AFM-C13AFM-BFM

Rutas metabólicas

Obtengo una serie de balances que indican la

velocidad con que se consumen sustratos, se

producen productos y se consumen/producen

intermediarios

Esto genera una serie de ecuaciones con n incógnitas (flujos). Para resolver el sistema debe haber tantas ecuaciones (o sea componentes relevantes) como flujos

Resolución por cuadrados mínimos.

Matriz estequiométrica X Matriz

V = Matriz Q

Sale de las rutas

metabólicas

Sale de datos experimentales

previamente reconciliados

Despejo Matriz V

A x V = Q

V= Q . AT =(A.AT)-1.AT.Q A AT

Repaso AFM

Una vez que tengo los flujos puedo: Calcular cualquer valor de Q que

no tenga su valor experimental A partir de los balances

Calcular parámetros intrínsecos del microorganismos Y´x/ATP, P/O, mATP

Calcular rendimientos máximos teóricos

Decidir que rutas metabólicas son las más probables

Cálculos de nodos

Seminario rend máx en cítrico y lisina

Seminario B. thuringiensis, Producción de Cítrico

Seminario Energética S. cereviseae

Seminario Vida en Titán

En este caso no hay valores de Q exp. Fijo qs en -1 y qp va tomando diferentes valores

Criterio: Determinar si los valores de los flujos irreversibles son positivos

AFM en una ramificación

Hay un error en el paper

Si asumimos que v1 y v4 son medibles: V2, v3 y v5 son expresados en función de v1 y v4

La matriz no tiene inversa porque v2 y v4 no son independientes

Pares de flujos independientes

Si medimos v2 y v4 obtenemos:

Hay dos maneras de aplicar AFM en sistemas indeterminados o subdeterminados b) FBA c) 13C-MFA

Análisis de Flujos Metabólicos

Análisis de Balances Metabólicos

Análisis de Flujos Metabólicos-13C

Se aplica una función objetivo, ej: maximización de producción de ATP

Conclusión: Podemos determinar los valores de flujos desconocidos usando Análisis de flujos Metabólicos (AFM) cuando el sistema está determinado o sobredeterminado. Sistema subdeterminados requieren restircciones adicionales para alcanzar una solución.

Las células utilizan un sustrato carbonado marcado (por ejemplo, 13C-glucosa) como única fuente de carbono. Luego de un tiempo que varía según las condiciones del experimento, cada metabolito en la red estará enriquecido en 13C en cierta proporción, y esa abundancia isotópica podrá cuantificarse con técnicas de RMN (resonancia magnética nuclear) o EM (espectrometría de masas).

•Condiciones estacionarias. •Se debe conocer el destino de cada uno de los átomos de carbono en los distintos intermediarios de la red metabólica

Requisitos:

Se establecen una serie de ecuaciones que relacionan la conversión entre metabolitos en la red bioquímica. La solución debe respetar las restricciones estequiométricas de las reacciones en la red. Pueden establecerse algunas restricciones matemáticas. Normalmente se basa en programas iterativos.

Metodología

Resolución

13C-AFM

a) asignación arbitraria de algunos valores de flujos al sistema de modo tal que se cumplan las restricciones estequiométricas de las reacciones bioquímicas del modelo,

b) simulación de la distribución isotópica de los metabolitos en la red bioquímica. A partir de un conjunto limitado de flujos ‘libres’ (a los cuales se les asigna un valor arbitrario) y de la composición isotópica del sustrato carbonado se puede reconstruir la distribución de isotopómeros de cada metabolito en el estado de equilibrio estacionario. Para ello, el modelo matemático utilizado para correlacionar la distribución de isotopómeros y los flujos intracelulares contiene una ecuación (normalmente, no lineal) para cada uno de los isotopómeros en el sistema. Por lo tanto, para una red bioquímica ‘mediana’ que incluya solamente las vías metabólicas centrales, se tiene un sistema de alrededor de 1000 ecuaciones no lineales.

c) comparación del patrón de marcación isotópica y los valores de flujo obtenidos durante la simulación con los valores experimentales obtenidos por CG-EM, d) repetición iterativa del procedimiento a través de un algoritmo de optimización de

modo tal que la diferencia entre la distribución in silico y la distribución experimental sea mínima

e) análisis estadístico de los resultados, en virtud de que la propagación de errores de los parámetros biológicos observables (e.g., distribución isotópica, flujos extracelulares, evolución de CO2, etc.) al mapa de flujos puede originar resultados precisos pero estadísticamente erróneos o inválidos

1) El genoma del microorganismo, junto con información bioquímica y otras informaciones específicas de la cepa a analizar es utilizada para reconstruir el mapa metabólico. 2) Se realizan los balances de masa en el estado estacionario, y se incorporan restricciones en determinados flujos (ej: reacciones irreversibles v>0). 3) Los coeficientes estequiométricos para cada metabolito enzimático son utilizados para construir la matriz estequiométrica. 4) Se fija un objetivo (ej: velocidad de crecimiento máxima) 5) Los flujos son calculados utilizando programación lineal

Análisis de flujos metabólicos (FBA)

Aplicaciones de FBA

Cálculo de distribuciones de flujos Calculo de rendimiento máximo

Determinación de si una función o vía persiste en el metabolismo, en particular luego de remover algún elemento

•Los resultados obtenidos dependen de la función objetivo utilizada

•Hay generalmente más de una distribución de flujos para una misma función objetivo. Soluciones alternativas.

•No da soluciones subóptimas

Limitaciones

Aplicaciones análisis flujos metabólicos

Extraído de Luis Acerenza- Modelos para analizar redes de reacciones bioquímicas celulares (II)

Funciones Objetivo: analizadas: •Maximización del crecimiento celular

•Minimización del potencial redox (puede interpretarse como maximización de la eficiencia energética de la célula)

•Minimización de la producción de ATP (implica uso eficiente de la energía)

•Minimización de consumo de sustrato (la idea es que el uso eficiente de la fuente de carbono lleva a un mayor tiempo de suministro de la misma e el caso de condiciones de limitación de nutrientes, ojo porque en medios ricos es probable que no funcione)

•Maximización de producción de ATP (se usa a veces para modelar mitocondria, probable- mente no funcione en bacteria)

Los experimentos son realizados a diferentes temperaturas y concentraciones de succinato