Biotecnologa: Conjunto de tcnicas que utilizan las potencialidades de los organismos vivos o de compuestos procedentes de ellos (enzimas, hormonas, antibiticos .), para la obtencin de productos, bienes y servicios

Biotecnologa moderna: en los ltimos 30 aos, avances en microbiologa, inmunologa e ingeniera gentica, con manipulacin selectiva y programada de material gentico Biotecnologa contemporneaClonacin, nanotecnologa, biomateriales, reprogramacinBiotecnologa tradicional: procesos de fermentacin de bacterias y levaduras desde hace miles de aos

Ingeniera Gentica: conjunto de tcnicas (Tecnologa del ADN recombinante) que permiten la manipulacin y transferencia de genes de un organismo a otro ( organismos genticamente modificados). ADN recombinante: ADN formado de organismos diferentes.Nanotecnologa: tcnicas a escala nanomtrica, con la posibilidad de fabricar materiales permitiendo manipular tomos y molculas (Richard Feynman)*

*

Se descubri posteriormente que esta prctica se vena haciendo en la naturaleza de forma espontnea desde hace millones de aos en los vegetales a travs de la bacteria llamada Agrobacterium tumefaciens. Organismo transgnico: es aqul que ha sufrido la alteracin de su material hereditario (genoma) por la introduccin artificial (manipulacin gentica) de un gen exgeno, esto es, proveniente de otro organismo completamente diferente. Aparentemente no existen barreras para mezclar los genes (DNA) de dos especies diferentes. Existen bioherramientas moleculares para componer y descomponer al DNA, intercambiando as fragmentos especficos de ADN de distintas especies e incluso transferirlos a bacterias. Las bacterias producen hoy en da, protenas humanas por ingeniera gentica como el interfern, la insulina y la hormona del crecimiento, de gran importancia en la medicina.

Agrobacterium tumefaciens: Gram- que infecta plantas a travs de heridas induciendo tumores. Contiene un plsmido Ti que se integra al genoma celular (activndose por sustancias de la herida) y provoca tumores y expresin de aminocidos especiales *

Microorganismos transgnicosProduccin de alimentos Eliminacin de basurasObtencin de materias primas para la industriaDescontaminar lo que las industrias han contaminado Animales de granja (cerdos, ovejas, borregos) "biorreactores de protenas teraputicas humanas en su leche (antitripsina, factor VIII de coagulacin)Plantas transgnicas "nueva revolucin verdeResistentes a sequas, a herbicidas o a plagas de insectos, Maduracin tarda o con caractersticas para mantener el color y sabor despus de congelacinEjemplos : algodn, la soja, la papa, el tomate y al maz

El maz porta un gen de la bacteria Bacillus thunngiensis para sintetizar una toxina que causa la muerte de insectos dainos, con esta estrategia se pretende disminuir el uso de insecticidas y obtener mejores rendimientos en las cosechas, sin embargo, se ha descrito que el polen de este maz transgnico es txico para las larvas de la mariposa monarca.Antitripsina : protena que se usa en el tratamiento de un tipo de enfisema por carencia hereditaria de dicha protena*

La Ingeniera Gentica Conjunto de tcnicas, nacidas de la Biologa molecular, que permiten manipular el genoma de un ser vivo, introduciendo genes en un organismo que carece de ellosEnzimas de restriccinCapaces de cortar el ADN por puntos concretosADN RecombinanteSegmento de ADN extrao intercalado en un ADN receptorSe realiza porSe obtieneTcnicas biotecnolgicasRecombinacin de ADNSecuenciacin del ADNReaccin en cadena de la polimerasaAplicaciones diversas

Incluye

las aplicaciones de la ingeniera gentica: Son numerosas las aplicaciones prcticas y comerciales de la ingeniera gentica.

Se abre un campo que nos ofrece adems la posibilidad de utilizar plantas y animales transgnicos as como microorganismos modificados genticamente para producir frmacos u otros productos de utilidad para el hombre, entre los que se pueden citar: la insulina humana, la hormona del crecimiento, interferones, la obtencin de nuevas vacunas o la clonacin de animales. Una puerta abierta que no nos debe hacer olvidar el impacto perjudicial que un uso inadecuado podra provocar en el ser humano y en el propio planeta. *

Entre los aos 70 y 80 se desarrollaron herramientas de la biologa molecular y la ingeniera gentica, lo que se conoce como tcnicas del ADN recombinante La tcnica se fundamenta en:Doble cadena del ADNComplementareidad de basesSiempre que se encuentren secuencias complementarias se unenOrden de las bases determina informacin de protenasCdigo de transcripcin universal

La tecnologa del ADN recombinante incluye diferentes tcnicas de las que destacan:

La rotura especfica del ADN mediante endonucleasas de restriccin, que facilita el aislamiento y la manipulacin de los genes individuales. La secuenciacin rpida de todos los nucletidos de un fragmento purificado de ADN, que posibilita determinar los lmites de un gen y la secuencia de aminocidos que codifica.La hibridacin de los cidos nuclicos que hace posible localizar secuencias

determinadas de ADN o ARN, utilizando la capacidad que tienen estas molculas de unirse a secuencias complementarias de otros cidos nuclicos. La clonacin del ADN, mediante la cual se puede conseguir que un fragmento de ADN se integre en un elemento gnico autorreplicante (plsmido o virus) que habita en una bacteria, de tal manera que una molcula simple de ADN puede ser producida generando muchos miles de millones de copias idnticas. La ingeniera gentica mediante la cual se pueden alterar secuencias de ADN

produciendo versiones modificadas de los genes, los cuales se pueden insertar a clulas u organismos.

Endonucleasas de Restriccin: Enzimas que pueden cortar elADN y lo hacen en secuencias concretasEnzimas que las bacterias usan para destruir ADN que ingresa a ellas, por ejemplo ADN de virus bacterifagos

Se conocen mas de 1200 enzimas de restriccinEco RI (E. coli) reconoce secuencias GAATTC y corta entre G y A

1 ADN plsmido2 ADN extrao3 Corte del plsmido y ADN extrao con Eco RI (endonucleasa de restriccin)4 Formacin de extremos cohesivos5 Formacin de ADN recombinantes6 Accin de ADN ligasa que sella los extremos

La clonacin de un gen consiste en introducirlo en una clula de modo que se copie y se mantenga

El gen se inserta en un ADN llamado vector de clonacin (plsmidos), capaz de entrar y replicarse de forma independiente en una clula husped

Resultado: ADN recombinante. Permite obtener grandes cantidades del gen insertado en la clula hospedadora adecuada apropiada

Las genotecas de ADN permiten guardar indefinidamente el ADN de un organismo

Un plsmido recombinante en una bacteria se replica con ella pudiendo obtenerse y aislarse millones de copias de dicho plsmido

1. Obtencin de plsmido recombinante2. Transformacin de bacterias3. Seleccin de bacterias transformadas4. Crecimiento de bacterias transformadas5. Aislamiento de los plsmidos recombinantesProceso de clonacin de un gen en bacterias

Ejercicios:http://personales.ya.com/geopal/biologia_2b/unidades/ejercicios/act8abiointema6.htmPrcticas de ejercicios similares en la pgina indicada

La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), es una tcnica que permite amplificar entre cientos de miles y millones de veces, en el transcurrir de pocas horas e in vitro, pequeas cantidades de ADN.

Es un mtodo alternativo a la clonacin muy rpido y eficaz

Por su alta sensibilidad, esta tcnica permite identificar un gen a partir de un solo cabello, una clula somtica o un espermatozoide.

Ha facilitado, y en muchos casos hecho posible, la tarea de identificacin de personas, por ejemplo de hijos de desaparecidos, mediante el anlisis de muestras del nio y de su abuela materna

Aplicaciones mdicas de la PCR en nuevas estrategias de diagnstico: Detectar agentes infecciosos como los virus de las hepatitis B y C Regiones del genoma del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) Diagnosticar la presencia o ausencia de HIV en recin nacidos de madres seropositivas. Diagnstico de hemofilias A y B, la distrofia muscular y la fibrosis qustica, o reconocer mutaciones de genes vinculadas con enfermedades oncolg icas

El mtodo se basa, en la realizacin de tres reacciones sucesivas llevadas a cabo a distintas temperaturas. Estas reacciones se repiten cclicamente entre veinte y cuarenta veces Primer paso: La muestra se calienta hasta lograr la separacin de las dos cadenas que constituyen el ADN, "desnaturalizacin".Segundo paso: la temperatura se reduce para permitir el "apareamiento" de cada una de dos cadenas cortas de oligonucletidos (inicidores o primers) con cada una de las hebras separadas del ADN molde. Los primers son sintetizados en el laboratorio y diseados de manera tal que permiten definir los lmites del tramo de ADN que se desea replicarTercer paso: la ADN polimerasa produce la extensin de los primers, en el espacio comprendido entre ambos, sintetizando las secuencias complementarias de las hebras del ADN molde (la T la condiciona la polimerasa

ADN polimerasa de E. coli se desactiva a la alta temperatura de la desnaturalizacin del ADN, por lo cual deba agregarse enzima fresca al comenzar el tercer paso de cada ciclo. Este inconveniente fue solucionado de manera ingeniosa cuando se la reemplaz por su equivalente de la bacteria "termfila" Thermus aquaticushttp://www.youtube.com/watch?v=N6kBo_pTOA8

APLICACIN: amplificar ADNFragmentos de ADN antiguos (momias, fsiles..)ADN de la escena de un crimenADN de clulas embrionarias para diagnstico prenatalADN de genes virales

Mtodos y tcnicas para determinar el orden de los nucletidos de un determinado fragmento de ADNUtilidad importante en biologa bsica y aplicada (forense)Precisa gran cantidad del fragmento a determinar (clonacin)

Mtodo Sanger o didesoxi:Fragmento de ADN (cantidad)Cebador en el extremo 3 (20 bases)ADN polimerasaDesoxiribonucletidos (A,T,C,G)Didesoxiribonucletidos marcados radiactivamente (paran la sntesis)

Cuatro tubos diferentes con:Polimerasa dATP, dCTP, dTTP y dGTPUn solo didesoxi marcado (ddATP)Se forman fragmentos de distinto tamao terminados en A

El cebador suele ser complementario del vector del fragmento desconocido, que suele ser una regin cerna a la insercin del fragmento y de secuencia conocida*

Los fragmentos de ADN obtenidos se separan por tamaos con electroforesisCada una de las cuatro muestras se insertan en un carril diferente del gelTerminada la electroforesis se ponen en contacto con una pelcula fotogrfica

Geles de acrilamida muy finos y largos que diferencian secuencias de un nucletido*

Marcaje de ddNTP con fluorescentes distintos puediendose leer al mismo tiempo losADNs de las cuatro mezclasComparativa de los dos mtodos

http://www.ucm.es/info/genetica/AVG/practicas/secuencia/Secuencia.htm*

El plsmido Ti o T-ADN de Agrobacterium contiene genes (onc) que provocan una mayor produccin de hormonas de crecimiento con la formacin del tumor o agalla.Se eliminan de Ti los genes onc y se sustituyen por otros genes que interese clonar, se habr obtenido un sistema eficaz para introducir ADN interesante a la planta, evitando la aparicin de la enfermedadTradicionalmente se han mejorado los cultivos por seleccin de ejemplaresActualmente se mejoran caractersticas con tcnicas de ADN recombinante: -Plantas transgnicas-

Actualmente se consiguen mejorar diferentes caractersticas con tcnicas de ADN recombinante -Plantas transgnicas-FASES:1. Transferencia de genes2. Regeneracin de plantas completasResistencia a herbicidas (mejora vegetal)Resistencia al glifosfato herbicida no selectivo, con gen de E. coli resistente, clonado e incorporadoResistencia a plagas, con toxina de Bacillus turingiensisResistencia a virus, con protenas de la cpsida de dicho virus

Plantas farmaceticas (biofarmacetica)Produccin de protenas humanas, vacunas, anticuerpos, mas econmicas y contienen mecanismos de modificacin postraduccional de las protenas, a diferencia de las bacterias

Mejora del producto (alimentos)Arroz transgnico arroz dorado- con caroteno (vit A)

Medio Ambiente:Utilizacin de organismos genticamente modificados para eliminar contaminantes

Biorremedacin: bacterias modificadas para degradar hidrocarburos

Bioadsorcin: Bacterias modificadas que adsorben en su superficie metales pesados

Fitorremedacin: Plantas transgnicas que transforman contaminantes peligrosos en sustancias inocuaschopos modificados para acumular metales, actualmente en condiciones controladas en invernaderoLa fitoestabilizacin :plantas que inmovilizan los metales en el suelo por absorcin o adsorcin en las races. Los contaminantes permanecen retenidos bajo la superficie del sueloLa fitoextraccin : plantas tolerantes capaces de absorber los metales desde el suelo y acumularlos en su biomasa area. Posteriormente, esta biomasa es cosechada, incinerada y tratada como residuo peligroso

Insercin de genes en vulos o clulas madre embrionarias:

Quimeras transgnicas slo sobre algunas clulas del embrinOrganismos transgnicos todas las clulas modificadasClulas modificadas Clulas no modificadas Transmisin a la descendencia, rganos y tejidos para trasplantes1.Secuencia hibrida de gen de inters y secuencia promotora de una protena de la leche2. Introducir el transgn en vulo fecundado 3.Implantacin en la hembra que lo expresar junto con la lecheEjs.: 1-antitripsina, factor VIII,

APLICACIONESObtencin de productos farmacuticosMedicina forenseDiagnstico de enfermedadesTerapia gnicaInsulinaInterfernH. De crecimientoFactor VIIIMarcadores genticosHuella genticaDeteccin en personas o fetos enfermedades hereditarias por tcnicas de ADN recombinanteInsercin de genes funcionales para corregir un defecto genticoEn clulas somticas En clulas germinales

Marcadores: pequeas diferencias en zonas concretas del ADN de diferentes individuos que sirven para su identificacinUno de los mas utilizados so repeticiones cortas en tndem que en cada individuo vara el n de repeticiones*

La forma activa de la insulina consta de dos polipptidos (A y B), que estn codificados por partes separadas de un mismo gen. Estos se pueden obtener en cultivos bacterianos separados.Produccin de insulina humana

*INSULINA: Una de las primeras aplicaciones prcticas de la ingeniera gentica fue la utilizacin de bacterias de crecimiento fcil para producir protenas, como por ejemplo la insulina, vital para la regulacin del metabolismo de los glcidos en el organismo. La diabetes, una enfermedad que se caracteriza por la disfuncin en la produccin de insulina, afecta a millones de personas. El tratamiento de esta enfermedad se realizaba utilizando insulina comercializada, procedente del pncreas de terneros o de cerdos, que no es tan efectiva como la humana. Adems, el proceso de aislamiento es caro y complejo. Actualmente se produce insulina humana utilizando microorganismos:La forma activa de la insulina consta de dos polipptidos (A y B), codificados por partes separadas de un mismo gen (conectados por puentes disulfuro), y que codifica la preproinsulina, un polipptido ms largo que contiene una secuencia seal, los polipptidos A y B de la molcula de insulina activa, y un polipptido de unin que est ausente en la insulina madura. La produccin de insulina humana en bacterias se realiza siguiendo dos caminos: 1. Produccin de proinsulina y conversin en insulina por mtodos qumicos. 2. Produccin de las cadenas A y B, en dos cultivos bacterianos separados, y unin de ambas cadenas por procedimientos qumicos. Debido a que la molcula de insulina es bastante pequea, en cualquiera de los dos casos resulta ms conveniente sintetizar qumicamente la secuencia adecuada de ADN que intentar aislar el gen de la insulina a partir de tejido humano.

1: ADN sinttico que codifica para la cadena A de la insulina humana, se inserta en un plsmido bacteriano. Se fabrica tambin ADN para la cadena B, y se inserta en otro plsmido. En ambos casos al lado del gen bacteriano para la -galactosidasa. 2: Los plsmidos se han introducido (por separado) en clulas de Escherichia coli. Al expresarse, dan lugar a una protena de fusin, -galactosidasa unida a insulina (A o B) mediante un residuo de metionina. 3: Ambas protenas de fusin se extraen y se purifican por separado, tratndose con BrCN, que destruye la metionina, quedando libres las cadenas de insulina. 4: Se juntan las cadenas A y B, y mediante procedimientos qumicos (oxidacin) se establecen entre ellas puentes disulfuro, obtenindose insulina en su forma final.*

Ingeniera Gentica: conjunto de tcnicas (Tecnologa del ADN recombinante) que permiten la manipulacin y transferencia de genes de un organismo a otro ( organismos genticamente modificados). ADN recombinante: ADN formado de organismos diferentes.Nanotecnologa: tcnicas a escala nanomtrica, con la posibilidad de fabricar materiales permitiendo manipular tomos y molculas (Richard Feynman)*

*Agrobacterium tumefaciens: Gram- que infecta plantas a travs de heridas induciendo tumores. Contiene un plsmido Ti que se integra al genoma celular (activndose por sustancias de la herida) y provoca tumores y expresin de aminocidos especiales *El maz porta un gen de la bacteria Bacillus thunngiensis para sintetizar una toxina que causa la muerte de insectos dainos, con esta estrategia se pretende disminuir el uso de insecticidas y obtener mejores rendimientos en las cosechas, sin embargo, se ha descrito que el polen de este maz transgnico es txico para las larvas de la mariposa monarca.Antitripsina : protena que se usa en el tratamiento de un tipo de enfisema por carencia hereditaria de dicha protena*las aplicaciones de la ingeniera gentica: Son numerosas las aplicaciones prcticas y comerciales de la ingeniera gentica.

Se abre un campo que nos ofrece adems la posibilidad de utilizar plantas y animales transgnicos as como microorganismos modificados genticamente para producir frmacos u otros productos de utilidad para el hombre, entre los que se pueden citar: la insulina humana, la hormona del crecimiento, interferones, la obtencin de nuevas vacunas o la clonacin de animales. Una puerta abierta que no nos debe hacer olvidar el impacto perjudicial que un uso inadecuado podra provocar en el ser humano y en el propio planeta. *El cebador suele ser complementario del vector del fragmento desconocido, que suele ser una regin cerna a la insercin del fragmento y de secuencia conocida*Geles de acrilamida muy finos y largos que diferencian secuencias de un nucletido*http://www.ucm.es/info/genetica/AVG/practicas/secuencia/Secuencia.htm*Marcadores: pequeas diferencias en zonas concretas del ADN de diferentes individuos que sirven para su identificacinUno de los mas utilizados so repeticiones cortas en tndem que en cada individuo vara el n de repeticiones**INSULINA: Una de las primeras aplicaciones prcticas de la ingeniera gentica fue la utilizacin de bacterias de crecimiento fcil para producir protenas, como por ejemplo la insulina, vital para la regulacin del metabolismo de los glcidos en el organismo. La diabetes, una enfermedad que se caracteriza por la disfuncin en la produccin de insulina, afecta a millones de personas. El tratamiento de esta enfermedad se realizaba utilizando insulina comercializada, procedente del pncreas de terneros o de cerdos, que no es tan efectiva como la humana. Adems, el proceso de aislamiento es caro y complejo. Actualmente se produce insulina humana utilizando microorganismos:La forma activa de la insulina consta de dos polipptidos (A y B), codificados por partes separadas de un mismo gen (conectados por puentes disulfuro), y que codifica la preproinsulina, un polipptido ms largo que contiene una secuencia seal, los polipptidos A y B de la molcula de insulina activa, y un polipptido de unin que est ausente en la insulina madura. La produccin de insulina humana en bacterias se realiza siguiendo dos caminos: 1. Produccin de proinsulina y conversin en insulina por mtodos qumicos. 2. Produccin de las cadenas A y B, en dos cultivos bacterianos separados, y unin de ambas cadenas por procedimientos qumicos. Debido a que la molcula de insulina es bastante pequea, en cualquiera de los dos casos resulta ms conveniente sintetizar qumicamente la secuencia adecuada de ADN que intentar aislar el gen de la insulina a partir de tejido humano. 1: ADN sinttico que codifica para la cadena A de la insulina humana, se inserta en un plsmido bacteriano. Se fabrica tambin ADN para la cadena B, y se inserta en otro plsmido. En ambos casos al lado del gen bacteriano para la -galactosidasa. 2: Los plsmidos se han introducido (por separado) en clulas de Escherichia coli. Al expresarse, dan lugar a una protena de fusin, -galactosidasa unida a insulina (A o B) mediante un residuo de metionina. 3: Ambas protenas de fusin se extraen y se purifican por separado, tratndose con BrCN, que destruye la metionina, quedando libres las cadenas de insulina. 4: Se juntan las cadenas A y B, y mediante procedimientos qumicos (oxidacin) se establecen entre ellas puentes disulfuro, obtenindose insulina en su forma final.*