Ingeniería genéticade plantas

Lucero Denisse MoctezumaEstrella Roman Rdz.Ana L. García

IntroducciónLas palabras biotecnología o ingeniería

genética se están introduciendo a nuestra vida. La mayoría de los ciudadanos presentan interés de saber si estos conceptos representan confianza, peligro, debido a la falta de información.

Como consecuencia se abren múltiples posibilidades de desarrollar nuevas tecnologías de producción que pueden tener un gran impacto en la industria, en el medio ambiente, alimentos y en la salud del ciudadano.

Conceptos generales• El genoma de

una planta contiene alrededor de 25.000 genes

Ingeniería GenéticaTécnicas que permiten alterar las

características de un organismo mediante la modificación dirigida y controlada de su genoma, añadiendo, eliminando o modificando alguno de sus genes.

Planta transgénica Planta cuyo genoma ha sido modificado

mediante ingeniería genética, bien para introducir uno o varios genes nuevos o para modificar la función de un gen propio. Como consecuencia de esta modificación, la planta transgénica muestra una nueva característica.

Una vez realizada la inserción o modificación del gen, éste se comporta y se transmite a la descendencia como uno más de los genes de la planta.

Cómo se hace una Planta transgénica

Consta de dos etapas fundamentales: transformación y regeneración.

Transformación: proceso de inserción del gen que se pretende introducir (también llamado transgén) en el genoma de una célula de la planta a transformar. La regeneración consiste en la obtención de una planta completa a partir de esa célula vegetal transformada.

Por qué hacer plantas transgénicas

Las células vegetales tienen por fuera de la membrana plasmática una fuerte pared de celulosa, que supone un verdadero obstáculo físico para la entrada de genes. Para salvar este problema se pueden seguir dos estrategias, o bien liberar a la célula de esta barrera física, o bien diseñar sistemas que dirijan el DNA al interior de la célula incluso en presencia de la pared.

Estos últimos son los métodos denominados de biobalística,

Para la transformación se suelen utilizar “protoplastos”, que son células vegetales a las que se les ha eliminado la pared celular por medio de tratamiento enzimático con celulasa y pectinasa. Se suelen emplear células de hoja, que son fáciles de dispersar y regeneran muy bien la planta completa.

Los protoplastos al estar desprovistos de la pared

externa facilitan la penetración de moléculas de DNA y por tanto son células más fáciles de transformar.

TRATAMIENTO PREVIO A LA TRANSFORMACION

Otro sistema alternativo muy utilizado es la transformación de discos de hoja. Se recortan pequeños discos, de algunos milímetros de diametro, de una hoja. Las células de su borde pueden ser facilmente transfectadas por el plásmido.

En cualquier caso, bien se trabaje con células en cultivo o con protoplastos, para modificar genéticamente una planta se requiere introducir genes exógenos en el interior del núcleo de una célula vegetal y para ello hay que recurrir a vectores que transporten el gen o los genes, o bien utilizar técnicas que permitan la introducción directa del transgen.

•Basados en Plásmidos y Virus•Basados en métodos físicos y químicos

Es necesario diseñar la construcción de DNA adecuada que contenga el gen o genes de interés, pero también algunos elementos necesarios para asegurar su correcta expresión.

Estos son las regiones reguladoras y el promotor del gen que permitirán que el gen sea activo y que lo sea en el momento y en el lugar correcto, es decir, que la proteína o proteínas se sinteticen en las células del tejido donde debe hacerlo.

Además, suele ser muy útil introducir en la construcción otros genes que llamaremos marcadores de selección, que también se suelen denominar reporteros, que permitiran confirmar que se ha producido la integración.

Transformación de Plantas por Agrobacterium tumefaciens

(Plásmido Ti )Agrobacterium tumefaciens es una bacteria Gram negativa

capaz de infectar plantas a través de heridas, se adhiere a la pared externa de una célula, desde aquí, es capaz de transferir fragmentos del plásmido Ti, que se encuentra normalmente en el

interior de estas bacterias, hasta el núcleo de la célula vegetal e inducir la formación de “tumores” en las plantas infectadas.

La célula vegetal que ha adquirido el plásmido se convierte en una célula tumoral, creciendo de manera independiente y no regulada, y se dedica a sintetizar unos aminoácidos especiales, las opinas, y otros compuestos única y exclusivamente para alimentar a la bacteria.

El plásmido Ti tiene un tamaño muy grande, es un DNA circular de unas 200Kb. Sin embargo, al interior de la célula vegetal solo penetra un fragmento de este plásmido, llamado T-DNA (DNA transferido), que tiene un tamaño de entre 12 y 24 Kb, dependiendo de la cepa bacteriana.

Esta región tiene una serie de características muy interesantes:

Una vez en el interior de la célula, el T-DNA no permanece como un plásmido independiente sino que se integra en uno de los cromosomas de la planta.

El T-DNA lleva una serie de genes, algunos de los cuales codifican para enzimas que intervienen en la síntesis de opinas.

El mecanismo de infección de Agrobacterium involucra la transferencia e integración de una región del plásmido Ti al genoma de la célula vegetal. Para que esta región sea transferida a la planta, los genes vir necesitan ser activados por "acetosyringone“ (compuesto fenolico que produce la planta cuando tiene una herida).

Otro vector específico es el plásmido Ri (inductor de raíz) de la bacteria Agrobacterium ryzogenes, cuya utilización sigue básicamente el mismo proceso que acabamos de comentar para el Ti.

Este plásmido cuando infecta una planta produce raicillas, o aparición de múltiples raíces por una proliferación desordenada de las células de la raíz.

Transformación por agrobacterium rizogenes y el

plasmido Ri

Transformacion de plantas por vectores viricos

Las ventajas de los virus radican en la eficiencia para la transferencia genica, la facilidad con la que pueden infectar celulas intactas, la rapidez con la que pueden extenderse a otras partes de la planta y el amplio espectro de plantas que pueden abarcar.

Tipos:Virus DNA: -virus del mosaico de la coliflor y los

geminivirus.Virus RNA: -virus del mosaico del bromo y del mosaico del

tabaco.

El virus del mosaico de la coliflorEste se considero inicialmente ideal por ser de pequeño

tamaño (8kb) y tener DNA de doble banda que puede ser manipulado mas facilmente in vitro. Es muy infeccioso, pero la organización de su genoma es compleja y compacta. Solo se han identificado dos genes como no-escenciales y estos son muy pequeños; ademas la capside es de pequeño tamaño y no admite DNA extra.

La replicacion tambien es compleja y requiere un paso atravez de RNA, lo cual puede introducir errores, puesto que la transciptasa inversa carece de actividad correctora. Un aspecto positivo es que el promotor del gen VI es muy eficiente y ha sido utilizado en la expesion de otros genes.

Geminivirus Son atractivos porque algunos miembros del grupo infectan

monocotiledoneas ademas de dicotiledoneas. La biologia molecular de estos virus no es muy conocida. Uno de los mas estudiados dentro de las limitaciones mencionadas es el virus estriado del maiz. Este virus se transmite a la planta solamente a traves de un saltamontes, produciendo unas estriaciones amarillentas en las hojas del maiz.

El genoma intacto no se ha podido introducir en la planta; consta de una sola hebra de DNA, carece de intermediarios, RNA, y origina un gran numero de copias en el nucleo de las celulas infectadas

El virus del mosaico del bromoEs un virus pequeño, que posee varias piezas

de RNA como genoma. Infecta numerosas monocotiledoneas, incluyendo cereales.

En plantas los virus de RNA son mucho mas frecuentes que los de DNA, además muchos de estos virus son filamentosos, por lo que el tamaño de la partícula del virus lo determina el tamaño del genoma, y por lo tanto, no existirá limitaciones de tamaño para insertos.

Virus del mosaico del tabacoVirus de RNA de hebra sencilla en una sola pieza. El gen bacteriano CAT (cloranfenicol acetil

transferasa) se coloca justamente antes del codon de iniciación en la proteína de la cápside. Se inoculan hojas de plantas de tabaco y se detecta actividad CAT, sin embargo, la infección no se extiende al resto de la planta.

Se sabe que la propagación del virus al resto de la planta depende, no solo de una proteína de la cápside intacta, sino también de la proteína de movimiento (PM) del virus.

METODOS QUIMICOS

Método de fosfato CalcicoBasado en la obtención de un precipitado

entre el CaCl2 y el DNA en una solución salina de fosfatos. En esta situación coprecipitan formando unos agregados que son endocitados/fagocitados por las células. Aparentemente el agregado con Ca protege al DNA de la degradación por la nucleasas celulares.

Desventaja: que se ve afectado por factores tales como el cambio de pH en la solución, etc.

Metodo de DEAE DextranoBasado en la obtención de complejos entre la

resina DEAE y el DNA. Los polímetros de DEAE dextrano o polybreno tienen una carga que les permite unirse a las muy negativamente cargadas moléculas de DNA. El DNA acomplejado se introduce en las células mediante choque osmótico mediante glicerol.

Desventaja: El uso de DEAE dextrano se limita a las transfecciones transistentes.

Método de lipofección Se basa en la formación de complejos entre lípidos

cationicos y DNA. El complejo tiene afinidad por la membrana y permite la entrada del DNA al citosol.

Existe un gran numero de lipidos que se emplea en lipofeccion aunque existe una extructura consenso de un lipido cationico sintetico, apatrir del cual se han diseñado muchas variantes (DOPE). Es esencial optimizar las condiciones específicas de transfección para obtener buenas eficiencias, que suelen ser en buenas condiciones de entre el 70 y el 90% de las células de la placa.

Desventaja: elevado precio de lipidos, no todos los lipidos funcionan con todos los tipos celulares

Electroporación• La membrana se hace permeable por este

metodo.• Consiste en aplicar descargas eléctricas de alto

voltaje a las células para producir poros nanométricos en sus membranas. El DNA entra en la célula a través de los poros, o al redistribuirse los componentes de la membrana con el cierre de estos.

• El método se lleva a cabo colocando la suspensión de las células y el DNA en una pequeña cubeta y aplicando descargas de 2.0 a 4.0 kv a 0ºC.

Ultrasonicación

Impulsos ultrasónicos de una intensidad acústica de 0.5 W/cm2 se

aplicaron a segmentos de hoja durante 30 minutos. El DNA lo introducen en su genoma y lo

transmiten a sus descendientes.

Las pistolas génicas Que puede introducir DNA directamente en

células epidérmicas usando unas partículas de tungsteno de 4 µn cubiertas de DNA del vector. Se han logrado transformar por este método células epidérmicas de cebolla con una eficiencia de hasta el 44 por 100 , aun no igualada por ningún otro método

Transferencia genética por bombardeo

Bombardeo de células embrionarias de 12 días. Con partículas de oro recubiertas de DNA expulsadas de un acelerador de partículas eléctrico.

Sistema de Microproyectiles Bombardeo de células con DNA, que lo

mantiene en solución. Un pistoletazo pone en movimiento una nube de microgotas aceleradas por una corriente de gas en un pequeño capilar según la ley de Bernoulli. Las microgotas conteniendo el DNA y microproyectiles salen despedidas a grandes velocidades produciendo diminutas incisiones en las células receptoras por donde el DNA puede penetrar.