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Análisis de PesticidasDe la A a la S

Centro de Investigaciones del Medio Ambiente-CIMAUniversidad Nacional de La Plata.Departamento de Química. Facultad de Ciencias Exactas.

De la A a la S…

Dr . Damián Marino

Su Identidad…

• Clasificación según familias químicas 

‐Esqueleto base

‐Grupos funcionales

‐Propiedades fisicoquímicas

‐Modo de acción.   

• Organoclorados

DDTDDT

• Organofosforados

Clorpirifos

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• Carbamatos

Carbaryl

• Piretroides

Cipermetrina

• Derivados del Ácido Fenoxiacético

2,4-D

• Derivados de Triazinas

Estrategias de análisis

• Analitos en muy bajas concentraciones.

• Diferentes tipos de matrices ambientales.

• Interacciones químicas.q

• Estabilidad química de los compuestos.

• Disponibilidad Instrumental.

• Normativa aplicada: EPA-ASTM-IRAM

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Secuencia de trabajo

PESTICIDA Extracción

InterpretaciónClean‐up

ConcentraciónCuantificación

Interpretación de resultados

Propiedades fisicoquímicas

• LÍQUIDA– DIRECTA , EXTRACCIÓN, DIGESTIÓN

• SÓLIDA O SEMISÓLIDAEXTRACCIÓN DIGESTIÓN

Extracción

– EXTRACCIÓN, DIGESTIÓN

• GASEOSA– DIRECTA, EXTRACCIÓN

• BIOTA– EXTRACCIÓN, DIGESTIÓN

EXTRACCIÓN LÍQUIDO-LÍQUIDO

GENERALIDADES

• Es un proceso por el cual se transfiere uno o más solutos de una fase a otra, generalmente entre dos líquidos.

• Se emplea una fase acuosa y una fase orgánica• Se emplea una fase acuosa y una fase orgánica no miscible.

• La fase orgánica puede ser más densa o menos densa que la fase acuosa. 

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EXTRACTANTES (1)

• Propiedades deseadas:

– No tóxico

– Ópticamente transparente

– Más denso que el agua

– Baja tendencia a formar emulsiones

EXTRACTANTES (2)

• Solventes empleaddos:

– Diclorometano CH2Cl2– Cloroformo CHCl3– Tetracloruro de carbono CCl4– Benceno C6H6

– Eter isopropilico CH3CHOHCH3

– Eter dietilico CH3CH2OCH2CH3

Embudo de decantación

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EXTRACCIÓN SÓLIDO-LÍQUIDO

-Una masa de sólido (suelo, sedimentos, biota) se pone en contacto con el solvente.

-Se extrae vía sonicación o Soxhlet.

-Se filtra para separar las fases.?!?!

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• Generalmente involucra una técnica cromatográfica

Clean‐up Aislamiento específico

• En escala preparativa.

• Se trabaja con propiedades específicas de cada compuesto: afinidad química.

CROMATOGRAFIA????

Cromatografía• La cromatografía engloba a un conjunto de técnicas basadas

en la separación de los componentes de una mezcla y suposterior detección.

• Las técnicas cromatográficas son muy variadas, pero en todasellas hay una fase móvil que consiste en un fluido (gas, líquidoo fluido supercrítico) que arrastra la muestra a través de unafase estacionaria que se trata de un sólido o un líquido fijado

óliden un sólido.

• Los componentes de la mezcla interaccionan en distintaforma con la fase estacionaria y con la fase móvil. Deeste modo, los componentes atraviesan la faseestacionaria a distintas velocidades y se van separando..

Fundamento de la cromatografíaMuestra:

tres componentesmezclados

Faseestacionaria

Se dispone una mezclasobre una fase estacionaria

Fase móvil

Se hace fluir una fasemóvil sobre la estacionaria

Dependiendo de la afinidadrelativa por ambas fases, loscomponentes de la mezcla

primitiva se separan

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1. Intercambio iónico-Separa según carga eléctrica- Fase estacionaria: grupos cargados unidos a un soporte

insoluble- Fase móvil: gradiente de sal o de pH

Tipos de cromatografía

2. Partición-Separa según solubilidad en solventes- Fase estacionaria: Un solvente sobre un soporte sólido- Fase móvil: El otro solvente fluyendo

3. Afinidad- Separa según la afinidad del analito por un ligando

inmovilizado- Fase estacionaria: ligando unido a soporte insoluble- Fase móvil: (1) solución sin ligando (2) solución con

ligando libre

4. Hidrofóbica- Separa según hidrofobicidad- Separa según hidrofobicidad- Fase estacionaria: grupos hidrofóbicos unidos a un

soporte insoluble- Fase móvil: gradiente inverso de sal

5. Exclusión molecular- Separa según tamaño molecular- Fase estacionaria: dextrano o agarosa entrecruzados- Fase móvil: solución tamponada

+

+

+

+

+

+

‐‐‐

‐

‐‐‐

‐

+

+

+

+

+

+

‐‐

‐

‐

‐

‐‐

‐

+

+

+

+

+

+

‐

‐‐

‐

‐

‐‐

‐‐

‐

Intercambio iónico

+

+

+

‐‐‐

+

+

+‐‐

‐‐‐

‐ ‐

‐ ‐+

+

+‐‐

‐‐ ‐

‐ ‐

Proteínas adsorbidasal intercambiador

iónico

A baja concentraciónde sal, se desprenden las proteínas menoselectronegativas

A mayor concentraciónde sal se desprendenlas proteínas máselectronegativas

Partición

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La máxima altura (h) alcanzada por el disolvente en su avance,se denomina frente del disolvente, y dA es la distancia recorridapor la sustancia A. Rf es el cociente entre la distancia recorridapor una sustancia desde el origen (d) y la distancia del origenal frente del disolvente (h). Para la sustancia A:

h

dRf A

A

Cromatografía de afinidad

1 2 3

Cromatografía de exclusión molecular

• Se tiene el analito separado del resto de loscomponentes de la matriz.

• La sensibilidad de los instrumentos no essuficiente para detectarlos en lasconcentraciones logradas (varios ml) respecto alos tamaños de las muestras manejables en ellos tamaños de las muestras manejables en ellaboratorio.

• Se necesita de operaciones de concentración.

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Concentración

Calor y vacío

En Frío-Burbujeo de Nitrógeno

d t‐uso de compuestos auxiliares 

Técnicas Integradas : EFS (SPE)

• Se realiza la extracción, limpieza y concentración en un mismo paso.

• El gasto de reactivos es menor.g

• El costo de insumos específicos es superior

GENERALIDADES

• La fase sólida contiene grupos activos ligados covalentemente.

• Componentes de la muestra se unen porComponentes de la muestra se unen por interacciones débiles.

• Altamente selectiva.

• Permite concentrar componentes minoritarios.

DISPOSITIVO EXPERIMENTAL

Cartucho con sustancia adsorbente:

AdsorbenteAdsorbente

Lana de vidrio

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BIOENSAYO, GRAVIMETRÍA

COLORIMETRÍA, ESPECTROFOTOMETRÍA

TENDENCIA EN COSTE

EC

TIV

IDA

D

N, p

pm

(A

pro

x.)

ESTRATEGIAS ANALÍTICAS EN LA HISTORIA

CROMATOGRAFÍA EN PAPEL Y CAPA FINA

CROMATOGRAFÍA DE GASES Y LIQUIDOS

GC-MS Y HPLC-MS

TEN

DEN

CIA

EN

SELE

1940 19901980197019601950 2000

AÑO (Aprox.)

LIM

ITE

S D

E D

ETE

CC

IÓN

Cuantificación Análisis Instrumental

-En base al tipo de molécula que se va aanalizar se selecciona el instrumento para sudetección y cuantificación.

-Generalmente se aplica una técnicacromatográfica acoplada a un detectorespecífico/selectivo.

-Se pueden preparar derivados de lassustancias para una mejor detección.

Técnicas instrumentales

• Espectrofotómetro UV, Fl, IR

• Cromatografía Gaseosa CG y sus detectores asociados FID, NPD, ECD, masas, etc.

C fí Lí id H LC d• Cromatografía Líquida HPLC y sus detectores asociados UV, FL, n, masas, etc.

UV-VISIBLE

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Cromatografía de Gases

Cromatografía de Gases

“Es la técnica a elegir para la separación de compuestos orgánicos e inorgánicos térmicamente estables y volátiles”

• Un cromatógrafo de gases consiste en el acoplamiento de varios módulos básicos ensamblados para:

– Proporcionar un flujo constante de gas portador

– Permitir la introducción de vapores de la muestra en la corriente de gas que fluye

– Contener la longitud apropiada de fase estacionaria

– Mantener la columna a la temperatura apropiada (o la secuencia del programa de temperatura)

– Detectar los componentes de la muestra a medida que eluyende la columna

– Proveer una señal legible proporcional en magnitud a la cantidad de cada componente

Identificar los componentes previamente separados

• Selección de detectores adecuados que permitan el análisis cualitativo.– La selección de un detector está relacionada con la

naturaleza de las sustancias a determinar.– Los componentes de una muestra se identifican por su

tiempo de retención– Se pueden emplear técnicas que aporten una mayor

información sobre la naturaleza de los componentes: Acoplamiento con Espectrometría de Masas

• Análisis Cuantitativos basados generalmente en la integración del área bajo los picos.

Cromatografía de Gases

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Sistema de inyecciónEl modo estándar es la inyección directa, la muestra es inyectada con una jeringa a través de un septum de goma a un alineador de vidrio donde es vaporizada y transportada por el gas al interior de la columna.

El bloque de inyección, se q y ,mantiene a una temperatura tal que permita convertir prácticamente de forma instantánea la muestra líquida en un tapón de vapor.

Existen jeringas especiales para muestras gaseosas. También se puede emplear un lazo o bucle para incorporar las muestras gaseosas al flujo de gas portador

Cromatografía de gases: columnas capilares

Columnas capilares Columnas Empacadas

Sistemas de detección

Detector de ionización de llama (FID) Este detector añade hidrógeno al eluyente de la columna.La mezcla pasa a través del conducto de un mechero, donde se mezcla con aire externo y luego arde.Cuando entra en la llama materialCuando entra en la llama materialionizable del eluyente de la columnaSe quema y la corriente aumentanotablemente.Este detector es ideal para compuestos oxidables.No responde a los compuestos de carbono totalmente oxidados, comocarbonilos o carboxilos y grupos éster

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Detector de captura de electrones (ECD)

El eluyente pasa entre dos electrodos. Uno de los electrodos tiene en su superficie un radioisótopo que emite electrones de alta energía conforme decae.Los electrones bombardean el gas portador (N2) formándose un plasma que contiene iones positivos, radicales y electrones térmicos.Se aplica una diferencia de potencial de modo que se recolectan los electrones generados.Los compuestos que absorben electrones reaccionan con los electrones térmicos disminuyendo la corriente del detector, la cual es medida y permite la cuantificación

DDT

2,4-D

Carbaryl

EJEMPLO CG

55

to

t1A  B

Flujo de fase móvil Señal

to

t1

t2

A      B

tBA           B

tAA

tiempo

t2

tB

tA

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Cromatografos de Gases

Cromatografía Líquida-HPLC

Cromatografía de Líquidos 58

Detector Ultravioleta

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Celda de flujo:0.5 cm de camino ópticoy 10 L de capacidad

Cuantificaciones

• Verificaciones de identidad por sobreagregado.

• Contra curva de calibración construidas con estándares de referenciaestándares de referencia.

• Ensayos de recuperación en cada una de las etapas.

• Validaciones instrumentales y de métodos.

• Casos de OC/OF y 2,4‐D

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Espectrómetría de masas

Espectrometría Espectrometría ≠ Espectroscopía≠ Espectroscopía(M di ió d ) (i li b ió(Medición de un rango) (implica absorción o

emisión de energía radiante)

Espectrómetro de masas

35

40

45

e fan I

Extracto vegetal contaminado(0.05 mg/kg)

GC-IT-MS (full-scan)

EI

22000

26000

197

314

97 258

Clorpirifos

i

8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Time (min)

0

5

10

15

20

25

30

Rel

ativ

e A

bund

ance

Diazinon

Endosulf

Endosulfan

 II60 100 140 180 220 260 300 340 m/z

2000

6000

10000

14000

18000 97 258286213

125 169 24465351

4 ppm

1 ppm

CLORPIRIFOS

0.1 ppm

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800000

1200000

1600000

2000000

2400000

2800000

3200000

3600000

Abundance CLORPIRIFOS tR = 10.48

IDENTIFICACIÓN/CONFIRMACIÓN

6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.000

400000

min

40 80 120 160 200 240 280 3200

40000

80000

120000

160000

200000

240000

280000

m/z

Abundance

97197

314

25865 125 286

43213

169244

81 144 351111

EIFull scan

0

2000

4000

6000

8000

Abundance97

197

314

25865 125 28643 213

169 244 351

NCl

Cl Cl

OP(OCH2CH3)2

S

CLORPIRIFOS

314

40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 3400

2000

4000

6000

8000

m/z

Abundance 197

97

258286

212

244 351

REFERENCIA

40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 m/z

FIT = 99%

Espectrómetro de Masas

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314

4060801001201401601802002202402602803003203400

2000

4000

6000

8000

m/z

Abundance 197

97

258286

212

244 351

314

4060801001201401601802002202402602803003203400

2000

4000

6000

8000

m/z

Abundance 197

97

258286

212

244 351

Interpretación de resultados

Conocimiento de la ausencia, presencia/concentración de

Pesticidas

Hacemos un repaso de todo?....

Una instantánea de su respuesta…

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Gracias!!