CASOS C1INICOS

Anticuerpos Dna como Ayudo en elDiagnóstico de Lupus EritematosoDiseminado y otros EnfermedadesInflamatorios o NeoplósicasDr. Alvaro Gutiérrez D. *Dra. Ana Abigail Porras M. **Dr. Ricardo Castro D. ***

La determinación de anticuerpos DNA dedoble hélice, ha sido utilizada en eldiagnóstico de Lupus Eritematoso Dise­minado, sin embargo, los anticuerpos de hé­lice simple, más fáciles de determinar en ellaboratorio, no han sido evaluados ampli;J­mente para el diagnóstico de Lupus Eritema­toso y Artritis Reumatoidea. En el presenteestudio, fue utilizada la técnica de cuantifi·cación de los anticuerpos DNA de hélicesimple, por absorción y contraelectroforesis.

Pacientes con LED mostraron títuloselevados de anticuerpos DNA en formaconstante mientras que la AR, fueronvariables.

Se concluye que esta prueba, asociada aotros parámetros, es de gran ayuda diagnós­tica.

J\.fATERIALES y METODOS

Nos basamos que éste trabajo en el es·tudio de 500 pacientes internados en elHospital San Juan de Dios con diversas pa·tologías. Ciento tres pacientes en estudiofueron diagnosticados con los criterios clí·nicos y de laboratorio usuales, como LED oArtritis Reumatoidea (AR). Los criterios

*Universidad de Costa Rica, Facultad de Micro­biología, Depto. de Análisis Clínicos.

**Hospital San Juan de Dios, Laboratorio Clínico,Sección de Hematología.

***Hospital San Juan de Dios, Sección Ortopedia.

Clínicos en que nos basamos para la clasifi·cación como AR o LED fueron los si­guientes:

AR: poliatralgias con flogosis articular, pre·senci;J de rigidez o deformid;Jdes articulares,nódulos subcutáneos.

LED: erupción cutánea eritematosa en cara,cuello o extremidades. Artritis o polioartri·Lis. pleuresía. Síndrome de Raynaud onefritis. Para LEO. la presencia de célulasLE en el transcurso de la enfermedad fue unfactor indispensable en el diagnóstico.

Pacientes en que el diagnóstico de certezano pudo establecerse, no fueron consi­derados en el análisis de los datos, en los quese incluyó únicamente, lupus eritematoso di·seminado o AR bien definidos. Otro grupode pacientes con diversas patologías en lasque se incluyen trastornos renales, cardíacos,problemas hematológicos, colelitiasis,colecistitis y algunas virosis fueron estu­diados pero no incluidos en este reporte. Seincluye en el estudio, 100 sueros de personasaparentemente normales.

E st os sueros fueron analizados hastadonde fue posible el mismo día de la ex­tracción o fueron guardados en congelación,por un período no mayor de 48 horas antesde ser procesados.

Después de analizados fueron guardadosen congelación a -20"C: un porcentaje de

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ellos, (20%) fueron estudiados nuevamentepor anticuerpos después de 4-6 meses paraobservar si la congelación afectaba de algunamanera los títulos obtenidos. Los anti­cuerpos que son de hélice simple, se mi­dieron siguiendo la modificación de Arquem­bourg que brevemente se describe de la si­guiente manera:

1° Fase de absorción del anticuerpo

Se utiliza placas de microtitulación en U(Cooke Engineerie Ca). En cada huequecillose coloca 0.025 mI. de búffer Tris pH .8. Enel huequecillo 1°, se coloca 0.025 mI. deDNA* con una concentración de 5.12 mg/mlpreparado en búffer Tris, desnaturalizadopor calentamiento en baño de agua a ebu-.llición por 10 minutos. Se hace dilucionesdobles seriadas hasta el huequecillo núme­ro 6 para obtener concentraciones de DNAde 2.56 mg/dl a 0.8 mg/dl. Posteriormente seagrega 0.025 mI de suero a cada uno de loshuequecillos, se mezcla y se incuba a 37"Cpara su absorción, durante una hora. *(CalfThymus, tipo V. Sigma Chemical Ca.)

2° Fase de contraelectroforésis (CEP)

Se preparan placas de vidrio de 31/4x x 4pulgadas (Kodak proyector slide) recubiertascon Ionagar al 0.80'0 (Ionagar NO'2 Oxoid) enbúffer Tris 6.8.

Se perforan hileras pares de huequecillosse'parados 5mm entre sí, con 2mm de diá­metro. Se practica una CEP a 50 voltios, por30 minutos en el suero absorvido, contra unasolución de DNA 0.2 mg/ml desnaturalizadopor calor.

Posteriormente se tiñen, con una soluciónde Pyronina Y al 0.05 %; para identificar laslíneas de precipitación. Consideramos queno era necesario hacer titulaciones inter­medias entre las escogidas por lo que mantu­vimos los títulos de 80, 160, 320, 640,1280, 2560 como las diluciones de trabajoen todo estudio. En todos los sueros estu­diados, se practicó la determinación de cé­lulas LE, RA y anticuerpos antinucleares enlátex y titulación de complemento.

RESULTADOS y DISCUSION

De los 600 sueros analizados, 22 corres-

pondían a pacientes con LED, 81 con AR,100 a personas aparentemente sanas y elresto a diversas patologías.

Los cuadros 1 y II corresponden a la dis­tribución de frecuencias de los títulos deanticuerpos DNA en LED y AR respec­

'tivamente.Para LED, observamos que los títulos

oscilaron entre 640 y 2560 con una mayorincidencia en los títulos de 2560; en ningunode los casos analizados, se obtuvo nivelesmenores a 640. Todos los casos de LED,excepto uno, pertenecían al sexo femenino.

Com¡nrativamente encontramos en AR,una diversidad en los niveles de anticuerposque oscilaron desde los más altos en 2560hasta negativas; predominaron en esta enfer·medad, los títulos de 640 que representaronun 31 % de la muestra. Estos hallazgos vienena corroborar lo descrito en la literatura sobreel aparecimiento de anticuerpos DNA enotras enfermedades del tejido conectivocomo son la AR y la AR juvenil (16, 19).Una distribución de los resultados anteriorespor sexo, no mostró una diferencia signifi­cativa.

Las tablas III y IV nos muestran unadistribución de los títulos de anticuerposencontrados en estas dos enfermedades ci­tadas por edades. Del análisis del cuadro sedesprende que la edad no tiene relacióndirecta con niveles de anticuerpos.

Durante la Fase aguda y mientras elpaciente no recibió tratamiento se obser­varon títulos de anti DNA altos, con nivelesbajos de complemento que oscilaron entre Oy 80 unidades de complemento 50% (CH50).Esto concuerda con los resultados de variosinvestigadores (20, 21, 22) con anti DNA dedoble hélice.

Por espacio de un alío tuvimos opor­tunidad de obtener muestras seriadas de 5pacientes con LED, que se presentaron a laConsulta Externa del Hospital San Juan deDios para recibir atención en forma perió­dica; logramos observar que durante eltiempo en que se mantuvo el tratamiento,los títulos de anti DNA bajaron y los nivelesde complemento aumentaban hasta recu­perar sus valores normales.

La titulación de complemento en AR nomostró cambios significativos en las muestrasde los pacientes examinados oscilando los

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valores entre 80-45 u CH50 como se anotaen la tabla V. Tanto a los pacientes con LEDcomo a los de AR, se les practicó deter­minaciones de anticuerpos antinucleares yprueba para AR en látex.

Los pacientes con LED fueron positivosen un 47% para la prueba de AA (látex) y un6% para AR (Látex). Por otra parte lospacientes con Artritis Reumatoidea fueronpositivos en un 60% para la prueba de AR(látex) y todos negativos para AA (látex).

Como puede observarse en la tabla VI, enlos pacientes con AR no encontramos unarelación directa entre los títulos de anti DNAy los títulos de RA (Látex). Los títulos deanti DNA obtenidos para otras patologías sonmuy variados, encontrándose muy elevadas,al igual que en LED, únicamente en pacientescon hepatitis viral y algunos linfomas (Gutié­rrez y col. en preparación).

La tabla # 7 muestra una distribución enpo b la ción aparentemente normal obser­vándose que el 96% de los pacientes mues­tran títulos menores de ] 280 sin encontrarsediferencias significativas por edad.

Con el fin de demostrar la estabilidad delanticuerpo DNA, en los sueros analizados, sepracticaron determinaciones a 100 muestrasde diferentes títulos luego de permanecer encongelación por espacio de 4-6 meses; no seobservaron cambios significativos en los títu­los originalmente obtenidos.

CONCLUSIONES

No existen pruebas de laboratorio de

verdadero valor diagnóstico de artritis reu­matoidea.

Las pruebas de Látex para AA y AR, noson parámetros confiables en el diagnósticode estas dos entidades clínicas dado elimportante número de falsos negativos quese observan en las pruebas.

La determinación de anticuerpos DNA esmás específico para el diagnóstico de LEDya que todos los pacientes mostraron tenertítulos altos, mientras que aquellos con ARpresentaron títulos variables. Es importanterealizar determinaciones del complementosérico con las de anticuerpos DNA ya que laasociación de títulos altos de anti-DNA conniveles bajos de complemento sérico es lacaracterística más comúnmente encontradoen pacientes con LED.

La disminución importante de los títulosde anti-DNA en pacientes con LED some­tidos a tratamiento médico, nos permiterecomendar esta técnica como valioso indi­cador de la respuesta del paciente al trata­miento médico.

AGRADECIMIENTO

Este proyecto fue financiado parcial­mente con fondos de la Vicerrectoría dcInvestigación de la Universidad de CostaRica bajo el proyecto 002-007 -038.

Los autores agradecen a los DoctoresJorge Collado y Rafael (armona por su asis­tencia técnica y al Dr, Víctor MI. Villa rejosen la revisión del manuscrito y sus valiosasobservaciones sobre el proyecto original.

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Tabla # 3

mSTRIBUCION POR EDADES DE TITULOS DE ANTI-DNA

EN LUPUS ERITEMATOSO OJSEMINADO

TITULOS DE ANTI DNA

Grupo deedades O 80 160 320 640 1280 2560 r

10-19 O O O O 1 O O 1/120--29 O O O O 1 2 2 5/5

30-39 O O O O O 1 3 4/4

40-49 O O O· O O 1 2 3/3

50--59 O O O O O O O O

60- + () O O O 1 1 O 2/2

dese. O O O O O 2 5 7/7

TOTAL O O O O 3 7 12 22/22

Tabla # 4

DISTRIBUCION POR EDADES DE TITULOS OE

ANTI-DNA EN ARTRITIS REUMATOIDEA

TlTULOS DE ANTI DNA

Grupo deedades O 80 160 320 640 1280 2560 r

10-19 2 O 1 O 4 1 O 6/8

20-29 3 O 1 2 2 1 1 7/10

30-39 2 O O O 3 O O 3/5

40-49 1 O 1 2 5 1 1 10/11

50-59 1 O 2 O 1 3 O 6/760- + 2 O 1 1 2 1 1 6/8

dese- 2 O 5 3 5 8 6 27/29

TOTAL 13 O 11 9 25 15 9 65/80

202 Act. Méd. Cost. . Vol. 22 - No. 2, 1979 - 111-236

Tabla # S

NIVELES DE COMPLEMENTO (CHSO) y ANTI DNA

EN PACIENTES CON ARTR ITlS REUMATOIDEA

PACIENTE

O.N.C.W.F.AA.F.B.H.P.B.R.R.V.J.N.B.M.J.M.J.D.M.E.J.N.M.S.M.D.M.P.M.B.M.J.M.A.M.G.G.M.C.H.C.M.H.C.M.Ch.

NIVELES DE C'

8097

100120122125130130150150170170180230235295315

NIVELES DE ANTI DNA

Neg.640640

12801280640640640

12801280640640160Neg.

1280640320

Tabla # 6

RELACION ENTRE TITULOS DE ANTI DNA

Y RA TEST EN ARTRITIS REUMATOIDEA

TITULOS DE ANTI DNA

TITULaSDE RA o 80 160 320 640 1280 2560 r

320 o O o o 1 2 o 3/3160 1 o o o O 2 o 2/380 O O 1 o O 3 o 4/440 o o 1 O o o o 1/120 3 o 3 1 4 2 o 10/1310 O O O O 1 O O 1/1

Neg. 4 O O 5 10 3 1 19/23

TOTALES 8 O 5 6 16 12 40/48

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Tabla # 7

DETERMINACION DE ANTICUERPOS DNA EN POBLACION NORMAL

TITULOS DE ANTI DJ."IJA

Grupo de N° examinadoedad -5 20 40 80 160 320

lO-14 7 4 1 l O O l

15-19 23 l8 1 O 3 l O

20-29 24 20 O 2 2 O O

30-39 20 15 O l 2 2 O

40- + 26 20 O 4 2 O O

TOTAL lOO 77 2 8 9 3

204 Act. Méd. Costo - Vol. 22 - No. 2, 1979 - 111-236

o ó

E9 '?12

11

10

9

8

en 7¡,¡f-<Z¡,¡

O 6..:o.'1l:

5

4

CUADRO I

DlSTRIBUCION DE FRECUENCIAS POR TITULOS DE

ANTI-DNA EN LUPUS ERITEMATOSO DISEMINADO

O 80 160 320

TITULOS DE ANTI-DNA

640 1280 2560

Act. Méd. Costo - Vol. 22 - No. 2, 1979 - 199-207 205

28

26

24

22

20

18

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'"~¡¡J

"" 14~

12

10

8

6

4

2

CUADRO JI

DISTRIBUCION DE FRECUENCIAS POR TITULOS DE

ANTI DNA EN ARTRITIS REUMATOIDEA

Dó~o

O 80 160 320 1280 1280 2560

TITULOS DE ANTl DNA

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