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8. BÚSQUEDA DE FITOPLASMAS EN ÁRBOLES DE C. alliodora (Ruiz & Pavón) Oken, CON SÍNTOMAS DEL ARROSETAMIENTO

8.1 MATERIALES Y MÉTODOS Teniendo en cuenta la alta variabilidad genética reportada en C. alliodora, los

diferentes grados de susceptibilidad a la enfermedad observados en el banco de

Paraguaicito y que los síntomas del arrosetamiento son similares a los causados

por fitoplasmas en otras especies, se evaluó la presencia del microorganismo en

genotipos con síntomas típicos de la enfermedad, mediante la técnica de PCR

anidado y mediante microscopía electrónica de transmisión.

8.1.1 Detección mediante PCR anidado. Se utilizaron dos metodologías, en una

primera fase se colectaron 5 muestras de árboles enfermos de la subestación

experimental Paraguaicito y una muestra como control negativo de un árbol

asintomático del vivero forestal La Coca de Cenicafé, ubicado en Chinchiná

Caldas. La muestra 8 corresponde al control negativo (Injerto del 12 de octubre de

2006 de nogal cafetero sano, proveniente de Pereira Risaralda R-III 2-1); las

muestras 2 (tejido foliar) y 4 (madera) hacen parte del árbol con mayor afección de

la enfermedad en el lote (severidad 80%). Las muestras 1, 3 y 5 corresponden a

tejido de rebrotes de árboles de nogal con síntomas de la enfermedad. La muestra

7 es el control positivo (árbol Chino parasitado con fitoplasma) y la 6 corresponde

al posible vector de la enfermedad (Torvochrimnus poeyi, Hemiptera: Lygaeidae)

(Figura 25).

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Muestra 1 (NS-II-1-1)

Muestra 2 (S-IX-1-1) Muestra 3 (S-IX-1-2) Muestra 4 (S-IX-1-1)

Muestra 5 (CU-I-1-9)Muestra 6

(Torvochrimnus poeyi) Árbol chino (enfermo)M8 (Control

negativo R-III-2-8)

Figura 1. Muestras colectadas para la detección del fitoplasma en Paraguaicito Quindío y Chinchiná Caldas

Las muestras se llevaron a tubos Corning con Buffer de extracción, se llevaron al

laboratorio de Fitopatología de Cenicafé ubicado en Chinchiná Caldas y mediante

el protocolo de Gilberston et al (1991) modificado, se extrajeron los ácidos

nucleicos. Para la extracción, las muestras se maceraron en Nitrógeno líquido, se

sirvieron en tubos eppendorf con 1ml de Buffer de extracción y se agitaron en un

vortex durante 2 minutos. Posteriormente se adicionaron 90µl de SDS 10%, se

agitó en vortex durante 2 minutos y se incubó a 65°C por 10 minutos en baño

María. Se adicionaron 150 µl de acetato de potasio pH 5,5, se homogeneizó

mediante inversión de los tubos y se dejó en hielo por 10 minutos. A continuación,

se centrifugó a 14000 r.p.m. durante 10 minutos a 4°C, se recogió el sobrenadante

y adicionó 0,5 volúmenes de isopropanol 100% (frío) para precipitar los ácidos

nucleicos. Se hizo una nueva centrifugación a 14000 r.p.m. por 10 minutos, se

eliminó el sobrenadante, se lavó el pellet con 500 µl de etanol al 100%, se

centrifugó a 10000 r.p.m. durante 5 minutos, se volvió a centrifugar previo lavado

con etanol al 70%, se eliminó el sobrenadante, se secó el pellet al vacío utilizando

un speed vac y se resuspendió en agua.

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Posterior a la extracción, se amplificó el ADN mediante una prueba de PCR

anidado, que es una técnica que involucra dos reacciones en cadena de la

polimerasa (PCR) sucesivas, con dos pares de cebadores distintos, de manera

que los cebadores utilizados en el primer PCR flanqueen una región del ADN

ribosomal del fitoplasma y la segunda PCR (internal o nested PCR) amplifica una

región al interior del producto amplificado en la primera reacción en cadena

(external PCR). Esta técnica además de ser más específica para fitoplasmas,

descarta la amplificación de ADN de bacterias o de la misma planta.

Para la primera amplificación se preparó un coctel con reactivos Promega® con

los siguientes componentes: Buffer 0,1%; MgCl2 25 mM; dNTPs 2 mM; 0,1

unidades de Taq polimerasa por µl. Además, se adicionó a cada tubo de la

reacción 100 ng de los cebadores específicos para ADN ribosomal de fitoplasmas

(P1/P7); 100 ng de la muestra (ADN enfermo ó ADN sano extraídos de nogal); y

agua destilada estéril hasta completar un volumen de 25 µl. Los tubos se

colocaron en el termociclador para la amplificación, programado para 35 ciclos así:

94ºC por dos minutos, 94°C por un minuto, 55ºC por dos minutos, 72°C por tres

minutos. La temperatura final después de realizados todos los ciclos, fue de 72°C

por diez minutos y finalmente de 4ºC por tiempo indefinido. Una vez terminada la

primera amplificación se siguió con la segunda amplificación la cual se realizó en

iguales condiciones a la primera, empleando el producto amplificado así: de cada

reacción se tomó 1 µl y se diluyó en 29 µl de agua destilada estéril y de esta

dilución se tomó 1 µl y se le adicionó los otros dos pares de cebadores (FU5/RU3,

R16F2/R16R2 y R16F2N/R16R2), sometiéndolo a una temperatura de

alineamiento de 50°C. Para observar la amplificació n de estos productos, se

preparó 100 ml de un gel de agarosa al 1% en Buffer TAE 1X, teñido con un µl de

Bromuro de etidio (solución stock a 10 mg/ml), y mediante una cámara de

electroforesis a 90 V, se separaron los productos de la reacción. Los fragmentos

amplificados se visualizaron a través de un analizador de imágenes y el gel se

documentó mediante fotografía. La presencia del fitoplasma en cada una de las

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muestras se evaluó mediante la comparación de las bandas del gel de las

muestras de nogal, los testigos sanos y los testigos enfermos de otras especies.

La secuencia de ADN amplificada, característica del fitoplasma, se insertó en el

vector pGEM®-T Easy (plásmido preparado por digestión con EcoR V y 3’ terminal

thymidines added) con el buffer 2X Rapid Ligation Buffer (60mM Tris-HCL (pH7,8),

20mM MgCl2, 20mM DTT, 2mM ATP, 10% PEG) y se incubó a 4°C con la enzima

T4 DNA ligasa (Storage buffer: 10Mm Tris-HCl (pH 7,4), 50mM KCl, 1mM DTT,

0,1mM EDTA, 50% Glycerol); con el objetivo de que el fragmento de ADN de

interés se inserte en el vector y quede ligado a él por la Ligasa.

Posteriormente se hizo la transformación de bacterias, que consiste en la inserción

del vector con el fragmento de ADN de interés a una bacteria; para lo cual, en

tubos eppendorf se adicionaron 10 µl de la ligación (bacterias + fragmento de

interés, control positivo (control del kit) y control negativo o bacterias más vector

sin la ligación), se incubaron durante 30 minutos en hielo, en baño María (42°C)

durante 30 minutos con el objetivo de permeabilizar la membrana celular y en hielo

durante 2 minutos para estabilizar nuevamente la membrana. Posteriormente se

adicionaron 250 µl a cada tubo de Caldo LB y se llevaron a un shaker a 180 r.p.m.

durante 1 hora ubicándolos de manera horizontal con el objetivo de que se

multipliquen las bacterias. Las bacterias se sembraron en el medio selectivo LB

(Agar LB (3,2 %), X-Gal (100mg/ml), Ampicilina (10%)) dispersándolas sobre la

superficie del medio de cultivo mediante un rastrillo bacteriológico y se incubaron

boca abajo a 37°C toda la noche.

Las colonias seleccionadas como transformadas son las de color crema-blanco, ya

que el inserto (secuencia de interés) al ligarse al vector bloquea en él, la

secuencia del LacZ impidiendo que reaccione con el X-Gal del medio de cultivo, lo

que bajo condiciones normales (sin inserto) provoca la coloración azulada de las

bacterias al crecer en el medio selectivo.

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Posterior a la transformación se hizo el PCR de colonia con el objetivo de

identificar las bacterias que presentan en el plásmido la secuencia de interés, en

este caso del fitoplasma. Para lo cual, en 15 µl de agua se sembraron colonias de

bacterias blancas, se incubaron durante 5 minutos a 95°C en un Termociclador, se

hizo una PCR y en un analizador de imágenes, previa electroforesis en gel de

agarosa, se pudieron observar las colonias que presentaron el fragmento de ADN

de fitoplasma que se desea clasificar.

Con las bacterias seleccionadas por presentar el fragmento de interés se llevó a

cabo el Miniprep, que consiste en extraer de las bacterias el ADN plasmídico

(fragmento de interés); para lo cual, las colonias seleccionadas de cada PCR se

repicaron a 5 ml de caldo LB + Ampicilina (1 µl por cada 1 ml de medio) y se

dejaron durante toda la noche a 180 r.p.m. en forma horizontal. Posteriormente,

los tubos con las bacterias en medio LB + Ampicilina, se centrifugaron a 6500

r.p.m. durante 10 minutos, se descartó el sobrenadante y se resuspendió el pellet

de las células bacterianas en 250 µl de buffer P1 y se transfirieron a tubos

eppendorf.

Se adicionaron 250 µl de buffer P2 y se invirtieron suavemente los tubos 6 veces.

En este paso se inicia el rompimiento de las células por lisis alcalina.

Posteriormente se adicionaron 350 µl de buffer N3 y se invirtieron los tubos 6

veces inmediatamente. Se centrifugó durante 10 minutos a 15000 r.p.m., se pasó

el sobrenadante a una columna QIAprep, con el objetivo de que a un pH

específico el ADN plasmídico se pegue a la membrana, se centrifugó durante 1

minuto y se descartó lo que pasa a través de la columna (flow-through). La

columna del QIAprep se lavó adicionando 0,75 ml de buffer PB y centrifugando

durante 1 minuto. Se lavó nuevamente con 0,75 ml de buffer PE y se centrifugó

durante 1 minuto. Se descartó lo que pasa a través de la columna y se centrifugó

durante 1 minuto adicional para remover los residuos del buffer de lavado. La

columna QIAprep se ubicó sobre un tubo de 1,5 ml, se adicionaron 50 µl de buffer

EB (10Mm Tris-Cl, pH 8,5) al centro de cada columna QIAprep y se centrifugó

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durante 1 minuto, la columna se descartó y se almacenó a -20°C. Mediante un gel

de agarosa (1%) se comprobó la presencia en cada una de las muestras, la

extracción del fragmento de ADN plasmídico que se requiere secuenciar.

Las muestras seleccionadas se enviaron a Macrogen Korea para su

secuenciación, al recibir la secuencia (combinación de las 4 pares de bases

(Adenina, Guanina, Citocina y Timina) que hace característica la especie y permite

su clasificación), mediante el programa BLAST se editaron y comparando el

resultado con las secuencias inscritas en el banco de genes del Gen Bank, se

obtuvo la clasificación o identificación del microorganismo asociado a las

muestras, en este caso del fitoplasma.

En una segunda fase, se colectaron 14 muestras de árboles con síntomas del

arrosetamiento del nogal en la finca La Irlanda (Santagueda Palestina, Caldas),

lugar en el que originalmente se observó la enfermedad. Se tomó una muestra de

2 adultos y 3 ninfas de Torvochrimnus poeyi (Hemiptera: Lygaeidae) posible vector

de la enfermedad (Figura 26). Se hizo una prueba de digestión para evaluar la

calidad del ADN extraído y con las muestras que digirieron se hizo el PCR

anidado.

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Muestra 1

Árbol 1 Muestra 3Árbol 2

Árbol 3 Muestra 5

Árbol 5 Muestra 10 Árbol 6

Muestra 12

Muestra 14

Muestra 7

Muestra 8

Figura 2. Muestras colectadas de árboles enfermos en la Finca la Irlanda en Santagueda Palestina Caldas.

En el laboratorio de Fitopatología de Yuca del CIAT, a cargo de la Dra. Elizabeth

Álvarez, se cuantificó el ADN de las muestras colectadas en Paraguaicito y en La

Irlanda, mediante Espectofotómetro a 260 nm en una dilución 1 en 100 del ADN

en agua destilada estéril y se amplificaron mediante la prueba de PCR anidado.

En una tercera fase se procedió a hacer una extracción de ADN de acuerdo al

protocolo de Prince et al, 1993, a muestras que corresponden a peciolo, rama, raíz

y tallo de 3 árboles enfermos y 1 asintomático de la subestación experimental

Paraguaicito. Para lo cual, la muestra macerada en Nitrógeno líquido y

resuspendida en 8 ml del buffer de extracción se centrifuga a 13000 r.p.m. por 20

minutos a 4°C. El pellet se resuspende en 4 ml de b uffer Grinding, se agrega 80 µl

de Proteinasa k, 440 µ de Sarkosil 10% y se incuba entre 1 ó 2 horas a 55°C.

Árbol 4

90

Posteriormente, las muestras se centrifugan a 8000 r.p.m. durante 10 minutos a

4°C. Se toma 900 µl (fase líquida), se pasa a tubos eppendorf de 2 ml., se

centrifuga durante 10 minutos a 8000 r.p.m. a 4°C y se recupera el sobrenadante.

Se adiciona 540 µl de Isopropanol frío al sobrenadante, se mezcla suavemente y

se incuba durante toda la noche a 4°C. Al siguiente día, los tubos se centrifugan

durante 15 minutos a 8000 r.p.m. y 4°C, se descarta el sobrenadante, se

resuspende el pellet en 700 µl de buffer TE, se agrega 25 µl de SDS al 20%, 20 µl

de Proteinasa k, se mezcla suavemente e incuba durante 1 hora a 37°C. Posterior

a la incubación, se adiciona y mezcla completamente 175 µl de NaCl 5M, 150 µl

de la solución CTAB/NaCl y se incuba a 65°C durante 10 minutos. Se agrega 900

µl de cloroformo isoamil alcohol, mezcla completamente y se centrifuga a 8000

r.p.m. durante 10 minutos. Posteriormente se remueve el sobrenadante viscoso,

se pasa a un tubo limpio, se agrega 1 volumen de cloroformo, se centrifuga a 8000

r.p.m. durante 10 minutos, se transfiere el sobrenadante a un nuevo tubo, se

adiciona 600 µl de alcohol Isopropanol frío e incuba durante toda la noche a 4°C.

Al tercer día se centrifugan los tubos a 11000 r.p.m. durante 10 minutos a 4°C, se

elimina el sobrenadante, el pellet se lava en 1 ml de etanol frío al 70% y centrifuga

a 11000 r.p.m. durante 10 minutos a 4°C. Se deja se car completamente y

resuspende en 50 µl de buffer TE (Prince et al, 1993).

Para determinar la presencia de otra clase de microorganismo asociado a árboles

con síntomas de arrosetamiento del nogal cafetero, en una cuarta fase, se hizo

ITS’s con el ADN extraído en la primera fase de árboles enfermos en la

subestación experimental Paraguaicito (M1, M3, M4 y M5), de Torvochrimnus

poeyi (Hem: Lygaeidae) posible vector de la enfermedad (M6), de la muestra

asintomática colectada en Chinchiná Caldas que resultó positiva a fitoplasma (M8)

y de ADN de Vinca parasitada con fitoplasma extraído en el CIAT Palmira. Los

cebadores utilizados para la amplificación fueron el ITS1 / ITS4, C1-F / L1-R, UNI-

ORF / UNI-OLF y SSU 530F / SSU-1494R. Con el producto del PCR se hizo una

electroforesis en un gel de agarosa al 1,5%, Se clonó el ADN de las muestras

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enfermas (M1, M3, M5 y M6) de las tres reacciones de PCR mezcladas en un

tubo eppendorf, a razón de 5 µl de cada reacción; de igual manera se clonó la M8

(uno de cada par de cebadores), Se transformaron 21 colonias de nogal sano y 20

colonias de nogal enfermo, Se extrajeron los fragmentos de interés de las 41

colonias y se hizo un PCR anidado con el propósito de observar variaciones en las

secuencias de cada muestra y seleccionar las colonias a secuenciar, Los

cromatogramas resultado de la secuenciación, se ingresaron al programa Codon

Aligner y usando la opción call bases (Programa Phred) se asignaron valores de

calidad a cada base, obteniendo un valor de Phred por encima de 60,

Adicionalmente se hizo la remoción del vector usando la opción trin vector y con

un porcentaje de identidad máxima del 95%, se ensamblaron las secuencias,

En una quinta fase, se colectaron muestras de peciolos, hojas, tallo y raíz de

árboles enfermos en la Subestación Experimental Paraguaicito (Tabla 12) con la

colaboración del Dr, Juan Fernando Mejía del laboratorio de Fitopatología de Yuca

del CIAT; los ácidos nucleicos se extrajeron de acuerdo al protocolo de Prince et

al, 1993 y la PCR anidada se realizó utilizando el protocolo anteriormente descrito

con los cebadores P1/P7 y en la segunda reacción se alinearon los cebadores

R16F2N/R16R2 y F1/B6, Los fragmentos amplificados se clonaron para su

secuenciación y comparación con las secuencias inscritas en el banco de genes

del Gen Bank,

Tabla 1, Muestras colectadas para detección de fitoplasmas

Código Especie Genotipo Organo Concentración µg/µl

M1-H Nogal cafetero NS-II-1-1 Hoja 0,455 M1-B Nogal cafetero NS-II-1-1 Brote 0,400 M1-T Nogal cafetero NS-II-1-1 Tallo 0,505 M1-R Nogal cafetero NS-II-1-1 Raíz 0,455 M2-R Nogal cafetero S-IX-1-2 Raíz 0,280 M2-B Nogal cafetero S-IX-1-2 Brote 0,785 M2-H Nogal cafetero S-IX-1-2 Hoja 0,480 M2-T Nogal cafetero S-IX-1-2 Tallo 0,500 M3-H Nogal cafetero S-IX-1-2 Hoja 2,650 M3-B Nogal cafetero S-IX-1-2 Brote 0,260 M3-T Nogal cafetero S-IX-1-2 Tallo 0,255

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Código Especie Genotipo Organo Concentración µg/µl

M4-H Nogal cafetero NS-II-1-1 Hoja 0,660 M4-B Nogal cafetero NS-II-1-1 Brote 0,595 M4-R Nogal cafetero NS-II-1-1 Raíz 0,720 M5-H Nogal cafetero S-IX- Paclo Hoja 1,020 M5-B Nogal cafetero S-IX- Paclo Brote 0,345 M5-R Nogal cafetero S-IX- Paclo Raíz 0,915 M5-T Nogal cafetero S-IX- Paclo Tallo 1,260 MV Vinca Paraguaicito Rebrote 0,345

MC-B Café Gigante Huila Brote 0,495 MC-B2 Café Gigante Huila Brote 0,080 MC-H1 Café Gigante Huila Hoja 0,635 MC-H2 Café Gigante Huila Hoja 0,015 MC-T Café Gigante Huila Tallo 0,110

8.1.2 Detección mediante Microscopía electrónica de transmisión. La prueba

de microscopía electrónica de transmisión se hizo con el objetivo de identificar los

materiales que presentaran estructuras carentes de pared celular, pleomórficas,

de membrana trilaminada y limitadas al floema que corresponden a estructuras

fitoplasmáticas.

Para la observación ultramicroscópica de cortes ultrafinos se utilizaron pecíolos y

nervaduras principales de hojas con síntomas, siguiendo la metodología descrita

por Herrera (1990). Para ello, se cortaron trozos de aproximadamente 2 - 4 mm

con un bisturí desinfestado. El tejido se fijó con una solución de glutaraldehído al

2% durante toda una noche a 4ºC. Posteriormente, los trozos de tejido se lavaron

con tampón fosfato (70 mM NaH2PO4; 30 mM KH2PO2; pH 6,5) tres veces durante

15 minutos cada vez. Luego, las muestras se sometieron a una post-fijación

durante 2,5 horas a 4°C, en una solución de tetraóx ido de osmio al 1%. El tejido se

deshidrató mediante una serie de inmersiones en etanol 50, 70, 90, 95 y 100% de

etanol absoluto. Enseguida, se infiltró con resina (Hardener, Ciba, Swiss) a razón

de 2:1 (etanol: resina) durante 1 hora. Luego, la proporción de etanol: resina se

cambia a 1:1 y se dejó durante toda la noche. Finalmente, los trozos se

sumergieron en resina al 100% durante 5 horas con agitación continua. Cada trozo

de tejido, individualmente identificado, se colocó en moldes plásticos, los cuales se

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incubaron a 70ºC durante 16 h. Los bloques de resina previamente polimerizados

en la etapa anterior, se tallaron en su parte superior en forma piramidal, con el

propósito de exponer el trozo de tejido vegetal al cuchillo del ultramicrótomo.

Posteriormente, el bloque tallado se colocó en un ultramicrótomo, donde se

seccionó el tejido a un grosor de 50 µm. Los cortes desde el micrótomo se

colectaron en una grilla (200 mesh) con membrana de Colodium. Los cortes se

contrastaron con uranil acetato al 2%, durante 30 minutos a temperatura ambiente,

seguido de un lavado de 1 minuto en agua destilada y 5 minutos en citrato de

plomo (4 mM Pb(NO3); 6 mM Na3C6H5O7x2H2O; 160 mM NaOH) durante 5

minutos. Todas las muestras se observaron en microscopio electrónico de

transmisión. Las muestras se colectaron y fueron procesadas por el Ingeniero

Cristian Olaya del laboratorio de Virología del CIAT Palmira. Las muestras

evaluadas correspondieron a la muestra 1, muestras 2, muestra 3, muestra 5 y

muestra 8, colectadas en la primera fase en la Subestación experimental de

Paraguaicito y en Chinchiná Caldas (Figura 25).

8.2 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 8.2.1 PCR anidado. Con el método utilizado para la extracción de ADN se

obtuvieron concentraciones entre 10 ng/µl y 100 ng/µl. La calidad del ADN de las

muestras 1, 3, 5, 6 y 8 se corroboró mediante la técnica RAPD (amplificación al

azar de fragmentos polimórficos de ADN por sus siglas en inglés) utilizando el

cebador PALRN y como control positivo ADN de una cepa de Colletotrichum sp.

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DNA Lambda Hind III

Marcador M1 M2 M3 M4 M6 M6 M7 M8

Marcador DNA ladder

M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8

VIN

CA

CP

Figura 3. Electroforesis en gel de agarosa 1%. Izq. ADN total; dcha. Perfil amplificación RAPD

Utilizando los cebadores P1 y P7 en el PCR, y como anidados los cebadores

R16F2N/R16R2 y R16R2/R16F2, se obtuvieron varias bandas (Figura 28), por lo

que se procedió a hacer una prueba con gradientes de temperatura para aumentar

la especificidad en el PCR y se obtuvo la mayor especificidad bajo una Tm de

56,8°C (Figura 29).

M1

VIN

CA

M3

M5

M6

M8

CN

M1

VIN

CA

M3

M5

M6

M8

CN

PCR 1

PCR anidadoR16F2N – R16R2 M

1

MIX

M5

M6

M3

PCR anidadoR16R2 – R16F2

Figura 4. Amplificación de ADN de las muestras 1, 3, 5, 6, 8, Vinca (control positivo) en PCR anidado

55°C 56.8°C 59.8°C 61.6°C 66°C64.4°C

Enf

erm

oS

ano

CN

Figura 5. Tm cebadores (gradientes) 55.0°C, 56.8°C, 59.8°C, 61.6°C, 64.4°C, 66.0°C con las muestras Sano (M8), Enfermo (M3) y Control negativo (agua destilada estéril)

Teniendo en cuenta el gradiente de mayor especificidad, se hizo el PCR anidado y

se obtuvo una banda similar a la descrita para individuos parasitados con

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fitoplasmas en las muestras que corresponden al individuo asintomático y al

control positivo Vinca (Figura 30).

CNSano EnfermoDNA Vinca CN

ladder

Figura 6. PCR anidado de la M8 (control asintomático), M6 (enfermo) y Control negativo (agua destilada estéril) con los cebadores P1/P7 y R16F2N/R16R2.

De acuerdo a los resultados de la amplificación, las secuencias de mayor número

de bases de nogal cafetero y de vinca, coincidieron con porcentajes de similitud

altos con el fitoplasma de Delphinium sp. Las colonias del control positivo (vinca)

dieron como resultado Delphinium 16SrIII Phytoplasma, a excepción de dos

muestras en las que se obtuvieron cero bases de la secuencia.

Tabla 2. Análisis de las muestras secuenciadas

Muestra Especie Número bases Resultado Cobertura Máxima identidad

1 Nogal cafetero 0 Vector

2 Nogal cafetero 106

Posición 1: Crespera de Café Fitoplasma

33% 90%

Posición 2: Aster yellow Phytoplasma

46% 100%

3 Vinca 0 Vector 4 Vinca 0 Vector 5 Nogal cafetero 0 Vector 6 Nogal cafetero 0 Vector


Posición 1: VIH Tipo I 21% 93% Posición 3: Sugarcane grassy shoot Phytoplasma

54% 100%

8 Nogal cafetero 0 Vector


Posición 1: Kluyveromyces gen putativo de copoporphy rinogeno oxidasa

11% 100%

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Muestra Especie Número bases Resultado Cobertura Máxima identidad

Posición 2: Sugarcane grassy shoot Phytoplasma

40% 100%

10 Nogal cafetero 0 Vector 11 Nogal cafetero 0 Vector


Posición 1: VIH Tipo I 14% 93% Posición 8: Hovenia witches broom Phytoplasma

21% 100%

13 Nogal cafetero 0 Vector 14 Nogal cafetero 0 Vector


Posición 1: VIH Tipo I 14% 93% Posición 9: Hovenia witches broom Phytoplasma

21% 100%


Posición 1: Gallus gallus secuencia cromosomal

8% 93%


16% 92%


Posición 1: cromosoma 11 humano

40% 78%


19% 92%

18 Nogal cafetero 0 Vector 19 Nogal cafetero 786 Posición 1: Delphinium

16SrIII Phytoplasma 99% 99%

20 Vinca 682 Posición 1: Delphinium 16SrIII Phytoplasma

99% 99%


99% 99%


98% 99%


100% 99%


99% 99%


99% 99%

Para comprobar que el ADN de las muestras obtenidas en campo no presentaba

un inhibidor en la reacción, se hizo un PCR anidado en el que se mezcló el ADN

de la M8 y el de la M5 (ADN obtenido en campo). Adicionalmente se tuvieron

como controles M8, Vinca (control positivo) y agua destilada estéril (control

97

negativo). De acuerdo a los resultados, las muestras de campo no presentan

inhibidores de la reacción (Figura 31).

M8 M8+M5 Vinca CN

PCR2CN

PCR11 kb

300 pb

600 pb

Figura 7. Gradiente de amplificación del PCR anidado con los cebadores P1/P7 y R16R2/R16F2N en gel de agarosa al 1%

Teniendo en cuenta que los síntomas son similares a los causados por fitoplasmas

en otras especies, el trabajo realizado por Galvis et al (2005) quienes al

secuenciar un fragmento de ADN de 941 pb de árboles con síntomas del

arrosetamiento del nogal encontraron con una similitud del 98% al fitoplasma de la

Crespera de Café, el comportamiento de los fitoplasmas en el árbol y que la

metodología no es absoluta; en una segunda fase, se decidió hacer una nueva

recolección de muestras de árboles con síntomas del arrosetamiento del nogal en

la finca La Irlanda (sitio donde se detectó inicialmente la enfermedad) y no se

detectó la banda del fitoplasma en las muestras de nogal enfermo, y se

encontraron en el control positivo (vinca) (Figura 32).

M2 M5 M8 CAFÉ

+CN M5 VINCA CN

PCR 1: RU3 / FU5PCR 2: RU3 / FU5

PCR 1: P1 / 97PCR 2: RU3 / FU5

PCR 1: P1 / 97Gel Figura 6PCR 2: RU3 / FU5

M2 M5 M8 CAFÉ +

CN

DNAladder

Figura 8. Electroforesis del PCR de las muestras de ADN obtenidas en Irlanda en Santagueda Palestina Caldas

98

M 2ND D

M 5ND D

M7ND D

M 8ND D

M9ND D

M 10ND D

M 11ND D

M 13ND D

M 1*ND D

M 2*ND D

M3*ND D

CN

CN: Agua

M4*

ND D

M 2 M5 M7 M 8 M 9 M 10 M 11 M 12M 1 M3 M 4 M6 M 13 M 14

Electroforesis en gel de Agarosa 1% del ADN total de las muestras obtenidas en Irlanda en Santagueda Palestina Caldas

Electroforesis de la prueba de digestión de las muestras de ADN obtenidas en Irlanda en Santagueda Palestina Caldas

Figura 9. Electroforesis del ADN total y la prueba de digestión de las muestras colectadas en la finca La Irlanda en Santagueda Palestina Caldas

Los resultados de la cuantificación del ADN realizada en el laboratorio de

Fitopatología de Yuca del CIAT se ilustran en la Tabla 14 y los perfiles de

amplificación del PCR anidado en la Figura 34.

Tabla 3. Concentración de ADN

Muestra Tejido Procedencia Abs. Conc. µg/µl Vol [20 ng/µl] ADN µl Agua

µl

M5 Rebrote Irlanda 0,190 0,950 2,10 97,90 M7 Rama Irlanda 0,245 1,225 1,63 98,37 M8 Hoja Irlanda 0,257 1,285 1,55 98,45 M1 Rebrote Irlanda 0,365 1,825 1,095 98,90 M1 Hoja Paraguaicito 0,086 0,430 4,65 95,35 M2 Hoja Paraguaicito 0,016 0,080 5,0 15,00 M4 Madera Paraguaicito 0,043 0,215 1,86 18,14 M5 Hoja Paraguaicito 0,099 0,495 0,86 19,20 M7 Árbol chino Paraguaicito 0,00 - - - M8 Hoja Vivero La Coca 0,063 0,315 1,27 18,73

ABS.: Absorbancia; CONC.: Concentración

99

M5-

I

MW

CP: yuca PCR anidado

M7-

I

M8-

I

M-I

M1-

P

M2-

P

M4-

P

M5-

P

M8-

P

CP

M5-

I

M7-

I

M8-

I

M-I

M1-

P

M2-

P

M4-

P

M5-

P

M8-

P

CP

Figura 10. Patrón de amplificación del PCR realizado en el CIAT con los cebadores P1/P7 y F1/B6 de las muestras de ADN obtenidas en Irlanda en Santagueda Palestina Caldas y en la subestación experimental Paraguaicito

El ADN total extraído mediante el protocolo de Prince et al (1993) en la tercera

fase, y las pruebas de la calidad RAPDs con el Cebador GGABF y digestión,

realizadas para probar la calidad del ADN, se ilustran en las Figuras 35, 36 y 37.

El PCR con los cebadores P1/P7 y R16F2N/R16R2, no permitió detectar

fitoplasmas en las muestras de ADN de nogales enfermos que presentaron buena

calidad.

MW 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Figura 11. Electroforesis en gel de agarosa 1% del ADN total. M1, M2, M3 y M4 peciolo, rama, raíz y tallo del árbol 1; M5, M6, M7 y M8 peciolo, rama, raíz y tallo del árbol 2; M9, M10, M11 y M12 peciolo, rama, raíz y tallo del árbol 3; M13, M14 y M15 peciolo tallo y raíz del árbol asintomático

100

MW 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 CN

Figura 12. Patrón de amplificación de las muestras de ADN mediante la prueba RAPD. agarosa 1%. M1, M2, M3 y M4 peciolo, rama, raíz y tallo del árbol 1; M5, M6, M7 y M8 peciolo, rama, raíz y tallo del árbol 2; M9, M10, M11 y M12 peciolo, rama, raíz y tallo del árbol 3; M13, M14 y M15 peciolo tallo y raíz del árbol asintomático

MW 1ND 1D 2ND 2D 3ND 3D 4ND 4D 5ND 5D 6ND 6D 7ND 7D 8ND 8D

MW 9ND 9D 10ND 10D 11ND 11D 12 ND 12D 13ND 13D 14D 14ND 15D 15ND

Figura 13. Prueba de digestión en agarosa 1%. M1, M2, M3 y M4 peciolo, rama, raíz y tallo del árbol 1; M5, M6, M7 y M8 peciolo, rama, raíz y tallo del árbol 2; M9, M10, M11 y M12 peciolo, rama, raíz y tallo del árbol 3; M13, M14 y M15 peciolo tallo y raíz del árbol asintomático

Estos resultados son similares a los reportados por Doyle et al (2001), quienes al

evaluar la epidemia del amarillamiento letal del cocotero en Honduras utilizando

los cebadores específicos LYF1/LYR1, detectaron ADN de fitoplasma en el 6% de

las muestras tomadas de tejido del tronco y concluyeron que los síntomas en la

zona de estudio se pueden atribuir a un factor abiótico como exceso de agua y no

al fitoplasma del ALC. A los obtenidos por la Dra. Liliana Franco de la Universidad

Militar Nueva Granada, quien al hacer pruebas moleculares con 4 muestras de

nogal cafetero con síntomas de la enfermedad utilizando los cebadores P1/P7 y en

la PCR anidada R16F2N/R2 obtuvo bandas características de fitoplasma muy

101

tenues que no pudieron confirmarse por secuenciación y RFLP; a los obtenidos

por Mungo et al (2008) quienes encontraron positivos por PCR con los cebadores

R16F2N/R16R2 sólo el 12,5% de Urapanes (Fraxinus sp.) sintomáticos inoculados

con fitoplasma mediante Cuscuta subinclusa, a pesar de haber resultado el 100%

positivos mediante la prueba de DAPI; y a los obtenidos por López et al (2007)

quienes encontraron resultados positivos con el test de DAPI, negativos mediante

PCR con los cebadores P1/P7 y P1/Tint, y raramente positivos con los cebadores

F2/R2 y F2/Tint en plantas de Catharanthus roseus (Vinca) inoculados con

Urapanes infectados, sin embargo, los resultados fueron finalmente positivos

utilizando los cebadores R16mF2/R16mR1.

Adicional a la dificultad de detectar estructuras fitoplasmáticas por la baja

concentración y su irregular distribución en el hospedero, García (2004) reportan

que hay estaciones en las cuales el título de fitoplasmas disminuyen hasta niveles

indetectables, siendo en el caso del decaimiento del Peral, diciembre la época del

año en la que se alcanza la máxima detección de este microorganismo. Musetti

citado por Heinrich et al (2001) reporta que un problema en la detección por PCR

es la presencia de putative inhibitors en fitoplasmas de material vegetal infectado.

Teniendo en cuenta los resultados, en una cuarta fase se hicieron ITSs para

buscar otros microorganismos asociados, los cuales generaron la amplificación de

las muestras de ADN (excepto la de la M4), con los 4 pares de cebadores. Sin

embargo, en la reacción con los cebadores UNI-OR / UNI-OLF se obtuvo el mismo

patrón de bandas en las muestras de ADN y en el control negativo (CN, agua

destilada estéril en lugar de ADN) (Figura 38), razón por la cual se descartó para

la secuenciación de los fragmentos obtenidos.

102

M1 M3 M4 M5 M6 M8 V CN M1 M3 M4 M5 M6 M8 V CN

M1 M3 M4 M5 M6 M8 V CN M1 M3 M4 M5 M6 M8 V CN

C1F/L1R SSU530F/SSU1494R

UNI-ORF/UNI-OLF ITS1/ITS

1 kb

1 kb

CN: Control Negativo PCR con Agua

V: Vinca

Figura 14. Gradiente de amplificación de ITS con los cebadores C1-F / L1-R, UNI-ORF / UNI-OLF y SSU 530F / SSU-1494R en gel de agarosa al 1.5%

Verificación de los insertos obtenidos por PCR de colonia a partir de los iniciadores T7/SP6 de las colonias de nogal enfermo y nogal asintomático (M8). Agarosa 1.5%

PCR de colonias de nogal sano (8) y nogal enfermo. Agarosa 1%

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

20 21

Colonias de NogalEnfermo

1kb

1kb

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

20

1kb

1kb CNCN CN

Colonias de Nogal Sano

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

15 16 17 18 19 2 0 CN

Colonia s deNogal Sano (M8)

1kb

1kb

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

15 1 6 17 18 19 2 0 21

Colonias deNoga l Enfermo

1kb

1kb

Figura 15. Gradiente de amplificación del PCR de colonia y el miniprep de los amplificados obtenidos con los ITS

Al ensamblar las secuencias resultado de la transformación se generaron 5

secuencias únicas (Contig) en las muestras de nogal enfermo y 4 en las muestras

de nogal sano (Tabla 15).

Tabla 4. Longitud y calidad de las secuencias

Nogal enfermo Nogal sano Muestra Longitud Calidad Muestra Longitud Calidad

Contig 1 E4 789 789 Contig 6 S12 535 535

103

Nogal enfermo Nogal sano Muestra Longitud Calidad Muestra Longitud Calidad

E5 788 780 S13 535 535 Contig 2 E12 535 535 S21 535 535

E18 535 535 S2 535 535 E1 535 535 S5 535 535 E2 535 535 S6 520 504 E6 535 535 S7 535 526 E8 535 535 Contig 7 S10 529 529 E9 535 535 S14 529 529

Contig 3 E10 529 529 S15 529 529 E11 529 529 S16 529 529 E13 529 529 S17 529 529 E16 529 529 S8 529 529 E7 529 529 S9 529 529

Contig 4 E20 519 505 Contig 8 S11 443 438 E19 350 346 S18 443 443

Contig 5 E14 440 440 S1 443 443 E17 440 440 S3 443 443

S4 443 443 S20 520 520

Al comparar los Contig con las secuencias en el Gen Bank se obtuvieron los

resultados que se ilustran en las Tabla 16 y 17. Con estos amplificados no se

detectaron bacterias ni hongos asociados a la enfermedad.

Tabla 5. Secuencias de nogal asintomático (M8)

Descripción Cobertura Máxima identidad

Contig 1 Cordia decandra voucher 1837 internal transcribed spacer 1, partial sequence; 5.8S ribosomal

92% 91%

Cordia nodosa internal transcribed spacer 1, partial sequence; 5.8S RNA gene

92% 88%

Eriodyction crassifolium var. nigrescens transcribed spacer 1, partial sequence; 5.8S ribosomal

92% 84%

Contig 2 Acetobacter pasteurianus partial ITS 1, strain CCM 3615 99% 100% Escherichia coli str. K-12 substr. DH10B, complete genoma 99% 100% Escherichia coli W3110 DNA, complete genoma 99% 100% Contig 3 Escherichia coli str. K-12 substr. DH10B, complete genoma 99% 100% Escherichia coli apc 01, complete genoma 99% 100% Escherichia coli W3110 DNA, complete genoma 99% 100% Contig 4 Escherichia coli str. K-12 substr. DH10B, complete genoma 99% 99%

104

Descripción Cobertura Máxima identidad

Escherichia coli W3110 DNA, complete genoma 99% 99% Escherichia coli str. K-12 substr. MG 1655, complete genoma 99% 99% Contig 5 Escherichia coli W3110 DNA, complete genoma 99% 99% Escherichia coli str. K-12 substr. MG 1655, complete genoma 99% 99% Shigella boydii CDC 3083-94, complete genoma 99% 99%

Tabla 6. Secuencias de nogal enfermo

Descripción Cobertura Máx. identidad

Contig 6 Acetobacter pasteurianus partial ITS 1, strain CCM 3615 99% 99% Escherichia coli str. K-12 substr. DH10B, complete genoma 99% 99% Escherichia coli ATCC 8739, complete genoma 99% 99% Contig 7 Escherichia coli str. K-12 substr. DH10B, complete genoma 99% 100% Escherichia coli APEC 01, complete genoma 99% 100% Escherichia coli W3110 DNA, complete genoma 99% 100% Contig 8 Escherichia coli W3110 DNA, complete genoma 99% 100% Escherichia coli str. K-12 substr. MG 1655, complete genoma 99% 100% Shigella boydii CDC 3083-94, complete genoma 99% 100% S20 Escherichia coli str. K-12 substr. DH10B, complete genoma 99% 100% Escherichia coli W3110 DNA, complete genoma 99% 100% Escherichia coli str. K-12 substr. MG 1655, complete genoma 99% 100%

Bajo las condiciones de recolección de las muestras realizadas en la quinta fase,

en la PCR inicial (cebadores P1/P7) se detectó la banda de 1800 pb en el control

positivo (ADN de yuca parasitada con fitoplasmas) y en M5-H (ADN extraído de

nogal con síntomas del arrosetamiento) (Figura 40). En el PCR anidado con los

cebadores F1/B6 en las muestras MC-H2 (Hojas de Café con Crespera), MC-B2

(Brotes de Café con Crespera), nogal (nogal con síntomas del arrosetamiento),

Control positivo Vinca, Control positivo yuca, M5-H (Hojas de nogal con síntomas

del arrosetamiento), M4-H (Hojas de nogal con síntomas del arrosetamiento) y M3-

T(Tallo de nogal con síntomas del arrosetamiento) (Figura 41); con los cebadores

R16F2N/R2 en las muestras Control positivo yuca, Control positivo Vinca, M5-H

(Hojas de No nogal con síntomas del arrosetamiento), M4-H (Hojas de nogal con

105

síntomas del arrosetamiento) y M3-T (Tallo de nogal con síntomas del

arrosetamiento) (Figura 42).

P1/P7

Yuca M5-H Yuca

Figura 16. Amplificación PCR inicial, cebadores P1/P7. Marcador Hypper ladder II

F1/B6

MC-H2 MC-B2 Vinca Yuca M5-H M4-H M3-T Vinca Yuca

Figura 17. Amplificación PCR anidado, cebadores F1/B6. Marcador Hypper ladder II

R16F2N/R2

Yuca M5-H M4-H M3-T YucaVinca

Figura 18. Amplificación PCR anidado, cebadores R16F2N/R2. Marcador Hypper ladder II

Los resultados de la secuenciación confirmaron la asociación de fitoplasmas a las

muestras enfermas. En nogal con arrosetamiento se detectaron fitoplasmas de 4

especies, incluyendo el de Delphinium encontrado inicialmente en la M8 (nogal

asintomático de Chinchiná) (Tabla 18).

106

Tabla 7. Secuencias nogal con arrosetamiento, vinca con filodia y café con crespera

Especie Descripción Muestra Cebador Cobertura Identidad máxima

Nogal Sugarcane yellows phytoplasma Tallo R16F2N/R2 10% 100% Nogal Spirea stunt phytoplasma Tallo R16F2N/R2 10% 100% Nogal Sugarcane yellows phytoplasma Tallo R16F2N/R2 10% 100% Nogal Spirea stunt phytoplasma Tallo R16F2N/R2 20% 100% Nogal Delphinium 16SrIII phytoplasma Hoja F1/B6 100% 99% Nogal Chinaberry yellows phytoplasma 1 Hoja F1/B6 100% 99% Nogal Spirea stunt phytoplasma Hoja F1/B6 100% 98% Nogal Delphinium 16SrIII phytoplasma Hoja F1/B6 100% 99% Vinca Delphinium 16SrIII phytoplasma F1/B6 100% 99% Vinca Delphinium 16SrIII phytoplasma F1/B6 92% 99% Vinca Sugarcane yellows phytoplasma RP 100% 95% Vinca Delphinium 16SrIII phytoplasma F1/B6 100% 99% Vinca Sugarcane yellows phytoplasma F1/B6 93% 98% Vinca Delphinium 16SrIII phytoplasma RP 100% 97% Café Chayote witches' broom

phytoplasma RP 100% 96%

Se decidió hacer un PCR con cebadores específicos del grupo III

(rpL2F3/rp(1)R1A), con las muestras de ADN que presentaron la banda

característica del fitoplasma y se obtuvieron los amplificados que sugieren la

agrupación de los microorganismos asociados a la crespera de café, filodia en

vinca y arrosetamiento del nogal cafetero dentro de fitoplasmas del grupo III

(Figura 43).

1800 pb

Café Café Nogal Nogal Nogal Nogal Nogal Vinca Yuca CN CN Anidado

Figura 19. Amplificación. 1 MC-B2, 2 MC-H2, 3 M5-H, 4 M4-H, 5 M3-T, 6 MC-T, 7 nogal blanco, 8 MV, 9 CP YUCA, 10 CN, 11 CN PCR Anidado. Marcador Hypper ladder

107

8.2.2 Detección mediante microscopía electrónica de transmisión. La prueba

realizada por el Ing. Cristian Olaya, mostró estructuras similares a las de un

fitoplasma sin confirmación en la muestra 3 (Figura 44), estructuras irregulares en

los vasos y células acompañantes en las muestras 5 (Figura 45), 2 (Figura 46) y 1

(Figura 47), ausentes en la muestra 8 (control negativo), que no presentó

irregularidades (Figura 48).

60k20k

05k02k

Figura 20. Tejido de rebrotes con síntomas del Arrosetamiento fisiológico en el genotipo S-IX-1-2 (Muestra 3)

0.2k 30k-cloroplasto

10k 50k

Figura 21. Tejido del genotipo CU-I-1-9 con síntomas del Arrosetamiento fisiológico (Muestra 5)

108

0.5k 80k

20k 80k

Figura 22. Tejido del genotipo S-IX-1-1 con severidad del 80% del Arrosetamiento fisiológico (Muestra 2)

0.2k 20k

80k 80 mitocondria

Figura 23. Tejido enfermo del genotipo NS-II-1-1(Muestra 1)

0.2k 0.2k

80k mitocondria 80k

Figura 24. Tejido asintomático del injerto del genotipo R-III-2-1 colectada en el vivero Forestal La Coca de Cenicafé y al que se le detectó el fitoplasma Delphinium 16SrIII (Muestra 8)

109

8.3 CONCLUSIONES Bajo las condiciones de este estudio se detectaron fitoplasmas de varias especies,

asociados a los árboles con síntomas del arrosetamiento. De igual manera se

encontró un fitoplasma en la muestra asintomática tomada inicialmente como

control negativo, con un 99% de similitud con Delphinium 16SrIII Phytoplasma.

Con lo que se piensa que una de éstas especies es la causante de la enfermedad

y las otras actúan como endófitos, o que es necesario el complejo para que se dé

la enfermedad.

Es necesario iniciar estudios de transmisión, de PCR en árboles asintomáticos,

utilizando metodologías más sensibles para aclarar la etiología y el agente

causante de la enfermedad.

Los fitoplasmas asociados a los árboles enfermos pertenecen al grupo de los

causantes de la filodia en vinca, cuero de sapo en yuca y crespera de café, sin

embargo, se observaron polimorfismos que confirman la clasificación de los

mencionados fitoplasmas en subgrupos diferentes.

Mediante la técnica de microscopía electrónica no se detectaron fitoplasmas

asociados a las muestras con síntomas del arrosetamiento y se encontraron

estructuras desconocidas a lo largo de todo el tejido en los materiales enfermos,

ausentes en el árbol asintomático, que ameritan atención.

8. BÚSQUEDA DE FITOPLASMAS EN ÁRBOLES DE … · En este paso se inicia el rompimiento de las...

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