa, capturando todos los determinantes que se sabe intervienen en el tropismo del co-receptor.

- Trofile es el estudio más sensible para determinar el tropismo, disponible para el area clínica, que detecta subpoblaciones minoritarias con tropismo alternado en un rango de 5%.13 Así, Trofile es el ensayo más certero de tropismo disponible ya en el mercado. En un panel de 38 cepas de VIH de múltiples subtipos (R5, X4, o duales/mixtos), Trofile fue capaz de identificar correctamente el tropismo en todas las muestras.14 Cerca de 23,000 muestras han sido analizadas usando este ensayo y Trofile es reconocido como el estándar de oro entre las pruebas de tropismo comerciales. Todos los protocolos clínicos de pruebas de antagonistas al co-receptor han usado Trofile.

2.3 Análisis genotípico de la región V3 para determinar el tropismo del co-receptor de VIH-1Los determinantes genotípicos del tropismo para el co-receptor de VIH-1 permanecen por ser definidos. La evidencia indica que la mayoría de estos determinantes están localizados en la región V3 de la proteína de superficie gp120, y que existen múltiples determinantes genéticos más que simple cambio genotípico. Basados en estos resultados, diferentes algoritmos han sido establecidos para tratar y predecir el tropismo de VIH-1, basado en el genotipo.

2.4 Limitaciones del análisis genotípico del tropismoExisten diferentes obstáculos a vencer para el empleo de un análisis genotípico en la determinación del tropismo del VIH-1.

1. La región de la envoltura presenta un alto grado de diversidad de secuencia y tamaño variable, haciendo de su secuenciación un reto técnico. Además, la presencia conjunta de inserciones y deleciones, “indels”, puede conducir a una secuenciación inadecuada o no muy certera.

2. El análisis genotípico tiene limitaciones para poder identificar a las poblaciones minoritarias de VIH-1. Mientras que la prueba de resistencia genotípica estándar puede identificar variantes menores de la población por debajo de 15% a 25%, la secuenciación de V3 presenta un umbral superior, debido a la presencia de los indels. Así, la diversidad de secuencia no hereditaria puede reducir considerablemente la capacidad de la secuenciación de V3 para identificar a las poblaciones minoritarias.15

3. Los algoritmos comúnmente usados para predecir el tropismo a un co-receptor en VIH-1 clase B no son precisos.15 Algoritmos de subtipos específicos para VIH-1 clase no B, serán necesarios pero aún no han sido bien establecidos.

4. Finalmente, no todos los determinantes del tropismo se encuentran en la región V3 de la proteína gp120. Por ejemplo, un reporte reciente muestra que una mutación individual en la proteína gp41 fue capaz de conferir a un virus R5 la capacidad para usar el co-receptor CXCR4 (por lo tanto, virus con tropismo dual) (Figura 2).16 Así, dos virus con secuencias V3 idénticos pueden tener diferentes tropismos.

Figura 3. Mapas de la región entera de env de dos VIH-1 con diferente tropismo, uno a CCR5 y otro dual. Ambos virus presentan una secuencia de V3 idéntica con respecto a la proteína gp120. Sin embargo, una mutación puntual en la región que codifica para la proteína gp41 (G515V) fue capaz de conferir un tropismo dual. Debido a que esta región se encuentra fuera de la secuencia de V3, la genotipificación de esta última únicamente, provocaría una designación incorrecta de tropismo, en este caso hacia CCR5.


3. ¿Por qué realizar la prueba antes del tratamiento con antagonistas de CCR5?

La medicina individualizada se basa en el concepto de crear estrategias médicas que serán más benéficas para cada paciente. En cáncer de mama, antes de que el Herceptin® se prescriba, el médico ordena una prueba para determinar si el tumor del paciente expresa altos niveles de HER2, proteína blanco del tratamiento con Herceptin. Si el tumor no expresa HER2, el paciente recibirá poco beneficio de la administración de Herceptin.17

3.1 Conoce el tropismo del VIH-1 de tu pacienteDe forma semejante que en el ejemplo del Heceptin, pasa con los antagonistas de CCR5. Estas drogas antagonizan con el VIH-1 que utiliza el co-receptor de CCR5 para entrar a las células hospederas. Las pruebas clínicas para el tropismo de VIH-1 en un paciente serán capaces para determinar si el virus del paciente es blanco probables para la droga. Los pacientes con otras clasificaciones de tropismo (VIH-1 no R5) obtendrán proco beneficio clínico de un tratamiento con antagonistas a CCR5, porque el virus puede continuar

entrando a la célula huésped usando los co-receptores CXCR4, los cuales no se encuentran bloqueados por los antagonistas a CCR5.18

La importancia de la prueba del tropismo antes de la iniciación del tratamiento con antagonistas a CCR5 se ha demostrado en diversos protocolos clínicos. En los protocolos MOTIVATE 1 y 2, el antagonista a CCR5, maraviroc, fue probado en individuos que tenían virus R511,12, y en el protocolo A4001029, se probó el mismo antagonistas pero en individuos con virus duales/mixtos.18 En pacientes con población R5, después de 24 semanas de tratamiento con el antagonista CCR5 además de la terapia estándar optimizada, se observaron reducciones de -1.95 y -1.97 log10/mL de copias de ARN de VIH-1 (protocolos MOTIVATE 1 y 2, respectivamente). Los pacientes en el grupo placebo (con sólo la terapia estándar optimizada) muestran reducciones de -1.03 y -0.93 log10 de ARN de VIH-1 (Cuadro 2). Después de 24 semanas de tratamiento, hubo incremento de 111 y 102 células/mm3 en el grupo con el tratamiento antagonista de CCR5 además de la terapia estándar, mientras que el grupo control, presentó incrementos de 52 y 64 células CD4+/mm3 en el mismo lapso de tiempo.

TEO: Terapia estándar optimizada. [BID]: Toma de maraviroc dos veces al día. D/M: Virus duales/mixtos R5: Virus R5MOTIVATE 1 Y 2: 11,12 Terapia de maraviroc más la terapia estándar optimizada en viremia, experiencia en pacientes infectados con el VIH con tropismo a CCR5 (América del Norte [1] y global [2].A400102918: Maraviroc además de la terapia estándar optimizada en viremia, experiencia de pacientes infectados con VIH-1 duales/mixtos.

El otro protocolo paralelo, el A4001029, donde también se empleó maraviroc en individuos con virus tópicos dual/mixtos aporta muy diferentes resultados.18 Después de 24 semanas de tratamiento se observó una reducción en promedio de -1.20 log10 de ARN de VIH-1 con la terapia de maravoric además de la terapia estándar, comparado con un promedio en la disminución de -0.97 log10 de ARN de VIH-1 en el grupo placebo (con sólo la terapia estándar). Hubo un incremento de 62 células CD4+/mm3 en grupo tratado con el Marvoric contra el de 36 células CD4+/mm3 en grupo control, después de 24 semanas. Los resultados demuestran que los pacientes con poblaciones virales duales/mixtos no se benefician con un tratamiento con el antagonista de CCR5 como aquellos individuos quienes tienen una población de virus R5.

Glosario de términosCCR5: Receptor a quimiocinas 5, es expresado sobre la superficie de diversos tipos de células inmunes. La CC en su abreviatura, indica la presencia de residuos de cisteína.

Tropismo a CCR5: Término empleado para indicar que un virus emplea, exclusivamente, el co-receptor CCR5 para entrar a las células huésped.

Virus que emplean a CCR5: Indica el empleo de virus que usan el co-receptor CCR5 para entrar a su célula

huésped, aunque no de forma exclusiva. Este grupo incluye, entonces, a los virus R5 y con tropismo dual.

CXCR4: Receptor para quimiocinas 4; es expresado sobre la superficie de diversas células inmunes. La X se refiere a un aminoácido cualquiera presente entre dos residuos de cisteína.

Tropismo a CXCR4: Término empleado para indicar que un virus que usa el co-receptor de CXCR4 exclusivamente para lograr su entrada en las células hospederas.

Virus que emplean a CXCR4: Indica la utilización, por parte de un virus, del co-receptor CXCR4 para entrar a su célula huésped, aunque no de forma exclusiva. Este grupo incluye, además de los virus X4, a los que presentan tropismo dual.

Tropismo Dual: Virus que pueden entrar a las células huésped usando ya sea el co-receptor CCR5 o el CXCR4.

Tropismo Mixto: Poblaciones trópicas mixtas de virus que pueden contener tropismo hacia CCR5, hacia CXCR4 y/o virus con tropismo dual.

Tropismo: Capacidad de un virus particular de VIH-1 para infectar una célula blanco usando un co-receptor específico (CCR5 o CXCR4).

29 www.pacal.org

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