1.2 Colorantes hematológicos (Tema 1)

LOS COLORANTES HEMATOLOGICOS

QCB.EH ROSARIO SALAZAR RIOJASSERVICIO DE HEMATOLOGIA1


1. El color y los colorantes HEMATOLOGICOS

2. El color y las estructuras celulares 3. Problemas TECNICOS en las tinciones4. Casos de morfologa

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Qu es un COLOR?

Es la longitud de onda del espectro de LUZ VISIBLE que absorbe y refleja un cuerpo Espectro de la luz visible:380 nm........Violeta 780 nm..........Rojo3


Un cuerpo es BLANCO cuando refleja todas las longitudes de onda Un cuerpo NEGRO absorbe todas las longitudes de onda

Un cuerpo ROJO absorbe todas las longitudes de onda menos las rojas

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LOS COLORANTES HEMATOLOGICOSBASOFILO NEUTROFILO

Qu es un COLORANTE?

Un colorante es una sustancia con capacidad de transmitir un color a un sustrato Debe penetrar e interactuar con las estructuras moleculares de las clulasHEMATIES PLAQUETAS 5

LOS COLORANTES HEMATOLOGICOSLas estructuras celulares que vamos a teir deben ser tratadas previamente, mediante la FIJACIONLa FIJACION es un proceso fsicoqumico que inmoviliza determinadas estructuras celulares, y que permite que puedan ser posteriormente coloreadas sin ser arrastradas en el procesoEOSINOFILOS 6


Durante la FIJACION se producen varios fenmenos:

Se coagulan las protenas celulares conservando su arquitectura Pueden perderse algunas sustancias no esenciales para la interpretacin citomorfolgica; los alcoholes disuelven las grasasLas extensiones sanguneas se pueden fijar con calor seco, alcoholes, formaldehdo, acetona, etc. El mejor fijador para morfologa es el metanol (alcohol metlico)

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LOS COLORANTES HEMATOLOGICOSQUE PRETENDEMOS CON LAS TINCIONES? 1. Identificar las clulas 2. Identificar sus estructuras internas Densidad de la cromatina Presencia de nuclolos Citoplasma: CaractersticasGranulacin8


CELULA PLASMATICA (LINFOCITO B): A LA IZQUIERDA IMAGEN AL MICROSCOPIO ELECTRONICO Y A LA DERECHA UN ESQUEMA DE LA MISMA 9


MITOCONDRIAS

NUCLEO

APARATO DE GOLGI

RETICULO ENDOPLASMICO CON RIBOSOMAS

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LOS COLORANTES HEMATOLOGICOSNUCLEO

CONTIENE ADN Y PROTEINAS ESPECIFICAS SU MAYOR O MENOR DENSIDAD, EQUIVALENTE A MAS O MENOS MADUREZ, SE TRADUCE POR UNA COLORACIN +/ INTENSA LA PRESENCIA DE NUCLEOLOS (ACUMULACION DE ARN PROPIA DE CELULAS INMADURAS) SE VE COMO UNA ZONA CLARA RODEADA DE UN HALO MAS INTENSO

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LOS COLORANTES HEMATOLOGICOSRETICULO ENDOPLASMICO RUGOSO ES EL LUGAR DONDE SE SINTETIZAN LAS PROTEINAS DE LAS CELULAS ES MUY RICO EN ARN (RIBOSOMAS) CUYO CARACTER ACIDO ATRAE A LOS COLORANTES BASICOS

A VECES MUESTRA DILATACIONES QUE AL MICROSCOPIO PARECEN PEQUEAS VACUOLASSU PRODUCCION SE ENVIA AL APARATO DE GOLGI, Y DE ESTE AL EXTERIOR

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LOS COLORANTES HEMATOLOGICOSESTRUCTURAS GRANULARES MITOCONDRIAS LISOSOMAS CENTRIOLOS GRANULOS DE GLUCOGENO VACUOLAS OTRAS SE OBSERVAN CON EL MICROSCOPIO OPTICO COMO GRANULOS, MAS O MENOS GRANDES, QUE ADQUIEREN DISTINTA COLORACION SEGUN SU CONTENIDO

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LOS COLORANTES HEMATOLOGICOSQU COLOR TRANSMITE UN COLORANTE?NEUTROFILO

1. El suyo propio

2. Un color distinto: metacromasia3. Ms de un color: alocromasiaBASOFILO

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COMO TRANSMITE EL COLOR?

Coloracin = impregnacin del sustrato Reaccin qumica = citoqumica

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LOS COLORANTES HEMATOLOGICOSMECANISMO USUAL DE COLORACION

ATRACCION ELECTROSTATICA

+

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LOS COLORANTES HEMATOLOGICOSColoracin: Afinidad de carga elctrica del colorante por el sustrato celular

Directa: Se produce una unin electro polar entre colorante y sustrato Indirecta: El colorante necesita una pieza de unin intermedia, a la que se denomina mordiente17

LOS COLORANTES HEMATOLOGICOSLos mordientes suelen ser metales: aluminio, molibdeno, cromo, vanadio, etc Colorante Mordiente Sustrato

El conjunto colorante + mordiente se denomina laca Ejemplo: Tanto la Hematoxilina como el Rojo Nuclear emplean el Aluminio como mordiente18

LOS COLORANTES HEMATOLOGICOSColoracin progresivaSe aade al sustrato celular el colorante muy diluido (por ej. al 1%), y se deja durante tiempos diferentes en distintas muestras. Se observa la tincin de distintas estructuras de manera progresiva

Coloracin regresivaPartiendo del colorante muy concentrado, se enjuagan gradualmente las muestras (diferenciacin) hasta lograr la mejor visualizacin de determinadas estructuras celulares19

LOS COLORANTES HEMATOLOGICOSMETACROMASIAFenmeno tintorial en el que un colorante determinado tie a un sustrato celular en un color diferente al propio

AZUL DE TOLUIDINA Tie de color ROSA los grnulos de los basfilos

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LOS COLORANTES HEMATOLOGICOSMETACROMASIALos grnulos de los BASOFILOS contienen mucopolisacridos cidos con grupos sulfatos [-] a menos de 5 unos de otrosLas molculas de Azul de Toluidina (intensamente bsicas +) se unen apretadamente configurando una tonalidad final rosada (fenmeno de basofilia)

BASOFILO 21

LOS COLORANTES HEMATOLOGICOSPARTES DE UN COLORANTEGRUPO CROMOFORO: son grupos de tomos en resonancia (e- en vibracin) que predisponen a la molcula a ser coloranteFRACCION CROMOGENA: constituyen la mayor parte de la molcula, a la que da color (peso y densidad) GRUPO AUXOCROMO: portador de la carga elctrica, positiva o negativa, que se une al sustrato22


ANILINA O2N - NH2+ / Cl-

cromforo

cromgeno

auxcromo23

LOS COLORANTES HEMATOLOGICOSPARTES DE UN COLORANTEGrupos cromforos: -NO (nitroso) -NO2 (nitro) -N=N- (azo) -C=S (tio)Son grupos atmicos en resonancia (nubes de electrones en vibracin), que confieren una aptitud colorante a la molcula. Aportan el color de base: morado en el caso de la anilina

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LOS COLORANTES HEMATOLOGICOSPARTES DE UN COLORANTEFraccin cromgena Anillo bencnicoCuanto mayor sea el peso de esta fraccin mas intensa ser la accin colorante Pueden ser cclicos (derivados de Benceno, Antraceno o Naftaleno) o Acclicos (Etil, Metil,...)

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LOS COLORANTES HEMATOLOGICOSPARTES DE UN COLORANTE Grupos auxcromosCatinicos (+): Amina primaria NH2 Amina secundaria -NHDerivados arlicos y alqulicos Carboxilo COOH Sulfnico SO3H Oxidrilo OH Fosfrico PO4H3

Aninicos (-):

Nota: Actan como lugar de enganche al sustrato celular. Para ser activos deben hallarse como sales solubles (sdicas, potsicas, cloruros, sulfatos, etc)26

LOS COLORANTES HEMATOLOGICOSCOLORANTES BASICOS

Los AUXOCROMOS CATIONICOS o bsicos (+) se salifican con los cidos (-) del sustrato:

BASOFILO

BASOFILIAafinidad del sustrato celular [-] por colorantes bsicos [+]

BASOFILIA INTENSA EN EL CITOPLASMA DE 27 UN PLASMOCITO

LOS COLORANTES HEMATOLOGICOSCOLORANTES ACIDOS

Los AUXOCROMOS ANIONICOS o cidos (-) se salifican con las sustancias bsicas (+) contenidas en las estructuras celulares:

ACIDOFILIAafinidad del sustrato celular [+] por colorantes cidos [-]EOSINOFILO

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LOS COLORANTES HEMATOLOGICOSCOLORANTES NEUTROSSus molculas contienen AUXOCROMOS CATIONICOS Y ANIONICOS, que les permite presentar acidofilia y basofilia segn los sustratos celulares sobre los que se fija. Ejemplo: Eosinato de azul de metileno

[+]/Cl-

[-]/Na+

BASOFILIACELULA

+ACIDOFILIA29

LOS COLORANTES HEMATOLOGICOSCOLORANTES NEUTROSSuelen emplearse diluidos en soluciones alcohlicas (metanol con frecuencia), en las que existe un equilibrio entre los iones [+] y [-]NEUTROFILO

Ejemplo: El eosinato de azul de metileno tie los ncleos de las clulas reaccionando con los cidos nucleicos (azul de metileno[+]) y con las nucleoprotenas (eosinato[-])30

LOS COLORANTES HEMATOLOGICOSCOLORANTES NEUTROS

Variando el pH del medio en el que interaccionan el colorante y los sustratos celulares, se puede modificar la afinidad y por tanto la coloracin final

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COLORANTES NEUTROSLas protenas celulares contiene grupos aminos y grupos cidos: Cualquier protena a un pH inferior a su punto isoelctrico (PI) se carga [+], con lo que tendr mayor afinidad por los colorantes cidos [aninicos -].

Por el contrario, si elevamos el pH por encima de su PI se pondrn de manifiesto sus cargas [-], aumentando su avidez por los colorantes bsicos [catinicos +].

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LOS COLORANTES HEMATOLOGICOSCOLORANTES NEUTROS

HEMOGLOBINA: protena eritrocitaria rica en grupos cidos (-COO-) y amino (-NH2). La tincin de MGG proporciones varias coloraciones: = Sepia (beige claro), a pH 7 - 7.2

= Rosa a rojo, a pH 6.4 6.8 (til si policromasia)= Gris-azulada, a pH 7.2 7.6

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pH 7.4

pH 6.8

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LOS COLORANTES HEMATOLOGICOSNEUTROFILO

COLORANTES NEUTROSNormalmente para teir extensiones de citologas sanguneas se emplean colorantes qumicamente neutros, con los que se obtiene una:

TINCION PANCROMATICA, una TINCION PANOPTICALINFOCITO35


En 1.891, ROMANOVSKI emple una solucin acuosa de Azul de Metileno para teir una muestra de sangre con Plasmodios, en la que haban aparecido colonias de hongos despus de 3-4 meses.

Sorprendido, observ que los ncleos de los polimorfo nucleares adquiran un tono rojo prpura, mientras el citoplasma permaneca ms o menos azulado.TINCION NORMAL CON AZUL DE METILENO 36


AZUL DE METILENO

CH3 N+

CH3N

auxcromo

cromgeno

S

cromforo

N+

CH3 CH3auxcromo37

LOS COLORANTES HEMATOLOGICOSAZUL

AZUL DE METILENOAZUL-VIOLETA

-CH3

AZUR BVIOLETA-ROJO

-CH3

AZUR AROJO OSCURO

-CH3

VIOLETA DE METILENO38


El azul de metileno y sus derivados aportan 3 colores principales: Rojo Azul

Violeta

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TINCION PANCROMATICAUna SOLUCION UNICA, compuesta por varios colorantes y sus derivados qumicos en solucin aportan toda una gama de colores

NEUTROFILIA 40

LOS COLORANTES HEMATOLOGICOSTINCIONES PANCROMATICASDe los trabajos de ROMANOVSKI, y de otros autores como LEISHMAN, WRIGTH, GIEMSA, TRIBONDEAU, etc, derivan las actuales tinciones pancromticas, basadas en diversas combinaciones de: Azul de metileno y sus derivados (azures)

Eosina

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LOS COLORANTES HEMATOLOGICOSTINCIONES PANCROMATICASCOLORANTE DE WRIGHT: Resulta de la demetilacin del Azul de Metileno (AM) en un medio muy alcalino (CO3HNa) y a 1 atmsfera de presin, obtenindose sucesivamente una mezcla de:Azul de Metileno

+

Azur B (I)

+

Azur A (II)

+

Violeta de Metileno42

LOS COLORANTES HEMATOLOGICOSTINCIONES PANOPTICASEmpleo sucesivo de 2 o ms soluciones colorantes. En general son de mayor calidad cromtica que las tinciones pancromticasEjemplo: La Tincin de May-Grnwald-Giemsa43

LOS COLORANTES HEMATOLOGICOSTINCIONES PANOPTICAS

COLORACION DE MAY-GRNWALD-GIEMSA (o panptica de Pappenheim)

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LOS COLORANTES HEMATOLOGICOSTINCIONES PANOPTICASGIEMSA: - Eosinato de Azur II (azur A) - Azur II al 0.76% en glicerina y metanol MAY-GRNWALD (*): Eosinato de AM al 0.2% en metanol

(*): Eosinato de Azul de Metileno (una molcula de Eosina unida a dos de Azul de Metileno) al 0.2-0.25% en metanol

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LOS COLORANTES HEMATOLOGICOSTINCIONES PANOPTICASFIJACION: metanolMAY-GRNWALD

PRECOLORACION: AM + eosinaCOLORACION FINAL

GIEMSA

NOTAS: La adicin de pequeas cantidades de GLICERINA a la solucin de Giemsa aumenta la ionizacin del colorante y su disponibilidad, y por otra parte disminuye la formacin de precipitados cuando la tincin es prolongada. Si adems se aade una gota de ACETONA (x 20 cc de sol. de Giemsa) se mejora la penetrabilidad del colorante, hecho muy til cuando existe una gran densidad celular 46


EL COLOR DE LAS ESTRUCTURAS CELULARES

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Para COMUNICAR lo que vemos al microscopio debemos reconocer determinadas CARACTERISITCAS de las clulas teidas, e informar en trminos concretos que definan situaciones de normalidad o de anormalidad. Vamos a tratar a continuacin sobre la TERMINOLOGIA que debemos usar para expresar nuestros resultados

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LOS COLORANTES HEMATOLOGICOSComponentes moleculares implicados en la qumica de las coloracionesAcidos Nucleicos Nucleoprotenas Lpidos (fosfo-)Carbohidratos

Ac. Fosfrico: anin principal Alcalinidad de HIS, ARG y LIS cidos, bsicos o neutrosEn su mayora acdicos

(+): alcalino, carcter bsico, pH elevado (>7), catin (-): carcter cido, pH bajo (2 nuclolos

Mononucleosis Infecciosa

Blasto maligno

Blasto maligno68

LOS COLORANTES HEMATOLOGICOSCARACTERISTICAS DEL CITOPLASMA

INTENSAMENTE BASOFILOEs decir contiene sustancias con gran avidez por los colorantes bsicos. Y concretamente las clulas con gran actividad de sntesis poseen una gran basofilia debido a la presencia en el citoplasma de ARN, que contiene abundantes grupos fosfricos (PO3-).

PLASMOCITO

LINFOCITO ACTIVADO69


DE BASOFILIA MEDIAComo ocurre en los linfocitos ligeramente activados o en los promielocitos

LINFOCITO T ACTIVADO (MONONUCLEOSIS I.)

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Bordes netos

Bordes irregulares

Linfocito activado (mononucleosis inf.)

Linfocito71

LOS COLORANTES HEMATOLOGICOSCARACTERISTICAS DE LA GRANULACIONEosinfila ( acidfila)

Basfila

Neutrfila (mixta)

Granulocito Eosinfilo

Granulocito Basfilo

Granulocito Neutrfilo72


PROBLEMAS TECNICOS

Vamos a revisar brevemente algunos defectos comunes en las tinciones de rutina que se realizan en los laboratorios de Hematologa

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LOS COLORANTES HEMATOLOGICOSPROBLEMAS TECNICOS Las extensiones de sangre para examen morfolgico se deben de realizar inmediatamente despus de la extraccin de la muestra en EDTA.

Cuando pasan ms de 2 o 3 horas, comienzan a aparecer fenmenos degenerativos en las clulas.CELULA NO IDENTIFICABLE, CON EL NUCLEO EN DEGENERACION (CARIOLISIS) 74

LOS COLORANTES HEMATOLOGICOSPROBLEMAS TECNICOS

La solucin de fijacin precoloracin se ha derramado, secndose en la zona dejada al descubierto

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Fijacin defectuosa y depsitos de colorantes en torno a los hemates

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LOS COLORANTES HEMATOLOGICOSPROBLEMAS TECNICOSPrecipitados de colorante en halo entre las clulas

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Defecto en la fijacin: es imposible distinguir la morfologa de los eritrocitos78

LOS COLORANTES HEMATOLOGICOSPROBLEMAS TECNICOSExtensin insuficientemente seca, y mal fijada por el alcohol

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Entre otros excesos se observa una sobre-tincin que impide reconocer las caractersticas de la cromatina de los ncleos

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La cantidad de solucin fijadoracolorante es deficiente

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Solucin de lavado con suciedad que dificulta la visin

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LOS COLORANTES HEMATOLOGICOST. PANCROMATICA DEFICIENTE: EXCESO DE COLORANTE QUE IMPIDE VER LA CROMATINA NUCLEAR Y SUCIEDAD

T. PANCROMATICA CORRECTA

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LA GRANULACION ESPECIFICA DEL BASOFILO SE HA PERDIDO PARCIALMENTE. AL SER SU CONTENIDO SOLUBLE EN AGUA, UN EXCESO DE LAVADO LA HA ELIMINADO

LA GRANULACION SECUNDARIA DEL BASOFILO MUESTRA SU TIPICA COLORACION NEGRUZCA DEBIDO A LA AVIDEZ DE LA HEPARINA (ACIDO) POR EL AZUL DE METILENO (BASE)

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En las tinciones que usamos, ya hemos comentado que el color se logra por una atraccin electrosttica, establecindose enlaces qumicos estables aunque no muy fuertes. Por ello un lavado excesivo, combinado o no con una cantidad insuficiente de solucin colorante, puede conducir a una decoloracin ms o menos intensa

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LOS COLORANTES HEMATOLOGICOSSOLUCIONES A LOS PROBLEMAS TECNICOS

Limpieza de los portaobjetos Eter / Alcohol [1:1] pH del agua destilada: 7-7.2 Hervir o tamponar Secado de las extensiones Mnimo 2 horas; ptimo 24 h86

LOS COLORANTES HEMATOLOGICOSSOLUCIONES A LOS PROBLEMAS TECNICOS

Sobrecarga de color: precipitados Glicerina

Suciedad de fondo Lavar con A.D. Conservacin Cubrir con DPX87


CASOS DE MORFOLOGIA

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Ncleo FormaCromatina Nuclolos Citoplasma Coloracin

Fig. 1: Linfocito

Bordes

Grnulos89



Fig. 2: Eosinfilo

Bordes

Grnulos90



Fig. 3: Mielocito

Bordes

Grnulos91



Fig. 4: Neutr. Banda

Bordes

Grnulos92



Fig. 5: Linfocito

Bordes

Grnulos93



Fig. 6: Basfilo

Bordes

Grnulos94



Fig. 7: Neutr. Segmentado

Bordes

Grnulos95



Fig. 8: Monocito

Bordes

Grnulos96



Fig. 9: Blasto

Bordes

Grnulos97



Fig. 10: Linfocito

Bordes

Grnulos98

1.2 Colorantes hematológicos (Tema 1)

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