EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS

NUCLEICOS

EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS

NUCLEICOS

Consideraciones iniciales

- Condiciones de limpieza y esterilidad

- Peligrosidad de algunos reactivos usados en la purificación

FasesFases

- Rotura-homogeneización: obtención de un lisado celular- Bacterias: lisozima- Plantas y hongos: rotura mecánica y/o enzimas

específicas (celulasas, quitinasas)- Células animales: detergente

- Rotura mecánica: macerado con nitrógeno líquido, prensa de French, homogeneizador, sonicación.

- Purificación: separación de los ácidos nucléicos del resto de componentes celulares

- Extracción con solventes orgánicos, precipitación de proteínas y otras impurezas

- Concentración: mediante precipitación

- Lavado y resuspensión

Rotura-homogeneización- Prevenir la degradación del ADN

- Evitar rotura física del ADN- Impedir acción de nucleasas: EDTA (Ácido etilendiaminotetraacético)

- Detergentes: SDS, desestabilizan las membranas celulares

- Proteinasa K: degrada proteínas

- Buffer rotura, composición típica: Tris, EDTA, SDS, CTAB

Purificación

- Extracción con fenol-CIA (1:1) (CIA: cloroformo:alcohol isoamílico 24:1)

- Acetato potásico: elimina proteínasSDS y lípidos, precipitados por centrifugación

Concentración - Precipitación con alcoholes: etanol (2.5:1) o isopropanol (0,7:1), en presencia de cationes monovalentes (Na+, K+, NH4

+)

- Centrifugación en frío

- Lavado con etanol 70%. Secado.

- Resuspensión en TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8)

Purificación mediante columnas- Gel filtración: separación por tamaño

- Columnas de afinidad, intercambiador aniónico

Purificación de ADN plasmídicoPurificación de ADN plasmídico

- Lisis alcalina

- Rotura: tampón con glucosa, lisozima, EDTA- Desnaturalización: tampón con SDS, NaOH- Purificación: acetato potásico en solución ácida

- Boiling- Rotura, hervido, hielo, centrifugación.

- Columnas de afinidad

- Gradiente de cloruro de cesio

Purificación de ADN plasmídicoPurificación de ADN plasmídico

- Gradiente de cloruro de cesio- Utiliza un gradiente de cloruro de cesio y el agente intercalante bromuro de etidio para generar diferencias de densidad entre el ADN superenrrollado plasmídico (ccc) y el ADN lineal cromosómico o plasmídico circular abierto (oc). El superenrrollado acepta menos BrEt y será más denso, apareciendo más abajo tras la centrifugación

Cuantificación de ácidos nucleicosCuantificación de ácidos nucleicos

- Electroforesis

- Marcadores de peso molecular de concentración conocida, comparar la intensidad de la señal tras la tinción con bromuro de etidio. Densitometría

- Espectrofotometría- 260 nm (máxima absorbancia de ácidos nucléicos)- 280 nm (máxima absorbancia de proteínas)

- ADNss: 1.0 OD = 33 µg/µl- oligonucleótidos: 1.0 OD = 20 µg/µl- ADNds: 1.0 OD = 50 µg/µl- ARNss: 1.0 OD = 40 µg/µl

Para ADN puro: A260/A280 = 1.65 – 1.9

Para ARN puro: A260/A280 = 2.0

EXTRACCIÓN DE ARNEXTRACCIÓN DE ARN

FasesFases- Material de partida

- Siempre fresco o congelar inmediatamente, preferiblemente en nitrógeno líquido.

- Evitar acción ARNasas: espacio de trabajo limpio, siempre guantes, tratar en autoclave todo el material dos veces o en horno a 260ºC durante 12 h. Todas las soluciones tratadas con DEPC (dietil pirocarbonato) 0.1% (mezclar por agitación durante 2-3 h al menos y luego tratar en autoclave), excepto las que llevan Tris, para éstas usar H2O DEPC ya esterilizada de partida. El DEPC inactiva las RNAsas por carboxietilación de determinados aminoácidos.

- Rotura: similar al caso del ADN, conveniente hacerlo en frío, por ejemplo nitrógeno líquido. Rápidamente añadir buffer de rotura.

- Purificación: Varios sistemas. - Mezclas tipo Trizol (Invitrogene): Isotiocianato de guanidina. Precipita las proteínas y permite una separación de los diferentes componentes celulares: ADN, ARN, proteínas, etc- Extracciones con fenol-cloroformo y precipitación selectiva con LiCl

0.2 M. Siempre quedan trazas de DNA, deben eliminarse con ADNasa libre de ARNasas, sobre todo si se va a realizar RT-PCR

- Columnas RNeasy de Qiagen: ARN de muy buena calidad, algo de contaminación con ADN.

Típico gel de agarosa con ARN de hongos teñido con BrEt

- Las bandas intensas corresponden a los ARN ribosomales (aprox. 80% del total en la célula), aproximadamente 3.4 y 1.7 kb de tamaño

- El ARNm no representa más del 2-5% del total y aparece como un barrido o a veces no es visible

- Almacenamiento

En H2O DEPC a -80ºC durante semanas-meses. A -20ºC es mucho más inestable. También precipitado con etanol/sal a -80ºC

¿ARN total o ARNm?

- Para la mayor parte de usos ARN total puede ser utilizado: Northern, RT-PCR

- ARNm es imprescindible para construcción de bibliotecas de ADNc y para el marcaje de sondas para hibridación de microarreglos.

Purificación de ARNm

- Columnas de oligo(dT)-celulosa

- Retienen el ARNm al tener una cola de poly-A en 3’. Una ronda elimina entre 50-70% ARNr, se pierde entre un 20 y un 50% del total de ARNm. Una segunda ronda elimina hasta 95% de ARNr y es imprescindible para marcaje de cDNA en microarrays.

- Dyna-beads

- Dyna-beads (de Dynal), recubiertas con oligo(dT) pemiten separar eficientemente el ARNm mediante separación magnética

Streptavidina

Biotina

Bolita magnéticaOligo-dT 25 nucleótidos

Molécula de ARNm