ACTUALIZACIONES

El equilibrio T1/T2 Posibilidades de inmunomodulación para el tratamiento de las enfermedades infecciosas

Carlos A. Alvarez, Jorge A. Cortés, Elkin Peñaranda, Jorge Enrique Gómez • Santafé de Bogotá, Colombia

Propósito: revisar los datos básicos de la respuesta de las citoquinas durante las infecciones por tuberculosis, lepra, leishmaniasis y toxoplasmosis así como los estudios clínicos que utilizan citoquinas como terapia principal o coadyuvante

Fuentes de obtención de datos: bases de datos Medline (1966-1999) Selección de los estudios: se seleccionaron los estudios básicos que mostraban

datos relevantes sobre el papel de citoquinas para cada infección tanto en estudios in vitro, modelos animales o células humanas. Para los ensayos clínicos se analizaron todos los datos publicados encontrados en Medline.

Extracción y síntesis de datos: se hicieron resúmenes detallados y se discutieron y contrastaron los resultados de los trabajos básicos. Los ensayos clínicos se resumieron y clasificaron en nivel de evidencia l a IV y de recomendación clínica.

Resultados: se revisaron y sintetizaron datos de 84 artículos que describen las citoquinas expresadas durante cada uno de los procesos infecciosos escogidos para análisis. Se encontraron dos ensayos clínicos en tuberculosis, dos en lepra, tres en leishmaniasis visceral, dos en leishmaniasis mucocutánea y ningún ensayo en toxoplasmosis.

Conclusiones: las citoquinas que aparecen durante una infección corresponden a los productos de células linfocitarias de perfil T1 (IFN γ, TNF α, IL2 e IL12) oT2 (IL4, IL6, IL10 e IL13). En esta revisión se discutieron los datos existentes sobre el papel de cada grupo de citoquinas y las experiencias clínicas con cada una de ellas. No existen estudios clínicos conclusivos para el uso de citoquinas en terapéutica humana para las enfermedades infecciosas analizadas, sin embargo el conjunto de conocimientos indica que la inmunomodulación será en el futuro un pilar fundamental en el tratamiento de las enfermedades infecciosas. (Acta Med Colomb 1999;24:209-219)

Palabras claves: citoquinas, IFN γ, TNF α, IL12, IL2, inmunoterapia.

Introducción que trata sobre la aplicación de las citoquinas en terapéutica o del

porqué de este artículo La medicina ha tenido en los últimos 10 años una verda-

dera invasión de nuevas herramientas terapéuticas. En 1993 la "Revue du practicien" (París) lanzó una edición especial sobre el uso de las citoquinas en medicina (1). En la intro-ducción sobre el tema los editores escribieron: "Hacemos frente a un verdadero neologismo: las citoquinas... una armada que no cesa de crecer día a día y llena de siglas, números y letras griegas... todos estos neologismos des-alientan a muchos médicos y forman un nuevo lenguaje en rápida evolución. Debemos aprenderlo y comprenderlo pues

es el lenguaje que hablan las células entre sí". Las aplica-ciones actuales de la inmunomodulación abarcan numero-sos campos: tratamiento del cáncer y las infecciones, la cicatrización y las enfermedades autoinmunes. En el cam-po de la infectología las citoquinas representan un poten-cial importante que nos puede dar alternativas ante nuevas situaciones como el aumento en la población de in-munosuprimidos (por trasplantes, infección por VIH, pa-

Dres. Carlos Arturo Alvarez y Jorge Alberto Cortés: Residentes de Medicina Interna; Dr. Elkin Peñaranda Contreras: Residente de Dermatología; Jorge Enrique Gómez Marín: Profesor Asistente. Instituto de Salud del Trópico, Departamento de Medicina Interna, Facultad de Medicina, Universidad Nacional de Colombia. Santafé de Bogotá.

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cientes en quimioterapia) y el preocupante y cada vez más frecuente caso de la resistencia a los antibióticos. De otra parte las citoquinas han aportado una nueva esperanza frente a infecciones previamente consideradas intratables como la leishmaniasis mucocutánea refractaria a los antimoniales y las hepatitis Β y C. En nuestro medio tal vez la citoquina más conocida es el interferon alfa (IFN a) utilizado en el tratamiento de la hepatitis Β crónica, pero en los últimos años se ha visto la salida al mercado de nuevas citoquinas tales como el interferon gamma (IFN γ), el factor de crecimiento de colonias granulocítico-monocítico (GM-CSF) y próximamente la interleuquina 12 (IL 12). Nota: hemos escogido las siglas en inglés con el fin de facilitar el encontrar la correspondencia de cada una de ellas en la literatura científica internacional.

Metodología Este artículo propone hacer una actualización basada en

la experiencia de los autores (2-4) y sus intereses particulares con respecto a los últimos conocimientos obtenidos en la aplicación de las citoquinas para el tratamiento de las enfer-medades infecciosas. Hemos escogido realizar una revisión por enfermedades y presentar las bases de la respuesta inmunológica establecidas para cada una de ellas. No se debe perder de vista que las citoquinas son sólo una de tantas estrategias posibles de inmunomodulación y que existen otras más como la utilización de anticuerpos monoclonales anticitoquinas o antirreceptores de citoquinas y los fármacos inmunoestimulantes. Se hizo una búsqueda exhaustiva de datos de pruebas clínicas de citoquinas en bases de datos como Medline y Current Contents. Se utilizaron como fuen-tes de obtención las bases de datos Medline (1966-1999) utilizando la palabras claves en inglés: cytokines, therapeutic, tuberculosis, leprosy, leishmanioses y toxoplasmosis. Cuan-do se comenten los resultados de las evaluaciones clínicas de algunas citoquinas se anotarán los niveles de evidencia y de recomendación para la aplicación clínica (5).

El papel de las citoquinas en la respuesta inmune Las citoquinas son unas glicoproteínas de origen celular

diverso que producen fenómenos biológicos variados ac-tuando como señales entre las células del sistema inmune, la inflamación y la hematopoyesis. A diferencia de las hormonas, las citoquinas no pasan necesariamente por la corriente sanguínea, una citoquina puede incluso quedarse integrada a la membrana celular e influir la célula adyacen-te. Una sola citoquina puede tener múltiples actividades biológicas (pleiotropismo), y varias citoquinas pueden te-ner actividades que se superponen (redundancia) . Inversamente una sola célula puede tener receptores para múltiples citoquinas e interactuar con varias citoquinas. Por ejemplo, la producción de IgE es inducida tanto por la IL4 como por la IL13. De otra parte, el IFNγ estimula la producción de IgG2a pero suprime la producción de IgE. Una pregunta que queda por resolver es cómo una misma

citoquina puede dar lugar a respuestas biológicas contra-dictorias (estimulación-inhibición) (6).

A diferencia de las hormonas que son producidas por un solo tipo celular y actúan sobre una célula específica, las citoquinas son producidas por diferentes tipos de células y sus efectos influyen en el funcionamiento de diversas cla-ses de células, lo cual lleva a la formación de una verdadera red de interacciones (3). Por ejemplo el IFNγ es producido por los macrófagos y los linfocitos Τ activados y los macró-fagos a su vez pueden ser activados por IL1, IL2, IL4 y TNF. Los grupos de citoquinas implicadas en la respuesta inmunitaria son las interleuquinas (IL) 1 a la 18, los interferones (IFN) α, β, γ y τ y los factores de necrosis tumoral (TNF) α y β. Las citoquinas son importantes para el control de las infecciones pero llevan consigo efectos adversos tales como: la l infól is is , f enómenos de autoinmunidad e inflamación. Por esta razón, es importante tener una respuesta equilibrada: efectiva en la respuesta inmune sin ser nociva para el huésped.

Los dos brazos de la respuesta inmune y la respuesta inmune diferencial: un equilibrio de tipo ying-yang es necesario

Los huéspedes vertebrados utilizan varios mecanismos para protegerse contra las infecciones. Los anticuerpos bloquean los receptores, matan los parásitos por fijación del complemento, favorecen la fagocitosis y son interme-diarios en el mecanismo de citotoxicidad mediada por anticuerpos (ADCC) a través de la desgranulación de los mastocitos y los basófilos. Otro mecanismo de defensa es la activación de las células "asesinas naturales" (NK) y de los linfocitos Τ citotóxicos los cuales eliminan las células infectadas y activan a los neutrófilos y macrófagos que realizan la destrucción intracelular de los microorganismos que ellos han fagocitado. Esos dos tipos de respuesta co-rresponden el primero a inmunidad humoral y la segunda de tipo celular. En el caso de una infección determinada la una predomina sobre la otra (7).

Nuestro entendimiento del papel de los subgrupos de las células Τ y de las citoquinas en las enfermedades infecciosas ha pasado por varias etapas. La primera fue que los linfocitos Τ auxiliares (CD4+) pueden dividirse en dos grupos funcio-nales caracterizados por el perfil de citoquinas que producen: Th1 (IL 12, IFN γ, TNFα e IL2) que llevan a una respuesta de tipo celular y a una hipersensibilidad retardada (DTH) y Th2 (IL10, IL5, IL4 y recientemente IL6 e IL13) que ocasionan una respuesta de predominio humoral. Estos no son los únicos patrones de citoquinas posibles, un tercer grupo de citoquinas que produce ambos tipos de citoquinas es el llamado ThO y las células que producen grandes cantidades de factor transformante de crecimiento β (TGF-ß) han sido llamadas Th3. El segundo hecho revelado por los trabajos en el modelo murino fue que las dos vías son antagonistas y casi siempre si la una es protectora la otra es nociva. De manera más reciente el concepto de dos categorías de CD4+ de

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acuerdo al perfil de citoquinas que producen ha sido amplia-do a los CD8+ y a las células no-T (células asesinas naturales o NK, macrófagos y linfocitos B) y ahora se habla más bien de perfiles de citoquinas T1 y T2 (8, 9). El hecho de que las respuestas T1 y T2 sean opuestas (el resultado final es una respuesta celular en el caso de T1 y humoral en el caso de T2) y antagónicas (el predominio de una lleva a una dismi-nución en la producción de las citoquinas del otro tipo) ha conducido a asemejar este paradigma a un equilibrio de tipo Ying/Yang que simboliza muy bien los fenómenos que la caracterizan (Figura 1).

Aunque se dispone ahora de este nuevo concepto los estudios de citoquinas dentro de las infecciones han revela-do más problemas que soluciones, la mayor parte de ello debido a que un mismo agente infeccioso puede afectar órganos diferentes en cada uno de los cuales puede ocurrir un tipo diferente de respuesta inmune. De otro lado diferen-tes grupos de citoquinas pueden estar presentes en distintas etapas de la infección y la importancia de una u otra citoquina puede variar de una etapa a otra de la infección y de un huésped a otro. Sin embargo, existen ciertos principios generales que pueden ser aplicados: las citoquinas asocia-das a parásitos extracelulares multicelulares, como en el caso de las helmintiasis, son de tipo T2 y los intracelulares (como los protozoarios Leishmania, Toxoplasma y Trypanosoma) dan lugar a una producción de citoquinas T1 (9, 10). El resultado de este tipo puede verse de cerca en el tipo de respuesta que los parásitos helmintos provocan: eosinofilia, IgE elevada y en ciertos casos, mastocitosis.

Cada una de éstas es estimulada por las citoquinas caracte-rísticas de las células T2: IgE por IL4, eosinofilia por IL5 y la mastocitosis por IL3, IL4 e IL10. Al presente no se sabe si una respuesta T2 es benéfica para enfrentar las infeccio-nes por helmintos o si simplemente el predominio de ésta es un mecanismo del parásito para escapar a una inmunidad efectiva y si la respuesta T1 es universalmente necesaria para obtener una protección. Contra esta hipótesis existe evidencia por ejemplo en el modelo murino infectado por Heligmosomoides polygyrus que la supresión de una res-puesta T2 por un anticuerpo anti-IL4 bloquea la producción de una inmunidad protectora frente a una segunda infec-ción (10). De otra parte, estudios en el modelo murino de infección por Toxoplasma muestran que si no existe la regulación por citoquinas tipo T2 de una respuesta exagera-da tipo T1 (que sin embargo es protectora) los ratones presentan una respuesta inmune letal. De esta manera, las citoquinas de tipo T2 en esta infección, aunque no contro-lan el crecimiento parasitario, juegan un papel primordial evitando una sobreproducción de citoquinas que llevan a inmunopatología relacionada con la respuesta del huésped a la infección (11).

Una nota de precaución se debe hacer con respecto a los estudios en modelos animales pues es bien claro que las respuestas T1 o T2 en humanos son diferentes a las encon-tradas en estos modelos. Un ejemplo de ello es el papel del óxido nítrico inducido por las citoquinas T1 lo cual está bien establecido en los macrófagos del ratón; en cambio en los de los humanos se encuentra la activación de otras vías tales como la degradación de triptófano para el control de infecciones intracelulares (12). De otro lado se debe tener en cuenta que incluso en una misma infección se han encontrado diferencias de respuesta entre linfocitos de di-ferentes tejidos (13).

Tienen gran importancia los factores que determinan que se lleve a cabo una respuesta preferente hacia un tipo T1 y T2, tales como la vía de la infección, el tejido, la forma de presentación del antígeno, la célula presentadora del antígeno, el tipo de linfocito, las señales coestimulatorias y la dosis del antígeno que pueden influir en una u otra vía. Se ha encontrado que algunas enzimas proteolíticas como la papaína desencadenan respuestas del tipo T2 (13). Inclu-so dentro de una misma proteína antigénica se encuentran epitopes T1 o T2. De otra parte, las infecciones parasitarias provocan un gran problema inmunológico en el huésped. Los parásitos son antigénicamente complejos y tienen ci-clos de vida complicados que comprenden varios estadios y ocupan órganos diferentes. El resultado de todo esto es que la infección se vuelve en general crónica sin poder erra-dicarse totalmente (13).

Respuesta T1/T2 en la infección por Mycobacterium tuberculosis

El Mycobacterium tuberculosis, agente causal de la tu-berculosis, es un patógeno que se transmite por la vía aérea

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a través de gotitas de menos de 2μm. Al alcanzar el alvéolo el bacilo se enfrenta a los macrófagos. La adhesión a éstos se hace a través de los receptores para complemento CR1. CR2, CR4 y los receptores de manosa, así como a través de ligandos inespecíficos de proteínas y carbohidratos (14). Una vez adherida a la membrana, la micobacteria es fagocitada e incorporada en un fagolisosoma. La activación del macrófago permite la eliminación de las bacterias fagocitadas. Esta activación de los macrófagos es mediada por el IFNγ y otras citoquinas. El macrófago además puede actuar como una célula presentadora de antígenos o como efectora. La presentación de antígenos por parte del macró-fago se hace a los linfocitos Τ innovadores (CD4+) que determinan la respuesta frente a esta bacteria. Para una inmunidad efectiva y protectora se requiere que los linfocitos activados generen un patrón de citoquinas TI: IFNγ, IL-2 e IL-12 (14). Veamos lo que se conoce respecto al papel de estas citoquinas en la tuberculosis y algunas semejanzas con respecto a otros patógenos intracelulares.

Un estudio realizado sobre linfocitos aislados en san-gre periférica demostró que los pacientes con la enferme-dad tenían niveles séricos inferiores de IFNγ y una menor producción de RNAm de IFNγ e IL-2 comparado con lo encontrado en los linfocitos provenientes de donadores voluntarios sanos (15). Este estudio fue hecho en pacien-tes con evidencia de contacto con tuberculosis (PPD posi-tivo). De igual forma, los pacientes con tuberculosis tie-nen menores niveles de esta citoquina y de TNFα, cuando se examina la producción por los linfocitos alveolares (16). Estudios en modelos animales de bacterias intrace-lulares han mostrado un aumento en la susceptibilidad frente a micobacterias atípicas (M. avium) debido a meno-res producciones de IFNγ (17). Estudios en familias sus-ceptibles a infecciones por micobacterias atípicas tam-bién señalan a la disminución en la producción de IFNγ como una diferencia clave frente a individuos no afecta-dos (18). En el caso de estos individuos se demostró que una mutación en el receptor para IFNγ genera una limita-ción para expandir la respuesta mediada por esta citoquina (19). También se ha demostrado que el IFNγ bloquea la respuesta de IL4 producida por células que responden a estímulos alergénicos en pacientes atópicos y aumenta la proliferación de células del tipo T1 en pacientes PPD positivos. Un hecho llamativo es que los pacientes o individuos sanos con una respuesta protectora no tengan niveles aumentados de citoquinas correspondientes al gru-po T1 (20). Algo que puede explicar este hallazgo es que se ha encontrado que los pacientes con progresión de la enfermedad tienen un aumento en los niveles de IL4. La activación de la respuesta T2 y la supresión consecuente en la producción del IFNγ, tendría efectos negativos para el individuo infectado con TBC y favorecería la prolifera-ción del bacilo (21). De igual manera los estudios en ratones en los cuales se ha limitado la respuesta de IL4 e IL10 (por "knock out" de los genes correspondientes) son

capaces de desarrollar una respuesta normal al ser infecta-dos con cepas patógenas de M. tuberculosis (22).

La IL 12 es producida por los macrófagos al entrar en contacto con la micobacteria y tiene efectos positivos sobre la respuesta inmunológica frente a bacterias intracelulares como M. tuberculosis. Esta citoquina induce secreción de IFNγ y la activación de linfocitos NK (23). Estos linfocitos son capaces de eliminar macrófagos infectados con M. tuberculosis in vitro al ser estimulados por IL 12 o por IL2 (16) y su activación está determinada por los linfocitos CD4+ a través de mecanismos independientes a las proteí-nas del complejo mayor de histocompatibilidad (24, 25). La importancia de esta citoquina queda manifiesta en los estudios experimentales en ratones en los cuales se ha borrado el gen correspondiente. Estos ratones producen en menor cantidad citoquinas T1 y una menor proliferación de linfocitos, monocitos y neutrófilos al ser enfrentados a micobacterias (22). Estos defectos genéticos en humanos son infrecuentes, pero pacientes con deleciones importan-tes de este gen y proteínas no funcionales no son capaces de controlar infecciones por bacterias intracelulares usualmente no patógenas tales como M. bovis BCG o la Salmonella enteritidis (26). Entre las células que participan en la defen-sa inmune se ha identificado un subgrupo de linfocitos T, que se caracteriza por expresar en su membrana el receptor de células Τ γδ (27, 28). Estos linfocitos corresponden 5% de la población de linfocitos en sangre periférica pero tienen un papel muy activo en infecciones localizadas. Se ha demostrado que los antígenos de M. tuberculosis en conjunto con los linfocitos Τ ayudadores (CD4+), produc-tores de IL2 e IFNγ son capaces de estimular este grupo específico de células, mientras que la IL10 tiene un efecto totalmente opuesto, posiblemente al bloquear la produc-ción de las anteriores interleuquinas (17). Macrófagos in-fectados con M. tuberculosis vivos son capaces de inducir la activación de estas células, aunque no sucede lo mismo cuando se utilizan antígenos proteicos solubles (28), hecho que explica el escaso éxito alcanzado hasta ahora con la utilización de antígenos aislados de tuberculosis frente al logrado por la vacunación con una micobacteria viva (M. bovis BCG). Además estas células están relacionadas con la capacidad del sistema inmune de reconocer antígenos no proteicos, que son constituyentes importantes de la pared de la micobacteria (29).

En resumen, la micobacteria se adhiere al macrófago y es fagocitada. Dentro del fagolisosoma, algunos de sus antígenos inducen la liberación de citoquinas T1 especial-mente IL12. Esta citoquina permite la activación de los linfocitos T CD4+ productores de citoquinas T1 , con la subsecuente liberación de IL2 e IFNγ Al mismo tiempo se activan linfocitos Τ γδ y se bloquea la liberación de citoquinas T2 (IL4 , IL6, IL10). El concierto de citoquinas T1, linfocitos Τ γδ y linfocitos T CD4+ permiten la activa-ción del macrófago y de las células T con actividad citotóxica (CD8+ o linfocitos NK). La Figura 2 pretende mostrar una

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visión esquemática de estos procesos. La formación del granuloma y la eliminación definitiva de la bacteria intracelular ocurre por activación de la vía de producción de radicales oxigenados. En el proceso mueren algunos macrófagos infectados por citólisis o por apoptosis. Lo anterior sucede en los individuos normales y sanos. Pero, ¿qué determina el desarrollo de la enfermedad? La tuber-culosis sobreviene en aquellos individuos que por defectos de estas vías, en calidad o intensidad, no logran contener la infección (31). Esto sucede en los pacientes con ciertos defectos genéticos, pacientes con HIV+ u otras formas de inmunosupresión (corticoïdes, linfomas, desnutrición, etc.). Otros estudios sugieren además que la dosis del antígeno, es decir, el número de bacilos contaminantes puede deter-minar la respuesta (28). Si la carga es pequeña (menor a 10.000 unidades formadoras de colonias) la respuesta de citoquinas es T1 y protectora, mientras que cargas mayores inducen las respuestas T2 y el subsecuente desarrollo de la enfermedad. Esto podría explicar los hallazgos epidemio-lógicos con relación al contacto prolongado con otros pa-cientes bacilíferos (32). Finalmente, la virulencia de la micobacteria puede determinar el curso de la colonización inicial. Algunos antígenos de tuberculosis generan respues-tas protectoras T1 , mientras que otras las T2. Otros factores de virulencia son la capacidad para escapar de la vacuola fagocítica o la producción de sustancias que impiden la activación del macrófago. De esta manera encontramos que en la interacción entre el hospedero y las bacterias intrace-

lulares juega un papel muy importante la activación de T1, generando una respuesta protectora la cual se encuentra disminuida o anulada en los pacientes que desarrollan la enfermedad.

Existen pocos informes con respecto a la aplicación de las citoquinas en el tratamiento de la tuberculosis humana. El IFN γ ha sido utilizado como terapia coadyuvante en infecciones por micobacterias atípicas. En la infección por M. tuberculosis, el IFN γ más el G-CSF fueron utilizados en un caso de tuberculosis cerebral de un paciente inmuno-compromet ido quien l levaba 11 meses de terapia antituberculosa con seis drogas y esteroides a altas dosis sin ninguna mejoría (33). Luego de iniciar tratamiento con IFN γ a una dosis de 65 μg/m2 más G-CSF a 300 mg/día por via subcutánea se presentó una notable mejoría a las seis semanas y resolución completa de sus lesiones en el cerebro y la médula espinal luego de cinco meses de terapia con estas citoquinas. El nivel de evidencia clínica para este trabajo es de III y la naturaleza de la recomendación es de C para el caso de tuberculosis multirresistente y en inmuno-comprometidos. En Argentina (34) se llevó a cabo un ensayo de fase II con IFN α en cinco pacientes que presenta-ban tuberculosis multirresistente. Tres de los cinco pacien-tes tuvieron negativización de sus esputos para BK. Se necesitan nuevos ensayos con el fin de determinar mejor el papel de esta citoquina.

Respuestas T1/T2 en lepra La lepra es un ejemplo clásico de las enfermedades

debidas a gérmenes intracelulares con comportamiento es-pectral. La prueba intradérmica (lepromina) produce una respuesta positiva en pacientes con lepra tuberculoide y una respuesta negativa en pacientes con lepra lepromatosa (35). Lo anterior refleja un tipo de respuesta inmune media-da por células presente (polo tuberculoide) o ausente (polo lepromatoso). En el espectro de la enfermedad intervienen diversos factores pero se sabe que la inmunidad a través de la respuesta celular marca diferencias entre cada uno de los polos. En el polo tuberculoide hay una fuerte respuesta contra M. leprae la cual declina progresivamente hasta llegar a el otro polo (lepromatoso) en el que se puede hablar de un defecto en la respuesta celular contra esta micobacteria. Sin embargo, la verdadera inmunidad contra la lepra está dada en la mayoría de personas que se infectan y que nunca desarrollan la enfermedad. De otra parte el espectro de la enfermedad es inestable y por ello se encuentran estados interpolares dados por el desarrollo de reacciones in-munológicas que pueden variar tanto en el tipo de manifes-tación clínica como en la posición de la enfermedad en la clasificación (35).

El estudio serológico o tisular de las citoquinas en lepra muestra claras diferencias y se ha encontrado que entre cada polo de la enfermedad existe un patrón distintivo de expresión (36-38). Los pacientes con lepra lepromatosa muestran tanto serológica como tisularmente una produc-

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ción aumentada de citoquinas supresivas del tipo T2 como las IL4, IL5 e IL10 y una producción disminuida de las citoquinas "protectoras" del tipo T1 como IFN y e IL2 y existe además una disminución en la producción de citoquinas derivadas del macrófago (TNF α e IL1ß) (36, 37). Los pacientes con lepra tuberculoide muestran en el suero y los tejidos los niveles más altos de IFNγ (38, 39) citoquina cuya principal fuente son las respuestas de tipo T1 y que desempeña un papel central en la defensa contra bacterias intracelulares. Esto además se ha demostrado con la inyección intradérmica de IFN γ que produce una dismi-nución evidente de M. leprae viable a nivel tisular (37). En las respuestas TI además del IFNγ es importante la IL 12, sin embargo no se encuentran niveles serológicos de IL 12 que se correlacionen de manera constante con el polo tuberculoide de la enfermedad y se encuentran niveles séricos bajos lo que podría explicar el desarrollo de lepra en personas con "buena" inmunidad celular (38). El TNF α, se encuentra elevado de manera significativa en suero de pacientes con lepra tuberculoide en algunos estudios (39, 40) sin embargo este hallazgo es inconstante (41). La respuesta T2 causa depresión de la inmunidad mediada por células a través de la IL-10 que es inmunosupresora de la destrucción mediada por macrófagos de patógenos intracelulares, logrando inhibir la producción del IFNγ lo que se refleja por una correlación negativa entre estas dos citoquinas y con una correlación positiva entre la carga bacilar y los niveles de IL-10 cuando ésta se determinó en suero (42). En pacientes con lepra lepromatosa además se encuentran niveles séricos altos de IL1 b (42) lo que se puede correlacionar con el aumento de la respuesta del tipo humoral.

También existe correlación entre los perfiles de expre-sión de citoquinas T1/T2 y los estados reaccionales. En las de tipo I (de reversa) se encuentra en el suero elevado el IFNγ, lo que representa un estado inmune de hipersensibili-dad exagerada mediada por células que lleva a destrucción del bacilo con el concomitante daño tisular (43). En las reacciones tipo II se encuentran elevadas de IL-10 sérica lo que puede jugar un papel en la patogenia, pues se aumentarían las respuestas por células Β y la formación de anticuerpos potenciando la formación de complejos inmunes característicos de esta reacción (44). Además ocu-rre un aumento de TNF α y de IL 1 β en suero que es paralelo al aumento de la temperatura de la velocidad de sedimentación y que pueden ser causa de estas manifesta-ciones (39, 42).

Otra evidencia importante de la existencia de respuestas dicotómicas T1/T2 en lepra es que el tratamiento puede tener efecto sobre las citoquinas en pacientes con lepra y durante los estados reaccionales. Se ha encontrado una reducción gradual de citoquinas séricas con la terapia multidroga recomendada por la OMS, llegando incluso a niveles comparables a los de las personas sanas al año de tratamiento tanto en pacientes con lepra lepromatosa como

en aquellos con la forma tuberculoide (45). En los estados reaccionales tratados con corticoïdes esta disminución en citoquinas es también clara y se da al cabo de semanas. Se ha encontrado que los pacientes que en el curso del trata-miento muestran los niveles séricos más elevados de IL1 β son los que tienen mayor riesgo de hacer reacciones lepro-sas, por lo que se ha sugerido que la medición de los de esta citoquina puede ser de valor en el seguimiento (45). Estos efectos del tratamiento en las citoquinas son reflejos tanto de la disminución del estímulo antigénico así como de un efecto antiinflamatorio propio de medicamentos como el clofazimine, la dapsona y por supuesto los corticoesteroides sobre las -citoquinas proinflamatorias. En resumen, en los polos espectrales inmunológicos de la enfermedad encon-tramos una respuesta de tipo T1 en la lepra tuberculoide y de tipo T2 en la lepromatosa. Lo que determina una u otra respuesta no está totalmente definido pero en diferentes estudios se evidencian factores genéticos asociados al com-plejo mayor de histocompatibilidad (MHC) así como otros no asociados como el gen del receptor de la vitamina D (46). Tanto el espectro de la enfermedad así como las reacciones y el tratamiento reflejan cambios inmunológicos bien expresados en las citoquinas (47).

Se han realizado algunos ensayos clínicos con citoquinas para el tratamiento de las diferentes formas de lepra. En el Instituto Oswaldo Cruz en Brasil (48) se trataron dos gru-pos de pacientes, ocho de ellos con lepra multibacilar diag-nosticada recientemente y los cuales se trataron con IFNγ a dosis de 30 μg en ciclos de tres días y descanso por tres días y reinicio por otros tres días hasta completar seis inyeccio-nes y luego de un mes se continuó con una inyección mensual de 100 mg por un total de diez meses. Este esque-ma se realizó de manera simultánea con talidomida y poliquimioterapia convencional (rifampicina, clofazimina y dapsona). Un segundo grupo consistió en 12 pacientes que habían recibido dos años de esquema múltiple antilepra y que recibieron IFNγ solo. Los resultados del seguimien-to demostraron que el IFNγ por sí sólo no aceleraba la disminución de bacilos y que se requiere terapia antibiótica concomitante. En otro estudio brasileño en la ciudad de Bahía (49) diez pacientes fueron tratados con multiterapia antibiótica y diez con el mismo esquema más IFNγ diez dosis diarias de dos millones de unidades por m2 seguido por diez dosis diarias de 100 millones/m2 durante 20 días. El IFNγ fue bien tolerado pero no fue capaz de cambiar el curso clínico. Por lo tanto estos dos ensayos no han dado los resultados esperados y hacia el futuro sería deseable ensayar combinaciones de citoquinas.

Respuesta T1/T2 en leishmaniasis: el caso índice del nuevo paradigma

La Leishmania es un parásito intracelular obligado de células del sistema monocito-fagocitario, lo cual hace que la infección per se tenga características inmunológicas es-peciales ya que el hecho de lograr sobrevivir en la célula

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presentadora de antígeno por excelencia y al mismo tiempo efectora de la respuesta final, demuestra su capacidad para modular la respuesta inmune del hospedero. El parásito es transmitido por la picadura de un flebótomo (Lutzomyia sp. en América) penetrando en forma de promastigote al ma-crófago por medio de dos moléculas, LPG y gp63, que se unen a receptores del complemento en el macrófago, per-mitiendo la entrada del párasito al fagolisosoma, donde pueden sobrevivir e incluso replicarse en formas de amastigote (50, 51). En el modelo murino de infección por Leishmania major la susceptibilidad y la resistencia están asociados a diferentes patrones de expresión de citoquinas. Los animales con lesiones diseminadas que no cicatrizan tienen fuertes respuestas de anticuerpos, altos niveles de IgE y ninguna actividad de hipersensibilidad retardada (DHT). La cicatrización y la desaparición de lesiones se asocian a una fuerte actividad DHT y niveles bajos de anticuerpos. Además de esto, la transferencia de células T1 protege los ratones susceptibles mientras que la transferen-cia de líneas celulares T2 exacerban la infección. La posibi-lidad de cambiar la presentación y el pronóstico clínico de la enfermedad a través del cambio en el predominio de uno u otro tipo de citoquinas dio una demostración contundente de la importancia de una adecuada respuesta inmune frente a un agente infeccioso dado (50, 51).

Desde el punto de vista clínico la leishmaniasis puede presentar un espectro que varía desde estado considerados anérgicos como la leishmaniasis difusa (LD) y la leishmaniasis visceral (LV), hasta estados considerados hiperérgicos como la leishmaniasis mucosa (LM) pasando por un estado más benigno como lo es la leishmaniasis cutánea localizada. Actualmente se ha demostrado que el cuadro clínico predominante depende del tipo de respuesta instaurado por el individuo. El estudio de la inmunopatología de la leishmaniasis ha avanzado a pasos agigantados desde que Pirmez y colaboradores (52) encontraron una relación entre los patrones de citoquinas expresados en los mRNA de linfocitos de biopsias de lesiones en diferentes formas de leishmaniasis humana estaban relacionados con diferen-tes patrones locales de producción de citoquinas. Los pa-cientes que presentan cuadros localizados (LCL) o una infección no sintomática presentan un predominio de pro-ducción de citoquinas T1 (52), mientras que los pacientes con LV y LD se caracterizan por presentar un incremento en los niveles IL4, IL5, IL10 y por ende de la producción de inmunoglobulinas (52); de otra parte estos pacientes pre-sentan una inmunidad celular deteriorada (la prueba de leishmanina es negativa). Así mismo se ha visto cómo la mejoría de los pacientes con LD y LV se logra cuando hay un incremento en su respuesta celular, tanto así que los pacientes curados positivizan su leishmanina. La LD se presenta en individuos inmunocompetentes, pero paradóji-camente son anérgicos para infecciones por Leishmania presentando un gran deterioro clínico (52-54). En los casos de LV y LD es necesario aclarar si la falta de respuesta T1

es el resultado de una respuesta exacerbada T2 que inhiba la producción de la repuesta T1 o de la inmunomodulación ejercida por el parásito (55). El papel de la respuesta inmu-ne en la LM es más compleja, pues la aparición de la sintomatología generalmente aparece varios meses hasta años después en personas con antecedentes de leishmaniasis cutánea que curaron espontáneamente o con tratamiento (56). Desde el punto de vista de patrón inmunológico los estudios realizados no permiten mostrar resultados donde predomine algún tipo de respuesta sino por el contrario podría considerarse como un perfil TO, es decir, sin predo-minio de algún tipo de producción de citoquinas (57). En resumen, en leishmaniasis se puede decir que las formas crónicas y agresivas están relacionadas con factores extrín-secos e intrínsecos (v.g. características de la especie de Leishmania, susceptibilidad génetica, mecanismos de pre-sentación del ant ígeno, respuesta de las células mononucleares a los inmunomoduladores, etc) que facili-ten una respuesta de T2 y por el contrario la infección no sintomática ó la presentación de las formas benignas de-penderá de una respuesta predominante T1 (58, 59). Actualmente se trabaja en los factores que determinan el balance T1/ T2 en el hospedero y al parecer se ha relaciona-do con la dosis del antígeno y con las características de las células presentadoras de antígeno como las de Langerhans o macrófagos (63,64). Experimentalmente se ha demostra-do que al estimular el perfil T1 (por medio de IFN y. IL-12, GM-CSF) se logra una mejor respuesta al tratamiento con antimoniales (60-65). En los modelos de vacunas que usan parásitos atenuado se observa una mejor respuesta protec-tora cuando se emplea como adyuvante IL-12, facilitando el perfil T1 (67). En un estudio piloto abierto, Sundar y Murray (68) ensayaron IFN γ como tratamiento único sin antimoniales en LV. El resultado de este estudio mostró que había disminución en la parasitemia en sólo algunos casos (cuatro de nueve pacientes). Posteriormente (69), en un estudio doble ciego aleatorizado realizado en la India en pacientes con LV la utilización del IFNγ más estibogluconato de antimonio en diez (63%) de 16 pacientes produjo cura parasitológica comparado con uno (7%) de 15 pacientes con estibogluconato de antimonio al décimo día de trata-miento. A pesar de este buen resultado inicial, estos mis-mos autores (70) luego de estudiar 156 pacientes encontra-ron que la tasa definitiva de curación a los seis meses entre pacientes con antimoniales fue de 36% y los de antimoniales más IFN γ fue de 49%. Las diferencias no alcanzaron a ser estadísticamente significativas. Estos estudios tienen un nivel de evidencia Ib. Nuevos estudios se deberán realizar combinando IFNγ con otras citoquinas como la IL 12 (71), con el fin de mejorar la eficacia terapéutica. En leishmaniasis mucocútanea luego de varios informes de casos aislados, Falcoff (72) reportó un estudio abierto no aleatorizado con pacientes que presentaban una LC o mucocutánea refracta-ria al tratamiento con antimoniales. Utilizando dosis subóptimas de antimoniato (10 mg/kg) con IFNγ (100 mg/

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m2) en 12 de 13 casos hubo resolución completa de las lesiones. Este estudio tiene un nivel de evidencia III y una naturaleza de recomendación clínica C. Un grupo mexica-no (73) ensayó IFNγ más alopurinol y pentamidina en dos pacientes con leishmaniasis cutánea difusa, obteniendo una rápida mejoría pero ambos pacientes recayeron tres meses más tarde. La naturaleza poco frecuente de esta forma clínica hace difícil plantear estudios más amplios pero hacia el futuro sería importante ensayar combinaciones de citoquinas. Algunos autores plantean que utilizar una sola citoquina como el IFNγ produce un contrabalanceo por aumento en la producción de citoquinas T2, lo cual puede explicar la baja respuesta obtenida o las recaídas en el caso de LV (68).

Toxoplasmosis La toxoplasmosis puede dar lugar a manifestaciones

severas siendo la mejor conocida la forma congénita (74). El modelo murino de infección por Toxoplasma ha permiti-do establecer algunas bases fundamentales de una respues-ta inmune efectiva. Una respuesta celular más que humoral es la responsable del control de la infección (75). Los anticuerpos tienen un papel accesorio (76). Las primeras células activadas no son específicas (NK y macrófagos) con liberación del IFNγ Esta respuesta se desencadena por productos secretados por el parásito. También se secretan la IL 12 y el TNF α. El reclutamiento de los CD4+ comien-za con una presentación de antígeno de tipo CMH I (dado el estado intracelular del parásito). El efecto directo de este tipo de presentación es la activación privilegiada de los CD8+ citotóxicos. El perfil de citoquinas protectoras es T1 (IFNγ, TNFα, IL 12 e IL2) y la contrarregulación de la producción del IFN γ y de las otras citoquinas T1 protecto-ras es efectuada por las citoquinas T2: IL6, IL4 e IL10 (77).

La característica más importante de la infección por T. gondii es la fuerte y persistente respuesta celular que prote-ge al huésped contra los taquizoítos (77). Las formas quísticas (bradizoítos) por su localización intracelular son resistentes a esta inmunidad. Un trabajo reciente de Bohne et al (78) demostró que el IFN y es el desencadenante principal de la conversión de los taquizoítos en bradizoítos. El mecanismo inmunitario más eficaz inducido por T. gondii es logrado a través de la producción por las células Τ del IFN y (79). Lo más notorio de la relación del Toxoplasma con los mamíferos es que logra una convivencia muy bue-na. En efecto, en contraste con otras infecciones parasita-rias crónicas, el T. gondii no produce inmunopatología significativa en los huéspedes inmunocompetentes. La re-sistencia inmunitaria al T. gondii es principalmente celular. Aunque los anticuerpos provocan lisis del Toxoplasma en presencia de complemento la transferencia de grandes can-tidades de suero procedentes de animales crónicamente infectados no protege al ratón contra la infección por una cepa virulenta. De otra parte el ratón sin linfocitos Β puede controlar la infección (80).

Mc Leod et al (81) demostraron claramente la existencia de una tolerancia inmunológica en la función de produc-ción del IFN y en los linfocitos procedentes de los recién nacidos con toxoplasmosis congénita. Los resultados de este estudio muestran que existe una disminución selectiva de la producción del IFNγ e IL2 cuando los linfocitos son estimulados por un lisado de Toxoplasma. Lo más llamati-vo es que la función está preservada frente a otros antíge-nos. Estos resultados llevan a pensar en la existencia de una tolerancia inmunológica creada durante el desarrollo del sistema inmune del feto infectado. Con respecto a la toxo-plasmosis cerebral (TC) que ha surgido como una causa importante de morbilidad y mortalidad en los pacientes con infección por VIH, ésta aparece cuando el número de célu-las CD4+ se encuentra por debajo de 200/cm3 y general-mente como recrudecimiento de una infección latente de T. gondii (82). La disminución de los CD4+ marca claramente el nivel de riesgo para la reactivación de una infección toxoplásmica latente en los pacientes con infección por VIH. Aunque se sabe que a esos niveles no todos los pacientes que tienen infección latente por T. gondii desa-rrollan TC. Esto se ha mostrado que ocurre sólo en 30% de los pacientes VIH con la infección latente por T. gondii (82). Recientemente (83) se ha logrado encontrar que los pacientes con VIH que desarrollan una TC tienen una susceptibilidad genética ligada a los genes del complejo mayor de histocompatibilidad. El genotipo DQ3 es más frecuente en los pacientes de VIH con TC que en los pacientes VIH que no desarrollan TC con los mismos niveles de CD4+ y con infección latente por T. gondii. De otra parte el haplotipo DQ1 es menos frecuente en los pacientes con TC con respecto a aquellos que no lo desarro-llan. Esto se ha explicado porque existen genes del HLA que codifican para un producto que funciona como copresentador del antígeno a las células CD8+. Se sabe que los CD8+ son los linfocitos que funcionan como relevo para la producción del IFN y cuando se encuentran niveles disminuidos de CD4+ (84, 85).

Los inmunólogos clínicos se han preguntado si el déficit funcional de las células Τ puede ser sustituido por la admi-nistración directa de citoquinas o por la inducción en la producción de IFNγ de fuentes no Τ (85, 86). El tratamien-to prolongado de toxoplasmosis en los pacientes afectados por SIDA con IFN y recombinante (rIFN) no es posible dado su costo y su toxicidad. Una alternativa es la activa-ción de las células NK (86, 87). Trabajos recientes han demostrado que esta vía puede ser estimulada con IL 12 recombinante aunque la protección se logra de manera parcial (88). Como IL2 e IL12 parecen ser grandes inductores del IFNγ se piensa que la utilización sinérgica de ellas podría ser utilizada en dosis más pequeñas lo cual disminuiría sus efectos tóxicos potenciales (89). Para de-terminar el papel inmunoterapéutico del IFNγ Murray, et al (90) estudiaron in vitro los macrófagos procedentes de pacientes con SIDA los cuales estimularon con rIFNγ. Esto

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indujo la producción de Η2Ο2 y la actividad fagocítica anti-Toxoplasma. Sin embargo esta experiencia demostró que esta activación no permanece mucho tiempo. De nuevo Murray et al (91) administraron a diez pacientes con SIDA dos dosis diferentes de rIFNγ: 0,03 mg/m2 y 0,5 mg/m2 por infusión intravenosa continua durante cuatro semanas. Los monocitos obtenidos luego de la infusión y cultivados du-rante cinco a siete días mostraron un aumento en la produc-ción de H202 y actividad antitoxoplásmica. Una nueva ad-ministración de rIFN permitió una activación continua du-rante las 24 horas posteriores a la primera y la tercera infusión. Para obtener una activación más persistente in vivo será necesario probar diferentes regímenes de admi-nistración. En esta área la combinación con otras citoquinas parece ser prometedora, especialmente con IL2 (92) o IL12 (88). La combinación con antibióticos ha sido igualmente experimentada en el modelo animal combinando el rIFN γ con la pirimetamina o la clindamicina (93). Quedan por realizar ensayos clínicos controlados para evaluar estas nuevas estrategias terapéuticas.

Conclusiones Los estudios sobre el papel de las citoquinas durante la

respuesta inmune frente a los agentes infecciosos han de-mostrado que las manifestaciones clínicas casi siempre se correlacionan con alteraciones en la producción de los gru-pos de citoquinas T1 y T2. Esto se ha corroborado al utilizar citoquinas exógenas como adyuvantes en el tratamiento de formas graves o incurables de algunas infecciones parasita-rias o microbianas proporcionando mejorías sustanciales. Sin embargo, la utilización de citoquinas como agentes tera-péuticos no siempre han dado los resultados esperados y lo que se perfila hacia el futuro es que su utilización deberá pasar primero por un conocimiento profundo del papel de cada una de ellas en las diferentes situaciones patológicas. Como la respuesta inmune se trata de una producción orquestada y armónica de múltiples citoquinas con funcio-nes redundantes y antagónicas entre ellas, parece ser que el tratamiento de las infecciones requerirá el uso de no sólo de una sino de combinaciones adecuadas de varias de ellas con el fin de lograr una mejor respuesta clínica.

Summary Purpose: to review critically the published data about

therapeutic use of cytokines in humans for tuberculosis, leprosy, leishmanioses and toxoplasmosis.

Sources of data: Medline and Current contents Selection of studies: all experimental and clinical studies

about cytokines found by using the key words cytokines, therapeutic and tuberculosis, leprosy, leishmanioses and toxoplasmosis.

Extraction of the data: detailed summaries of data from basic science studies and from clinical studies. The clinical studies were classified by evidence level I to IV and characteristics of recommendation.

Results: data from basic science studies and clinical suggest that cytokines imbalance are crucial aspects of pathogenesis in human infectious diseases. We found therapeutic assays in humans: two in tuberculosis, two in leprosy, three in visceral leishmanioses, two in muco-cutaneous leishmanioses and any in toxoplasmosis.

Conclusions: experimental in vitro and in vivo studies have shown that in these infectious diseases there is an imbalance between T1/T2 cytokines. Until now, any study using a single cytokine for the treatment of tuberculosis, leprosy, tuberculosis or toxoplasmosis have achieved a level of evidence I. Further studies combining two or more cytokines are warranted in order to best determine the place of cytokines for the treatment of these infectious diseases.

Key words: citokynes, IFNγ, TNF α, IL12, IL2

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ACTUALIZACIONES • El equilibrio T1/T2

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Acta Med Colomb Vol. 24 N°5 ~ 1999 219