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Análisis del paper “Is Saliva a Potential Biomarker of Arsenic Exposure? A Case-Control Study in West Bengal, India” de Bhowmick et al. (2013). Juan Fernando Díaz Biotecnología Ambiental, Ingeniería en Biotecnología, Escuela Politécnica del Ejército. 22 de mayo, 2013

RESUMEN

El documento científico elaborado por Bhowmick et al. (2013) muestra los resultados obtenidos en la investigación para determinar si la saliva puede servir como un biomarcador para el monitoreo de la exposición a Arsénico (As). Como parte de este estudio también se diseño un método analítico simple y reproducible para cuantificar As. El arsénico presente en el agua subterránea, la cual suele ser utilizada para ingestión en diversas comunidades, es un problema de salud pública ya que la exposición continua y a dosis altas puede causar arsenicosis, la cual se manifiesta con problemas de salud graves así como también con cáncer en órganos del cuerpo. Estudios previos para determinación del nivel de exposición a As en humanos han empleado distintos tipos de fluidos, entre ellos la orina, y muestras de tejidos, sin embargo existen inconvenientes de índole variada que ponen a consideración la búsqueda de un nuevo y mejor biomarcador. La saliva es un fluido no usado ampliamente en estudios epidemiológicos, de los pocos estudios existentes varios concluyen que la saliva no es un biomarcador adecuado. Las poblaciones de West Bengal, India usaban anteriormente agua subterránea con una alta concentración de As, aunque ahora emplean un agua más segura todavía ciertos grupos del lugar consumen el agua con niveles nocivos de As. En el estudio se tomó muestras de orina y de saliva de los voluntarios seleccionados para realizar el análisis respectivo. Por otra parte también se analizó el agua del lugar para ver la posible correlación de la presencia de arsénico en las personas con los niveles actuales y anteriores encontrados en el agua usada ya sea para riego de cultivos o consumo personal. La tecnología aplicada fue básicamente la digestión ácida de las muestras y análisis con espectrometría de absorción atómica con generación de hidruro (HG-AAS) y un espectrómetro de masas/plasma acoplado inductivamente (ICP-MS). La HG-AAS tiene una sensibilidad alta ya que posee límites de detección bajos, lo que permite determinar arsénico en muestras reales, esto es gracias al acoplamiento de un generador de hidruros (Morand et al., s/a). Por otra parte, el ICP-MS combina el análisis rápido de la tecnología ICP con la precisión y los límites de detección bajos de un

espectrómetro de masas. Puede hacer un multianálisis de elementos traza, incluso hasta partes por trillón (Worley et al., s/a). Los resultados del ensayo hallaron que existe asociación entre la ingesta diaria de As y su concentración en la saliva. De igual forma se vio una correlación positiva entre la concentración del metal en orina y saliva. La ingesta total diaria (TDI) y las calificaciones de lesión de piel se relacionaron al As en orina, mientras que el sexo, hábitos de fumar, las calificaciones de lesiones y la TDI tuvieron efecto sobre el As en saliva. También los investigadores concluyen que la saliva puede permitir tener un panorama de lo que está ocurriendo dentro del organismo en el proceso metabólico del As. La conclusión más importante es que la saliva es un biomarcador de la exposición de las personas al arsénico tras la ingestión de agua potable o alimentos regados con agua con altos niveles del metal.

METODOLOGÍA

A continuación se explicará brevemente la metodología empleada en la investigación de Bhowmick et al. (2013). Estudio de la población y recolección de muestras Se colectó igual número de muestras de orina y saliva dentro de tres poblados del distrito de Nadia, West Bengal, India. Los participantes salieron de un estudio transversal o estudio de prevalencia realizado entre el 2006 y 2007. Se escogió personas que hayan vivido como mínimo 10 años en el área de estudio y tengan entre 18 y 65 años. Se excluyó a quienes tenían enfermedades contagiosas o disfunción renal. Además se obtuvo información de le edad, sexo, peso y tamaño corporal, índice de masa corporal, ocupación años de residencia y hábitos de bebida y tabaquismo. Finalmente, se caracterizó a los pacientes por sus lesiones en la piel. En botellas tratadas previamente con ácido se recolectó las muestras de orina y saliva independientemente, tras lo cual se las almacenó a -20°C hasta el análisis. Las muestras de agua potable se recogieron en botellas similares en los puntos identificados como fuentes primarias del líquido y se les añadió HNO3. Preparación de la muestra y análisis

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Las muestras de orina fueron filtradas y digeridas con HNO3 por 4 horas a 120°C, posteriormente con H2O2 se removió el exceso de orgánicos y se continuó con el calentamiento. El As en la muestra se analizó con HG-AAS. Las muestras de agua previamente acondicionadas con ácido nítrico se analizaron para As también con HG-AAS. El As en saliva se midió con ICP-MS. Para ello las muestras se centrifugaron, se le añadió HNO3, etanol y un estándar interno. La reproducibilidad fue controlada mediante la ejecución frecuente de los estándares de laboratorio. Estimación de la exposición total a As inorgánico Aunque el consumo de agua subterránea es una de las principales formas de entrada de As (III y V) inorgánico al organismo de los humanos, el consumo de alimentos, como el arroz en este estudio, es otra forma de introducir As en el sistema, por ello se estimó cual era la ingesta de agua y arroz diaria. Análisis de datos La información obtenida se transformó a logaritmo para que pueda ser usada con propósitos estadísticos. Además se estableció la correlación entre la ingesta diaria total y el As en saliva y orina. Por otra parte, se examinó la relación existente entre los niveles de As en el organismo con las variables demográficas y otras variables independientes como la edad de los participantes.

ESTUDIOS PREVIOS SIMILARES

Como lo mencionó el estudio de Bhowmick et al. (2013) existen pocos estudios realizados acerca de la saliva como un biomarcador para identificar la exposición a arsénico. Entre ellos se tiene el estudio de Fängström et al. (2008) el cual analizó la exposición de los infantes al As a través de la leche materna. A breves rasgos este estudio trataba de determinar si la leche materna podría ser una vía de transferencia de As a los infantes o por el otro lado, ser un medio de protección contra el metal. La conclusión final fue que efectivamente la leche de la madre constituye un medio de protección para el niño, ya que a pesar de las altas dosis de ingesta que pudieron haber tenido las madres a través del agua potable, la leche solo mostró bajas concentraciones de As inorgánico (media de 1 μg/kg, rango de 0.25–19 μg/kg). Como consecuencia de esto los niños presentaron concentraciones bajas de As en orina (media de 1.1 μg/L; rango de 0.3–29 μg/L). El arsénico en la leche se correlacionó con el arsénico en la sangre materna, la orina y la saliva. La especie prevalente de arsénico fue el arsenito [As (III)]. La tecnología usada en este estudio fue el ICP-MS para el análisis de las muestras de leche, saliva y eritrocitos, mientras que para el análisis de orina se utilizó la

HG-AAS. Por otro lado, se uso cromatografía líquida de alto desempeño (HPLC) para identificar las especies químicas de arsénico [As (III), As (V), MA (metil arsénico) y DMA (dimetil arsénico)] en orina. En otro estudio, Yuan et al. (2008) tratan sobre la identificación de especies arsenicales en saliva humana. La investigación resalta la importancia de bio-monitorear los químicos y sus metabolitos en el cuerpo humano con el fin de rastrear los efectos causados por estas sustancias y las transformaciones que pueden sufrir las mismas, ya que debido a esto pueden tener un transporte diferente en el organismo o causar distintos problemas. El objetivo principal es establecer a la saliva como un biomarcador de buenas características, no invasivo, altamente sensible y capaz de establecer correlación entre las concentraciones halladas y la exposición previa al As. En la metodología de este artículo se emplea cromatografía líquida (LC) combinada con ICP-MS para separar las diferentes especies de arsénico y establecer los niveles de los mismos. Luego para confirmar los resultados se empleó espectrometría de masas con ionización por electrospray (ESI-MS) acoplada a LC y finalmente se uso también monitoreo de múltiple reacción. En los resultados se pudo identificar principalmente cuatro especies de arsénico: As (III), As (V), MA (V) y DMA (V). Adicionalmente se halló bajas concentraciones de MA (III) y DMA (III). Las especies predominantes fueron las inorgánicas [As (III) y As (V)] con 85% del total de arsénico. Las concentraciones totales de saliva oscilaron entre 0.2 a 3.3 μg/L entre los voluntarios de Edmonton Canadá, mientras que las muestras de Mongolia interior estuvieron entre 0.4 a 140 μg/L. Como conclusión se planteó que la prevalencia de las lesiones de piel (un síntoma común de envenenamiento con arsénico) presentes en las personas se pueden relacionar con las concentraciones de As en su saliva haciendo a este fluido un biomarcador ideal incluso para determinar las cantidades de cada especie del metal. Chen (2013) junto a Yuan (autor del artículo mencionado anteriormente) y otros colaboradores analizaron también las diferentes especies de arsénico presentes en la saliva de pacientes de leucemia promielocítica aguda tratados con trióxido de arsénico, un procedimiento muy común en esta enfermedad. Esta investigación se realizó porque un monitoreo detallado del As terapéutico y sus metabolitos puede ayudar a mejorar la eficacia del tratamiento y minimizar los efectos colaterales inducidos por el arsénico. Las muestras se analizaron utilizando HPLC acoplada con ICP-MS. También se efectuó una HPLC acoplada a ESI-MS.

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En los resultados se pudo establecer la presencia de 8 especies arsenicales, algunas de ellas inorgánicas y otras de ellas en forma de moléculas metiladas y/o tioladas. El As (III) se estableció como la especie predominante con el 71,8% del total de arsénico presente en saliva. Además se observó que conforme se aumentaba la concentración de arsénico en la sangre (esto ocurría producto de las infusiones diarias que se suministraba a cada paciente como parte del tratamiento normal) la metilación del arsénico disminuía, hallándose menos especies metiladas en las muestras analizadas sugiriendo que la saturación de este compuesto en el organismo puede conducir a una deficiencia de la biometilación. Al final, la conclusión fue que la saliva puede ser usada como un biomarcador clínico apropiado para el monitoreo de especies arsenicales en pacientes con leucemia promielocítica aguda (APL). En un estudio realizado en el 2010 por Lew et al., cuyo objetivo era bio-monitorear el arsénico en orina y saliva de niños que juegan en campos de juego construidos a partir de madera tratada con arseniato de cobre cromado (CCA). Esto se hizo debido a que en estudios anteriores muestras del lavado de manos de niños que estaban en las zonas de juegos tenían cuatro veces más arsénico que las muestras de otros niños. Entonces, era probable que estas zonas de juego elaboradas con CCA sean una vía de exposición para los infantes. Se analizaron muestras de orina y saliva mediante HPLC combinada con ICP-MS. Las especies identificadas en las muestras de ambos grupos de niños fueron similares [As (III), As (V), MA y DMA]. La suma de las especies de arsénico en orina dieron valores de 15 ± 28 μg/L en el grupo CCA y 12 ± 23 μg/L en el grupo no CCA. Mientras que en saliva la suma dio como resultado 1.1 ± 2.1 μg/L en el grupo CCA y 1.4 ± 1.1 μg/L en el grupo no CCA. De este modo se concluyó que no hay una diferencia significativa entre ambos grupos y por ende se puede decir que las zonas de juegos elaboradas en CCA no son una fuente significativa de arsénico para los niños.

DISCUSIÓN

A pesar de que no existen actualmente varias y diversas investigaciones donde se utilice a la saliva como un biomarcador confiable, con la poca información que se tiene cada uno puede ir extrayendo sus propias conclusiones respecto a la utilidad de esta herramienta de bio-monitoreo. Analizando los cuatro estudios citados en este documento junto al texto base de Bhowmick et al. (2013), se halla algunos elementos comunes. Así se tiene que todos ellos encontraron básicamente

cuatro especies de arsénico: arsenito, arsenato, metil arsénico o monometil arsénico y dimetil arsénico, As (III), As (V), MA o MMA y DMA, respectivamente. Como se conoce, el As es un elemento tóxico para el ser humano y otras formas de vida sobre el planeta cuando están expuestas a altas dosis y durante periodos prolongados. En el ser humano puede causar daños a varios órganos internos e incluso originar la aparición de cáncer en algunos de ellos (Khan et al., 2011). Sin embargo, existe una gran diferencia entre lo que es As orgánico (como en la comida del mar) e inorgánico (proveniente de rocas y el suelo) y esto reside en su toxicidad (Hamano-Nagaoka et al., 2007). Dentro de las especies inorgánicas que están ampliamente distribuidas en los ambientes hay dos en especial, el arsenato y arsenito. El arsenito es mucho más toxico, soluble y móvil que el arsenato. Por ello, hallar concentraciones altas o incluso bajas de esta forma del metal puede ser un llamado de peligro para la comunidad que emplea el agua como fuente de bebida (Khan et al., 2011; Fängström et al., 2008). Se debería tener principal control y cuidado con las formas de arsenato como H2AsO4

– y HAsO4

2– ya que ellas son predominantes

en las aguas bien oxidadas, mientras que las formas de arsenito como H3AsO3 y H2AsO3

– son

predominantes en los ambientes reducidos (Khan et al., 2011). Por otro lado, debido a la existencia de pocos artículos parecidos, Bhowmick et al. (2013), Fängström et al. (2008), y Chen et al. (2013) en cada uno de sus artículos respectivos citan a Yuan et al. (2008) con su artículo “Arsenic Speciation Analysis in Human Saliva” el cual constituye la primera investigación realizada en este tema y la base para el desarrollo de investigaciones futuras. En estos tres artículos la metodología usada es la misma. Usan ácido nítrico para la digestión de las muestras y posteriormente peróxido de hidrógeno. El ácido nítrico sirve para realizar una digestión parcial ácida de la muestra y de esa manera extraer el arsénico inorgánico (iAs) en ella presente, ya que hasta la fecha no se ha logrado una completa recuperación de este tipo de arsénico y que como se mencionó antes es la especie más tóxica (Hamano-Nagaoka et al., 2007). El peróxido de hidrógeno busca en cambio remover el exceso de orgánicos de la muestra y evitar cualquier problema posterior en la medición (Bhowmick et al., 2013). Los equipos y tecnología utilizada mayoritariamente en los cinco estudios fue la espectrometría de masas/plasma acoplada inductivamente (ICP-MS) la cual se combinaba con cromatografía de gases para poder separar las

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especies de arsénico presentes. Esta combinación se usa además porque con ella se logra límites de detección de hasta partes por millón, lo cual es muy útil si se piensa en hacer un bio-monitoreo (Hata et al, 2007; Worley et al., s/a). Otra técnica empleada por Bhowmick et al. y Fängström et al. es la de espectrometría de absorción atómica con generación de hidruro (HG-AAS), donde la producción de hidruros ha ayudado a la absorción atómica a aumentar su sensibilidad, es decir logrando medir niveles más bajos de arsénico en las muestras (Morand et al., s/a). Adicionalmente, Yuan et al. (2008) y Chen et al. (2013) utilizan en sus estudios la espectrometría de masas con ionización por electrospray. Esta técnica básicamente lo que consigue es romper la muestra hasta dejar al analito libre de solvente y sea un único ion, para que posteriormente pase a un espectrómetro de masas (HT-LABS). De esta forma, ambos autores consiguieron confirmar las especies presentes en sus muestras y que ya habían sido identificadas por ICP-MS. Entre las conclusiones obtenidas por varios autores se puede extraer que no solo el agua subterránea es una fuente de arsénico. Una población también puede ingerir As a través de sus alimentos, en especial la comida marina y el arroz (Susheela, 1998; Nishimura, 2010). Es por ella que muchas veces se sugiere a los participantes de un estudio o pacientes que no ingieran alimentos ni bebidas por lo menos treinta minutos antes de la toma de muestra, ya que esto podría verse reflejado en los resultados obtenidos (Bhowmick et al., 2013; Fängström et al,. 2008). Así mismo, cabe destacar que respecto al arroz, este ya posee naturalmente arsénico en su biomasa y puede ser que la acotación hecha por Bhowmick et al. (2013) no sea del todo cierta al mencionar que el riego de estos cultivos con agua subterránea alta en As puede ser la causante de que el arroz sea otra fuente de exposición al As para la población. Tal vez esto sea cierto en parte, aduciendo que el As en el agua incrementó la concentración de As en la gramínea, sin embargo puede ser que se necesiten análisis y estudios más precisos respecto a esto para llegar a una conclusión más fehaciente. Como puntos finales, cabe mencionar que aunque la orina sea usada ampliamente como un biomarcador, en este caso de estudio puede que no sea totalmente idóneo, ya que el As es eliminado rápidamente tras su ingesta en este medio (Bhowmick et al., 2013). En contraste a esto último, la saliva es producida constantemente y posee un flujo alto de sangre, y los químicos y sus metabolitos son distribuidos por muchos mecanismos como difusión pasiva, transporte activo y ultrafiltración desde la sangre. Con esto se

ha demostrado que la concentración de contaminantes químicos presentes en la saliva es un reflejo de su concentración en el plasma (Yuan et al., 2008). Aunque los niveles de As hallados en saliva en los cinco estudios mencionados son bajos, todos ellos están correlacionados con los niveles hallados en otros fluidos o tejidos que pueden poseer concentraciones mayores de arsénico. Además en todas las investigaciones analizadas, excepto en la de Fängström et al. (2008), se instaura que las concentraciones de arsénico en saliva están directamente relacionadas con las lesiones de piel de los participantes de cada estudio. Por todas estas razones la saliva puede conseguir su lugar como un biomarcador de mucha importancia para el bio-monitoreo de la exposición frente a arsénico, ya que es no invasiva, puede obtenerse en pacientes difíciles como los niños, permite un análisis simple y presenta buena correlación entre las especies de As presentes y sus concentraciones con los síntomas de las personas.

REFERENCIAS

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Bhowmick, S., Halder, D., Kundu, A., Saha, D., Iglesias, M., Nriagu, J., Guha, D., Roman-Ross, G., Chatterjee, D. (2013). Is Saliva a Potential Biomarker of Arsenic Exposure? A Case-Control Study in West Bengal, India. Environ. Sci. Technol. DOI 10.1021/es303756s

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