2007 Manual Metodos Inmunologicos Completo

UNIVERSIDAD DE COSTA RICAFacultad de MicrobiologaInstituto Clodomiro Picado

Manual deMtodos Inmunolgicos

ES

P

1

2

Bruno Lomonte Vigliotti, MQC, PhD

2007

Manual de Mtodos Inmunolgicos

Cuarta Edicin, 2007

Este folleto puede descargarse gratuitamente por internet, en la siguiente direccin:

http://www.icp.ucr.ac.cr/~blomonte/

Si requiere referirse a este manual como cita bibliogrfica:

Lomonte, B. (2007) Manual de Mtodos Inmunolgicos, 138 pp. Universidad de Costa Rica. Acceso libre en: http://www.icp.ucr.ac.cr/~blomonte/

para comentarios o sugerencias, dirigirse a:

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B. Lomonte i

Manual de

Mtodos Inmunolgicos

INDICE

Cap. 1 Preparacin de antisueros en animales de experimentacin....................... p. 1Cap. 2 Diluciones seriadas y pruebas serolgicas de titulacin ............................ p. 18Cap. 3 Purificacin de inmunoglobulinas mediante tcnicas de precipitacin ....... p. 24Cap. 4 Cromatografa de afinidad e inmunoafinidad ............................................ p. 29Cap. 5 Preparacin de geles de agarosa para tcnicas inmunolgicas .................. p. 37Cap. 6 Doble inmunodifusin en gel ................................................................... p. 42Cap. 7 Inmunodifusin radial .............................................................................. p. 48Cap. 8 Tcnicas de aglutinacin .......................................................................... p. 53Cap. 9 Marcaje de protenas con biotina .............................................................. p. 61Cap. 10 Mtodos inmunoenzimticos: ELISA ....................................................... p. 63Cap. 11 Electroforesis de protenas en poliacetato de celulosa o en agarosa .......... p. 78Cap. 12 Inmunoelectroforesis ............................................................................... p. 84Cap. 13 Electroforesis en geles de poliacrilamida .................................................. p. 90Cap. 14 Inmunoelectrotransferencia (Western blotting) ......................................... p. 100Cap. 15 Hibridomas y anticuerpos monoclonales .................................................. p. 110Cap. 16 Marcaje de anticuerpos con fluorescena .................................................. p. 121

Referencias ............................................................................................................ p. 132

B. Lomonte ii

Prefacio a la Cuarta Edicin

El presente Manual tiene como objetivo proporcionar al lector la informacinesencial para comprender, ejecutar e interpretar los principales tipos de tcnicasinmunolgicas bsicas en el laboratorio. Las aplicaciones clnicas de estos mtodos semencionan ocasionalmente, solo a modo de ilustracin, dado que son objeto de otrarecopilacin. En esta obra se presentan los mtodos inmunolgicos de laboratorio en unaforma muy general, teniendo en cuenta que los mismos son aplicables a numerosossistemas de interaccin antgeno-anticuerpo, ya sea para el trabajo hospitalario, o de otrandole.

Siguiendo el formato de las versiones anteriores de este Manual, se presenta unbreve fundamento terico de cada tcnica, seguido de una descripcin de losprocedimientos, reactivos, principales cuidados, lectura, e interpretacin de los resultados.Las referencias bibliogrficas incluyen, en la medida de lo posible, los trabajos clsicos queoriginaron cada mtodo, y se complementan ocasionalmente con algunos ejemplos deexperiencia propia, o de colegas cercanos.

Se espera que esta modesta obra didctica, cuya primera edicin se imprimi en1989, contine siendo de utilidad para estudiantes universitarios en formacin profesional,y pueda eventualmente servir tambin de consulta posterior. Las valiosas observaciones yayuda de los colegas del Instituto Clodomiro Picado constituyeron un elemento muyimportante en la elaboracin de este Manual, a todos gracias.

San Jos, julio de 2007 Bruno Lomonte Vigliotti

B. Lomonte 1

Captulo 1

Preparacin de Antisueros en Animales deExperimentacin

Introduccin

Los trminos "antisuero" o "suero inmune" son utilizados comunmente para referirse aun suero que contiene altas concentraciones de anticuerpos contra un antgeno dado, obtenidogeneralmente mediante un proceso de inmunizacin. Los anticuerpos (Acs) pueden serconsiderados como herramientas biolgicas de gran utilidad para la deteccin y caracterizacinde diversas molculas de inters diagnstico o investigativo, gracias a su especificidad, la cual esexplotada de muchas maneras en las tcnicas inmunoqumicas. Aunque la mayora de losantisueros de utilidad diagnstica se pueden obtener comercialmente, en ocasiones pueden serfcilmente preparados a un costo menor. Adems, en el trabajo con enfoque investigativo, puedeser necesario preparar antisueros que no se encuentren disponibles a nivel comercial. En estecaptulo se revisan los fundamentos y procedimientos generales para preparar antisueros enanimales.

Contrario a lo que podra esperar quien se inicia en este campo, no existe un esquema deinmunizacin que sea idneo para todos los inmungenos. Ms bien, la inmunizacin secaracteriza por su empirismo, y fundamentalmente est basada en las experiencias descritas porinvestigadores, tan variadas como contradictorias.

En primer lugar, es necesario recalcar que la inmunogenicidad de una molcula, definidacomo su capacidad de inducir una respuesta inmune especfica, no es una propiedad intrnseca,ya que depende del sistema inmune al que se enfrente. La respuesta inmune hacia uninmungeno (o antgeno1; Ag), se encuentra bajo un complejo control gentico y fisiolgico,que implica variaciones no solo entre las especies, sino an entre los individuos de una mismaespecie. Cuando se comparan distintos esquemas de inmunizacin en individuos alognicos, estoes, genticamente heterogneos (por ejemplo conejos, carneros, caballos, etc.), es imposibledeterminar si las diferencias observadas en la respuesta son atribubles al esquema utilizado, o alas diferencias genticas entre los individuos, a menos de que se utilice un nmeroconsiderablemente grande de ellos. El alto costo y esfuerzo que presupone esto, limitasensiblemente la posibilidad de realizar estudios comparativos para optimizar esquemas deinmunizacin. Esta es la principal razn por la cual los mtodos de inmunizacin poseen unmatiz fuertemente emprico. Se ha dicho que "existen tantos esquemas de inmunizacin comopersonas que los realicen", y hay una razonable tendencia a aferrarse a un mtodo, cuando este

1 En este Manual, se utiliza el trmino "antgeno" como sinnimo de "inmungeno", aunque en sentido estricto elprimero se refiere a la capacidad de una sustancia de ser reconocida por los productos de la respuesta inmuneespecfica, independientemente de su capacidad para inducirla o no.

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ha tenido xito previamente. An con estas limitaciones, se puede partir de ciertos lineamientosque son comunes a la mayora de esquemas de inmunizacin.

La preparacin de un antisuero convencional, para la obtencin de anticuerpos policlonalescontra el (los) antgeno(s) de inters, comprende varias etapas o pasos generales (Cuadro 1.1).La purificacin final de los anticuerpos obtenidos puede ser necesaria o no, dependiendo del usoque va a tener el antisuero. Algunas de las principales tcnicas empleadas para la purificacin deanticuerpos se describen en captulos siguientes de este Manual.

Cuadro 1.1: Pasos para la obtencin de un antisuero mediante inmunizacin.1 2 3 4 5 6

Preparacindel

inmungeno

Inmunizacin Seguimiento yevaluacin de la

respuesta (sangrasde prueba)

Sangra final Evaluacin delantisuero

Purificacin delos anticuerpos

de inters

Preparacin del inmungeno

Un aspecto esencial en cualquier inmunizacin es la pureza (homogeneidad) del antgeno oinmungeno. Si se pretende obtener un antisuero monoespecfico, es decir, que reconocenicamente al antgeno de inters, la pureza del antgeno es crucial. El sistema inmune es capazde detectar trazas de contaminantes que podran pasar desapercibidas an por mtodos deanlisis bastante sensibles. Si el inmungeno disponible no tiene un alto grado de pureza, sepuede intentar producir un antisuero monoespecfico reduciendo al mnimo las dosis (paraminimizar la cantidad absoluta de contaminantes), el nmero de refuerzos, y el tiempo total de lainmunizacin. Lo que se persigue con esto es evitar el reconocimiento de los componentescontaminantes en la preparacin del antgeno, aunque ello depender de su inmunogenicidad.Estas medidas pueden resultar eficaces, pero de no ser as, las opciones que quedan son: (a)purificar mejor el antgeno en cuestin, antes de inmunizar; (b) generar el antisuero con elantgeno disponible, y posteriormente tratar de eliminar los anticuerpos dirigidos contra loscontaminantes, utilizando tcnicas de absorcin o de cromatografa de afinidad; o (c) recurrir ala tecnologa de hibridomas (Captulo 15) para obtener anticuerpos monoclonales. Esta ltimaalternativa es la que ha tenido el mayor impacto para la obtencin de anticuerpos contrasustancias que son de muy difcil purificacin.

Adyuvantes

Por lo general, los antgenos se administran junto con un adyuvante, con el fin de inducirla mayor respuesta posible de anticuerpos. Un adyuvante se define como cualquier sustancia queaumenta la respuesta hacia un inmungeno cuando se administra junto con l. Se han descrito

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diversas sustancias que poseen actividad adyuvante y algunos de sus mecanismosinmunopotenciadores se conocen parcialmente (Cuadro 1.2).

Cuadro 1.2: Mecanismos de accin postulados para algunos adyuvantes de uso comn *_______________________________________________________________________________

Prolonga la Induce la Estimula PotenciaAdyuvante persistencia formacin de linfocitos seales de

de antgeno granulomas en general co-estimulacin_______________________________________________________________________________Adyuvante de Freund incompleto + + - +Adyuvante de Freund completo + ++ - +Sales insolubles de aluminio + + - ?Mycobacterium tuberculosis - + - ?Bordetella pertussis - - + ?Lipopolisacridos bacterianos - - + +Polinucletidos (poli-IC/poli-AU) - - + ?______________________________________________________________________________*Ref: Goldsby et al. (2002).

Uno de los mejores adyuvantes que se conocen fue desarrollado en la dcada de 1940-50por Jules Freund. El mismo puede obtenerse de dos formas: (a) adyuvante de Freund"incompleto", que consiste en una mezcla de aceite mineral y un emulsificador (ej. arlacel A, uotros), en la cual se dispersa la fase acuosa (con el inmungeno) hasta lograr una emulsinestable; y (b) adyuvante de Freund "completo", que contiene los mismos componentesanteriores, junto con bacilos Mycobacterium muertos, en suspensin. Estos adyuvantes formanun depsito en el sitio de inyeccin, del cual se libera gradualmente el inmungeno, dando as unestmulo prolongado y de dosis bajas, que es conveniente para inducir la produccin deanticuerpos de alta afinidad (Herbert, 1978), segn los principios tericos de la seleccin clonal.La presencia de las micobacterias en el adyuvante completo activa a los macrfagos e induce laformacin de granulomas locales. Esta ltima propiedad puede llegar a ser desventajosa, si losgranulomas se extienden mucho y se ulceran, dando lugar a la formacin de abscesos. Por estarazn, el adyuvante de Freund completo se utiliza generalmente para administrar la primera dosisde antgeno al animal (dosis inicial) y el adyuvante incompleto para las dosis siguientes (dosisde refuerzo). El compuesto inmunopotenciador de las micobacterias es un componente de supared, de naturaleza glicolipdica, cuya actividad ha sido reproducida por un glicopptidosinttico denominado muramildipptido (MDP).

Los inmungenos insolubles o particulados (ej. bacterias, eritrocitos, protenas "agregadas"o desnaturalizadas por calor, etc.) tienden a ser ms inmunognicos que los solubles, por lo quegeneralmente se administran sin adyuvantes, con buenos resultados. Sin embargo, la respuestacontra antgenos particulados tambin puede potenciarse por la accin de adyuvantes, como seilustra en el ejemplo de la Fig.1.1.


1

10

100

1000

10000

Ttulo Aglutinante

A B CGrupo

Figura 1.1: Efecto del adyuvante de Freund completo sobre la respuesta de anticuerposcontra eritrocitos humanos, en ratones BALB/c. Las barras representan el promedio delttulo de anticuerpos sricos despus de la administracin de 3 dosis del antgeno, por vaintraperitoneal. El grupo A corresponde a ratones no inmunizados, y muestra que estoscarecan de anticuerpos pre-existentes contra los eritrocitos humanos. El grupo B recibi laprimera dosis de eritrocitos sin el adyuvante. El grupo C recibi la primera dosis conadyuvante. Las 2 dosis de refuerzo posteriores se dieron sin adyuvante, para ambos grupos.Note que la respuesta final de anticuerpos es ~10 veces mayor en el grupo C que en el B.

Para la utilizacin del adyuvante de Freund (una emulsin agua/aceite) se mezcla unvolumen del inmungeno (en fase acuosa), con 1-2 volmenes del adyuvante. A mayorproporcin de adyuvante en la mezcla, mayor facilidad en lograr la emulsin. Para esto, se llenauna jeringa de vidrio (con punta de metal con rosca) con la solucin acuosa y otra jeringa con eladyuvante. Ambas se interconectan mediante una llave de tres vas (Fig.1.2) o mediante unaaguja de doble conexin. Entonces, se expulsa con fuerza la solucin acuosa hacia la jeringa conel adyuvante (no el revs). Luego se pasa la mezcla de una jeringa a otra, repetidamente, hastaque adquiera un aspecto blancuzco y de consistencia viscosa, que dificulta cada vez ms el pasopor la llave o la aguja. Una manera de probar la estabilidad de la emulsin, es dejar caer una gotaen agua y ver si se mantiene ntegra, indicando que est lista para inyectarse. Por el contrario, sise dispersa rpidamente, la emulsin es an inestable, y probablemente tendr menor efectoadyuvante. Cabe aclarar que ciertos antgenos son demasiado valiosos o escasos para permitirnosrealizar esta prueba.

Otra manera de preparar la emulsin es mediante el uso de un sonicador. Se coloca unvolumen del antgeno (ej. 0,35 ml) con 1-2 volmenes del adyuvante de Freund (ej. 0,65 ml)directamente en una jeringa de vidrio de 2 ml sin mbolo, que ha sido previamente sellada en elfondo con papel parafinado (Parafilm) (Fig.1.3). La punta del sonicador se introduce en lamezcla y se aplica el ultrasonido en dos o tres pulsos intermitentes de unos pocos segundos,hasta formar la emulsin. La sonicacin no debe ser excesiva, para evitar el calentamiento de laemulsin (por la posible desnaturalizacin del antgeno). Finalmente, con la jeringa hacia arriba,se inserta cuidadosamente el mbolo, desplazando el aire, hasta dejar la emulsin lista parainyectarse.

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Figura 1.2: Llave metlica de tres vas. Se puede utilizar para acoplar dosjeringas (con punta de metal con rosca), y preparar la emulsin del adyuvantede Freund.

Figura 1.3: Preparacin de una emulsin agua/aceite mediante sonicacin directa enuna jeringa de vidrio sin mbolo. Colocando la punta de un sonicador dentro de la mezclade antgeno y adyuvante de Freund, se aplican 2-3 pulsos de unos cuantos segundos.Luego se coloca el mbolo y se expele cuidadosamente todo el aire.

Si no se dispone de piezas para acoplar jeringas, o de un sonicador, se puede preparar laemulsin colocando el adyuvante en un vial (de 2-10 ml) e inyectando fuertemente la solucin

sonicador

mezcla

Parafilm

aire

mbolo


del antgeno con una jeringa (2-5 ml) con aguja fina (ej. calibre 25) debajo del nivel de aceite. Laoperacin se repite varias veces, aspirando y expeliendo el material con fuerza. Sin embargo,conforme aumenta la viscosidad de la mezcla, es necesario ir aumentando el calibre de la aguja,por ej. a calibres 22, 20, y 18.

Las jeringas y piezas utilizadas en la preparacin de la emulsin se pueden lavar con unapequea cantidad de acetona, para eliminar el aceite, y luego con un detergente neutro. Eladyuvante de Freund debe ser manipulado con precaucin, ya que su inyeccin accidental puedeocasionar reacciones de hipersensibilidad significativas, por ejemplo lesiones que causan rigidezpermanente en los dedos. Tambin los ojos pueden sufrir daos irreversibles por el contacto coneste adyuvante (Goding, 1986), por lo que debe tenerse mucho cuidado, principalmente cuandose trabaja con el sistema de jeringas interconectadas mediante una llave de 3 vas, o cuando seutiliza la tcnica del vial abierto: la presin que se ejerce sobre la mezcla viscosa puede causarque la aguja salte con fuerza y que la mezcla nos salpique accidentalmente.

Adems del adyuvante de Freund, otro adyuvante de uso comn es el hidrxido dealuminio. Si no se dispone de este reactivo, puede ser preparado haciendo reaccionar, por ej.,250 ml de sulfato de aluminio al 5% con 100 ml de hidrxido de sodio al 5%, agitandofuertemente. El precipitado que se forma se lava dos veces por centrifugacin, con solucinsalina, y se resuspende hasta su volumen original. Los antgenos se adsorben espontneamentesobre este precipitado, mezclando volmenes iguales de la suspensin y el antgeno en solucinacuosa. El alginato de sodio es otro adyuvante similar, que polimeriza en presencia de calcio yforma depsitos con el (los) antgeno(s) adsorbidos. En la Fig.1.4 se muestra un ejemplocomparativo de la respuesta de anticuerpos obtenida con el uso de distintos adyuvantes.

Escogencia de la especie de animal a inmunizar

El primer requisito para que una molcula sea inmunognica es su carcter de "extraa"para el individuo. Esto es, la albmina srica bovina no va a despertar una repuesta inmune al serinyectada en una vaca, pero s puede ser un excelente inmungeno en un conejo, por ejemplo.Una mayor distancia filogentica entre la especie de la cual proviene el antgeno, y la especieque se inmuniza, generalmente se asocia con una mayor inmunogenicidad, debido a que lasdiferencias estructurales entre sus componentes ortlogos tienden a ser mayores.

Al escoger la especie de animal a inmunizar, debe tomarse en cuenta un aspecto prctico:el volumen de antisuero requerido. A su vez, esto depende de la dilucin final a la cual seutilizar el antisuero. Es posible utilizar especies tan pequeas como el ratn (que proporcionaalrededor de 1 ml de suero), hasta especies de produccin industrial como el caballo (del que seobtiene hasta 12-15 litros de plasma en tres das de sangra). Sin embargo, generalmente losanimales ms utilizados son los conejos y los cobayos (para volmenes pequeos), o los carnerosy las cabras (para volmenes mayores). En principio, todo antgeno debe ser administrado a unaespecie distinta de la que proviene. Sin embargo, las reglas son bastante impredecibles. Porejemplo, se ha encontrado que los ratones no producen una respuesta contra los antgenos delsistema Rh humano, lo cual ha imposibilitado la preparacin de anticuerpos monoclonales deratn (ver Captulo 15) contra dicho antgeno eritroctico.

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0,8

0,6

0,4

0,2

0

A492

da 43 da 58 da 74

A BC

Figura 1.4: Comparacin de la respuesta de anticuerpos contra el veneno de Bothropsasper, en ratones Swiss, utilizando diferentes adyuvantes para las dosis de refuerzo.Los 3 grupos (hembras) recibieron su dosis inicial con adyuvante de Freund completo. Elgrupo A continu su esquema con alginato de sodio, el grupo B con una mezcla de alginatode sodio y muramildipptido (MDP), y el grupo C con una mezcla de alginato de sodio ylipopolisacrido (LPS) de Brucella abortus. Cada barra representa el promedio de 8 animalespor grupo DE, y corresponde a la absorbancia de los sueros (diludos 1:2000) en un ELISAque utiliza el veneno como antgeno. Las ligeras diferencias observadas entre los grupos noson estadsticamente significativas (p>0,05). Ref: Rucavado et al. (1996).

La edad ptima del animal a inmunizar es preferiblemente la de adulto joven, por ser unaetapa en la cual el sistema inmune se encuentra plenamente desarrollado. Para algunos antgenos,podran hallarse diferencias de inmunogenicidad segn el sexo del animal.

Cuando se requiere preparar una gran variedad de antisueros, pero en pequeos volmenes,el ratn es una especie conveniente y econmica. Se ha descrito una alternativa para lapreparacin de antisueros en ratn que aprovecha la tcnica de induccin de tumores ascticos.En esta, se inmuniza normalmente al ratn, pero en vez de realizar una sangra final (queproporciona a lo sumo ~1 ml de suero), se le inyecta clulas de un mieloma no secretor (es decir,Ig-) en la cavidad peritoneal. Estas clulas son comunmente utilizadas en los laboratorios quegeneran anticuerpos monoclonales mediante tecnologa de hibridomas (Captulo 15) e inducenun tumor asctico al cabo de unos das. De este modo, se puede obtener volmenes considerablesde fludo (hasta 15-40 ml/ratn), con concentraciones de anticuerpos similares a las del plasma(Mahana y Paraf, 1993). Sin embargo, los animales deben someterse a eutanasia durante lasfases iniciales de la produccin del tumor, por consideraciones ticas.


Figura 1.5: Forma de inmovilizar un ratn. Los dedos pulgar endice sostienen un pliegue de piel en la regin del cuello,tensando apenas lo suficiente para que el animal no gire sucabeza. Los otros dedos aprisionan la cola y parte posterior delratn contra la mano.

La dosis ptima a administrar puede variar segn cada antgeno y cada especie. En general,el objetivo que se persigue es estimular una alta proporcin de los clones linfocitariosespecficos para el antgeno, sin causar tolerancia por exceso (tolerancia de altas dosis), niestimular clones de muy baja afinidad. Las dosis iniciales para las especies intermedias (conejo,cobayo) estn en el mbito de los 100-1000 g, y de los 500-5000 g para las especies grandes(carneros, cabras). Los ratones se inmunizan por lo general con dosis en el mbito de los 10-100 g, aunque es posible utilizar dosis an ms bajas para antgenos muy escasos o muy txicos(Goding, 1986). En cuanto a las dosis de refuerzo, se sugiere administrar un 20-50% de la dosisinicial, con el fin de seleccionar los clones de mayor afinidad que se han activado durante larespuesta primaria o inicial. Sin embargo, no siempre una alta afinidad implica una altaespecificidad, como se discutir ms adelante.

Figura 1.6: Inyeccin intraperitoneal en elratn. La aguja (calibre 26 o similar) seinserta a travs de la piel del abdomen a laaltura de una lnea imaginaria que une lasextremidades posteriores. Si se inclina elanimal hacia un costado, la masa visceralse desplaza ligeramente, reduciendo laposibilidad de que la puncin lesione algnrgano.

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Figura 1.7: Inyeccin intravenosa en el ratn. El animal esinmovilizado introducindolo en un tubo ancho (ej. de 50 ml), alcual se le ha hecho una ranura longitudinal por donde sesostiene la cola. Con una aguja fina (calibre 26 o similar) secanula una de sus venas caudales, en forma muy superficial, y

se presiona suavemente el mbolo. Este no deber ofrecer resistencia si la puncin es correcta. Previamente a lainyeccin, las venas pueden dilatarse exponiendo a los animales al calor de un bombillo durante unos minutos.

Dosis del inmungeno

En ocasiones, el antgeno de inters puede ser sumamente escaso, o valioso, o no puedeadministrarse en grandes cantidades debido a su toxicidad. En tales casos es posible lograr laproduccin de antisueros an con dosis muy bajas de antgeno. Por ejemplo, durante lapreparacin de antisueros contra potentes neurotoxinas de serpiente con actividad letal, se logrbuenas respuestas con el esquema de inmunizacin que se seala en el Cuadro 1.3, utilizandoconejos.

Cuadro 1.3: Esquema de inmunizacin para la obtencin de un antisuero de conejo contra lanotexina, una neurotoxina letal de veneno de la serpiente australiana Notechis s. scutatus*_____________________________________________________________________________Da 1 8 16 24 32 40 48 56 64 72 80 88 92Dosis (g) 1 1 2 2 4 4 8 8 16 16 24 24 sangraAdyuvante FC FC FC FI FI FI FI FI FI FI FI FI --Va s.c. s.c. s.c. s.c. s.c. s.c. s.c. s.c. s.c. s.c. s.c. s.c. arteria central oreja_____________________________________________________________________________*Ref: Alape-Girn et al. (1996). FC: adyuvante de Freund completo; FI: adyuvante de Freundincompleto; s.c.: subcutnea.


Tipos de antgenos

El peso molecular del antgeno influye en su inmunogenicidad. Las macromolculas comoprotenas, glicoprotenas, polisacridos y otras, tienden a ser inmunognicas per se. Lasmolculas pequeas, en el mbito de 3.000-5.000 daltons, tienden a inducir una respuestainmune dbil, o incluso pueden carecer de inmunogenicidad. La respuesta inmune mejoranotablemente cuando se acopla covalentemente estas molculas pequeas a una protenatransportadora inmunognica. Las molculas muy pequeas, menores de 2.000-3.000 daltons,se comportan como haptenos. Esto significa que no son capaces de inducir respuesta por ssolas, por lo que deben ser necesariamente acopladas a un transportador inmunognico. Esimportante recalcar que, aunque los haptenos no inducen una respuesta inmune por s solos, ellosson capaces de ser reconocidos (por s solos) por los productos de una respuesta inmune (ej.anticuerpos), si estos ya han sido previamente generados.

Para obtener anticuerpos contra pequeos pptidos sintticos, por ejemplo (Cuadro 1.4),se requiere acoplarlos covalentemente a algn transportador. Los mtodos para realizar unacople hapteno-protena son variados, y frecuentemente utilizan reactivos bifuncionales queestablecen un enlace covalente entre las partes a conjugar (Mkel y Seppl, 1986). Acontinuacin se describe una tcnica simple para acoplar pptidos a un transportador proteico,basada en el uso de carbodiimida. Este reactivo ataca los grupos carboxlicos (de losaminocidos Asp y Glu, o el C-terminal libre) para convertirlos en sitios que reaccionan con losgrupos amino libres (o primarios) del transportador.

Acople de pptidos pequeos a una protena transportadora

1.Pesar 5 mg del pptido (3-5 moles, dependiendo del peso molecular) y disolver en 5 ml deagua destilada.

2.Agregar 50 mg de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) y ajustar el pH a 5,0colocando una gota sobre un papel indicador. Esperar 5 min y revisar nuevamente el pHpara mantenerlo en 5,0.

3.Agregar 17 mg de ovalbmina u otro transportador proteico (0,3-0,5 moles, para obtener unarelacin molar pptido/transportador de 10/1), disuelta en 5 ml de agua.

4.Incubar por 4 hr a temperatura ambiente.

5.Agregar 1 ml de acetato de sodio 1,0 M (pH 4,2), para una concentracin final de 0,1 M, eincubar por 1 hr adicional.

6.Dializar o ultrafiltrar en una membrana de poro pequeo (ej. 3 kDa) contra solucinsalina amortiguada (ej. PBS, pH 7,2) y finalmente liofilizar.

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Cuadro 1.4: Esquema de inmunizacin para la obtencin de un antisuero de conejo contra elpptido sinttico p115-129 (secuencia KKYRYYLKPLCKK) de la miotoxina II de Bothropsasper, conjugado al toxoide diftrico*_______________________________________________________________________________

Da Dosis Adyuvante Va_______________________________________________________________________________

1 3 mg Freund completo i.m.23 1 mg alginato i.m.51 1 mg alginato i.m.65 1 mg alginato i.m.113 0,5 mg alginato i.m.164 0,5 mg alginato i.m.174 sangra - - - arteria central oreja

_______________________________________________________________________________*Ref: Caldern y Lomonte (1998). La relacin molar entre el transportador y el pptido es de 1:3,2.

Los diversos inmungenos o antgenos pueden clasificarse en dos grandes grupos, segn sucomportamiento inmunolgico; esto es, el tipo y caractersticas de la respuesta inmune queinducen:

(1) La mayora de molculas de alta complejidad y asimetra estructural (ej. protenas,glicoprotenas) se comportan como antgenos T-dependientes. Este nombre indica queestimulan a los linfocitos B solamente si se cuenta con la colaboracin de los linfocitos Tcooperadores (Th, CD4+). Tpicamente estos antgenos inducen el fenmeno denominadocambio de isotipo en las clulas B; es decir, pasar de la sntesis inicial de IgM/IgD a la sntesisde otras clases de inmunoglobulinas como IgG, IgA e IgE (manteniendo el mismo idiotipo).Otra caracterstica de estos antgenos es que inducen una poblacin de linfocitos de memoria (Ty B) considerable, lo que ocasiona que la respuesta a estmulos repetidos sea cada vez mayor,hasta un cierto lmite.

(2) Por otra parte, las molculas con estructuras repetitivas simples y simtricas (ej.polisacridos, protenas polimricas), tienden a comportarse como antgenos T-independientes.Esto significa que tienen la capacidad de estimular a los linfocitos B sin requerir de seales decooperacin por parte de linfocitos T. Estos antgenos, por lo general, no inducen el cambio deisotipo, o en ocasiones inducen un leve cambio, limitado solo a ciertos isotipos como la IgG3.Tambin se caracterizan por dejar una memoria inmunolgica muy dbil y de corta duracin, encomparacin con los antgenos T-dependientes (Abbas et al., 1994; Goldsby et al., 2000). Losantgenos T-independientes del subgrupo 1 (TI-1) tienen la capacidad de activar una altaproporcin de linfocitos B sin importar su especificidad antignica (activacin policlonal)cuando se administran en altas dosis. Ejemplos tpicos de estos antgenos son loslipopolisacridos (LPS) de la membrana externa de bacterias Gram-negativas.

Es posible convertir un antgeno T-independiente en T-dependiente, acoplndolo a unaprotena u otra molcula capaz de estimular clulas T. Esto puede ser de utilidad para obteneraltos niveles de anticuerpos IgG, y se ha explotado en la elaboracin de vacunas contrapolisacridos bacterianos (por ejemplo, los polisacridos de Hemophilus influenzae tipo b).


La degradabilidad del antgeno es otro factor importante para su inmunogenicidad, dadoque las respuestas T-dependientes requieren de un procesamiento del antgeno por parte declulas presentadoras.

Va de administracin del antgeno

Aunque muchos mtodos coinciden en que la mejor ruta de administracin para losantgenos particulados es la intravenosa, no hay un consenso sobre cul es la mejor va para losantgenos solubles. Diferentes revisiones sobre este tema recomiendan distintas rutas deinmunizacin. Mientras algunos sugieren utilizar sitios mltiples de inoculacin, otros sealanque esto no es de ningn beneficio. Entre las vas de inmunizacin ms utilizadas estn lasubcutnea (s.c.) y la intramuscular (i.m.). Tambin existen otras como la intradrmica (i.d.;para volmenes hasta de 100 l por sitio), la intraperitoneal (i.p.), la inyeccin en ganglioslinfticos, y la inyeccin en las almohadillas de las patas posteriores. En ciertos casos es deinters la inmunizacin por va digestiva o va nasal, por ejemplo en el estudio de la inmunidaden mucosas. En el caso de la administracin oral de antgenos, se ha encontrado que, bajo ciertascircunstancias, se puede inducir un estado de tolerancia (tolerancia oral), un fenmeno que seinvestiga con gran inters por su potencial aplicacin en la modulacin teraputica deenfermedades autoinmunes.

En conclusin, debido a la variabilidad de la respuesta inmune de cada individuo, es difcildeterminar si un mtodo es superior a otro. Esto requiere de diseos experimentalesestadsticamente vlidos, de un costo considerable, especialmente cuando se utiliza animalesgenticamente heterogneos. Por las mismas razones antes expuestas, es muy difcil predecir losresultados de distintos esquemas de inmunizacin con base en principios tericos.

Calendario de inmunizaciones y sangrado

Por lo general, la primera dosis de refuerzo se administra de 15 a 30 das despus de ladosis inicial. Se prosigue luego con varias dosis de refuerzo, por ejemplo cada 7, 15 o 30 das,hasta que se alcanza un nivel de anticuerpos satisfactorio. Algunos autores recomiendan dejartranscurrir el mayor tiempo posible entre las distintas dosis de antgeno (por ej. varios mesesentre la dosis inicial y el primer refuerzo) para lograr antisueros de alta avidez (Morris, 1980).

En contraste con la gran variedad de calendarios de inoculacin descritos en la literatura, elmomento ptimo para el sangrado final generalmente se ubica entre 7 y 15 das despus delltimo refuerzo, cuando los niveles de anticuerpos alcanzan su mximo. Debido a que este altonivel puede mantenerse por un perodo adicional variable, es conveniente no exsanguinar alanimal, sino tomar sangras voluminosas cada semana, mientras la calidad del antisuero semantenga aceptable. Es importante obtener una muestra de suero antes de comenzar lainmunizacin (suero pre-inmune) como un valioso control para las distintas tcnicas en que seevaluar y utilizar el antisuero obtenido.

Para el sangrado de conejos, una ruta conveniente y segura es la arteria central de lasorejas (Fig.1.8). Esta puede dilatarse empleando una gota de xilol, y canularse cuidadosamente

B. Lomonte 13

con una aguja calibre 22 o 20 (sin jeringa), para obtener volmenes hasta de 20-30 ml mediantegoteo libre. Alternativamente, se puede realizar una sangra parcial o total mediante puncincardaca (con aguja 20 o 18), aunque este procedimiento es de alto riesgo.

Figura 1.8: Sangra en conejo a travs de la arteria central de la oreja. A la izquierda se sealan laarteria central (A), utilizada para la sangra, y la vena marginal (V), utilizada para la inyeccin intravenosa.A la derecha se muestra la forma para realizar la puncin de la arteria, en forma muy superficial, con unaaguja calibre 22 o 20 sin jeringa. La sangre se recoge por goteo libre en un tubo.

En el ratn, las sangras exploratorias, o parciales, se realizan cortando la punta de la cola(2-3 mm) y recogiendo la sangre en un capilar heparinizado, el cual se sella por un extremo conplasticina. Para la exsanguinacin, puede anestesiarse al animal con pentobarbital sdico ocompuestos similares, y realizar una sangra retro-orbital (del ojo), recogiendo las gotas desangre en un tubo o pipeta Pasteur (~1 ml). En nuestra experiencia, la anestesia de ratones conuna inyeccin i..p. de Mebumal, en dosis de 0,6 mg/10 g de peso corporal, ha dado buenosresultados. Bajo esta anestesia profunda, tambin se puede realizar la exsanguinacin cortandocon una tijera la regin axilar y recogiendo la sangre con una pipeta. De igual forma, puedehacerse una diseccin rpida y realizar una puncin cardaca, bajo anestesia, o posteriormente ala inhalacin de CO2 en una cmara especialmente adaptada para esto.


Evaluacin del antisuero

Es conveniente realizar pequeas sangras exploratorias (sangras de prueba) a lo largo delcalendario de inmunizaciones, con base en las cuales se evala la respuesta de anticuerpos, y sedecide si el animal est listo para una sangra voluminosa. La manera de evaluar un antisuerodepende de la tcnica en que se va a utilizar. Sin embargo, en ocasiones puede evaluarsemediante ciertos criterios generales, tales como una inmunodifusin en gel, una aglutinacin, unELISA, etc. (ver captulos correspondientes en este Manual).

Cuando el inmungeno es particulado (ej. bacterias, clulas) se puede evaluar el ttulo y laespecificidad del antisuero mediante una aglutinacin directa (Captulo 8). En unaaglutinacin en lmina, el tiempo que tarda en evidenciarse la reaccin, as como el tamao delos grumos obtenidos, dan una idea aproximada de la avidez del antisuero. Una aglutinacinrpida y fuerte indica que la avidez del antisuero es alta.

Para evaluar la respuesta hacia inmungenos solubles se puede utilizar tcnicas como latitulacin por doble inmunodifusin en gel (Captulo 6). Alternativamente, se puede adsorber oacoplar el antgeno a una partcula de soporte para efectuar una aglutinacin pasiva (Captulo8), o emplear tcnicas inmunoenzimticas como el ELISA (Captulo 10). Debe tenersepresente que los ttulos obtenidos con diferentes tcnicas no son comparables entre s, debido asu distinta sensibilidad fsica, as como a otros factores involucrados en cada caso. Por ejemplo,un antisuero que reconozca a un antgeno con un ttulo de 1:16 mediante doble inmunodifusinen gel, podra tener ttulos de 1:100.000 o mayores si lo evaluamos mediante un ELISAsuficientemente sensible.

La inmunizacin puede detenerse una vez alcanzado un ttulo estable en el animal, si ya nomejora sensiblemente al aplicar nuevos refuerzos. Sin embargo, cabe destacar que a lo largo deltiempo puede producirse un aumento de la afinidad promedio de los anticuerpos.

Como criterios de evaluacin de un antisuero, se utiliza tanto el aspecto cuantitativo(ttulo) como el cualitativo (afinidad y especificidad), siendo este ltimo el ms importante.Para ciertas aplicaciones, no es tan primordial el hecho de que el antisuero posea un ttulo muyalto, sino el que sea de una alta especificidad. Un ejemplo de esto podra ser el desarrollo de unatcnica inmunolgica para la determinacin de una hormona, u otro analito particular, querequiere ser detectado muy selectivamente en el contexto de una muestra compleja. Para otrosfines, la cantidad de anticuerpos puede ser el aspecto de mayor inters. Por ejemplo, un altottulo es ventajoso para antisueros utilizados en la neutralizacin de toxinas, o de agentesinfecciosos como los virus.

Existe la tendencia a pensar que una alta afinidad de los anticuerpos obtenidos se asociasiempre con una mayor especificidad en su reconocimiento del antgeno, y por ende, una mayorespecificidad de las tcnicas inmunolgicas en que se emplean. Estos dos parmetros nonecesariamente correlacionan. En ciertas circunstancias, por ej. en sistemas donde la muestracontiene sustancias que asemejan inmunoqumicamente al antgeno de inters, una alta afinidadde los anticuerpos podra conducir a una baja especificidad de la tcnica. Para ilustrar la relacinindependiente que existe entre la afinidad y la especificidad de los anticuerpos, vase los datospresentados en la Fig.1.9.

B. Lomonte 15

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

control mt-I mt-II mt-III mt-IV mt-I mt-II mt-III mt-IV

A (77 das) B (378 das)

A410

Figura 1.9: Especificidad de los anticuerpos contra la regin 115-129 de la miotoxina II deBothrops asper. Se uni distintas isoformas de miotoxina (mt-I, II, III y IV) a placas de ELISA, y seprob la reactividad de un suero de conejo generado contra la regin 115-129 de la isoforma II, obtenidoen distintos momentos de la inmunizacin: a los 77 das (A) y a los 378 das (B). En los inicios de lainmunizacin, pese a que los anticuerpos probablemente tienen menor afinidad y ttulo, reconocenselectivamente a la toxina original, pero no a sus variantes o isoformas (las cuales poseen ligerasvariaciones en su secuencia de aminocidos). Al final de la inmunizacin, los anticuerpos reconocenindiscriminadamente a las 4 variantes de esta protena. Ref: Caldern y Lomonte (1998).

La importancia de las variables arriba citadas, en cada mtodo inmunolgico, y suevaluacin, requieren de una clara comprensin de los principios tericos en que estos sefundamentan, as como de las circunstancias particulares involucradas en cada caso.

Mtodo general para la preparacin de un antisuero en conejo

Haciendo las salvedades sealadas en este captulo con respecto a la diversidad deesquemas de inmunizacin existentes, la gran variabilidad de las respuestas inmunes, y lasdificultades prcticas para demostrar objetivamente la superioridad de un mtodo sobre otro, sepresenta a continuacin un mtodo general de inmunizacin para antgenos proteicos. Estepretende ser solamente una gua de trabajo, que en nuestra experiencia ha dado resultadosaceptables.

1.Seleccionar al menos 2 conejos jvenes, de un peso corporal de al menos 2 Kg, para lainmunizacin. Los animales deben examinarse para verificar que no muestren signos deinfeccin u otras patologas, y deben mantenerse en condiciones de bioterio adecuadas, enjaulas claramente rotuladas.


2.Tomar una muestra de sangre (2-3 ml) de la arteria central de la oreja, para conservar unaalcuota de suero pre-inmune de cada animal.

3.Preparar el antgeno de inters, disolviendo 1-2 mg en 1 ml de solucin salina o PBS.Emulsificarlo con 1,5 ml de adyuvante completo de Freund, como se describi en laseccin sobre adyuvantes.

4.Inyectar por va intramuscular, en dos puntos distintos del muslo de cada conejo, 0,5 ml de laemulsin (0,5-1,0 mg de antgeno por conejo). Verificar que la aguja no se encuentreintravenosa, aspirando ligeramente con la jeringa antes de inyectar.

5.Inyectar dosis de refuerzo (0,2-1,0 mg de antgeno por conejo) por la va intramuscular,emulsificado en adyuvante de Freund incompleto, o disuelto en alginato de sodio (~1 ml).Repetir cada 2 semanas, hasta cumplir 10-12 semanas. La respuesta se puede evaluar 10das despus de cada refuerzo, por ejemplo mediante una doble inmunodifusin en gel. Laformacin de una banda de precipitacin ntida e intensa, indica una afinidad y ttuloapropiados.

6.Una vez alcanzada una respuesta satisfactoria, sangrar a los animales de la arteria central de laoreja (ej. 20-30 ml), separar el suero inmune, y conservarlo en alcuotas a -20C.

Inmunizacin con ADN

En aos ms recientes, se ha desarrallado una nueva estrategia para la inmunizacin haciaantgenos proteicos, en la cual se administra al individuo el ADN que codifica para el antgenode inters (en vez del antgeno). El ADN se puede introducir por la va intramuscular, o a travsde la superficie de la piel (en este caso utilizando una pistola de helio a presin; "gene gun";Fig.1.10). Las clulas del organismo captan el ADN y sintetizan el antgeno codificado, duranteun lapso de tiempo variable, suficiente para que se desarrolle una respuesta inmune.

Esta estrategia ha cobrado importancia para la inmunizacin con antgenos de difcilpurificacin, gracias al auge y la simplicidad de las tcnicas para clonar y manipular ADN. Latcnica elimina la necesidad de expresar previamente los genes como protenas para poderinmunizar, poniendo a las propias clulas del organismo receptor a realizar esta tarea. Diversosestudios han demostrado la factibilidad de estos procedimientos basados en ADN y laposibilidad de obtener respuestas inmunes satisfactorias, como una interesante alternativa conrespecto a la inmunizacin convencional utilizando antgenos (Weiner, 1998; Lizano, 2001). Sinembargo, en ocasiones se obtienen respuestas inmunes de menor magnitud que las obtenidas enforma convencional, administrando directamente el antgeno proteico.

B. Lomonte 17

Figura 1.10: Inmunizacin de ratones con ADN. La imagen de la izquierda muestra una pistola gnica,utilizada para impulsar partculas de oro recubiertas con el ADN de inters, a travs de la piel. Al centro seobserva un ratn con el abdomen rasurado, listo para recibir el "disparo" de ADN (derecha).

Cuadro 1.5: Algunos datos de inters para la cra de animales de experimentacin._______________________________________________________________________________Caracterstica Ratn Cobayo Conejo_______________________________________________________________________________Edad de la pubertad 35-40 das 45-70 das 120-180 dasPerodo de gestacin 18-21 das 62-72 das 30-32 dasDuracin del ciclo sexual 4-5 das 16-19 das irregular, ovulacin estimulada

por el apareamientoEdad del destete 18-28 das 20-21 das 6-8 semanas________________________________________________________________________________

Cuadro 1.6: Algunos parmetros fisiolgicos de animales de experimentacin._____________________________________________________________________________Caracterstica Ratn Cobayo Conejo_____________________________________________________________________________Temperatura rectal, C 35,7-37,9 37,6-39,4 37,5-39,9Frecuencia respiratoria (/min) 84-230 69-104 36-56Frecuencia cardaca (/min) 328-780 260-400 123-304Peso promedio adulto, kg 0,025 0,7 4,0Eritrocitos, x106/l 7,7-25,0 4,5-7,0 4,5-7,0Hemoglobina, g/dl 14,8 12,3 13,6Leucocitos, x103/l 8,0 10,0 9,0Temperatura ptima, C 20-24 18-24 17-20Humedad relativa ptima, % 45-55 45-55 40-60_____________________________________________________________________________


Captulo 2

Diluciones Seriadas y Pruebas Serolgicasde Titulacin

Introduccin

El concepto de dilucin puede definirse simplemente como la disminucin de laconcentracin de una sustancia en una solucin. La preparacin de diluciones es una tareacotidiana en el trabajo de laboratorio, y es fundamental en una gran variedad de tcnicas,por lo que la comprensin de sus aspectos bsicos y prcticos es de suma importancia.

Dilucin directa vs. dilucin seriada

Una dilucin es directa cuando se realiza en un solo paso, desde la solucin originalhasta la solucin final (Ej. 1):

Note que al pasar 1 ml de la solucin original altubo que contiene 9 ml del solvente, obtenemosun volumen final (VF) de 10 ml, con lo quehabremos disminudo la concentracin 10 veces.Es decir, el factor de dilucin (FD) es 10. El FDes el nmero de veces que disminuye laconcentracin de la sustancia original en un pasode dilucin. Cuando se prepara un conjunto dediluciones en secuencia, cada una a partir de laanterior, con un FD constante, las llamamosdiluciones seriadas (Ej. 2):

[x] [1/10 x] [1/100 x] [1/1000 x]

1 ml 1 ml1 ml1 ml

9 ml9 ml 9 ml

etc.

En cada paso de la serie del ejemplo 2, estamos diluyendo 10 veces la solucin deltubo precedente, por lo que el FD es 10. Conociendo el FD, podemos calcular cul es la

solucin original solucin diluda

1 ml

9 mlsolvente

[x] [1/10 x]

B. Lomonte 19

dilucin de la sustancia original que hay en cada tubo (concentracin relativa). En el tubo#1 la concentracin es 1/10 con respecto a la muestra original. En el tubo #2 laconcentracin es 1/10 con respecto al tubo anterior, y es (1/10) (1/10) = 1/100 con respectoa la muestra original, y as sucesivamente.

En serologa se utiliza ampliamente el proceso de dilucin seriada para la realizacinde diversas pruebas de rutina clnica y de investigacin. Pero antes de describir los detallesprcticos del montaje de las diluciones seriadas, es necesario sealar una de suscaractersticas importantes, que las diferencia de las diluciones directas:

las diluciones directas permiten obtener resultados cuantitativos. las diluciones seriadas solo permiten obtener resultados semi-cuantitativos.

A qu se debe esta diferencia? Toda medida conlleva un cierto grado de error, oincertidumbre. A mayor nmero de pasos en un proceso, mayor es la incertidumbre que seacumula. Veamos el Ej. 3. Suponga que tenemos una solucin de concentracin conocida(ej. un patrn primario de una sal, preparado por gravimetra) y queremos prepararsoluciones de diversas concentraciones a partir de dicho patrn:

Tericamente podramos usar dilucionesdirectas (Ej. 3a) o diluciones seriadas (Ej.3b) para dicho fin. En el caso de lasdirectas, cada una de ellas posee unaincertidumbre similar, ya que se hanrealizado en un solo paso.

Por otra parte, al utilizar la forma seriada(Ej. 3b), cada solucin es preparada a partirde la anterior, por lo que el error demedicin se propaga y se amplifica: laincertidumbre aumenta proporcionalmenteal nmero de pasos de dilucin.

Si la exactitud y precisin logradasmediante diluciones directas sonsuperiores a las obtenidas por dilucinseriada, cabe preguntarse cul es larazn para el uso tan frecuente de estasltimas en serologa. Su principalventaja radica en la posibilidad deabarcar un mbito muy amplio deconcentraciones (diluciones), usandomediciones sencillas y repetitivas.

patrnprimario

[x]

[x]

[x]

[x]

1

2

3

Ej. 3a

[x] [x][x]1 2 3patrn

primario

Ej. 3b


Note, en el esquema del Ej.3, que las distancias entre las distintas concentraciones deuna serie son logartmicas. En cambio, el mbito de diluciones obtenible por un procesodirecto es mucho ms reducido.

Pruebas serolgicas de titulacin

Muchas pruebas serolgicas consisten en estimar, de modo semicuantitativo, lacantidad relativa de anticuerpos sricos contra un determinado antgeno, en un individuo.Para esto se realiza una serie de diluciones de su suero (u otros tipos de muestras) con unsolvente apropiado para la prueba, y luego se enfrenta cada dilucin contra el antgeno deinters, mediante algn tipo de reaccin inmunolgica. A mayor concentracin deanticuerpos en la muestra, mayor ser la dilucin capaz de dar una reaccin positiva a laprueba.

Ej. 4:

suero 1

suero 2

suero 3

1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 Dilucin

+ + + +

+ + + + + + +

+ + +

-

- - - -

- - - -?

Lectura

Lectura

Lectura

En este caso, observamos que el suero 2 posee mayor cantidad de anticuerpos contrael antgeno que se prob, en comparacin con el suero 1, ya que an diluyndolo 1:128 fuecapaz de dar una reaccin positiva, mientras que el suero 1 alcanz a dar positivo hasta unadilucin mxima de 1:16. Los resultados se pueden expresar con el trmino de "ttulo" deuna muestra, que se define como el inverso de la mxima dilucin que da una reaccinfrancamente positiva en una prueba determinada. En el Ej. 4, diramos que el ttulo delsuero 1 es de 16, mientras que el ttulo del suero 2 es de 128. Tambin puede expresarse elttulo en la forma 1/16, 1:16, "16 diluciones", etc. Todas estas maneras de expresin

B. Lomonte 21

tienen un mismo significado. Note que el suero 3 tendra un ttulo de 8 (o 1:8) porque es lamayor dilucin francamente positiva (la reaccin en 1:16 fue dudosa).

Aunque en los ejemplos descritos se estim la cantidad de anticuerpos contra unantgeno dado, los mismos principios podran ser aplicables a la situacin inversa, es decir,la estimacin semicuantitativa de un antgeno en la muestras, utilizando sus respectivosanticuerpos.

Cmo preparar diluciones seriadas

La primera decisin al disear una dilucin seriada es cul va a ser el volumen final(VF) que queremos que quede en los tubos. Para algunas pruebas (por ej. aglutinaciones entubo o en placas de 96 hoyos; Captulo 8), es conveniente que el VF sea exactamente elvolumen requerido para la tcnica a realizar. De esta forma, una vez terminadas lasdiluciones, podemos adicionar los reactivos necesarios a cada tubo (u hoyo) y ahorrartiempo y material. En otros casos, por el contrario, se necesita que el volumen final sealigeramente superior al volumen requerido en la tcnica. Por ejemplo, al preparar una seriede diluciones para una titulacin mediante ELISA (Captulo 10), en donde se requierenmuestras de 100 l por triplicado, un volumen final apropiado para los tubos podra ser de400 o 500 l (permitira pipetear fcilmente 100 l tres veces).

Una vez determinado el VF, se adiciona a cada tubo de la serie un volumen desolvente igual al VF deseado. El volumen de transferencia (VT) es el volumen desolucin original (muestra) que agregamos al primer tubo, y que seguimos transvasando acada tubo hasta completar la serie. El VT se puede calcular con la siguiente frmula:

FD-1VT = VF

Ejemplo: Cmo preparar una serie de diluciones (5 tubos) para una prueba de aglutinacinque utiliza 0,4 ml de muestra y 0,1 ml de antgeno, con FD=3 y utilizando NaCl 0,15 Mcomo solvente?

Pasos para el montaje de diluciones seriadas:

1.Preparar y rotular los tubos necesarios.2.Adicionar a cada tubo un volumen de solvente igual al VF.3.Calcular el VT.4.Transferir el VT de la muestra al primer tubo.5.Homogenizar.6.Transferir el VT del primer tubo diludo al segundo.7.Homogenizar.8.Continuar transvasando y homogenizando hasta el final.


En primer lugar, preparamos los 5 tubos que usa dicha tcnica, los rotulamos ycolocamos en cada uno un volumen de solvente igual a VF que deseamos obtener, o sea,0,4 ml. Luego calculamos el VT:

VT= VF = 0,4 ml = 0,2 ml FD-1 3 - 1

Esto nos indica que debemos transvasar en cada paso un volumen de 0,2 ml. Al llegaral ltimo tubo de la serie descartamos 0,2 ml (el VT), para as obtener el mismo VF entodos los tubos. Algunas veces, principalmente cuando se sospecha que un suero posee unttulo muy alto para la prueba que estamos realizando, este "sobrante" del ltimo tubo seconserva aparte, con el fin de seguir diluyndolo en el caso de que todas las dilucionespreparadas den positiva la prueba.

Principales cuidados en las diluciones seriadas

La homogenizacin minuciosa de cada tubo, despus de pipetear, es un cuidadofundamental para la correcta preparacin de una serie de diluciones. Para esto, mezclamosbien el lquido agregado y el solvente, utilizando la misma pipeta con que vamostransvasando, mediante su llenado y vaciado sucesivo por un mnimo de 5 veces. Dado quela pipeta se est utilizando simultneamente para la medicin y para la homogenizacin, esposible utilizar una misma pipeta (o puntilla descartable) en todo el proceso, para unamisma serie. Los agitadores mecnicos para tubos (ej. Vortex) sustituyen eficazmente lahomogenizacin por pipeteo repetido, agilizando el trabajo.

El uso correcto de las pipetas es fundamental para la obtencin de resultadosconfiables. Las pipetas automticas agilizan el trabajo de diluciones, y es importante tenerclaros los detalles de su manejo antes de su empleo. Asimismo, es importante mantener sucalibracin peridicamente.

Al realizar diluciones seriadas con todos los cuidados y recomendaciones, se lograuna precisin de 1 tubo (1 paso de dilucin), por las mismas razones que explican lasemicuantitatividad del mtodo. Este es el nivel de incertidumbre aceptado en lastitulaciones. Ello implica, por ejemplo, que una diferencia de solo un tubo (un paso dedilucin) entre dos muestras, no es significativa. Este concepto tiene relevancia en eltrabajo clnico, en especial cuando se realiza la titulacin serolgica de dos muestras desuero de un mismo paciente, tomadas con 10-15 das de diferencia, con el fin de determinarsi en ese lapso ha ocurrido una elevacin significativa del nivel de anticuerpos contra unantgeno dado (ej. un agente infeccioso). Este es el concepto de seroconversin. Cuando elaumento que se observa en el ttulo es de al menos 2 pasos de dilucin, se puede tenercerteza de que ha ocurrido una seroconversin. Un aumento de solo 1 paso quedara en lazona de incertidumbre.

Finalmente, debe recalcarse que los procedimientos incorrectos o poco cuidadososdurante la preparacin de diluciones seriadas, invalidan cualquier resultado obtenido poreste mtodo, y con ello, la confiabilidad de las pruebas.

B. Lomonte 23

Ejemplos de la aplicacin de diluciones seriadas en titulaciones

Para ilustrar la aplicacin de las diluciones seriadas se describir la titulacin de unsuero anti-eritrocitos de carnero, preparado en conejo. Este antisuero es til en diversastcnicas inmunolgicas (ej. en la cuantificacin de la actividad ltica del complemento). Elsuero se obtiene mediante la inmunizacin de conejos con eritrocitos frescos de carnero, oalternativamente, con estromas desnaturalizados de dichos eritrocitos. Un nombre comnque recibe este antisuero es el de "hemolisina", debido a que sus anticuerpos IgG e IgM, alactivar el complemento, son capaces de inducir la lisis de los glbulos rojos reconocidos.

La titulacin de este antisuero se puede realizar fcilmente mediante tcnicas deaglutinacin de eritrocitos (Captulo 8). Las ms convenientes son las demicroaglutinacin, realizadas en placas de 96 hoyos con fondo en "U", preparando lasdiluciones con micropipetas automticas. Sin embargo, si no se cuenta con el equipo paramicroaglutinacin, se puede utilizar el mtodo tradicional en tubos de ensayo, trabajandoincluso con pipetas de vidrio. El uso de este tipo de pipetas presenta una limitacinimportante en el trabajo serolgico, ya que a raz del riesgo de contaminacin por diversosagentes infecciosos, no es permitido pipetear materiales biolgicos medianteaspiracin con la boca. El uso de aditamentos como peras de succin, u otros, acoplados apipetas de vidrio, hace muy engorrosa la preparacin de diluciones seriadas. Por esta razn,se debe preferir siempre el uso de micropipetas automticas para el trabajo serolgico condiluciones.

Para los mtodos de titulacin por hemaglutinacin en tubo, o pormicrohemaglutinacin en placa, referirse a las descripciones correspondientes, en elCaptulo 8.


Captulo 3

Purificacin de Inmunoglobulinas medianteTcnicas de Precipitacin

Introduccin

Los mtodos de precipitacin de protenas mediante el uso de compuestosorgnicos (ej. rivanol, cido caprlico) o de sales inorgnicas (ej. sulfato de amonio, sulfatode sodio) se han utilizado por ms de 60 aos para fines de su purificacin parcial. Susprincipales ventajas sobre otras tcnicas ms modernas son la simplicidad, el bajo costo, larapidez, y el alto rendimiento final.

La precipitacin de protenas por efecto de sales inorgnicas (salting-out) ha sidoinvestigada en detalle. En general, el aumento de la concentracin de iones en el solventeconduce a una mayor interaccin protena-protena, y la consiguiente disminucin en susolubilidad. Cada protena precipita a una cierta concentracin de sales, y las diferenciasentre las protenas son aprovechadas para lograr su separacin. Los factores msimportantes en este proceso son el pH, la temperatura y la concentracin de protenas(Tijssen, 1985; Heide y Schwick, 1978). Para las inmunoglobulinas (Igs) se utiliza un pHcercano a su punto isoelctrico promedio, usualmente entre pH 7,0-8,0. La mayora deprotenas son menos solubles al aumentar la temperatura (por ejemplo, de 4C atemperatura ambiente). En cuanto a la concentracin de protenas, cuando esta es baja serequiere mayor concentracin salina para la precipitacin, y viceversa.

Los mtodos de precipitacin proteica tienen gran utilidad cuando se desea obteneruna preparacin de inmunoglobulinas parcialmente purificadas, con un mnimo de recursosy un mximo de rendimiento, en forma rpida. Entre estos, los mtodos que utilizan salesproporcionan preparaciones enriquecidas en inmunoglobulinas, aunque no logran eliminarpor completo la albmina srica, as como diversas globulinas del plasma. Por otro lado, lautilizacin del cido caprlico (octanoico) es notable, por la relativa pureza con la que seobtienen las inmunoglobulinas, con una contaminacin mucho ms baja de albmina, encomparacin con el uso de sales (Fig.3.1).

El cido caprlico causa la precipitacin de la mayora de protenas plasmticas,con excepcin de las inmunoglobulinas, las cuales quedan en solucin. Por el contrario, lassales inorgnicas causan la precipitacin de las inmunoglobulinas (y otras globulinas),dejando a la albmina en solucin. En este sentido es importante notar que en laprecipitacin por sales, las inmunoglobulinas son sometidas a un proceso dedesnaturalizacin reversible, ya que se hacen precipitar y luego se redisuelven nuevamente(disminuyendo la salinidad del medio). Esto puede resultar, potencialmente, en mayoresalteraciones moleculares en las inmunoglobulinas. Sin embargo, una ventaja es que almomento de redisolver las inmunoglobulinas precipitadas, se tiene la opcin de poder

B. Lomonte 25

concentrarlas, manteniendo el volumen del solvente a un mnimo. Por otra parte, la tcnicadel cido caprlico se considera como un tratamiento menos drstico para lasinmunoglobulinas, ya que no las desnaturaliza, aunque a diferencia del mtodo anterior, nopermite concentrarlas directamente.

A continuacin se presentan algunos procedimientos descritos para la purificacinparcial de inmunoglobulinas, basados en procesos de precipitacin diferencial de protenas.

Purificacin de Igs sricas por precipitacin con sulfato de amonio(Hudson y Hay, 1989)

1.Disolver 1000 g de sulfato de amonio (de alta pureza, libre de metales) en 1000 ml deagua destilada, a ~50C. Dejar a temperatura ambiente durante la noche y ajustar elpH a 7,2 con una solucin diluda de cloruro de amonio o de cido sulfrico.

2.Diluir la muestra de suero 1:2 con solucin salina fisiolgica (NaCl 0,15 M). Colocarloen un recipiente apropiado, sobre un agitador magntico, a velocidad moderada.Evitar la formacin de espuma, pues implica la desnaturalizacin de protenas.

3.Agregar la cantidad requerida del sulfato de amonio saturado, poco a poco, para llegar auna concentracin final de 45% v/v (ver frmula adelante). Por ejemplo, para 10 mlde suero se agregan 8,2 ml de sulfato de amonio 100% saturado. La solucin se tornablancuzca, por la formacin de un precipitado. Dejar en agitacin suave por 15-30min adicionales, para que los grumos de precipitacin crezcan.

4.Centrifugar por 15 min a 1000xg y descartar el sobrenadante.

5.Lavar el precipitado, agregando abundante sulfato de amonio (al 45% de saturacin), yresuspendiendo bien los grumos del precipitado. Note que a esta concentracin elsulfato de amonio no permite que el precipitado se redisuelva, y funciona solo comoun solvente que diluye aquellas protenas que an estn solubles (principalmentealbmina), atrapadas entre los grumos de precipitado. Centrifugar de nuevo.

6.Descartar el sobrenadante y redisolver el precipitado, al mismo volumen de la muestraoriginal, con solucin salina. Centrifugar una vez ms, con el fin de eliminar residuosde protena insoluble (desnaturalizada de modo irreversible). Recoger elsobrenadante.

7.Re-precipitar las inmunoglobulinas, ahora con una concentracin final de 40% delsulfato de amonio saturado. Centrifugar.

8.Descartar el sobrenadante. Lavar el precipitado con sulfato de amonio al 40% desaturacin, y centrifugar.


9.Descartar el sobrenadante. Redisolver el precipitado en un volumen mnimo de solucinsalina, o de PBS (salina amortiguada con fosfatos, pH 7,2).

10.Eliminar las sales de la preparacin final mediante dilisis contra PBS (ej. 5 cambios de1 litro en 24 hr), ultrafiltracin, o cromatografa de filtracin en gel (ej. Sephadex P-10, G-25, u otros medios similares).

Nota: Para calcular el volumen de solucin saturada que se requiere para alcanzar una concentracindada de sulfato de amonio, se puede utilizar la siguiente frmula:

V = Vm (Sf - Si) V = volumen de solucin saturada a agregar 1 - Sf Vm = volumen de la muestra de suero a procesar

Sf = saturacin final deseadaSi = saturacin inicial

Cuadro 3.1: Soluciones saturadas de sulfato de amonio en agua, a diferentes temperaturas*._____________________________________________________________________________

Temperatura, C 0 10 20 25 30

Moles de (NH4)2SO4 en 1000 g de agua 5,35 5,53 5,73 5,82 5,91

g de (NH4)2SO4 en 1000 g de agua 706,9 730,7 757,1 769,1 781,0

Porcentaje por peso 41,42 42,22 43,09 43,47 43,85

Densidad (interpolada) 1,2428 1,2436 1,2447 1,2450 1,2449

g de (NH4)2SO4 en 1000 ml de solucin 514,7 525,1 536,3 541,2 545,9

Moles de (NH4)2SO4 en 1000 ml de solucin 3,90 3,97 4,06 4,10 4,13

g de (NH4)2SO4 a agregar a 1000 ml agua 706,8 730,5 755,8 766,8 777,5______________________________________________________________________*Heide y Schwick (1978).

Purificacin de IgG srica mediante cido caprlico (Tijssen, 1985)

Esta tcnica permite la purificacin rpida de IgG de muchas especies, a partir delsuero. Tambin se ha descrito su utilizacin para purificar anticuerpos monoclonalesmurinos a partir de fludo asctico (McKinney y Parkinson, 1987). El cido caprlico uoctanoico se utiliza en condiciones a las cuales precipitan las otras protenas plasmticas,dejando a las inmunoglobulinas en solucin. La pureza final de la IgG obtenida es cercanaal 90% (Tijssen, 1985).

B. Lomonte 27

1.Para cada 100 ml de suero, agregar 200 ml de acetato de sodio 0,06 M a pH 4,0 parallegar a un pH final de 4,8.

2.Agregar 6,8 g de cido caprlico, gradualmente, con agitacin fuerte. Dejar 30 min enagitacin.

3.Centrifugar. Recoger el sobrenadante y subir el pH con NaOH 1,0 M, hasta el pHdeseado. Eliminar las sales y el cido caprlico de la preparacin final mediantedilisis contra PBS (Fig.3.2), ultrafiltracin, o cromatografa de filtracin en gel.

Purificacin de IgG srica por un mtodo combinado, mediante sulfato deamonio y cido caprlico (McKinney y Parkinson, 1987)

1.Precipitar con cido caprlico como se describe arriba. Recoger el sobrenadante y ajustarel pH a 7,4 con NaOH 1 M.

2.Precipitar con sulfato de amonio slido (0,28 g/ml para obtener 45% de saturacin) yagitar por 15-30 min, a temperatura ambiente.

3.Centrifugar por 15 min a 5000xg y redisolver el precipitado en PBS, usualmente a 1/10del volumen original. Eliminar las sales de la preparacin final mediante dilisiscontra PBS, ultrafiltracin, o cromatografa de filtracin en gel.

Purificacin de Igs equinas mediante cido caprlico (Rojas et al., 1994)

1.Agregar al plasma equino cido caprlico (99%) suficiente para lograr una concentracinfinal del 5% (v/v).

2.Agitar fuertemente por 30 min a temperatura ambiente.

3.Filtrar con papel retentivo y obtener el sobrenadante claro. Alternativamente, paraprocesar pequeos volmenes, puede centrifugarse por 10 min a 1000xg.

4.Eliminar el cido caprlico de la preparacin final mediante dilisis contra PBS,ultrafiltracin, o cromatografa de filtracin en gel.


Figura 3.1: Anlisis electrofortico de preparaciones deinmunoglobulinas equinas obtenidas mediante las tcnicas deprecipitacin por sulfato de amonio (sa) o cido caprlico (ac),respectivamente. El plasma completo (pc) de caballo fue elmaterial inicial, en el cual se puede identificar las distintasbandas: (1) albmina, (2) alfa-1, (3) alfa-2, (4) beta, (5)fibringeno y (6) gamaglobulinas. Ntese como lasinmunoglobulinas purificadas mediante sulfato de amonioarrastran cantidades importantes de todas las globulinas ytrazas de albmina, mientras las inmunoglobulinas obtenidasmediante cido caprlico, aunque estn ms diludas,corresponden principalmente a la regin electrofortica gama.Para una explicacin sobre la tcnica de electroforesis decomponentes sricos, referirse al Captulo 11.

Figura 3.2: Dilisis. Las bolsas o membranas de dilisis secas se hidratan en agua destilada y se llenancon la solucin proteica, de la cual se va a eliminar las sales y otros pequeos solutos. Debe conocerse deantemano el tamao nominal del poro, dado por el fabricante (ej. 3.500 daltons, 12.000 daltons, etc.) paraasegurarnos de que la protena de inters no va a escapar de la bolsa junto con los solutos. Las bolsas sesellan en sus extremos mediante prensas especiales, o alternativamente, haciendo nudos (con el cuidadode no tensar excesivamente la regin de la membrana que participa en la dilisis, para no alterarmecnicamente el tamao de los poros). Finalmente se sumerge la bolsa de dilisis en el solvente finaldeseado (agua destilada, PBS, etc.) y se deja difundir pasivamente los solutos, manteniendo una agitacinsuave y realizando varios cambios del solvente, preferiblemente a 4C.

B. Lomonte 29

Captulo 4

Cromatografa de Afinidad e Inmunoafinidad

Introduccin

La cromatografa de afinidad explota las interacciones especficas que ocurrenentre las biomolculas, con la finalidad de lograr su separacin. En la naturaleza existenmuchos sistemas de unin especfica o selectiva, entre los que se puede citar lasinteracciones antgeno-anticuerpo, enzima-sustrato, enzima-inhibidor, oligosacrido-lectina, hormona-receptor, cido nucleico-protenas, etc. Adems de las interaccionesnaturales citadas, pueden encontrarse interacciones fortuitas, que no por ello son de menorutilidad.

Figura 4.1: Principio de la cromatografa de afinidad. En un sistema de interaccin especfica yreversible entre dos componentes (a), se acopla covalentemente uno de ellos a un medio de soporte(b). Al componente inmovilizado de esta manera se le denomina ligando. Al pasar una muestraheterognea que contiene el componente complementario, este se unir al ligando (c), permitiendo aseliminar las dems molculas mediante lavado. Finalmente, el componente de inters es eludomediante un cambio en las condiciones del medio, y recuperado (d). Ref: adaptado de PharmaciaBiotech, Suecia.

El principio de la cromatografa de afinidad es simple (Fig.4.1): se acoplacovalentemente uno de los dos componentes a un medio de soporte, para capturar alcomponente complementario a partir de una mezcla compleja de molculas. Esta unin es


reversible. Despus de lavar las molculas no unidas, se eluye el componente de intersmediante un cambio en las condiciones del medio, que induzcan una disociacin.

Para la elucin de una columna de afinidad es comn utilizar cambios de pH quealteren la afinidad de la unin, causando cambios reversibles y transitorios en las protenas.Sin embargo tambin existen otras estrategias para la elucin, tales como el uso desoluciones salinas de alta molaridad, el uso de agentes caotrpicos (Cuadro 4.1), o laseluciones de tipo competitivo que utilizan el mismo ligando, pero en estado libre.

Cuadro 4.1: Algunas formas de elucin en la cromatografa de afinidad *____________________________________________________________________________Condiciones de elucin Comentarios____________________________________________________________________________Glicina-HCl, pH 2,5-3,0 Incompatible con el uso de deoxicolato

Acido propinico 1 M Ms eficiente que el HCl al mismo pH, posiblementepor una ligera accin detergente. Pero puede causardesnaturalizacin irreversible.

Dietilamina 0,05 M, pH 11,5 Compatible con deoxicolato, por lo que es til paraantgenos de membrana.

Urea 2-8 M, pH 7,0 El calentamiento causa carbamilacin de protenas

Guanidina-HCl 6 M Fuertemente desnaturalizante

Tiocianato de sodio 3,5 M Las trazas inhiben el marcaje con yodo ofluorescena

Cloruro de magnesio 2-5 M Incompatible con el uso de deoxicolato

Yoduro de potasio 2-5 M, pH 7,5-9,0 -

Etiln glicol 50% v/v, pH 11,5 Rompe interacciones hidrofbicas_________________________________________________________________________* Goding (1986)

La cromatografa de afinidad ha ganado terreno por su simplicidad y rapidez, ascomo su alta selectividad, especialmente despus de la introduccin de los anticuerposmonoclonales (AcM). Con un AcM adecuado, en principio es posible aislar cualquierantgeno en un solo paso cromatogrfico y con un alto grado de purificacin. En laprctica, sin embargo, pueden presentarse diversos tipos de limitaciones al respecto.

Comercialmente, estn disponibles varios tipos de medios de soporte (en forma demicroesferas) pre-activados por mtodos qumicos, para acoplar prcticamente cualquierclase de ligandos, y aislar as sus molculas complementarias naturales (o fortuitas). Lamayora de las reacciones de acople a un soporte se realizan a travs de los grupos aminoprimarios de las protenas, a pesar de que el enlace resultante es uno de los menos estables(Goding, 1986). Tambin existen medios de soporte para realizar acoples covalentes atravs de otros grupos qumicos.

B. Lomonte 31

Algunos medios de soporte tienen un brazo espaciador en su grupo reactivo, cuyofin es aumentar la distancia entre la superficie del medio y la molcula covalentementeacoplada. Esto pretende reducir el impedimento estrico en la interaccin entre el ligando ysu componente complementario, durante el proceso cromatogrfico (Fig.4.2). Sin embargo,el brazo espaciador tambin puede dar lugar a fenmenos de adsorcin inespecfica dealgunas molculas, especialmente cuando el mismo es de naturaleza hidrofbica, y setrabaja con una alta concentracin de sales. Otro aspecto a considerar en el acople delligando al medio de soporte es que, en ocasiones, pueden ocurrir cambios importantes ensu conformacin nativa, en especial cuando el ligando reacciona con el soporte a travs demltiples puntos de unin.

ligando

brazo

Figura 4.2: El "brazo espaciador". Se esquematiza el acople de una molcula (ligando)directamente al medio de soporte activado (izquierda), o a travs de un brazo espaciador(derecha) para facilitar la interaccin y unin con su componente complementario,mediante la reduccin de posibles impedimentos estricos.

Acople de protenas a Sepharose activada con CNBr

Cuando se desea purificar los anticuerpos especficos contra un antgeno, a partirde un suero inmune, la cromatografa de afinidad es una de las mejores opcionesdisponibles. Para esto, se acopla covalentemente el antgeno de inters a un medio desoporte, para que acte como ligando en la captura y posterior elucin de los anticuerpos.Uno de los medios de soporte ms utilizados es la Sepharose activada con CNBr. Estemedio consiste de microesferas de agarosa tratadas con bromuro de ciangeno, en lascuales se establece un enlace isotiourea con las protenas, a travs de sus grupos aminolibres o primarios (-amino; Fig.4.3). Tambin existen otros medios de soporte pre-activados que utilizan reacciones distintas para el acople (N-hidroxisuccinimida,carbonildiimidazol, tolueno-sulfonil cloruro, etc.). Cada uno de ellos posee sus ventajas ydesventajas (Goding, 1986).


OH

HO HO

O-CNHR

NHCNBr RNH2

enlacetioisourea

Figura 4.3: Reaccin de acople de protenas a Sepharose 4B activada con CNBr. Seforma un enlace isotiourea entre el medio de soporte (agarosa) y los grupos aminoprimarios de la protena.

Procedimiento para acoplar protenas a Sepharose activada por CNBr

1.Disolver la protena en el amortiguador de acople. Utilizar 5-10 mg de protena por cadaml de gel. El amortiguador de acople se prepara con 4,2 g de NaHCO3(concentracin final 0,1 M), 14,6 g de NaCl (0,5 M), se ajusta su pH a 8,3 y se aforaa 500 ml.

2.Hidratar el gel seco con HCl 1 mM por 15 min (47 l de HCl concentrado, 11,7 N en 500ml de agua). Lavarlo varias veces con la misma solucin, utilizando al menos 200 mlpor cada gramo del gel seco. Esto puede realizarse en un embudo de vidrio poroso, oalternativamente, en tubos de centrfuga de 50 ml. El uso de un pH cido preserva lareactividad de los grupos qumicos del gel para el acople. Nota: 1 g de gel secoresulta en ~3 ml de gel hidratado.

3.Lavar por ltima vez el gel con amortiguador de acople (utilizando por lo menos 5 mlpor cada gramo de gel seco). A partir de este momento se debe acoplar la protena deinmediato, pues al subir el pH, los grupos reactivos del gel comienzan a inactivarse.

4.Transferir rpidamente el gel a la solucin de ligando (se recomienda una proporcin degel/amortiguador de 1:2 v/v). Mezclar suavemente en un rotador (no utilizar agitadormagntico, para no fragmentar las microesferas). La reaccin se puede dejarcompletar por 2 hr a temperatura ambiente o durante la noche a 4C.

5.Bloquear el exceso de grupos reactivos con etanolamina 1 M, o con glicina 0,2 M (1,5 gen 100 ml de agua) a pH 8,0 durante 2 hr a temperatura ambiente o 16 hr enrefrigeracin.

6.Empacar el gel en una columna cromatogrfica y lavar la protena no acoplada, haciendo4 ciclos de cambio de pH alto y bajo, respectivamente, con amortiguador de acople(ver arriba) y amortiguador de acetato (4,1 g acetato de sodio [0,1 M], 14,6 g NaCl[0,5 M], ajustar pH a 4,0 y aforar a 500 ml).

7.La columna est lista para ser utilizada. Guardarla siempre en refrigeracin. Nota: sepuede determinar la eficiencia del acople de la protena al soporte, midiendo la

B. Lomonte 33

disminucin en la A280 de una pequea alcuota de sobrenadante de reaccin, alinicio y al final del proceso.

Figura 4.4: Componentes de un sistema de cromatografa lquida convencional (de bajapresin). Una bomba peristltica (1) se encarga de hacer fluir el solvente hacia la columna, auna velocidad constante y regulable; (2) el medio cromatogrfico, en este caso una pequeacolumna de inmunoafinidad; (3) una fotocelda de flujo continuo, se encarga de detectar laabsorbancia a 280 nm del efluente de la columna, que finalmente termina en un recolector defracciones (4), o sistema mecnico de tubos intercambiables que se regula por tiempo o porrecuento de gotas.

Aislamiento de anticuerpos mediante cromatografa de afinidad

El siguiente es un procedimiento general para sistemas protena-protena. Puedenexistir casos particulares en que las condiciones de este mtodo causen la desnaturalizacinirreversible de las molculas de inters. En tal caso, deben buscarse otras modalidades deelucin (ver Cuadro 4.1).

1.Equilibrar la columna de Sepharose-antgeno con PBS, pH 7,2. Cuando la columna se hadejado de utilizar por algn tiempo, es conveniente realizar una pre-corrida sinmuestra, para limpiarla. Conectar la columna a un sistema de deteccin continua deprotenas (A280).


Figura 4.5: Detalle de una columna y graficador. A la izquierda se muestra un detallede la columna de inmunoafinidad de la Figura 4.4, construda con una jeringa descartablede 20 ml, a la cual se le coloc una base de "lana de vidrio" en el fondo, para retener elmedio cromatogrfico. La jeringa est sellada en su parte superior mediante un tapn decaucho, perforado por una aguja calibre 20 que se conecta a la lnea de entrada delsolvente. En la parte inferior se acopl una llave de plstico, unida a la lnea de salida. A laderecha se muestra la graficacin continua de la absorbancia del efluente de la columna,generndose un patrn de elucin de protenas, con base en la seal enviada por lafotocelda de flujo continuo.

2.Aplicar la muestra, diluda a partes iguales con PBS, y pasarla lentamente (ej. 1 gota/10-20 seg). Si el flujo es muy rpido, habr menor posibilidad de interaccin en lacolumna y el rendimiento final puede disminuir. Cuando se desea obtener el mximode rendimiento de una muestra, se puede dejarla recirculando continuamente por lacolumna durante unos 30 min, antes de continuar con el siguiente paso.

3.Una vez pasada la muestra, lavar la columna con unos 50 ml de PBS, con una velocidadde 1 gota/3-4 seg, para eliminar las protenas no unidas. El lavado debe continuarhasta que la A280 del eluente haya regresado completamente a su lnea base.

4.Eluir los anticuerpos unidos al antgeno, aplicando el amortiguador de elucin (glicina-HCl 0,1 M, pH 2,8-3,0). Recoger fracciones de 3-4 ml en tubos que contienen 0,5 mlde amortiguador receptor (Tris-HCl 0,5 M, pH 8,8), para neutralizar inmediatamenteel pH cido y renaturalizar los anticuerpos.

B. Lomonte 35

5.Una vez recolectados los anticuerpos, re-equilibrar la columna con PBS y conservarla enrefrigeracin. Una columna de afinidad puede ser reutilizada muchas veces, siemprey cuando la funcionalidad y el rendimiento se mantengan aceptables.

Nota: observe que este mismo procedimiento puede ser utilizado de forma inversa, para purificar un antgenoa partir de una mezcla compleja. Para ello, se puede acoplar a la columna los respectivos anticuerpos, o unanticuerpo monoclonal apropiado, y realizar la purificacin del antgeno por inmunoafinidad.

Cuadro 4.2: Unin de la protena A y protena G a las IgG de distintas especies *__________________________________________________________________Especie Subclase IgG Protena A Protena G__________________________________________________________________Humano IgG1 ++ ++

IgG2 ++ ++IgG3 - ++IgG4 ++ ++

Ratn IgG1 +/- +IgG2a ++ ++IgG2b ++ ++IgG3 ++ ++

Rata IgG1 + +IgG2a - ++IgG2b - +IgG2c ++ ++

Cerdo IgG + ++

Conejo IgG ++ ++

Vaca IgG1 - ++IgG2 ++ ++

Oveja IgG1 - ++IgG2 ++ ++

Cabra IgG1 + ++IgG2 ++ ++

Caballo IgG (ab) + ++IgG (c) + ++IgG (T) - +

Perro IgG ++ +__________________________________________________________________* Ref: Bio-Rad, boletn tcnico.


Purificacin de IgG de distintas especies con Protena A o con Protena G

La "protena A" es un componente de la pared bacteriana presente en muchas cepasde Staphylococcus aureus (ej. cepa Cowan I). Algunas cepas son capaces de secretarla almedio de cultivo en forma soluble. Su utilidad radica en que la protena A es capaz deunirse, en forma selectiva, a la regin Fc de las IgG de muchas especies animales, entreellas la humana (subclases IgG1, IgG2 e IgG4, aunque no la IgG3), la de conejo, y otras(Langone, 1982; ver Cuadro 4.2). La "protena G" funciona en forma similar, y esobtenida de ciertas cepas de estreptococos. Esta protena puede unirse a las IgG de algunasespecies que muestran una interaccin dbil con la protena A (y viceversa), por lo que laescogencia entre ambas se basa en el origen de las inmunoglobulinas que se deseapurificar.

Utilizando columnas que poseen protena A (o protena G) inmovilizada en unmedio cromatogrfico, es posible purificar fcilmente la IgG del suero de varias especies(Fig.4.6). El procedimiento general es el mismo descrito arriba, basado en la elucin de losanticuerpos con glicina cida.

Figura 4.6: Ejemplo de la purificacin de IgG en una columna de Sepharose-protena A. El trazo punteado representa la absorbancia a 280 nm de las protenas.Una muestra de suero de conejo (M) de 1 ml se aplic a la columna, y esta se lavcon PBS pH 7,2 hasta eliminar toda la protena no unida. La segunda flecha indica elcambio de amortiguador (glicina HCl, pH 2,8), que induce la elucin de la IgG(segundo pico). La columna se vuelve a equilibrar finalmente con PBS, para sualmacenamiento a 4C.

A280

volumen de elucin

M pH 2,8

B. Lomonte 37

Captulo 5

Preparacin de Geles de Agarosa paraTcnicas Inmunolgicas

Introduccin

Los geles de agarosa sirven como medio de soporte para la realizacin de unavariedad de tcnicas inmunolgicas, tales como la doble inmunodifusin, la reoforesis, lainmunodifusin radial y diversos tipos de inmunoelectroforesis.

La agarosa es un componente del agar, una mezcla de polisacridos extrada dealgunas algas marinas como Gelidium amansii, Gracilaria fortissima, y otras. Adems dela agarosa, el agar contiene agaropectina, un componente con propiedades inconvenientespara ciertas tcnicas. La agaropectina posee un alto contenido de grupos ionizables, quepueden interferir con la difusibilidad de algunas molculas en el agar, y que ademsgeneran una alta electroendosmosis (ver adelante). Al eliminar la agaropectina del agar,queda la agarosa, que est formada por polisacridos lineales neutros, compuestos porresiduos de galactosa (Fig. 5.1) que se alternan y forman redes por entrelazamiento. Estosresiduos pueden estar sustitudos en diversos grados por grupos sulfato, metoxilo, piruvatoy carboxilo, los cuales determinan en gran parte las propiedades fsicas del gel. El bajocontenido de grupos ionizados de la agarosa reduce los problemas de interaccin con lasmuestras, as como sus propiedades electroendosmticas. A la vez, la agarosa producegeles ms resistentes y transparentes que el agar.

La mayora de tipos de agarosa gelifican a temperaturas cercanas a los 40C. Para eltrabajo con clulas o con enzimas muy lbiles, existen preparaciones especiales agarosa debajo punto de gelificacin (low-gelling agarose), que gelifican a 30C. La temperatura degelificacin se relaciona directamente con el contenido de grupos metoxilo en elpolisacrido.

Aunque los geles de agarosa pueden someterse a muchos ciclos de licuefaccin ygelificacin, esto debe evitarse, debido a que durante cada calentamiento se hidroliza una

D-galactosa 3,6-anhidro-L-galactosa

Figura 5.1: Estructura de la subunidad repetida de la agarosa.


pequea proporcin del polisacrido. Por esto, para mantener la agarosa en estado lquido,es preferible colocarla en un bao de agua a 50C y no en ebullicin prolongada. Lahidrlisis de la agarosa puede ser importante en tcnicas cuantitativas de difusin, por dosrazones:

(1) vara la concentracin final real del gel.(2) los fragmentos solubles aumentan la viscosidad de la fase fluda del gel.

Por lo anterior, en vez de fundir y gelificar varias veces una misma preparacin deagarosa, es recomendable almacenarla en alcuotas de un volumen apropiado para latcnica a utilizar, las cuales se funden en bao mara para su uso. En la actualidad, tambines comn la utilizacin del horno de microondas para este fin.

Al enfriarse, las soluciones de agarosa forman un gel reticular, con poros de tamaoheterogneo (Fig.5.2). El dimetro promedio de los poros es inversamente proporcional ala concentracin del gel. La agarosa puede gelificar a concentraciones tan bajas como0,1% (p/v). Sin embargo, para lograr una consistencia ptima, por lo general se utilizaentre el 0,5 y el 1,5% de concentracin. Se estima que un gel al 1% forma poros cuyolmite de exclusin molecular para molculas esfricas es de 10-50 x 106 daltons, enpromedio.

100 C100 C

45 C tiempo

Figura 5.2: Gelificacin de la agarosa. Las cadenas lineales en solucin (100 C) comienzan a formaruna estructura reticular al enfriarse, la cual se estabiliza gradualmente hasta formar la estructura finalreticular del gel (Ref: adaptado de Pharmacia Biotech, Suecia).

Cuidados en la preparacin de los geles

Los geles de agarosa se preparan disolviendo la cantidad requerida del slido, ya seaen agua o en un amortiguador, aplicando calor directo, hasta lograr una ebullicin suave.Esto puede realizarse en un quemador de gas, en una plantilla de calentamiento elctrica, oen un horno de microondas. La agarosa est completamente disuelta cuando su aspecto escristalino. Durante el calentamiento convencional, se debe agitar constantemente paraevitar que el slido sedimente y "caramelice" en el fondo. Los agitadores magnticos concalentador incorporado son un aditamento muy conveniente para preparar soluciones de

B. Lomonte 39

agarosa.Si el amortiguador requerido es termolbil, se puede preparar la agarosa en agua, al

doble de la concentracin deseada. Una vez disuelta, se enfra ligeramente, y se mezcla conun volumen igual del amortiguador, tambin preparado al doble de la concentracindeseada ("2x"). Los amortiguadores de boratos pueden formar complejos con la agarosa,por lo que no se recomiendan como solvente.

Almacenamiento y cuidados en el empleo de los geles

Cuando se realiza rutinariamente un cierto nmero de pruebas de laboratorio queutilizan agarosa, conviene preparar agarosa y almacenarla en alcuotas. Para elalmacenamiento, se puede agregar un agente antimicrobiano como la azida de sodio1(NaN3) al 0,02%, o el timerosal al 0,01% (siempre que no interfieran con la tcnica en quese van a emplear los geles). Es importante usar recipientes hermticos para evitar ladeshidratacin del gel (sinresis). Por ejemplo, se puede utilizar tubos de vidrio con tapade rosca, los cuales pueden ser calentados en bao mara para fundir la agarosa almomento que se requiera. Los geles se pueden almacenar muy bien en refrigeracin, hastapor perodos de meses, si se previene la prdida de humedad.

Cuando se requiere fundir un gel previamente preparado y almacenado, se utiliza unbao mara en ebullicin (recuerde aflojar la tapa del recipiente). Una vez en estadolquido, el gel es chorreado sobre la placa de trabajo, sobre una superficie nivelada, ydejado en reposo para que gelifique como una capa de grosor homogneo (Fig.5.3).Usualmente es posible utilizar los geles apenas unos minutos despus de la gelificacin.Sin embargo, en algunas tcnicas cuantitativas se recomienda dejar los geles a 4C poralgunas horas, para que alcancen su mxima estabilidad.

Recubrimiento de placas de vidrio con una "capa base"

Las placas o lminas de vidrio poseen poca adhesividad hacia los geles de agarosa.Por esto, se recubren primero con una capa de agarosa que, una vez deshidratada, formauna pelcula base que da una fuerte adherencia a un segundo gel, o gel de trabajo. Parahacer la capa base, se prepara agarosa al 0,5% en agua destilada, se distribuye sobre laplaca, se gelifica y se deja secar en una estufa o una incubadora (37-60C). La adhesividadentre el vidrio y el gel de trabajo (chorreado posteriormente) no solo le da ms estabilidadmecnica al medio, sino que acta como un sello que evita que las muestras depositadas enlos hoyos del gel se desplacen entre el vidrio y el gel (Fig.5.4). Los materiales de plstico,tales como placas de Petri, placas comerciales, etc., por lo general poseen una altaadhesividad hacia los geles de agarosa, por lo que no requieren de una capa base.

1 Nota: la azida de sodio es txica, y adems pue

2007 Manual Metodos Inmunologicos Completo

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