INSTITUTOPOLITECNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICAS

GENETICA MICROBIANAPRACTICA 1AISLAMIENTO Y CARACTERIZACION DEL DNA

EQUIPO 5FLORES MERCHANT BRENDA ALYNGARCIA FELIPE IGNACIO GERARDO

SECCION 1 GRUPO 5QM1

INTRODUCCIONLos experimentos de Hershey-Chase probaron que el ADN era el material gentico pero, no como el ADN conformaba los genes. El DNA deba transferir informacin de la clula de origen a la clula hija. Deba tambin contener informacin para replicarse a si mismo, ser qumicamente estable y tener pocos cambios. Watson y Crick eran investigadores tericos que integraron todos los datos disponibles en su intento de desarrollar un modelo de la estructura del DNA.El DNA es una doble hlice, con las bases dirigidas hacia el centro, perpendiculares al eje de la molcula y las unidades azcar-fosfato a lo largo de los lados de la hlice.Las hebras que la conforman son complementarias (deduccin realizada por Watson y Crick a partir de los datos de Chargaff, A se aparea con T y C con G, el apareamiento se mantiene debido a la accin de los puentes hidrogeno entre ambas bases). Una purina con doble anillo siempre se aparea con una pirimidina con un solo anillo en su molcula. Las purinas son laAdenina(A) y laGuanina(G). En el ADN se encuentra la desoxirribosa.Las Pirimidinas son laCitosina(C) y laTimina(T). Las bases soncomplementarias, con A en un lado de la molcula nicamente encontramos T del otro lado, lo mismo ocurre con G y C.Si conocemos la secuencia de bases de una de las hebras, conocemos su complementaria. En cada extremo de una doble hlice lineal de DNA, el extremo 3'-OH de una de las hebras es adyacente al extremo 5'-P (fosfato) de la otra. En otras palabras,las dos hebras sonantiparalelas, es decir, tienen una orientacin diferente. En el esqueleto azucar -fosfato de del DNA los grupos fosfato se conectan al carbono 3 de la molcula de desoxirribosa y al carbono 5 de la siguiente, uniendo azcares sucesivos. La prima () indica la posicin del carbono en un azcar. Por convencin, la secuencia de bases de una hebra sencilla se escribe con el extremo 5'-P a la izquierda.Debido a la presencia del anillo aromtico delas bases nitrogenadas, la molcula puede absorber luz de 230 a 280 nm y esto permite identificarla ya que presenta un espectro de absorcin caracterstico. Cuando se calienta un ADN de doble hebra (forma nativa) se rompen las fuerzas de unin entre las dos hebras y acaban por separarse. Por tanto el DNA desnaturalizado es una sola hebra. En determinadas condiciones, una disolucin de ADN desnaturalizado puede volver formar DNA nativo. Este proceso recibe el nombre de renaturalizacin del DNA. Cuando es renaturalizado se forma a partir de molculas de DNA de distinto origen o entre una molcula de DNA y otra de RNA la renaturalizacin se conoce como hibridacin.OBJETIVOS Aislar DNA cromosmico de alto peso molecular, a partir de un cultivo bacteriano y/o de un lisado fagico. Establecer el espectro de absorcin de DNA aislado. Determinar la concentracin y grado de pureza del DNA obtenido.Mediante la aplicacin del programa bioinformatico DNAMAN Determinar la influencia de algunas caractersticas de la secuencia de DNA sobre su desnaturalizacin.

RESULTADOSA. Aislamiento del DNADe acuerdo al procedimiento realizado se obtuvo DNA de la cepa Escherichia coli DH0B pCR2.1 Topo y Escherichia coli DH10B pCR2.1 TOPO-ape. Se aisl el DNA.B. Determinacin de la concentracin de DNAEscherichia coli DH10B pCR 2.1 TOPO

Escherichia coli DH10B pCR 2.1 TOPO-ape

C. Determinacin del espectro de absorcin del DNANmEscherichia coli DH10B pCR2.1 TOPOEscherichia coli DH10B pCR2.1 TOPO-ape

2301.8321.15

2402.3631.70

2503.5247.36

260452.66

2703.2640.52

2801.8724.33

2900.749.54

3000.161.71

Tabla 1.- Absorbancias del aislamiento de DNA de Escherichia coli DH10B pCR2.1 TOPO y Escherichia coli DH10B pCR2.1 TOPO-ape

D. Curva de desnaturalizacin del DNA del bacterifago Q

TM= 69.3+0.41 (G+C) (G+C)= TM-69.3 0.41(G+C) = 74.1-69.3 0.41(G+C)= 11.8 POR LO TANTO (G+C) + (A+T)=100 DESPEJANDO (A+T)= 100 (G+C) (A+T)= 88.2

Figura 1.- espectro de absorcin del DNA del plsmido pCR 2.1 TOPO

Figura 2. Espectro de absorcin del DNa del plasmido pCR 2.1 TOPO-apeE. Curva de desnaturalizacin del DNAGrafica

Figura 3. Curva de desnaturalizacin del DNA del bacterifago QF. Influencia de diferentes parmetros sobre la desnaturalizacin del DNA. Las determinaciones se efectuaran empleando el programa DNAMAN.OligonucletidoLongitud(G,C)%TmSecuencia

1405086.8GCATGCGCATGCATATGCGCATGCATATGCATATGCGCAT

2407594.2GCCGACGTGGCTCCGCCCGGATGCAACCCGCGTCGGCTAG

34062.590AATGCCATCGTCAGCCGCCGGGTGCGGCCTCGCTGATTAT

44057.585.2AAAGGTAGGCCGCTTCGCGACCCGGTCGAGCAAGTTCATA

54057.582.7GTACGGTTAACCGGCCTACGGCTCCGGGGATGCTTAACAT

64057.583.5CCGCCTCAAGCTAGGATCCGCCTGACTCTTGATACTGCGA

7205054.3AAGTCCGTACAAGTCCGTAC

8305075.4GCGCGTGTAATGCTCAAGTGCAAGGTCATT

9605084.3TGCTAAATAGGTGCCTGCAAGTCGTACCCTATTGAAGCTATAGCTCAGTAGCTCCTGCCG

DISCUCION ANLISIS DE LA TCNICA

Durante la prctica se efectu el aislamiento de DNA de los plasmidos pCR 2.1.-TOPO y pCR 2.1 .- TOPO-APE ; en el primer paso se coloc Tris/EDTA/glucosa , el tris funciona como regulador de pH el cual favorece la aparicin de DNA , el EDTA es un quelante que atrapa los iones Mg +2 para evitar las accin de las DNAasas, la glucosa mantiene la fuerza inica para evitar daos al DNA.Al adicionar la solucin de NaCl se precipitan las protenas, se favorece la lisis celular y desnaturaliza el DNA; el SDS al ser un detergente disuelve las membranas celulares y al romperse la membrana se libera DNA que tiene protenas asociadas de las cuales se va a separar. En el siguiente paso se adiciono acetato de potasio el cual va a neutralizar el medio y favorecer la precipitacin de las protenas y el DNA genmico, el cido actico glacial tambin favorece las condiciones para la neutralizacin del medio. Posteriormente se verti una mezcla de fenol: cloroformo para quitar el exceso de protenas. La adicin posterior del etanol absoluto fue para precipitar el DNA y as obtenerlo en forma de pastilla despus de centrifugar, en el siguiente paso se volvi a adicionar etanol pero al 70% esto fue para retirar el exceso de iones del acetato de potasio; ya despus de dejar que se evaporara el etanol se adiciono solucin salina la cual sirve para recibir el DNA sin que este sufra daos.

Como se observa en las grficas logramos obtener el espectro caracterstico del DNA ya que el pico de mayor absorbancia lo obtuvimos en la longitud de onda de 260nm a la cual absorben en mayor grado la luz las bases nitrogenas del DNA, aunque en la cepa recombiante (pCR 2.1 TOPO.- APE) se obtuvieron absorbancias demasiadas altas a comparacin de la otra esto pudo haberse debido tal ves que no solo se ley DNA si no tambin RNA o que se haya cometido algn error en la tcnica de aislamiento ya sea durante el proceso o desde el inicio de la toma de la cepa. Posteriormente con las lecturas a 260 nm y 280nm se determin la concentracin y pureza del DNA obtenido, la cual fue de para la cepa no recombinante mientras que para la recombinante y de pureza 2.13 para la no recombinante y 2.16 para la recombinante lo cual indica que tienen una pureza alta.

En el siguiente experimento construimos una curva de desnaturalizacin con los datos proporcionados en el ejercicio, se determin el punto medio de la parte recta de la curva e interpolo en el eje de las abscisas para obtener el valor de TM del DNA del bacterifago Q el cual fue de 74.16, ya con este e valor se despejo de la formula y se obtuvo una concentracin de (G+C) de 11.8 y por lo tanto lo restante fue concentracin de (A+T)= 88.2

En la influencia de diferentes parmetros sobre la desnaturalizacin del DNA se observa que la influencia del contenido de GC es proporcional a la cantidad de Tm (temperatura media de desnaturalizacin) ya que entre mayor porcentaje de GC tenga el oligonucletido aumenta el valor de Tm. Con respecto a la influencia de la variacin de la secuencia de nucletidos se observa que no hay una diferencia significativa en los valores de Tm, es decir que no afecta la variacin de la secuencia y por ltimo la influencia de la longitud de la secuencia del nucletido se observa que el valor de Tm es proporcional a la longitud del nucletido ya que entre mayor sea su longitud mayor es el valor de Tm.CONCLUSIONES

Se aisl el DNA de los plsmidos pCR 2.1.- TOPO recombinante y no recombinante Se obtuvo el espectro absorcin de plsmidos pCR 2.1.- TOPO recombinante y no recombinante La concentracin obtenida fue de para pCR 2.1 TOPO y para pCR 2.1 TOPO-APE La pureza obtenida fue de 2.13 para pCR 2.1 TOPO y de 2.16 para pCR 2.1 TOPO-APE La pureza obtenida fue alta. La concentracin de GC es directamente proporcional a su TM es decir a mayor concentracin de GC mayor ser su TM. La variacin de la secuencia de nucletidos no afecta significativamente la TM. La longitud de la secuencia es directamente proporcional a su valor de TM es decir a mayor longitud mayor TM.Bibliografa http://www.biologia.edu.ar/adn/adnestructura.htmhttp://www.ibt.unam.mx/sintesis/cuantificacion.html https://books.google.com.mx/books?id=FXDiqLK6GmAC&pg=PA835&lpg=PA835&dq=dna+espectro&source=bl&ots=UrHryiX0PI&sig=ecFoffA9DSrLjckIlnLhNqipe0c&hl=es&sa=X&ei=CaM_VZO6J4qesAXl74HYBA&ved=0CB0Q6AEwADgK#v=onepage&q=dna%20espectro&f=false