CLONADO -...
103
CLONADO
Transcript of CLONADO -...
CLONADO
La clonación puede definirse como el proceso por el que se consiguen, de forma asexual, copias idénticas de un organismo, célula o molécula.
VECTORES DE CLONADO
Moléculas transportadoras que transfieren y replican fragmentos de ADN que llevan insertados.
Para que sirva de vector, una molécula debe ser capaz de replicarse junto con el fragmento de ADN que transporta.
También tiene que tener secuencias de reconocimiento que permitan la inserción del fragmento de ADN a clonar.
¿QUÉ VECTOR USO?
Tamaño del inserto
Número de copias
Incompatibilidad
Marcador de selección
Sitios de clonado
Funciones especializadas
VECTORES DE CLONADO EN E. coli
TIPO INSERTO
PLÁSMIDOS chico
BACTERIÓFAGOS medio
CÓSMIDOS medio/grande
BACs muy grande
PLÁSMIDO
Elemento genético extracromosomalque replica autonomamente
Tamaño: < 2 kb- > 1000 kb
linealesGeometría girasas circulares topología
topoisomerasas
FUNCIONES
Resistencia a antibióticos
Resistencia a metales : Pb, Zn, Hg
Funciones metabólicas para utilización de nutrientes: herbicidas, pesticidas, hidrocarburos
Sistemas de protección: restricción-anti restricción
DNA a clonar
Vector plasmídico
Digestión con endonucleasa yseparación de fragmentos
Digestión con endonucleasa
DNA ligasa
Vector recombinante
Transformación de célulasde E. coli competentes
Selección de clones positivos y recuperación del plásmido
Esquema clásicode clonado en un vector plasmídico
Placa de agar con medio LB + ampicilina
Selección de bacteriasque han incorporado el plásmido
MARCADOR DE SELECCIÓN
SITIO DE CLONADO MÚLTIPLE
ORIGEN DE REPLICACIÓN
MARCADORES DE SELECCIÓN
ANTIBIÓTICO INHIBICIÓN RESISTENCIA
Ampicilina síntesis de pared βlactamasa (usar en fase log)
Carbenicilina
Cloranfenicol síntesis proteica Cl. Acetil transferasa
Kanamicina síntesis proteica aminoglucósido fosfo transferasa
Tetraciclina síntesis proteica TetA (exportación del ATB)
Pag. 336
NÚMERO DE COPIAS
Está determinado por el control de la replicaciónAlto clonadoBajo genes letales, construcción de BACs
REPLICACIÓN PLASMÍDICA
Replicón: unidad genética constituída por el origen de replicación y sus elementos de control asociados
Replicón plasmídico: fragmento más pequeño de ADN plasmídico capaz de replicar autónomamente y mantener el Nº de copias.
ARN anti sentidoControl de la replicación iterones
Plásmido pMB1: casi todos los plásmidos usados en clonado derivan de él
Replicón pMB1/colE1: inicialmente 15-20 copias /célula. Modificaciones: >Nº de copias
Mutación TS
REGULACIÓN DEL NÚMERO DE COPIAS DEL PLÁSMIDO colE1 POR ARN ANTISENTIDO
Vida media corta
RNAsa H
No necesita síntesis proteica para replicarEn presencia de cloranfenicol aumenta el Nº de copias
Mutación en ARNII TS >Nº de copias al la temp.
Otros vectores tienen mutación en rop para aumentar el nº de copias
REGULACIÓN DEL NÚMERO DE COPIAS DEL PLÁSMIDO POR ITERONES
“esposar”
RepA: ATPasa helicasa
REGULACIÓN DEL NÚMERO DE COPIAS DEL PLÁSMIDO R1 POR ARN ANTISENTIDO
Control de la expresión de RepA
CopA and CopB
VECTORES RUNAWAY
Construídos a partir del plásmido R1
Un pequeño aumento en la formación del RNAm de RepA reduce drásticamente la síntesis de CopA debido a transcripción convergente, lo que lleva a la pérdida del control de nº de copias replicación “galopante”= runaway. Hasta 1000 copias de plásmido por genoma.
Amplificación runaway ocurre en presencia de síntesis proteica
Nature Biotechnology 1992, vol. 10, Nordstrom et al.
PλpRλcI857
cI( - )
T > 34ºC
Control de la transcripción de repA por el promotor del bacteriófago λpR
INCOMPATIBILIDAD
Los plásmidos que llevan el mismo replicón pertenecen al mismo grupo de incompatibilidad, por lo tanto no pueden coexistir en la misma bacteria
GRUPO DE ELEMENTO DE CONTROL COMENTARIOINCOMPATIBILIDAD NEGATIVO
colE1, pMB1 RNAI controla el procesamiento de pre-RNAII en primer
IncFII (RI), pT181 RNA controla la síntesis de RepA
PI, F, R6K, pSC101, p15A iterones secuestra RepA
VECTORES CON FUNCIONES ESPECIALIZADAS
VECTORES PLASMÍDICOS CON ORI DE BACTERIÓFAGO SIMPLE CADENA: FAGÉMIDOS
Además del ori bacteriano poseen un origen de replicación de bacteriófagos filamentosos simple cadena como M13 o f1.
El ADN sc se produce al infectar la bacteria con un bacteriófago helper que lleva los genes para generar ADN sc y empacar las partículas.
secuenciarViriones sondas mutagénesis
VECTORES SHUTTLE
Vector, generalmente plásmido, que puede propagarse en 2 especies diferentes
SEGREGACIÓN PLASMÍDICA
Plásmido con alto nº de copias: difusión pasivaPlásmidos con bajo nº de copias: sistema partición activo
Sistema de partición activoPlásmido P1: genes parA, parB, secuencia en cis parSComplejo nucleoproteico: ParA, ParB, IHF (integration host factor) y parS “guia y posiciona” al plásmido.
Recombinación sitio específicaRecombinasas sitio-específicas para resolver dímeros
Sistema toxina-anti toxinaElimina a la bacteria libre de plásmido
Recombinasas sitio-específicastoxina antitoxina
Toxina: proteínaAntitoxina: proteína o ARN (más inestable que toxina) Codificados por plásmido
"Hok sok system R1 plasmid present". Licensed under CC BY-SA 3.0 via Wikipedia - http://en.wikipedia.org/wiki/File:Hok_sok_system_R1_plasmid_present.gif
Sistema Hok/sok= host killing (toxin)/ suppression of toxin (RNA antitoxin)
TRANSFERENCIA PLASMÍDICA
Transformación
Transducción
Conjugación
CONJUGACIÓN
Transferencia de material genético entre bacterias a través del contacto directo entre células. Requiere muchos genes del mismo plásmido, en gral. plásmidos chicos no conjugan, salvo que estén con un plásmido “helper”
F+ F-
R. a ATB Información transferida Tolerancia a xenobióticospor la bacteria donante , ej. Uso de nuevos metabolitos
Plásmido F: episoma de aprox. 100 kb. Lleva oriV (replicación) y oriT (transferencia). Sólo 1 copia/célula. Locus tra y trb , aprox, 40 genes (para conjugación, gen pilin, etc.)
Plásmido libre :cepas F+
Plásmido integrado en cromosoma: cepas Hfr (high frequency recombination), cepas que transfieren ADN cromosómico.Sin plásmido: cepas F-
TRANSFORMACIÓN BACTERIANA
Electroporación
Transformación química
Tratamiento de las bacterias con cationes divalentes (CaCl2) y shock térmico
EFICIENCIA DE TRANSFORMACIÓN
Medida cuantitativa de cuantas células incorporaron el plásmido
Se expresa en Nº de transformantes por μg ADN plasmídico
Competencia (cfu/µg)
Aplicación
>1×109 Construcción de biblioteca genómica
1×106 Clonado/ subclonado
1×103 Transformación con plásmido
circular
IDENTIFICACIÓN DE COLONIAS BACTERIANAS QUE CONTIENEN PLÁSMIDO RECOMBINANTE
1) Análisis del ADN plasmídico: restricción y PCR
2) Complementación α
3) Inserción con inactivación
4) Hibridación
RESTRICCIÓN Y/O PCR
Complementación α
X-GAL: 5-bromo-4-cloro-3-indolil- beta-D-galactopiranosido
IPTG: Isopropil β-D-1-tiogalactopiranosido
Β galactosidasa
inactiva
βGalactosidasa inactiva
βGalactosidasa activa
Represor Lac inactivo unido a IPTG
Producto azulX-gal
Complementación α
Inactivación por inserción
Resistencia a Kanamicina
Resistencia a ampicilina
Origen de replicación
HIBRIDACIÓN
In situ colony
BACTERIÓFAGOS
Fago lambda
* Genoma de unos 45.000 bp
* Fragmento central de unas 15 kbp no es esencial para la replicación y
puede ser eliminado
* Ligación del inserto (unas 5-25 Kbp)
* Empaquetamiento del DNA “in vitro” en partículas de fago.
* Transfección de células y propagación.
lítico (clonación)Bacteriófago λ 2 ciclos de vida lisogénico: MI, Nut.
El ciclo lisogénico-lítico del bacteriofago
Unión del fago, penetración y liberación del DNA
Integración y replicación conel genoma bacteriano
Circularización delgenoma del fago(secuencias cos)
Inducción delciclo lítico
Lisis y liberación de partículas víricas
E. coli
INFECCIÓN VIRAL
1- Adsorción: producto del genJ del fago reconoce al receptor de maltosa LamB
2- Inyección del ADN: requiere el producto del gen pstM
3- Circularización del ADN: sitios cos + ligasa
El fago lambda como vector de clonación
gt10 gt11 (bibliotecas de expresión)
EMBL4
Vectores de inserción:
Vectores de sustitución
El fago lambda como vector de clonación
Extracto 2: cabezas vacías
Extracto 1: partes del fago sin cabeza
+
+
ADN
FAGO
Encapsidación
Screening de genoteca en fago λ
CICLO LISOGÉNICO
Sólo se expresa la proteína del gen cI: represor de los genes del ciclo lítico
INTEGRASAHOST INTEG. F.
TECNOLOGÍA GATEWAY
INTEGRASAHOST INTEG. F.EXCISIONASA Xis
TECNOLOGÍA GATEWAY
Emplea el sistema de recombinación del fago λ para “mover” fragmentos entre vectores que contienen los sitios para la maquinaria recombinante de λ
Reacción BP: producto de PCR con sitios flanqueantes + vector donante + clonasa BP => entry vector (este paso puede ser reemplazado por otro método de clonado)
Reacción LR: entry Vector + destination Vector + LR clonasa => expression vector
VENTAJAS DESVENTAJAS
Eficiente ¿Precio?Diseño simple de primers Secuencias attNo ligasa ¿molestan? No enzimas de restricciónNo purificación por gelOrientación No fosfatasa
Cósmidos
* Pequeñas moléculas de ADN circular (5-7 Kbp)
* Secuencia ori
* Marcadores de selección
* Secuencia COS: permite el empaquetamiento como
bacteriófago para la infección en E. coli pero se mantiene
en la célula como un plásmido.
*Permite clonar fragmentos de hasta 45 Kb.
*Apropiados como vectores en fases iniciales de
proyectos de secuenciación
BACs: CROMOSOMAS BACTERIANOS ARTIFICIALES
Basado en el plásmido F (fertilidad).
Contiene oriS, repE (helicasa) y genes de partición: parA, parB y parC
Inserto: 150-350 kb. Puede llegar a 700 kb.
1-2 copias por célula
VECTORES DE CLONADO USADOS COMUNMENTE
Plásmido Características Fuente comercial
pUC18, pUC19 Pequeño (2,7 kb) NEB Alto nº de copias MCS, R a ampi Selección blanco/azul
pBluescript idem pUC Stratagene ori SS promotores T7 y SP6 flanq. MCS
pACYC Bajo nº de copias (15) NEB ori p15A
Supercos Cósmido Stratagene 2 sitios cos Inserto 30-42 kb R a ampi promotores T3 y T7 flanq. MCS
VECTORES DE CLONADO USADOS COMUNMENTE
Plásmido Características Fuente comercial
EMBL3 vector λ de reemplazo Promega MCS: SalI, BamHI y EcoRI
λ ZAP vector λ Stratagene Excisión in vivo en pBluescript Inserto hasta 10 kb Selección azul/blanco
pBeloBAC11 vector BAC NEB Inserto hasta 1 Mb Promotores T7 y SP6 flanq. MCS Sitios cos Sitio LoxP
Escherichia coli
Aislada por el pediatra y bacteriólogo Theodor Escherich en 1885
NOMENCLATURA DEL GENOTIPO
Propuesta por Demerec et al., 1966
GENES: 3 letras en minúscula itálica. Sugiere en gral la función:
trp síntesis de triptofano.
Si la misma función es afectada por varios genes, se agregan letras itálicas en mayúscula:
recA, recB, recC y recD recombinación
Por convención, en el genotipo de E. coli sólo se mencionan los genes defectuosos
A veces se usan los superíndices + o – para aclarar o para enfatizar el locus WT
Fenotipos: 3 letras, empieza en mayúscula, seguidas por superíndice + o –, a veces r (resistente) o s (sensible).
En ciertas ocasiones se incluye el fenotipo en el genotipo
rpsL (Strr): mutación en el gen de la ribosomal protein small subunit 12 que da resistencia a streptomycin
MUTACIONES ESPECÍFICAS
Alelo: número del alelo en itálica: hsdR17
Si no se conoce el locus exacto se reemplaza la letra por un guión : arg-3
Mutación:
ámbar: am depués del gen
Sensible a la temperatura (gen inactivo a alta temperatura): ts Constitutiva: superíndice q. lacIq
Deleción: Δ. Δ(lac-pro)
Inserción: “::” trpC22::Tn10.
La posición de la inserción se puede dar con 3 letras, la 1ª siempre es z, la 2ª 10 min, la 3ª 1 min (letras a - i): zhg::Tn10 inserción de Tn10 a 87 min.
Fusión: Φ seguido por los genes fusionados en paréntesis. “ ´ ” gen fusionado incompleto (antes del gen: deleción en 5´, después del gen: deleción en 3´) Superíndice +: la fusión involucra a un operón.
Φ (ompC´-lacZ+): fusión entre ompC (delecionado en 3´) y el operón lac.
F+ cepa de coli que lleva el episoma F o factor de fertilidad (plásmido de 1 copia).F´ : plásmido F con genes adicionales. Al final del genotipo con los genes del plásmido entre corchetes.
Plásmidos que se transmiten a células F-El factor F se necesita para infección con vectores basados en fagos filamentosos.
Si no está indicado se asume que la cepa es F-.
Cepas Hfr (high frequency chromosome donation): el factor F está integrado en el cromosoma bacteriano y puede causar transferencia de cromosoma.
Mutaciones sin sentido: codones de terminación
AMBAR: UAG
OCRE: UAA
OPALO: UGA
Vectores con mutaciones sin sentido en genes esenciales para prevenir la diseminación en bacterias.
Esos vectores sólo pueden propagarse en cepas de E. coli que contengan el supresor adecuado.
Supresor ambar
Hay varios sistemas de restricción y modificación que deben ser eliminados de las cepas de E.coli K12 para que puedan ser usadas para clonar
SISTEMAS DE RESTRICCIÓN Y MODIFICACIÓN
Para reconocer y destruir ADN “extranjero”
Muchas cepas de E. coli de laboratorio son deficientes en 1 o más de los sistemas de restricción-modificación .
METILACIÓN Dam y Dcm
E. coli K-12 metilasas: Dam, Dcm y EcoK
Dam: DNA adenina metilasa, gen dam, metila GATC
Dcm: DNA citosina metilasa, gen dcm, metila CC(A/T)GG
La mayoría de las cepas que se usan para clonar son Dam+ Dcm+. Las cepas recA- son siempre dam+
Pag. 206
Cepas Dam- Dcm- son mutagénicas
(sistema de reparación mismatch)
SISTEMA EcoK
EcoK metilasa: AACN6GTGC y GCACN6GTT
EcoK endonucleasa: AACN6GTGC y GCACN6GTT NO metilado
Locus hsdRMS: hsdR…endonucleasa hsdM…metilasa hsdS…subunidad de reconocimiento del sitio
En gral. se usan cepas hsdR- (rk-mk
+) o hsdS- (rk-mk
-)
Pag. 206
RESTRICCIÓN McrA, McrBC y Mrr
McrA y McrBC: corta en metil C
Mrr: corta en metil A
Cuando se clona ADN muy metilado mejor usar cepas mutantes.
Deleción simple: Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr) “immigration control locus”
Pag. 206
RECOMBINACIÓN
Problema cuando se clona ADN con secuencias repetidas. Sensibilidad a agentes que dañan al ADNCepas Rec- Problemas en reparar roturas en las 2 hebras Taza de crecimiento
Dependiendo de la aplicación es preferible usar cepas Rec+
Cepas recA- tienen bloqueada la recombinación casi completamente.
Genotype Description Benefit
endA
Knock-out mutation in non-specific endonuclease (Endonuclease I). Eliminates non-specific endonuclease activity.
Improved plasmid yield/quality
hsdRMutations in hsdR prevents restriction of unmethylated EcoKI sites
Efficient transformation of DNA generated from PCR reactions
dam/dcm
Mutations in dam/dam abolish adenine and cytosine methylation at specific recognition sequences.
Propagation of DNA for cleavage with methylation-sensitive restriction enzymes e.g. Ava II, Bcl I
mcrA, mcrBC,or mrr
Mutations in these genes prevents methylated DNA from other organisms from being recognized as foreign
Allows cloning of genomic DNA or methylated cDNA
MANTENIMIENTO DE LA INTEGRIDAD DEL PLÁSMIDO TRANSFORMADO
recA Mutation in recA reduces DNA recombinationIncreased plasmid DNA stability
recBCD
recBCD encodes exonuclease V. Mutation in RecB or RecC reduces DNA recombination by a factor of 100.
Increased plasmid DNA stability
recJ/sbcC
Also involved in DNA recombination. Inactivation increases plasmid DNA stability
Increased plasmid DNA stability
uvcR/umuC
Involved in the UV and SOS DNA repair systems respectively. The inactivation of these genes increases the stability of plasmids carrying inverted repeats
Increased plasmid DNA stability
MANTENIMIENTO DE LA INTEGRIDAD DEL PLÁSMIDO TRANSFORMADO
Genotype Description Benefit
lacZ-delta-M15
Deletion of the N-terminal alpha-fragment from the LacZ gene, making β-galactosidase function dependent on expresion for the lacZ-α fragment from another source (e.g. a plasmid)
Used for blue/white screening of recombinant plasmids carrying the lacZ-α fragment
lacI
The lac repressor. Inhibits expression from the Lac promoter in the absence of lactose/IPTG
A functional lacI is required for blue/white screening
IDENTIFICACIÓN DE CLONES POSITIVOS
Genotype Description Benefit
deoRDeletion of a regulatory gene, allowing constitutive expression of deoxyribose synthesis gene
Increases the transformation efficiency for large plasmids
hee
Stands for “high electroporation efficiency”. Increases survival rate of cells during electroporation, leading to higher transformation efficiency.
High transformation efficiency
hteStands for “high transformation efficiency”.
High transformation efficiency.
AUMENTO DE LA EFICIENCIA DE TRANSFORMACIÓN
Application Strain
Routine Cloning/Sub-cloning, Blue/white screeningXLI-Blue, DH5-alpha, top10
Very high efficiency cloning e.g. for library construction
XL10-Gold, MegaX DH10b
Cloning of unmethylated DNA XL1-Blue MR
Production of unmethylated DNA JM110, INV110
Cloning of unstable plasmids Sure, Stbl4
Expression from T7 promoter BL21 (DE3)
Expression from T7 promoter, tight regulation BL21 (DE3) pLysS
Expression from T7 promoter with codon bias correction
BL21 codon plus, Rosetta
Improved disulphide bond formation Origami
Fast cloning (due to quick cell growth) Mach1
ALGUNAS CEPAS MUY USADAS
