4. ESPECTROSCOPIA MOLECULAR
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1 Técnicas espectroscópicas: Espectroscopia molecular Espectrofotometría de absorción UV-Vis
Aina Font i Barceló ombr
4. ESPECTROSCOPIA MOLECULAR
Las radiaciones se pueden representar en varias zonas dependiendo de que longitud
de onda o frecuencia tengan. Podremos encontrar varias técnicas de espectroscopia
dependiendo de la región del espectro que absorban o emitan.
- Si absorbe en la UV-Visible: Espectroscopia de absorción UV-visible.
- Si emite en UV-Visible: Fluorescencia, fosforescencia o quimioluminiscencia. Se
excitaran a una cierta longitud de onda y emitirán también a una longitud de
onda, son unas moléculas especiales que desprenden fluorescencia.
- Si absorbe en IR: Espectroscopia IR
- Cambios en el spin nuclear: RMN
Los espectros de absorción molecular son bastante más complejos que los espectros
atómicos, ya que el número de estados de energía de la molécula son muchísimos mas.
A diferencia de los espectros atómicos, que consisten en líneas, los espectros
moleculares están formados por bandas de absorción que abarcan un rango grande de
longitudes de onda. Las bandas incluyen la transición electrónica (del estado
fundamental al excitado) que a su vez incluyen transiciones de estados vibratorios y
rotacionales. Por lo tanto, el espectro esta formado por muchas líneas cerca entre si que
acaban formando las bandas.
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A cada movimiento le corresponde una cierta absorción de luz de una región diferente
del espectro de radiación.
- REM microondas: Transiciones de rotación sobre el eje de la molécula:
- REM infrarroja: Transiciones de vibración (rotación) -> Espectroscopia IR
- REM ultravioleta-visible: Transiciones electrónicas (vibratorios y rotatorios) -> Espectroscopia UV-Vis
Por lo tanto tal y como se puede ver en la imagen superior, una radiación con longitud
de onda en UV-VIS puede provocar un salto electrónico y a la vez transiciones de
rotación y de vibración. Una REM en zona de IR puede provocar transición de rotación
y de vibración, es menos energética que la UV-Vis y no provoca saltos de electrones. Y
finalmente la REM microondas puede provocar rotación en la molécula pero no es
suficientemente energética para provocar ningún otro tipo de transición.
E total= E rotación+ E vibración+ E electrónico
+ energía de la REM
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4.1 ESPECTROSCOPIA DE ABOSRCIÓN UV-VISIBLE
Se mide la cantidad de luz absorbida por la muestra con un detector. El detector mide
la cantidad de REM transmitida que haciendo el menos logaritmo obtendremos la REM
absorbida.
La longitud de onda de la REM UV-Visible es de 180-1000nm. Debemos recordar que
la REM absorbida es complementaria a la REM transmitida, la que vemos nosotros y
nos da el color.
- Absorción de 420-430nm: color amarillo
- Absorción de 500-520nm: color rojo.
- Absorción total: color negro (no hay transmisión)
- No absorción: color blanco (todo transmisión)
En esta técnica la REM provoca una transición electrónico, y a la vez también rotacional
y vibratorio. Debemos indicar en que estado electrónico se encuentran los electrones
(fundamental (E0) o excitado (E1)) y en que nivel vibratorio y rotacional. Las transiciones
electrónicas se basan en:
-Principio de Franck-Condon:
ü Las transiciones electrónicas tienen lugar entre un nivel energético inferior
(fundamental) a un estado energético superior. De un nivel vibratorio del
estado fundamentas hasta cualquier nivel vibratorio del estado excitado.
ü Se pueden encontrar 3 tipos de transiciones:
o Transiciones de electrones en orbitales moleculares π y σ.
Los enlaces σ son los que tienen lugar entre orbitales lineales al eje
intranuclear.
Los enlaces π son los que tienen lugar entre orbitales perpendiculares al
eje intranuclear.
o Transiciones de electrones en orbitales atómicos f/d
o Transiciones de transferencia de carga.
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FUNDAMENTO: ORBITALES MOLECULARES
Las zonas entre dos átomos unidos con un enlace covalente que están ocupadas por
electrones se llaman orbitales moleculares y se consideran como el resultado de la
superposición de orbitales atómicos.
Al momento que dos átomos se unen para formar una molécula, cada uno de ellos
aporta un electrón al enlace y se forman 2 orbitales moleculares (híbridos): uno de baja
energía (enlazante) y el otro de alta energía (inestable): antienlazante. Los electrones
de una molecular en estado fundamental se encuentran en el orbital molecular
enlazante.
De dos orbitales atómicos S se forman orbitales moleculares simétricos σ, un orbital de
baja energía y otro de alta energía (inestable) antienlazante. Estos enlaces moleculares
van asociados a los enlaces sencillos.
Los electrones del orbital σ se encontraran en estado fundamental (baja energía) pero
cuando se le dé una REM UV-Vis estos pasarán a un estado energético más elevado.
Dos orbitales p cuando se enlazan por superposición paralela forman orbitales no
simétricos π. Estos orbitales están relacionados con moléculas con dobles enlaces,
estas contienen dos tipos de orbitales moleculares: un orbital sigma que corresponde a
los electrones enlazantes (σ) y un orbital molecular pi asociado a los electrones (π). Los
electrones se encontraran en estado fundamental (baja energía) pero cuando se le dé
una REM UV-Vis estos pasarán a un estado energético más elevado y inestable
(antienlazantes).
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Además de los electrones pi y sigma, muchos compuestos contienen electrones no
enlazantes (n).
Así una molécula que tenga dobles enlaces, es decir, enlaces π, σ y orbitales no
enlazantes (n) podrá tener los siguientes saltos energéticos:
σ -> σ *, N-> σ * , π -> π* y N -> π*
Los compuestos saturados, con dobles enlaces, tienen electrones no enlazantes en los
orbitales N, estos electrones pueden tener transiciones n -> σ * que necesitan menos
energía que las transiciones σ -> σ *. Estas dos transiciones son poco probable en la
zona espectral UV. La mayoría de transiciones que tienen lugar en la técnica de
absorción UV-Visible son π -> π* y N -> π* por parte de moléculas orgánicas con
enlaces insaturados (dobles).
Las transiciones π -> π* y N -> π* constituyen la mayoría de las aplicaciones de la
espectroscopia UV-Vis de los compuestos orgánicos, esto es a causa que la energía
que se necesita para estos saltos conducen a picos de la región UV-Visible. Las
transiciones N -> π* suelen tener unos picos de absorbancia más bajos que las
transiciones π -> π* . Experimentalmente esta absorción tiene lugar en la zona espectral
de entre 200-700nm.
Energía-
Molécula con enlaces sigma y pi
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Estas grupos insaturadas capaces de absorber UV-Vis, se llaman grupos cromóforos.
La absorción de estos grupos se puede ver afectada por la presencia de grupos
auxocrómicos. Estos grupos funcionales no absorben por si solos en UV-Vis pero
pueden influenciar los picos de absorción de los grupos cromofóros.
- Efecto batocrómico: desplaza aumentando la longitud de onda de máxima
absorción
- Efecto hipsocrómico: desplaza disminuye la longitud de onda de máxima
absorción
- Efecto hipercrómico: aumenta la absorción.
- Efecto hipocrómico: disminuye la absorción
A parte de estos grupos la absorbancia también puede verse modificada por la polaridad
del disolvente donde se encuentra la molécula. Si el disolvente es polar las transiciones
N -> π* se desplazan hacia longitudes de onda más cortas (efecto hipsocrómico) a
diferencia de si la transición es π -> π* que se observa una tendencia inversa (efecto
batocrómico).
La conjugación de grupos cromóforos, es decir que haya alternados enlaces simples y
dobles también provoca una modificación de la absorbancia . Esta conjugación provoca
un efecto batocrómico y un efecto hipercrómico a causa de una reducción de la energía
del orbital π* y por lo tanto un menor carácter antienlazante.
FUNDAMENTO: LEY LAMBER-BEER
En esta técnica estudiamos la absorbancia de REM UV-Vis por parte de una molécula.
Como ya se ha comentado, la absorbancia consiste en el menos logaritmo de la
transmitancia.
La transmitancia se define como la parte de REM incidente que consigue atravesar la
muestra (no absorbida).
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La transmitancia se expresa como: T= P/ P0, donde P indica REM incidente y P0 la REM
transmitida.
La absorbancia por lo tanto será A= -logT.
A partir de este valor de absorbancia Lamber-Beer desarrollo una ecuación que
relacionar este valor con la concentración de analito en la muestra.
La ley de Lamber- Beer relaciona la absorbancia con la concentración, la absortividad y
los cm de la cubeta. La absorbancia es directamente proporciona a la longitud de la
trayectoria de la REM en la solución (cm de la cubeta) y a la concentración del analito
absorbente.
A= ɛ *C* b
ɛ= absortividad molar (característica de la molécula)
c= concentración del analito (g/l)
b= cm de la cubeta (1cm)
Gracias a esta fórmula a partir de la absorbancia podremos obtener la concentración de
nuestro analito en la muestra à análisis cuantitativo.
Esta ley tiene ciertas limitaciones:
- A concentraciones de analito elevadas (>0,01M) se puede ver modificada la absorbancia, se pierde la linealidad entre la concentración y la absorbancia. Esta
limitación es a causa de que la distancia entre las moléculas disminuye hasta el
punto de que cada molécula altera la distribución de carga de las moléculas
vecinas. Por lo tanto solo describe bien la relación concentración-absorción en
soluciones diluidas, si la muestra es muy concentrada será necesario diluirla.
- Desviaciones instrumentales: siempre conducen a errores negativos en la absorbancia. Puede ser causa de una radiación policromática (la ley solo acepta
monocromáticas) , radiación parásita o errores de la lectura de la absorbancia.
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INTRUMENTACIÓN:
Las fuentes de emisión deben ser continuas:
- Lámparas de deuterio (región UV) o hidrogeno.
- Lámparas de filamento de tungsteno (región Visible).
- Lámpara de arco de xenón.
Los selectores de longitud de onda mas utilizados son los monocromadores como el
prisma o la red de difracción. También se podrían usar los filtros.
El material de la cubeta de la muestra no debe absorber REM UV-Visible, por lo tanto
debemos usar:
- UV (<350nm): cuarzo o sílice fundida.
- Vis (350-200nm): vidrios de silicato.
De normal la longitud de la cubeta (b en la ley de Beer) tiene un valor de 1 cm.
Finalmente tenemos los detectores: fototubo (180-600nm) y el más utilizado el tubo
fotomultiplicador (UV-Vis). Este último detector consta de un cátodo y de una serie de
dinodos que amplifican los fotones a electrones.
Como se ha visto en temas anteriores hay varios tipos de instrumentos:
- Haz simple: las determinaciones se hacen por etapas separadas. Primero se mira el blanco y seguidamente la muestra.
- Doble haz: el instrumento nos permite medir a la vez la absorbancia del blanco y de la muestra, de esta manera se reducen los errores instrumentales ya que
en caso que hubiera alguno queda eliminado. Mayor precisión, pasa
simultáneamente la radiación entre las dos cubetas.
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- Instrumento con serie de dinodos: La muestra se encuentra entre la fuente y
el elemento dispersante. La REM primero pasa por la muestra y seguidamente
la radiación no absorbida va a un elemento de dispersión que la separará en
todas las longitudes de onda que se dirigirán hasta el detector que consiste en
una serie lineal de dinodos. El hecho que sea un detector con varios dinodos nos
permitirá determinar varias longitudes de onda a la vez. Podremos conocer la
absorción de la muestra en varias de longitudes de onda en una única
determinación.
APLICACIONES
- Utilizada básicamente para un análisis cuantitativo gracias a la aplicabilidad tanto en sistemas orgánicos cómo inorgánicos, alta selectividad, buena precisión
y fácil adquisición de datos.
- Análisis cualitativo: proporciona una información limitada para el análisis
cualitativo, la identificación de la molécula de manera inequívoca es muy
complicada.
- Interpretación del espectro: hace falta tener una gran base de datos de espectros
para hacer una comparativa muy exhaustiva y poder identificar correctamente la
molécula. Será útil para poder confirmar la presencia de una molécula.
- Determinación del punto isosbéstico y pKa: se basa en que la absorción de la
molécula con grupos funcionales ácidos o básicos depende del pH del medio.
Se debe obtener el espectro de la molécula a diferentes valores de pH,
dependiendo del pH la molécula absorberá una longitud de onda o otra ya que
los grupos funcionales serán diferentes. El punto donde de cruzan los espectros
se denomina punto isosbéstico. Su aparición evidencia que en el equilibrio se
encuentran dos especies absorbentes (acida-base). Gracias al punto isosbéstico
encontraremos el valor pKa, este se define como el valor de pH en el cual la
mitad del compuesto está en la forma ácida y la otra mitad la forma básica.
- Seguimiento de las reacciones químicas.
- Análisis de muestras; la absorbancia total de una disolución a una longitud de
onda concreta es igual a la suma de las absorbancias de los componentes (Ley
de Beer es aditiva). La abosrbancia total depende de las abosrbancias de los
componentes.
Atotal = Aa+ AB+Ac
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4.2 ESPECTROSCOPIA DE FLUORESCENCIA Y FOSFORESCENCIA
Técnicas que se basan en un proceso de absorción de REM y seguidamente un proceso
de emisión. Las moléculas son especiales y presentan una emisión fluorescentes, son
procedimiento luminiscentes. Su espectro nos da información tanto cuantitativo como
cualitativa.
En la fluorescencia la molécula tienen la capacidad de absorber fotones de la región
UV-Visible, por lo tanto deberán tener enlaces pi, y seguidamente emiten luz a una
longitud de onda más larga, es decir a menor energía.
La fluorescencia se diferencia de la fosforescencia en que la primera no hay un cambio
en el spin del electrón cuando este se excita a diferencia de la segunda técnica que el
electrón excitado se desaparea. Por lo tanto la fluorescencia es una técnica que emite
rápidamente post-excitacion, es decir enseguida los electrones vuelven a su estado
fundamentas y la emisión de luz tiene lugar <10-5s en cambio en la fosforescencia al
haber un cambio en el spin la emisión tiene lugar un cierto tiempo después de haber
excitado la muestra.
FUNDAMENTOS
El electrón lo podemos definir con el spin, la capacidad de moverse sobre si mismo y se
le asigna el valor +-1/2.
En el nivel fundamental los electrones pi se encuentran aparejados creando campos
magnéticos contrarios que quedan anulados. Cuando los electrones pasan a niveles
exitados puede ser con o sin cambio de spin.
Los electrones cuando se encuentran en estado fundamental tienen un estado apareado
de los dos spines, este estado se denomina singulete. Cuando un electrón es excitado
pasaremos a tener un estado excitado singulete, el espín del electrón promocionado
está apareado con el electrón del estado fundamental. Hay algunos casos donde el spin
del electrón excitado y del electrón fundamental se desaparean y se colocan de manera
paralela, en este caso hablaremos del estado excitado triplete. Cuando hablamos de
singulete o triplete hablamos de multiplicidad: estados degenerados correspondientes
al spin electrónico.
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Una transición del estado singulete al estado triplete es mucho menos probable que una
transición del estado singulete fundamental al estado singulete excitado. Por lo tanto en
la fluorescencia, que tiene lugar una excitación singulete-> singulete, habrá una emisión
de radiación (la vuelta del electrón a su estado fundamental) mucho mas rápida que en
la fosforescencia. En este caso el tiempo de vida media del estado excitado triplete es
más larga, la emisión después de una transición triplete/singulete tiene lugar un tiempo
después del fin de la excitación.
DIAGRAMA DE JABLONSKI
El diagrama de Jablonski nos representa la excitación y emisión de los electrones en la
fluorescencia y fosforescencia. Como podemos ver primero hay una absorción donde
los electrones pasan del estado S0 a S2., en el estado excitado éstos pueden sufrir
conversiones internas o la relajación vibracional (cambios entre diferentes estados
exitados) pero emiten RMN no radiantes. Cuando el electrón pasa del estado singulete
excitado al fundamental hay emisión de radiación que nos da el fenómeno de la
fluorescencia. En algunos casos tiene lugar esta transición pero sin que se desprenda
radiación, se desprende calor, son electrones que desactivan, este proceso se llama
conversión externa. Hay una transición que es del singulete S1 a triplte T1, que se llama
cruce entre sistema, esta es una transición no radiante y nos permite llegar al estado
triplete (es imposible a la práctica pasar del S0 a T1). El paso de T1 a estado fundamental
es una transición radiante-> fosforescencia.
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Por lo tanto en resumen:
ü Radiantes: Fosforescencia (tàs)
Fluorescencia (s1às0)
ü No radiantes: Conversión externa(s1às0)
Conversión interna (s2às1)
Cruce entre sistemas (s1-àt1)
Relajación vibracional (los electrones excitados se van relajando
a estados menos energéticos)
Como ya hemos comentado la duración de los procesos despende de como de probable
sea el proceso, por lo tanto la fluorescencia (10-6) en cambio la fosforescencia (102 -105).
El hecho que los electrones sufran relajación vibraciones, es decir, que se exciten a un
nivel elevado de energía y se vayan relajando a niveles inferiores antes de emitir, se
denomina relajación de Stokes. Define que las bandas de fluorescencia o fosforescencia
aparecen a una longitudes de onda mayores que la línea de excitación a causa de la
relajación vibracional.
Los espectros de fluorescencia siempre tendrán: una parte de excitación/absorción que
será a más energía y una longitud de onda más baja, luego habrá la parte de emisión
de fluorescencia y finalmente una parte con menos energía y más longitud de onda que
será la fosforescencia.
λ excitación < λ fluorescencia < λ fosforescencia
E excitación > E fluorescencia > E fosforescencia
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CUANTIFICACIÓN DE LA FLUORESCENCIA
El requisito mas importante para que haya fluorescencia o fosforescencia es que las
moléculas posean una estructura que absorba el UV-Visible, deben tener lugar las
transiciones de pi à pi* y nà pi*.
En esta técnica nos interesa medir la emisión de REM por parte de la molécula, para
cuantificarla utilizaremos el rendimiento cuántico. Este concepto se define como la
diferencia entre fotones emitidos y fotones absorbidos.
Rendimiento cuántico= Moléculas que emiten/ moléculas absorbidas
Rendimiento cuántico = Fotones emitidos/ fotones absorbidos
El máximo rendimiento cuántico (100%) será la situación en que cada fotón absorbido
resulta ser un fotón emitido. Todo lo que absorbe la molécula será emitido.
RELACIÓN FLUORESCENCIA-CONCENTRACIÓN
En la UV-Visible encontramos la Ley de Beer que relaciona la concentración de la
muestra con la absorbancia. En el caso de la fluorescencia encontramos la ecuación
de Kavanagh.
Relaciona la intensidad de la fluorescencia con la concentración.
F= KI0 2.303εbc
I0= Intensidad del haz indecente de la muestra
F= fluorescencia de la muestra
C= concentración de la muestra
La representación de relación entre la fluorescencia y la concentración de las especies
emisoras es lineal a bajas concentraciones. A concentraciones mayores se pierde la
linealidad,
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PROPIEDADES DE LAS MOLECULAS FLUORESCENTES
Las moléculas deben absorber REM UV-Visible por lo tanto deberán tener electrones pi
y n que se excitarán a niveles superiores (π -> π* y N -> π*).
Deberán ser moléculas con enlaces dobles o triples y si son conjugados y con alto grado
de estabilización por resonancia, serán mas fluorescentes. Otras características que
tienen estas moléculas son: aromaticidad, gran rigidez, estructuras multicíclicas y
grupos dadores de electrones.
Para aumentar la rigidez de las moléculas y por lo tanto la fluorescencia podemos
aumentar el pH, aumentar la viscosidad del medio, llevar a cabo la reacción en un
ambiente sin oxigeno y utilizar temperaturas bajas.
Hay algunos aspectos que pueden provocar una disminución de la fluorescencia
(Quenching):
- Estático: si la molécula fluorescente interacciona previamente con otra
molécula y se queda estática disminuirá la fluorescencia.
- Colisiones: molécula excitada que choca con otra molécula y pierde energía
(intensidad) y eso provoca una reducción de la fluorescencia.
- Químicos: el pH, presencia de oxigeno, polaridad.
- Concentración: al momento en el que se llega a una concentración de la
molécula máxima la intensidad de fluorescencia tenderá a reducirse.
Las moléculas que desprenden radiaciones fluorescentes se denominan fluorocromo, los más típicos que tienen fluorescencia intrínseca son:
- Aminoácidos aromáticos: fenilalanina, triptófano, tirosina, aunque no todos
tienen el mismo rendimiento quántico.
- Vitaminas A, B6, B12, E.
- Catecolaminas
- Porfirinas: hemoglobina
- Esteroides: colesterol.
- Tetraciclinas, AINES, barbitúricos.
Hay algunas moléculas que no son fluorescente pero se les puede añadir un marcador
fluorescente (conjugación), hay una unión covalente o no covalente entre la molécula y
el marcador.
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FLUORESCENCIA- INTRUMENTACIÓN
Para la fluorimetría se pueden usar dos instrumentos, debemos recordar que en esta
técnica la luz incidente y la luz emitida (detector) deben estar a 90º:
- Espectrofluorímetro, tiene de elemento de difracción el monocromador.
- Fluorímetro de filtro usan como elemento de difracción los filtros.
Espectrofluorímetro
La luz procedente de la fuente de excitación pasa a través de un monocromador que
permite escoger la longitud de onda a la que queremos excitar. Una vez la luz pasa a
través de la muestra, los electrones se excitan absorbiendo luz y seguidamente se
emitirá luz fluorescente a todas las direcciones. Algunas de las REM emitidas pasaran
por un segundo monocromador y llegarán al detector. Es importante que haya dos
monocromadores el primero que nos permite seleccionar la longitud de onda a la que
queremos excitar y el siguiente pre-detector nos permite escoger la longitud a la que la
molécula emite (análisis cualitativo). El detector debe estar colocado a 90º de la fuente
de emisión, es un factor muy importante porque sino el detector también nos dará
información de la REM no absorbida (REM parásita) y nosotros queremos conocer la
REM emitida (fluorescente).
Las lámparas usadas deben de ser UVI-Visible y se usan: lámpara de arco de xenón,
lámpara de vapor de Hg o láser. Seguidamente encontramos los monocromadores. La
REM incidirá a la muestra que se encuentra en una cubeta, es necesario que sea
transparente y no absorba la luz, en esta técnica vamos a utilizar el cuarzo. Finalmente
encontraremos el detector, el mas utilizado es el tubo fotomultiplicador, la señal es de
baja intensidad y este detector nos permite ampliarla.
REM Parásita
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Análisis del espectro
En esta técnica podemos analizar dos espectros diferentes:
- Espectro de excitación: representa la absorción por parte de la molécula. No se
selecciona ninguna longitud de onda en el monocromador de emisión. Se van
modificando las longitudes de onda de excitación mientras que las de emisión
se mantienen, así se podrá buscar la longitud donde haya máxima excitación y
por lo tanto fluorescencia.
- Espectros de emisión: representan la emisión de fluorescencia y fosforescencia,
se deberá dejar fija la longitud de onda del primer monocromador (la longitud de
onda debe ser aquella donde la excitación sea máxima).
Nos dará un espectro con dos bandas, la primera a mas energía y menos
longitud de onda corresponde la fluorescencia y la segunda de menos energía
pero mas longitud de onda a la fosforescencia.
El detector nos da un espectro que permite un análisis tanto cualitativo como cuantitativo
de la molécula.
- Cualitativo: las bandas que aparecen en el espectro nos dan información
cualitativa, son características de cada molécula, por lo tanto si comparamos los
espectros con bases informáticas podremos identificar la molécula. La longitud
de onda de emisión de las moléculas es característica de cada uno y nos permite
poder identificar. Da mucha información en el cas de interacción entre dos
sustancias, se puede observar el efecto sobre el fluorocromo según la
interacción.
- Cuantitativos: alta sensibilidad y límites de detección más bajos que en UV-
Visible. Con la ley de Kavanagh se puede relacionar la intensidad de la
fluorescencia a una determinada longitud de onda con la concentración. Esta
ley solo se cumple a absorbancias bajas (A<0,05), a partir de este valor se pierde
la linealidad de la recta y por lo tanto ya no se cumple la ecuación.
APLICACIONES
- Técnica muy sensible y selectiva, muy útil para los estudios cuantitativos.
Gracias a la relación lineal de fosforescencia y concentración, podemos hacer
una recta de calibrado que nos permitirá conocer a partir de la F la concentración.
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- Microscopia de fluorescencia: observación de la expresión de una proteína.
Cuando se hace la reacción con la proteína se une un fluorocromo que nos
indicara si hay presencia o no de la proteína.
- Detección de interacción entre proteínas: 2 fluorocromo diferentes están cerca
con diferentes longitudes de onda de emisión y de absorción. En este caso los
fluorocromo interaccionan y se superponen (transferencia de energía).
- Estudio de fragmentos para el desarrollo de fármacos: un fármaco si esta unido
al agua no desprende fluorescencia pero cuando interacciona con las proteínas
desprende. Se pude utilizar la técnica para conocer la desnaturalización de las
proteínas y si nuestro fármaco se une a ellas, a medida que se ira uniendo a las
proteínas, dejará de unirse al agua y desprenderá fluorescencia.
FOSFORESCENCIA- INTRUMENTACIÓN
Técnica muy parecida a la fluorescencia pero la radiación tarda unos segundo a ser
emitida después de haber excitado la muestra.
El hecho que tarde un tiempo en emitirse la REM hace que sea una técnica más
compleja y menos usada, se necesita una temperatura y condiciones muy constantes
para que los electrones no se desexciten con una REM no radiante. Se suele utilizar el
nitrógeno líquido para mantener las condiciones. La estructura molcular y el entorno
químico influencian que una sustancia termine emitiendo REM luminiscente y la
intensidad.
Para aumentar la probabilidad de que tenga lugar este proceso podemos trabajar con
temperaturas muy bajas, aumentar mucho la viscosidad o incorporar un tensioactivo que
haga la molécula más rígida.
Los instrumentos que se usan para esta técnica son el fosforímetro o
espectrofosforímetro, ambos instrumentos son muy parecidos a los usados en la
fluorescencia pero tienen un componentes adicionales: el vaso de Dewar que
proporciona una temperatura constante
APLICACIONES
- Aplicaciones muy específicas, como la determinación de especies orgánicas o
inorgánicas, por la dificultad de las condiciones necesarias.
Técnica instrumentales
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9 Técnicas espectroscópicas: Espectroscopia molecular Espectrofotometría de fluorescencia, fosforescencia y quimioluminiscencia
Aina Font i Barceló ombr
4.3 ESPECTROSCOPIA DE QUIMIOLUMINISCENCIA
Se basa en el mismo fundamento que la fosforescencia y la fluorescencia pero en este
caso no hay una lámpara que excite la muestra, sino que la transición a niveles
superiores tiene lugar en respuesta a una reacción química.
La reacción química permite la transición de los electrones a estados superiores y al
relajarse emitirán la REM, no hay ninguna radiación de excitación. La reacción entre la
muestra y el reactivo dará la emisión, y la intensidad de está dependerá de la
concentración de los reactivos. El rendimiento de luminiscencia nos dará la información
de la eficacia de la técnica.
La instrumentación en esta técnica es muy básica, por lo tanto es una técnica muy
sencilla. El luminometro detecta la luz emitida por nuestra muestra utilizando de detector
un tubo fotomultiplicador que ampliará cada fotón a un seguido de electrones (campo
eléctrico).
APLICACIONES
- Determinación de especies orgánicas o inorgánicas: según la presencia o no
de ciertas sustancias tiene lugar la reacción de quimioluminiscencia.
RESUMEN
En resumen de las tres técnicas:
- Fluorescencia: hay una lámpara que irradia nuestra muestra, esta absorbe la
energía y pasa de estado S0 a S1 (no hay cambio de spin). La radiación que
emite será justo después de haber excitado la muestra.
- Fosforescencia: hay una lámpara que irradia nuestra muestra, esta absorbe la
energía y pasa de estado S0 a T1 (hay cambio de spin). La radiación que emite
será unos segundos después de haber excitado la muestra, harán falta unas
condiciones muy constantes.
- Quimioluminiscencia: No es necesario una lámpara de REM para excitar los
electrones, estas transiciones tienen lugar gracias a una reacción química. El
detector determina la radiación emitida después de la reacción química.