3 Evaluacin de Medios de Cultivo 3.1 INTRODUCCION Un medio de cultivo es el material nutritivo en el que se pueden recuperar, multiplicar y aislar a los microorganismos in vitro, as como efectuar pruebas de susceptibilidad. El desarrollo de las tcnicas de crecimiento de microorganismos en medios slidos y de obtencin eficaz de cultivos puros se debi a Koch y Loeffler en 1882, el cual sigue siendo esencial en todas las reas de la microbiologa. Gran parte de la Microbiologa depende de la capacidad de cultivar y mantener microorganismos en un laboratorio a travs de medios especiales de cultivo para aislar e identificar los microorganismos, evaluar la sensibilidad a los antibiticos, analizar agua y alimentos, en microbiologa industrial y otras actividades. Los microorganismos necesitan fuentes de energa y la composicin precisa de un medio adecuado depender de la especie que se quiere cultivar, debido a que las necesidades nutricionales varan considerablemente y pueden ser elementales (para su composicin celular) energticas (satisfacen las reacciones oxido-reduccin) o especficas (compuestos que deben ser proporcionados porque no se encuentran en sus vas sintticas). Adems de los nutrientes los medios de cultivo deben reunir condiciones fsico-qumicas especficas de actividad de agua, pH, potencial de oxido-reduccin (E0), condiciones de isotona. Todos los microorganismos en general, bacterias y hongos en particular se cultivan sobre sustratos nutritivos para poder estudiar sus propiedades o la utilizacin de ellas en condiciones controladas. 3.1.1 CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Principalmente se clasifican en base a los requerimientos nutricionales de los diferentes microorganismos en: Bsicos o Generales: Contienen los nutrientes esenciales para promover el desarrollo de microorganismos poco exigentes nutricionalmente. Tales medios pueden ser: caldo o agar nutritivo, caldo tioglicolato, caldo triptosa, agar Tripticasena soya. Enriquecidos: Suplementados con otros nutrientes para promover el desarrollo de microorganismos exigentes: Ejemplo son agar sangre, agar chocolate, agar suero, entre otros. De enriquecimiento: Para aumentar la propagacin de ciertos microorganismos sin favorecer el desarrollo de otros, utilizados para el aislamiento de enterobacterias: Ejemplo son caldo selenito de sodio y cistena, caldo tetrationato, agar yema de huevo mas leche, etc. Selectivos: Se incorporan sustancias inhibidoras de la propagacin de un grupo de bacterias, pero permiten el crecimiento de otros grupos. Ejemplo son agar endo, eosina-azul de metileno y MacConkey. 31. Diferenciales: Permiten identificar con cierta facilidad algunos gneros o especies bacterianas por el aspecto caracterstico que toman sus colonias. Ejemplo de estos medios son el agar sangre, MacConkey. De transporte: se utilizan en el envo de muestras al laboratorio, ms comunes son: Stuart, caldo tioglicolato, caldo nutritivo y medio Carry-Blair. Para el mantenimiento: son medios simples y no deben estimular un crecimiento abundante. Se pueden emplear: agar nutritivo, medio de Dorset. Para el estudio de carbohidratos: medio basal OF, de Hugh Leiffson, medio para MR-VP y los que prueben algn azcar. 3.1.2 CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO El control de calidad de los medios de cultivo consiste en una evaluacin sistmica del trabajo para asegurar que el producto final se ajuste a un grado aceptable a lmites de tolerancia previamente establecidos, donde finalmente se proporcionen resultados verdicos y permite que se acepten los registros documentados de los fabricantes y abastecedores de productos comerciales. La viabilidad de los medios debe probarse con cultivos tipo de microorganismos de la ATCC (Coleccin Americana de Cultivos Tipo) u otras cepas certificadas. Para realizar el control de calidad de los medios de cultivo es necesario considerar los siguientes puntos bsicos: a) Personal: debe ser capacitado en el rea especfica y con un entrenamiento prctico. b) Material de vidrio: debe estar limpio, seco y libre de cualquier tipo de contaminantes, ya que la presencia de stos puede afectar los resultados. c) Materia prima: debe presentar caractersticas homogneas en el tamao de partcula, color y no presentar apelmazamiento. El envase debe ser de tapa de aluminio, frasco de vidrio mbar, composicin completa en la etiqueta, debe precisar fecha de caducidad, indicacin clara de la preparacin, as como el nmero y lote. El control de calidad para los medios de cultivo debe, en el anlisis final, asegurar que un medio respalde el desarrollo de los microorganismos, inhibir el desarrollo de microorganismos comensales, exhibir una respuesta bioqumica tpica, ser estable y tener un tiempo de conservacin razonable. 3.1.3 PRUEBAS QUE SE REALIZAN A LOS MEDIOS DE CULTIVO Esterilidad. La frecuencia con que se realizan las pruebas de control de calidad de medios es determinada por cada laboratorio y a las instrucciones de los fabricantes para todos los productos comerciales usados y debe efectuarse con varios tubos o frascos de cada lote. Se realiza particularmente para aquellos medios a los que se les adicionan componentes luego de la esterilizacin, visualmente y por subcultivo. Ciertos medios selectivos que pueden suprimir suficientemente el crecimiento visible de bacterias; sin embargo, pueden aparecer microorganismos viables al subcultivar. Los parmetros a evaluar son aspecto fsico como signos de deterioro, decoloracin, turbidez, cambios de color o estado de hidratacin. 32.Pruebas de promocin e inhibicin de crecimiento Para determinar la capacidad del medio para respaldar el desarrollo del microorganismo inoculado con una concentracin baja que nos permita ver la funcionalidad del medio, considerando que un error frecuente del control de calidad es el uso de un inculo concentrado que puede producir un desarrollo desorientador, para lo cual es necesario estandarizar esta prueba, mediante el empleo de una tcnica que nos ayude a dicho propsito como la tcnica de Miles & Misra. Esta tcnica es una de las ms empleados para medios slidos, la cual consiste en sembrar una suspensin de un cultivo joven de las cepas sobre la superficie de una placa, divida en cuadrantes; la suspensin debe ser de 0.02 ml, y adicionada en cada cuadrante, de cada una de las diluciones del cultivo. Despus de la incubacin de la caja, se cuenta con el nmero de UFC que crecen en cada dilucin. 3.1.4 USOS Y LAS APLICACIONES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Medicina Humana y veterinaria, se efectan investigaciones microbiolgicas en el diagnstico de infecciones y para el control de las medidas teraputicas que le siguen. Industria Farmacutica, la mayor parte de los productos de esta industria deben cumplir con una especificacin microbiolgica establecida de acuerdo a la Farmacopea respectiva. En consecuencia, el control de calidad microbiolgico es una fase importante en el proceso de produccin. Industria Cosmtica, debido que casi todos estos productos contienen sustancias biolgicas activas y por ello pueden contener microorganismos patgenos. Industria Lctea, la leche cruda es un medio de cultivo ideal para numerosos microorganismos. Industria Crnica, en los mataderos es donde se procede a investigaciones microbiolgicas y para la deteccin de residuos de antibiticos, si un animal ha estado tratado con antibiticos antes del sacrificio. Industria Alimentaria y de Bebidas, productos naturales pueden deteriorarse debido a la presencia de microorganismos. Su tratamiento est sometido a reglamentaciones particularmente estrictas. 33.3.2 OBJETIVO GENERAL Al finalizar la prctica el alumno deber: Evaluar medios de cultivo, por medio de la promocin e inhibicin de crecimiento microbiano para determinar si los medios de cultivo son viables. 3.2.1 OBJETIVOS PARTICULARES Aplicar la tcnica de Miles & Misra, por medio de la inoculacin de cepas ATCC (Coleccin Americana de Cultivos Tipo) en los medios de cultivo a utilizar y determinar si los medios de cultivo son viables. Comprobar si la morfologa colonial obtenida en cada uno de los medios de cultivo es especfica de los microorganismos tipo empleados. 34.3.3 METODO EXPERIMENTAL 3.3.1 MATERIAL 4.3.1.1 EQUIPO Microscopio ptico Estufa de Incubacin Vortex Asa bacteriolgicas calibradas de 0.01 y 0.001 ml Mecheros Bunsen 3.3.1.2 MATERIAL DE VIDRIO Tubos de ensaye de fondo plano Pipetas graduadas de 1.5 y 10 ml Porta objetos planos Cubre objetos Tubo 0.5 del Nefelmetro de Mac Farland 3.3.1.3 MEDIOS DE CULTIVO (por equipo) Agar Sangre (AS) Agar Chocolate (ACh) Agar Eosina-Azul de Metileno (EMB) Agar Cetrimida (AC) Agar sales Manitol (ASM) Agar McConkey (AMc) Agar Dextrosa Saboraund (ADS) Agar Salmonella-Shigella (SS) 3.3.1.4 CEPAS ATCC # COLECCION Salmonella enteritidis Enterobacter aerogenes Staphylococcus aureus Pseudomonas aureginosa Cndida albicans Streptococcus -hemoltico grupo A Escherichia coli Shigella 3.3.1.5 PRUEBAS BIOQUIMICAS OF Nitratos MR VP KIA SIM Urea Citratos MIO Arginina Malonatos LIA 3.3.1.6 REACTIVOS Glicerol Cristal Violeta Alcohol etlico al 70 y 90% Acetona Lugol 35.Safranina Aceite de inmersin Solucin Salina Fisiolgica (estril) 3.3.2 METODO EXPERIMENTAL 3.3.2.1 DETERMINACION DE LA DILUCION PARA LA TECNICA a) Sembrar las cepas de los diferentes microorganismos con un asa bacteriolgica 24 horas antes de la experimentacin. b) Dividir en cuatro partes las cajas petri, y posteriormente colocarlas durante menos de una hora en la estufa de incubacin a 37 C. c) Rotular la serie de tubos de ensaye para cada microorganismo del 1 al 5 respectivamente, y agregar 4.5 ml de SSF (estril). d) Preparar una suspensin de la cepa del microorganismo igualando la turbidez con el tubo nmero 0.5 del Nefelmetro de McFarland el cual equivale a 1.5 x 108 UFC / ml e) Tomar de la solucin anterior un volumen de 500 l con una micro pipeta y adicionarlo a un tubo que contenga SSF (Tubo 1 de dilucin 10-1) f) Homogenizar la solucin en el vortex g) Tomar del tubo 1 un volumen de 500 l con una micro pipeta y adicionarlos a otro tubo con SSF (Tubo 2 de dilucin 10-2) h) Homogenizar la solucin obtenida en el Vortex. i) Realizar los pasos hasta el tubo 5. 3.3.2.2 PROMOCION E INHIBICION DE CRECIMIENTO a) Agregar 10 l de la dilucin para la tcnica de Control de Calidad en los diferentes medios de cultivo a evaluar y distribuir uniformemente. Para realizar esta tcnica se debe emplear segn sea el medio de cultivo: un microorganismo que debe crecer (Cuadrante I), uno que debe diferenciarse del anterior (Cuadrante II) y por ltimo otro que no debe crecer (Cuadrante III) y el ltimo cuadrante se emplea como rea de esterilidad. b) Esperar a que la solucin anterior se difunda en el medio de cultivo, posteriormente realizar un barrido y/o estriado con una asa bacteriolgica y se incuba las cajas petri con los medios de cultivo en la estufa de incubacin a 37 C / 24 hrs. c) Realizar la lectura de las cajas petri (conteo manual), en donde el nmero de colonias debe oscilar entre 20-30 por cuadrante. d) Realizar el ensayo al mismo tiempo en un medio de referencia para asegurar el crecimiento del microorganismo, empleando la misma dilucin para cada una de las cepas de microorganismos empleados para comparacin de la recuperacin bacteriana en los medios de cultivo evaluados y de referencia. NOTA: A continuacin se presenta un diagrama de flujo con base al diseo experimental. 36.3.4 DIAGRAMA DE FLUJO 37.3.5 RESULTADOS UNIVERSIDADNACIONALAUTNOMADEMXICO. FACULTADDEESTUDIOSSUPERIORESCUAUTITLAN. LABORATORIODEMICROBIOLOGAFARMACETICA. NOMBRE DE LA PRCTICA CONTROL DE CALIDAD DE MEDIOS DE CULTIVO. Fecha de la Prctica No. de Prctica NOMBRE DE LOS ANALISTAS Nombre de la bacteria/Levadura Gram Catalasa Oxidasa O/F Otra prueba especificar CUENTA VIABLE. Dilucin Morfologa Colonial Tipo de Agar: _________________________________ UFC/mL 10-1 10-2 10-3 10-4 38. NOMBRE DEL AGAR MODO DE ACCIN CONTROL DE CALIDAD. Parmetros a evaluar Bacteria/Levadura Morfologa Colonial UFC/mL Promocin (--) Promocin (+) Inhibicin Esterilidad PRUEBAS BIOQUMICAS. PRUEBA Microorganismo usado Cumple 39.3.6CONCLUSIONES _____________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________. FIRMA DE REVISIN 40.4.7 BIBLIOGRAFIA BOLAOS, Carlos Alberto y ANACORETA, Inocencia Vargas. Tesis. Evaluacin de la Estabilidad de diferentes Medios de Cultivo preparados en condiciones estndar. FESC, 1999. COLLARD, Patrick. El desarrollo de la Microbiologa. Editorial Reverte. Barcelona, Espaa. 1990. COLLINS, C.H. Mtodos Microbiolgicos. 5 ed. Editorial Acribia. Zaragoza, Espaa. 1990. HERNNDEZ, Guadalupe. Tesis. Manual de Prcticas del Laboratorio de Bacteriologa. FESC, 2000. KONEMAN, MD. Diagnstico Microbiolgico. 5 ed. Editorial Mdica Panamericana. Buenos Aires, Argentina. 1999 MANUAL DE RECOMENDACIONES GENERALES PARA LA PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO. Secretara de Salud. Direccin General de Epidemiologa. Instituto Nacional de Diagnstico y Referencia Epidemiolgicos Dr. Manuel Martnez Bez. Mxico DF, 1989. NORMA OFICIAL MEXICANA, NOM-065-SSA1-1993. Especificaciones Sanitarias de los Medios de Cultivo. PRESCOTT, Lasing. Microbiologa. 4 ed. Editorial McGraw-Hill Interamericana. Espaa, 1999. 41.PRCTICA No. 4 CONSERVACIN DE CEPAS INTRODUCCIN Los sistemas de Validacin son los procesos que se requieren para asegurar que los parmetros de funcionamiento de los test, tanto comerciales como los de uso domsticos, son los esperados y las pruebas pueden ser utilizadas como mtodos de diagnstico en el laboratorio. La mayora de los procedimientos en Microbiologa, dependen de que los microorganismos viables en el cultivo sean capaces de mantener sus caractersticas morfolgicas, fisiolgicas y que sean tpicas y reproducibles. Para ayudar en este control, las Cepas Estndar de Control de Calidad, son un componente esencial de un proceso de validacin. Existen varias colecciones de cepas utilizables para el control de calidad. Algunos ejemplos son: ATCC : American Type Culture Collection- Rockville, USA NCIC : National Collection of Industrial Bacteria- Survey, Inglaterra JFCC: Japanese Federation of Culture Collection of Microorganism- Japn CCTM : Coleccin Nacional Lille, Francia RIA: USSR Reseach Institute for Antibiotics- Mosc, Rusia. NCIB : Coleccin Nacional industrial Aberdeen, Escocia DSM : Deutsche Sammlung von Mikroorganismen Gottinger, Alemania. As, la E. coli ATCC 25922 es igual a la DSM 1103 y a la NCIB 12210. Los organismos que han de ser utilizados en el control de equipos o sistemas de identificacin, generalmente son estipulados por los fabricantes o bien escogidos por el usuario. Generalmente se utilizan cepas de referencia como las ATCC y si son cepas domsticas, es necesario tener un historial del organismo que incluye nombre, rea de aislamiento, reacciones bioqumicas y patrn de sensibilidad a los antibiticos, forma de almacenaje, fecha de ltimo pase. En todo caso, las cepas de referencia deben tener requisitos especficos: Caractersticas tpicas. Caractersticas estables. Reproducibilidad. 42.MTODOS DE CONSERVACIN DE CEPAS BACTERIANAS. Los mtodos de conservacin de las cepas estndar de control de calidad, deben asegurar que las mismas mantengan sus caractersticas tpicas y que puedan ser reproducidas despus. El medio utilizado para su conservacin debe mantener un mnimo de mutaciones. Estas mutaciones pueden evitarse permitiendo tambin el mnimo crecimiento del microorganismo y aportando ptimas condiciones ambientales para su sobrevivencia, con el menor nmero de subcultivos. Para una mejor clasificacin de los mtodos de conservacin de cepas, los dividiremos en tres categoras: Cultivos Stock, Semistock y Cultivos de Trabajo diario. CULTIVOS STOCK: Estos representan el verdadero " Banco de Cultivos". Estos son mantenidos en un sistema cerrado de conservacin, minimizando su actividad gentica y fisiolgica, para evitar su potencial mutacin. Los dos mtodos ms importantes para conservacin en Stock, son la Liofilizacin y el ultracongelamiento. LIOFILIZACIN: Se hace una suspensin fuerte de un cultivo puro y joven en leche estril o similar, y se coloca en tubos con tapn de rosca y se siguen las instrucciones del aparato liofilizador, que puede ser tan sencillo como un simple bomba de vaco, hasta un sofisticado sistema. Durante este proceso evitar que el cultivo se derrame dentro el aparato liofilizador y la formacin de aerosoles. Este sistema tiene la ventaja de ser el que permite la sobrevivencia por un mayor periodo de tiempo y mayores facilidades para el transporte de las cepas. ULTRACONGELAMIENTO: Hacer una suspensin fuerte de la colonia pura en caldo Brucella conteniendo 15% de glicerol o sustituto. Dispensar en porciones de 0.5 ml en pequeos tubos con rosca y coloque en lo profundo del congelador a -45C. Tambin se puede utilizar la modificacin de Ultracongelamiento en Nitrgeno lquido, que consiste en colocar en una ampolla especial dentro de un aparato especficamente designado para el mantenimiento de cepas en nitrgeno lquido. Ambos sistemas preservan las bacterias por largos periodos de tiempo. CULTIVOS SEMISTOCK: Este trmino se refiere al mantenimiento de cultivos por un periodo intermedio entre el relativamente permanente cultivo en Stock y el cultivo de cepas control para el trabajo diario. De las 5 tcnicas listadas a continuacin, solo la de congelamiento es utilizable para el mantenimiento de cepas de anaerobios. Los congeladores convencionales pueden mantener una temperatura entre -10 a -25C. Los cultivos se preparan de la misma manera como en el caso de la ultracongelacin y 43.son colocados en el congelador. El mtodo permite la sobrevivencia de bacterias y levaduras en algunos casos por aos y en la mayora de las veces por al menos de 6 a 12 meses. CONGELAMIENTO EN CONGELADOR CONVENCIONAL: Se preparan tubos con tapn de rosca conteniendo agar soya tripticasa-cistena. Inocular el cultivo puro y jven e incube por 18 a 24 horas para obtener un crecimiento moderado, afloje la tapa y mantenga a temperatura ambiente o preferiblemente en refrigeracin, si es posible en la oscuridad. Microorganismos menos delicados sobreviven bien por un ao y los fastidiosos por 6 meses. CULTIVO EN CTA: Este mtodo es conocido tambin como mtodo Stamp en honor de su creador. Corte pequeos crculos de papel encerado y colquelo en una caja Petri de vidrio. Esterilice en autoclave por 15 minutos a 15 libras de presin. Prepare una suspensin de caldo nutritivo con 10% de gelatina en polvo ( Peso por Volumen ) y 0.25% de cido ascrbico ( P x V ) y dispense en tubos con rosca y esterilice en autoclave. Haga una suspensin fuerte de un cultivo puro y jven y coloque una gota del mismo con una pipeta estril sobre uno de los discos de papel acerado estril en una caja Petri. Con una pinza estril, transfiera el disco a un desecador de vaco conteniendo Pentaxido de fsforo. Evacue el desecador con la bomba de vaco. Cuando el disco est seco, aspticamente introducir en un tubo estril con tapa de rosca y colocar en el refrigerador. Para hacer un subcultivo del disco, aspticamente retire un crculo de papel con las colonias y colocarlo en un tubo conteniendo un caldo de cultivo e incubar por 24 horas a 35C y luego inocular en agar sangre e incubar nuevamente. SECADO EN DISCOS CON GELATINA: Es un mtodo especialmente utilizado para hongos, pero es til tambin para algunas bacterias. En el caso de los hongos, se utiliza un cultivo jven y bien desarrollado en un medio de cultivo inclinado, tal como agar de Sabouraud-dextrosa. Cubrir completamente con aceite mineral estril. El aceite debe ser esterilizado a 15 libras de presin por 45 minutos, para asegurar su esterilidad absoluta. Para reactivar la cepa, colocar la boca del tubo cerca de la llama de un mechero o incinerador y remueva una porcin visible de crecimiento con una asa estril larga o una aguja. Este mtodo permite la sobrevivencia por muchos aos. 44.Si el mtodo se va a utilizar para conservar bacterias, se utiliza Agar de Cerebro-Corazn o agar Mueller-Hinton suplementados con hemoglobina al 2% e Isovitalex al 1%. Los medios se sirven en tubos con tapn de rosca. Se esterilizan y luego se les hace solidificar en forma inclinada. Las bacterias son inoculadas en el medio e incubadas a 35C por 24 horas, tomando en cuenta sus requerimientos de oxgeno. Luego las cepas son cubiertas con aceite mineral estril, hasta 1 cm por encima del final del inclinado. Los cultivos son viables por 2 aos a temperatura ambiente. CONSERVACIN EN MEDIO DE CULTIVO INCLINADO CON ACEITE MINERAL: MANTENIMIENTO EN TIERRA ESTRIL: Es utilizado primeramente para hongos y bacterias esporuladas. Esterilice en autoclave tierra suelta en tubos con rosca a 15 libras de presin por 1 hora. Haga una suspensin fuerte del microorganismo jven y esporulado y colquelo en el tubo con tierra estril. Deje secar y colocarlo en un refrigerador. CULTIVOS DE TRABAJO DIARIO: Los cultivos control para el trabajo diario, son una forma conveniente para realizar el control de calidad de pruebas de uso frecuente y que requieren una lectura comparativa al momento de su lectura. Tal es el caso de las pruebas de coagulasa y oxidasa, entre otras. Para ste propsito se utilizan cultivos de 24 horas y son pasados diariamente. BACTERIAS RESISTENTES: Tal es el caso de Estafilococos y Enterobacterias. Se transfiere una colonia jven de un cultivo en Stock o semistock y se transfiere a un tubo con agar nutritivo inclinado e incubar por un mnimo de tiempo tal que haya crecimiento. Guardar en refrigerador. Los cultivos para trabajo diario, son transferidos a otros tubos de agar inclinado cada mes por un intervalo de 6 meses. Despus de ste tiempo, se debe volver a hacer otro pase del cultivo stock. BACTERIAS DELICADAS : Los cultivos de trabajo diario de organismos delicados como N. Meningitidis, N. Gonorrhoeae, S. pneumoniae y algunos menos delicados como el S. pyogenes, son preparados a partir del stock e incubados por 24 horas en medios apropiados como agar chocolate en ambiente de CO2 , para luego ser colocados en refrigeracin. Despus de una serie de 6 pases consecutivos, se debe preparar otro cultivo para uso diario a partir de la cepa en stock. 45.BACTERIAS ANAERBICAS: Los cultivos para trabajo diario de la mayora de las bacterias anaerbicas, pueden ser mantenidos en medio de carne cocida o en Tioglicolato con 0.5% de carbonato de sodio adicionado despus de esterilizar por autoclave. Los cultivos se incuban por 24 a 48 horas y guardados a temperatura ambiente. HONGOS: Los cultivos de uso diario de hongos, son mantenidos en tubos con agar Sabouraud o sustituto. Los cultivos se incuban a temperatura ambiente hasta que haya crecimiento, y ocurra la esporulacin, para luego ser colocados en refrigeracin. Los cultivos de trabajo deben ser transferidos cada 2 meses. Pasado ste tiempo se debe preparar otro cultivo de trabajo a partir de la cepa en stock. CULTIVOS DE TRABAJO COMERCIALES: Son preparados por casas comerciales utilizando cepas conocidas como la ATCC. Estas son estables en refrigeracin por un ao. Tal es el caso de Bact-Chek de Roche Diagnostics, Bactrol Disk de Difco, entre otras. Para reactivar las cepas se colocan en un caldo nutritivo como el caldo soya tripticasa e incubados por 24 horas a 35C. Luego se hace un pase a un medio de enriquecimiento o agar sangre. Se debe tener especial cuidado en el mantenimiento del cepario, ya que el mismo constituye una ayuda importante en la validacin de equipos, materiales, reactivos y habilidad del personal. Debe existir un programa metdico de pase de cepas , archivo de cada uno de los cultivos con sus caractersticas bioqumicas, sensibilidad a los antibiticos, origen de la cepa, mtodo de identificacin, fecha de siembra y prximo pase. 46.OBJETIVO Conocer y aplicar las tcnicas de mantenimiento de un cepario bacteriano y de hongos, por medio de metodologa establecida en la literatura, para ser utilizados en el control de equipos o sistemas de identificacin. MATERIAL Medios de cultivo y reactivos Cajas de agar soya tripticasa Cajas de agar sal y manitol Cajas de agar MacConkey Cajas de agar cetrimida Cajas de agar dextrosa Sabourou Tubos de OF Tubos de citratos Tubos de MR-VP Tubos de KIA Tubos de LIA Tubos de MIO Tubos de arginina Tubos de malonato Tubos de nitratos Tubos de urea Tubos con caldo nutritivo Tubos de carbohidratos Tubos con agua estril Tubos de dilucin con 5 ml de SSF estril Tubos de dilucin con agar base sangre inclinados Tubos de dilucin con 5 ml de caldo BHI+1% de sacarosa+1% de leche descremada Plasma de conejo Suero humano Perxido de hidrgeno Reactivo para oxidasa Reactivo de Erlich -naftol -naftilamina KOH 40% cido sulfanlico Aceite de inmersin 47. Aceite mineral estril Cristal violeta Lugol Alcohol/acetona Safranina Vidriera y diversos Pipetas graduadas estriles de 1 ml Pipetas graduadas estriles de 10 ml Tubo 0.5 del Nefelometro de MacFarland Microscopio compuesto Mechero/tablita Palillos estriles Asas bacteriolgicas Portaobjetos Cubreobjetos Plastilina Estufa bacteriolgica Refrigerador Congelador Material Biolgico Escherichia coli Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Staphylococcus saprophyticus Streptococcus faecalis Salmonella Typhi Pseudomonas aeuroginosa Enterobacter cloacae Enterobacter aerogenes Citrobacter freundii Klebsiella pneumoneae Candida albicans 48.DIAGRAMA DE TRABAJO No.1. Identificacin y conservacin de cepas. Cepadesconocida Realizarpruebasbioqumicas primarias Sembrarpordilucin AgarSoya Tripticasena Mediosselectivos ydiferenciales OFGram MotilidadCatalasa Incubar24hrs/37C IncubarOxidasa 24hrs/37 Realizarpruebas bioqumicassecundarias C Prepararsuspensin bacterianaigualadaal tubo0.5delNMF. Registrareinterpretar resultadosRegistrareinterpretar resultados. Registrareinterpretar resultados Colocar1ml.encaldoBHI con1%desacarosay1% delechedescremada. Inocularconunaasada2tubos conagarbasesangreinclinados Incubar812hrs/37Cyconservar Auntuboinclinado agregarhastacubrir aceitemineralestrily mantenera2025C Auntuboinclinado agregarhastacubrir aceitemineralestril yrefrigerara8C ElcaldoBHIsecongela a10C 49.DIAGRAMA DE TRABAJO No.2. Recuperacin e identificacin de cepas. Cepaconservada Realizarpruebas bioqumicasprimarias Gram Catalasa Oxidasa Motilidad OF Dividirentreslosmediosselectivosy diferencialeseinocularencadatercio lascepasrecuperadas Dividirentresunacajadeagar soyatripticasenaeinocularen cadaterciolascepasrecuperadas Realizarpruebas bioqumicassecundarias Incubar24hrs/37C Crecimientoenmedios diferenciales y selectivos Registrareinterpretar resultados. Registrareinterpretar resultados Registrareinterpretar resultados Eliminarelaceitemineral estrilaltuboinclinado incubadoatemperatura ambiente Ambientaryeliminarel aceitemineralestrilal tuboinclinadorefrigerado Descongelarelcaldo BHIcolocndoloa temperaturaambiente Crecimientoenagar soya tripticasa 50.7 ANALISISMICROBIOLOGICODEAGUA 7.1 INTRODUCCION El agua empleada en la Industria Farmacutica, ya sea como aditivo en las diferentes formas farmacuticas o en las operaciones de limpieza de los equipos y reas, que participan en los procesos de produccin farmacuticos, debe cumplir ciertas especificaciones dependiendo el tipo de agua que se emplea y en los procesos de produccin que se utiliza. Se debe contar con un sistema de control que asegure y mantenga la calidad del agua desde que se recibe para su proceso de purificacin hasta su uso. La FEUM (Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos) describe las especificaciones y los usos del agua. La siguiente tabla muestra el agua usada en la industria farmacutica: 1 tipo de agua uso especificaciones Agua Purificada El agua purificada es usada como un excipiente en la produccin de preparaciones oficiales, para limpieza de equipo y preparaciones de algunas soluciones farmacuticas. El agua purificada tiene requerimiento fsico, qumico y microbiolgico. Para obtener agua purificada se utiliza agua comnmente de la red municipal que es sometida a varias operaciones unitarias, como desionizacin, destilacin, intercambio inico, osmosis inversa, filtracin u otro proceso de purificacin. pH: entre 5 y 7 Determinar los siguientes compuestos: Cloruros: 0.5 mg/l Sulfatos* Amonio: