Análisis de corrientes registradas en inside out patch clamp de cilios de células receptoras...

Análisis de corrientes registradas en inside out patch clamp de cilios de

células receptoras olfatorias de Caudiververa caudiververa

Tomados por Ricardo Delgado

el 30 sep 2004 y el 17 oct 2002

Osvaldo Alvarez 3 de diciembre de 2007

Buscando canales ce cloruro activados por Ca2+

04930023.dat, -30 mV, 10,000 pps-30 mV NMG-Cl 110 mM Ca2+ 0.34 m .

04930023.dat Filtro Gauss 8 polos, low pass 100 Hz-30 mV NMG-Cl 110 mM 0.34 um Ca.

Filtro Gauss 8 polos, low pass 100 Hz

Si se usa un umbral puesto al 50% del salto de corriente, se dejan de ver los eventos más cortos que 3 ms.

5 ms 1 ms

04930023.dat Filtro gauss 8 polos, low pass 100 Hz

-30 mV Filtro Gauss 8 polos, hi pass 1 Hz, Cursor 1 a 2.

Zona 0

S. D. = 0.15 pA

Zona 0

Límite de detección de las transiciones de la corriente:Amplitud: 0.15 pA (5 pS @ 30mV) Duración 3 ms.

04930023.dat Filtro gauss 8 polos, low pass 100 Hz -30 mV NMG-Cl 110 mM 0.34 um Ca.

Zona 1

1.43 pA

1.32 pA 1.84


Zona 1 zoom

Cerrados


Zona 2

f=a1*exp(-.5*((x-x1)/s1)^2)+a2*exp(-.5*((x-x2)/s2)^2)

Param s.e.a1 0.0913 0.0020a2 0.0371 0.0021s1 0.3040 0.0085s2 0.2894 0.0206x1 -0.3995 0.0081x2 0.7758 0.0194

x2-x1=1.180.02 pA

P(abierto)= 0.71

Cerrados

Abiertos


Zona 2


Zona 2 zoom

Abiertos

0

2

4

6

8

10

12

0 50 100 150 200

Dwell time, ms

Nu

mer

o d

e ev

ento

s

Cerrados

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

0 50 100 150 200

Dwell time, ms

Nu

mer

o d

e ev

ento

s

Cerrados

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

0 50 100 150 200

Tiempo, ms

Pro

bab

ilid

ad a

cum

ula

da

Promedio t cerrado 19.6 ms

Abiertos

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

0 50 100 150 200

Tiempo, ms

Pro

bab

ilid

ad a

cum

ula

da

Promedio t abierto 20.9 ms


Frecuencia promedio 25 Hz

pS 636

Promedio t abierto 20.9 ms


Resumen 9 min de análisis

Resumen 18.3 s de análisis

04930029.dat Filtro gauss 8 polos, low pass 100 Hz-30 mV NMG-Cl 110 mM 3.51 um Ca. 20 um Niflumic acid

Zona 1

04930029.dat Filtro gauss 8 polos, low pass 100 Hz-30 mV -30 mV NMG-Cl 110 mM 3.51 um Ca. 20 um Niflumic acid

Zona 1 zoom

Cerrados

Abiertos

2.12 pA

Zona 1

04930029.dat Filtro gauss 8 polos, low pass 100 Hz-30 mV NMG-Cl 110 mM 3.51 um Ca. 20 um Niflumic acid

+10 mV 50 uM Ca

0 mV, 10-7 M Ca

+20 mV 50 uM Ca

+30 mV 50 uM Ca

02O17015 al 02O17026 110 NMG-Cl / 10 NaCl

-30 mV 50 uM Ca

+40 mV 50 uM Ca

+50 mV 50 uM Ca

02O17015 al 02O17026 110 NMG-Cl / 10 NaCl

-70 mV 50 uM Ca

-40 mV 50 uM Ca

-60 mV 50 uM Ca

-20 mV 50 uM Ca

02O17015 al 02O17026 110 NMG-Cl / 10 NaCl

-70 mV

-60 mV

-50 mV

-40 mV

02O17015 al 02O17026 110 NMG-Cl / 10 NaCl

-30 mV

-20 mV

+10 mV

+20 mV

+30 mV

02O17015 al 02O17026 110 NMG-Cl / 10 NaCl

-2.0

-1.5

-1.0

-0.5

0.0

0.5

-70 -60 -50 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 50 60 70 80

Vm, mV

I, p

A

GHK 110/10 02O17016-26

02O17015 al 02O17026 110 NMG-Cl / 10 NaCl

Curva roja canal selectivo para Cl-

-2.0

-1.5

-1.0

-0.5

0.0

0.5

-70 -60 -50 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 50 60 70 80

Vm, mV

I, p

A

GHK 110/10 02O17016-26 36 pS

02O17015 al 02O17026 110 NMG-Cl / 10 NaCl

-2.0

-1.5

-1.0

-0.5

0.0

0.5

-70 -60 -50 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 50 60 70 80

Vm, mV

I, p

A

GHK 10/0 02O17016-26

¿Y si fuera selectivo para Na+?

Curva roja canal selectivo para Na+

02O17015 al 02O17026 110 NMG-Cl / 10 NaCl

Análisis de ruido de corrientes macroscópicas.

Determinación del número de canales y de la corriente

unitaria y la probabilidad del abierto.

Lecar, H., and F. Sachs. 1981. Membrane noise analysis. In Excitable Cells in Tissue Culture. P. G. Nelson and M. Lieberman, editors. Plenum Press, New York. 137-172.DeFelice, L. 1981. Introduction to Membrane Noise. Plenum Press, New York.

Para analizar los registros de las corrientes macroscópicas haremos un modelo que supone:

•1) los canales tienen sólo dos estados: conducen o no conducen.

•2) todos los canales son iguales.

•3) no hay interacción entre los canales.

En membrana con un solo canal.

La corriente para el canal cerrado es 0.

La corriente para el canal abierto es i.

La probabilidad de encontrar el canal abierto es p.

La probabilidad de encontrar el canal cerrado es q.

Según la primera suposición p + q = 1

La corriente promedio de la membrana será la suma de la corriente de cada estado multiplicada por la probabilidad de cada estado.

ipqI 0

ipI

Para el caso de la membrana con un solo canal:

gpG

pipiqipI222 0

ppiqpiI22222 1

pqqpiI2222

qppqiI 22

pqiI22

La varianza de la corriente es la suma de las desviaciones de la corriente de cada estado con respecto a la corriente promedio, elevadas al cuadrado y multiplicadas por la probabilidad de cada estado.

2I

Para la membrana con 1 canal

ipI pqiI22

Para una membrana con N canales

NipI pqNiI22

ppNiI 122

Recordar que p + q =1

2222 pNipNiI

N

IIiI

2

2 Es una parábola

Corriente promedio, pA

Var

ianz

a, p

A2

i = 1 pA, N = 1,000

N

IIiI

2

2

iId

d

I

I

0

2

N

IIiI

2

2

Es una parábola

N

Ii

Ipr I

2

Es una recta

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 20 40 60 80 100 120

(p) pS

r(p

) p

S

i

iN

Análisis de la varianza y el promedio de corriente medida en cilios de células receptoras olfatorias.

x

d

riro

rm

ri = resistencia del líquido intracelular por unidad de longitud de cilio ohm m-1

d = longitud de cilio. m

ro = 0 =resistencia por unidad de longitud del medio extracelular.

= constante de espacio, m

rm = 0 = resistencia de la membrana por unidad de longitud del cilio ohm m.

i

m

rr

Larsson et al 1999 Biophys J. 72:1193-1203

/cosh/cosh

0

ddx

VxV

mii

m grrr

/1 pnggm 0

d

riro

rm

xV(0)

gm = 1 /rm S m-1 go = conductancia de la membrana con todos los canales cerrados S m-1

n = número de canales por unidad de longitud del cilio m-1.

= conductancia de los canales S.

p = probabilidad del estado abierto de los canales

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0 10 20 30 40 50 60

x , micrometros

V(x

) / V

(0)

/cosh/cosh

0

ddx

VxV mi

i

m grr

r/1 pnggm 0

p = 0

p = 1

n = 100 m-1

= 1 pSd = 30 o 60 m

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0 10 20 30 40 50 60

x , micrometros

V(x

) / V

(0)

/cosh/cosh

0

ddx

VxV mi

i

m grr

r/1 pnggm 0

p = 0

p = 1

n = 100 m-1

= 30 pSd = 30 o 60 m

/cosh/cosh

0

ddx

VxV mi

i

m grr

r/1 pnggm 0

N

Ii

Ipr I

2

d

dxxVpnI0

pVNI

222 1 VpNpI dxxVpnpd

I2

0

22 1

)(/2sinh)(/

21

12

pdpd

piI

pr I

)(/2sinh)(/

21

12

pdpd

piI

pr I

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 20 40 60 80 100 120

(p) pA

r(p

) p

A

i

iN

mii

m grr

r/1 pnggm 0

n 100 m

1 pS

d 1 m

V 1 V

0

5

10

15

20

25

30

35

0 20 40 60 80 100 120

(p) pA

r(p

) p

A

)(/2sinh)(/

21

12

pdpd

piI

pr I

i

< iN

mii

m grr

r/1 pnggm 0

n 100 m

30 pS

d 1 m

V 1 V

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

0 500 1000 1500

(p) pA

r(p

) p

A

)(/2sinh)(/

21

12

pdpd

piI

pr I

<i

< iN

mii

m grr

r/1 pnggm 0

n 100 m

1 pS

d 30 m

V 1 V

y = -0.4x + 33.7

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 20 40 60

Corriente promedio, pA

r(p

), f

A


i = 0.034 pA @ -40 mV = 0.8 pSn = 26 canales por md = 50 m

p = 0.61 @ Ca2+ 300 M

Rana pipiens .115/115 NaCl, 0.12 a 300 M Ca2+i

0

5

10

15

20

25

30

0 100 200 300 400

(p) pA

r(p

) p

A

)(/2sinh)(/

21

12

pdpd

piI

pr I

<i

<< iN

mii

m grr

r/1 pnggm 0

n 100 m

30 pS

d 30 m

V 1 V

000

2

)0(22 Vng

IiIr

r(p)

pA

 pA

)(/2sinh)(/

21

12

pdpd

piI

pr I

Curva negra

Puntos rojoslim d>>

r(p)

pA

 pA

000

2

)0(22 Vng

IiIr

)(/2sinh)(/

21

12

pdpd

piI

pr I

Curva negra

Puntos rojoslim d>>

r(p)

pA

 pA

2

2Ik

iIr

r(p)

pS

 pS

r(p)

pA

 pA

2

2Ik

iIr

i encontrada por Solver de Excel

Curva roja

Diameter 0.28 um

Lenght 60 um

Area 54.5 um2 0.908 um2 9.08 um2

Area 5.45E-07 cm2

Capacitance 5.45E-07 uF 9.08E-09 uf 9.08E-08 uF 0.09 pFRinside 11 Mohm 110 Mohm 110 MohmGmembrane 5 pS

Rmembrane 5.00E+12 ohm 5.00E+05 Mohm 500 GohmRm 200ohm cm2 3.67E+08 ohm 2.20E+10 ohmGsingle channel 1.00E+01 pSRsingle channel 1E+11 ohm 100000 Mohm 100 Gohm


Cilo entero 1 m 10m 10m

CanalNodoClamp

0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0

Tiempo, milisegundos

Inte

nsid

ad d

e co

rrie

nte,

pA

Canal

Clamp

0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0

Canal

Clamp

Inte

nsid

ad d

e co

rrie

nte,

pA


0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0

Canal

Clamp

Inte

nsid

ad d

e co

rrie

nte.

pA


0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

Serie1

Serie2

Canal

Clamp

Inte

nsid

ad d

e co

rrie

nte,

pA


0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0

Canal

Clamp

Inte

nsid

ad d

e co

rrie

nte


Varianza promedio canal 2 a 6 4.70E-02

Varianza promedio clamp 2 a 6 0.80 E-02

Canal Clamp

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