UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA

10ma PRÁCTICAAislamiento e identificación de salmonella en harina de pescado

Curso: Microbiología pesquera

Alumna: Marilli Milagros Sosa Sarmiento

Profesora: Nancy Martinez Ordinola

Grupo: F* Mesa: 1

Fecha de ejecución: junio del 2011

Fecha de entrega: julio del 2011

2011

INTRODUCCION

Dentro del análisis microbiológico a productos alimenticios o insumos que sean utilizados

para su elaboración se pone énfasis en la determinación de Salmonella ya que este

desencadena una serie de intoxicaciones que podrían ser letales para el hombre o el animal

que consuma el alimento contaminado, siendo la salmonelosis la principal infección generada

por esta enterobacteria gram negativa cuya transmisión tiene lugar por vía fecal – oral.

El mayor predominio de la Salmonella se encuentra en la carne de aves, ganado vacuno,

pavos y pollos, pero también se debe considerar los alimentos que se encuentran en contacto

con las heces y materia fecal en general como la harina de pescado, principal insumo para la

elaboración de piensos y alimento artificial destinado a peces y camarones como suplemento

proteínico.

La harina de pescado que se utiliza en la fabricación de piensos para los animales con

frecuencia tiene Salmonella como consecuencia de su contaminación por roedores y aves. El

marisco que se alimenta por filtración y que es capturado en aguas cercanas a las costas

contaminadas muchas veces, y los camarones precocidos congelados, han sido identificados

como los productos de mayor riesgo dentro de este grupo.

La evaluación microbiológica considera que los brotes fundamentalmente se deben a un

tratamiento térmico inadecuado de los insumos como la harina de pescado, por lo que se

debe de priorizar el control en los procesos de producción para garantizar que el producto

cumpla con los requerimientos sanitarios y se asegure la inocuidad del alimento.

REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

La salmonelosis se define como una infección zoonósica puesto que la fuente principal de la

enfermedad humana la constituyen los animales infectados. La transmisión tiene lugar por vía

fecal – oral por medio de la cual el contenido intestinal de un animal infectado es ingerido con

un alimento o con el agua. Los factores que cooperan en los brotes son principalmente el

tiempo de uso incorrecto de la temperatura y un tratamiento térmico insuficiente. La

contaminación puede ser cruzada por contacto directo o cruzada por contacto indirecto de los

materiales y utensilios de cocina.

El mayor predominio de Salmonella está en las carnes, estando las canales contaminadas

especialmente la carne de ave: pollo 35%, pavo 45%, vacuno y cerdo 1-5 % según

condiciones de los mataderos. También en alimentos desecados (el coco rallado para

repostería) y productos sin pasteurizar como huevo en polvo, huevo líquido y leche y sobre

todo en la cáscara de los huevos frescos de aves de corral ya que contienen heces o materia

fecal de la cloaca de la gallina. Los piensos compuestos también se suelen encontrar

contaminados siendo éstos el origen de la infección de los animales sobre todo en harinas de

carne y huesos de baja calidad.

El pescado, productos derivados y el marisco sólo están relacionados con la salmonelosis

accidentalmente, aunque la harina de pescado que se utiliza en la fabricación de piensos

para los animales con frecuencia tiene Salmonella como consecuencia de su contaminación

por roedores y aves. El marisco que se alimenta por filtración y que es capturado en aguas

cercanas a la costa contaminada muchas veces, y los camarones precocidos congelados,

han sido identificados como los productos de mayor riesgo dentro de este grupo. Los

productos vegetales como por ejemplo las hortalizas que se utilizan para preparar ensaladas,

han sido relacionados con brotes accidentales de fiebre tifoidea y salmonelosis, debido a la

utilización de agua de riego contaminada o de deyecciones humanas y de estiércol de los

animales como abono.

MEDIDAS DE CONTROL:

1. Asegurar que los piensos animales estén libres de Salmonella y los importados

tratados convenientemente con calor.

2. Intentar eliminar la Salmonella de las granjas reproductoras, mejorando las

condiciones higiénico – sanitarias de mataderos y granjas avícolas.

3. Evitar los riesgos de contaminación cruzada, especialmente de los alimentos

cocinados de los alimentos provenientes de los proveedores crudos, en fábricas y

cocinas (comedores sociales y cocinas centrales).

4. Asegurar un calentamiento suficiente de los alimentos, seguido de una refrigeración

rápida cuando hayan de ser almacenados, evitando dejarlos mucho tiempo a

temperatura ambiente.

5. Comprobar que los manipuladores de alimentos no son portadores de Salmonella

mediante el chequeo y analítica anual por parte de la mutua.

6. Controlar los roedores, pájaros e insectos en las fábricas y terreno circundante.

Aplicar un plan de D.D.D. (Desinsectación, Desratización y Desinfectación).

7. Incrementar la vigilancia y detección de Salmonella sobre todo en alimentos

cocinados mediante controles y analítica bacteriológica periódica.

Las harinas de pescado se emplean mucho en las raciones de animales por su gran

contenido proteico (60 – 70%). Su concentración grasa varia, pero generalmente se

encuentra en torno al 10%. Las harinas de pescado contienen todos los materiales

necesarios para el crecimiento microbiano, salvo humedad, que generalmente oscila entre 7 y

10%.

El método más conveniente usado en la elaboración de harina de pescado es el conocido

como fusión húmeda; el pescado completo o triturado se transporta lentamente mediante un

tornillo transportador a lo largo de un cilindro caliente; al mismo tiempo se inyecta en la más

vapor de agua. El material así tratado pasa a una prensa de tornillo que le extrae

aproximadamente el 50% del agua y casi todo el aceite. La porción sólida de la prensa se

lleva entonces a un rodillo secador de aire caliente muy largo en donde la temperatura de la

masa de pescado se eleva lo suficiente para desecarla hasta un contenido de humedad

menor del 10%. En la fase siguiente del proceso se enfría la masa a veces la harina se cura

antes de pulverizarla y ensacarla apilándola en un cobertizo para permitir su oxidación.

MATERIALES Y MÉTODOS

TOMA DE MUESTRA

Cuarteo: Colocar la harina de pescado sobre un papel y con la ayuda de una espátula estéril

dividir el todo en 4 porciones y cada uno dividirlo en cuatro, así sucesivamente, homogenizar

primero por porciones y luego toda la muestra.

Tomar 25g de la muestra de harina.

PRUEBAS MICROBIOLÓGICAS:

1. Enriquecimiento no selectivo o preenrequecimiento.

2. Enriquecimiento selectivo.

3. Siembra en placa en medio de agar selectivo.

4. Siembra de colonias sospechosas en medio de diferenciación

1. ENRIQUECIMIENTO NO SELECTIVO O PREENRIQUECIMIENTO

Materiales

o Papel de aluminio

o Balanza analítica

o Botella de vidrio

o Medio caldo lactosado

Método

o Mezclar los 25 g de harina de pescado con 225ml de Caldo lactosado. Incubar a 35°C

por 24 horas.

2. ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO

Materiales

o Pipetas

o Tubos de ensayo

o Medio caldo selenito cistina

o Medio caldo tetrationato verde brillante

Método

o Pipetear 1ml del cultivo de preenriquecimiento en 10ml de caldo selenito cistina,

incubar a 35ºC X 24 horas.

o Pipetear 1ml del cultivo de preenriquecimiento en 10ml de caldo tetrationato verde

brillante, incubar a 35ºC X 24 horas.

3. SIEMBRA EN PLACA EN MEDIO AGAR SELECTIVO

Materiales

o Placas petri

o Asa de kolle

o Medio Agar xilosa lisina desoxicolato

o Medio agar salmonella shiguella

o Medio agar bismuto sultifo

Método

o Pasar una asada a c/uno de los medios de enriquecimiento selectivo a la superficie de

una placa de c/uno de los siguientes medios: XLD, SS, BS. Extender de manera que

se tengan colonias aisladas, sembrar por estrías. Incubar las placas a 37 ºC durante

24 horas.

4. SIEMBRA EN COLONIAS SOSPECHOSAS EN MEDIOS DE DIFERENCIACION

Materiales

o Tubos de ensayo

o Asa de kolle

o Medio Agar tres azucares

o Medio Agar lisina hierro

Método

o Tomar colonias sospechosas del medio Selectivo usado y pasarlo a los tubos con

agar TSI (Agar tres azucares) y Agar lisina hierro (LIA) inclinados. Inocular los medios

mediante siembra en estría de atrás hacia adelante en la superficie inclinada y a

continuación por picadura en la columna de agar. Incubar los tubos durante 24 horas

a 35ºC.

RESULTADOS Y DISCUSION

LIA:

o Para Selenito con BS: Parte inclinado morado, no hubo descarboxilación.

o Para Tetrationato con XLD: Parte inclinada morado, no hubo descarboxilación.

o Para Tetrationato con SS: Parte inclinado morado, no hubo descarboxilación.

TSI:

o Para Selenito BS: Todo el tubo de color amarillo, puesto que hubo fermentación de

lactosa y de glucosa, no se apreció el peróxido de hidrógeno.

o Para Tetrationato con XLD: Todo amarillo, puesto que hubo fermentación de lactosa y

de glucosa, no se apreció el peróxido de hidrógeno.

o Para Tetrationato con SS: Todo amarillo, puesto que hubo fermentación de lactosa y

de glucosa, no se apreció el peróxido de hidrógeno.

 

Entonces, se puede afirmar que: No hay Salmonella en la muestra tomada de 25 gramos.

XLD

Las colonias deberían ser transparentes u opacas (con el color del medio de cultivo), colonias

transparentes con centro negro. Acá no se observa lo mencionado. (Reacción negativa)

SS

Las colonias deberían ser transparentes, incoloras, algunas transparentes con el centro negro

acá no se observa lo mencionado.(reacción negativa).

BS

Se detecto en las colonias con centro negro en el medio de agar Bs. indica la presencia de

salmonella en la harina de pescado reacción positiva

DISCUSIÓN

Se analizaron seis cultivos sospechosos (tres por cada medio). Comenzando con el medio

Agar Lisina Hierro se observa que para Selenito con BS permaneció de color a morado, esto

pues no hubo una descarboxilación, por lo que se puede decir que no hay presencia de

Salmonella tomando en cuenta la coloración morada sin variación de la parte inclinada del

tubo.

Para el caso de Tetrationato con XLD, se observó también la misma pigmentación morada en

la parte inclinada, por lo que se infiere que no hay presencia de Salmonella, finalmente el

Tetrationato con SS presentó todo el tubo amarillo, puesto que hubo fermentación de lactosa

y de glucosa, no se apreció el peróxido de hidrógeno, de manera se afirma que no hay

presencia de Salmonella en ninguna de las muestras.

Con el medio TSI se determina si hay degradación de glucosa y degradación de lactosa con o

sin producción de sulfuro de hidrogeno manifestando una coloración negrusca en el fondo del

tubo por acción del hierro.

Observando los medios de TSI pudimos notar que el Selenito con BS mostró una coloración

amarillenta de forma completa, esto nos indica que hubo tanto degradación de glucosa en el

fondo, como degradación de lactosa en la parte superior, por lo que se infiere que no se

puede tratar de Salmonella ya que este bacilo gram negativo solo degrada la glucosa y

descarboxila la lisina alcalinizando el medio.

En el caso del Tetrionato con XLD también hubo un predominio absoluto del color amarillo en

todo el tubo, descartándose así la presencia de Salmonella. Finalmente se observó, que

también el Tetrationato con SS mostró similares características coloración amarilla en todo el

medio.

Los resultados tanto de LIA como de TSI expresan coherencia, ambos se registran una NO

contaminación de la muestra con Salmonella.

- Se observaron las placas con los medios selenito cisteína y con tetrationato verde brillante ambos se sembró en las placas con medios (SSA, BSA, XLD) y solo dio reacción positiva en las placas con el medio BSA tanto en selenito como tetrationato pues en este se dio el crecimiento de la coloración negra en el centro de las colonias y el brillo metálico alrededor de ellas se deben a la producción de sulfuro de hidrógeno y de la reacción de los iones de bismuto con este. Es ente medio donde se da el principio de fermentación de lactosa o sacarosa, sin embargo, en la prueba final de identificación en los medios de diferenciación (con TSI) se detecto lo siguiente que en el medio con selenito salió positivo, en la parte inclinada en el semi agar observándose el color amarillo, esto es, reacción positiva a la lactosa; y en cuanto la parte recta se vio un vacio, este vacio a podido ser por la presencia de oxigeno. O sea indica que es negativa a la reacción con glucosa, en el medio con tetrationato se identifico que la parte recta del tubo se observo un color amarillento lo que indica reacción positiva a la glucosa sin embargo no se produjo la presencia de colonias negras (en el fondo del tubo) lo que muestra que es negativa a la producción del sulfuro de hidrogeno. En cuanto al agar LIA en selenito se observo un color plomo en todo el tubo o sea que la reacción es negativa a la descarboxilación de la lisina, con tetrationato se observo que se mantuvo el color de medio violeta oscuro, o sea, salió reacción positiva a la descarboxilación de lisina, finalmente la prueba de LIA en ambos medios de selenito como tetrationato en su conjunto, seria negativa porque la presencia de uno implica la no presencia del otro.

CONCLUSIONES

Las tres pruebas en el medio LIA resultaron negativas porque no se dio la descarboxilación

de la lisina por acción de la cadaverina, lo cual no alcalinizó el medio y por ende no hubo un

cambio de coloración.

Las tres pruebas en el medio TSI fueron negativas porque hubo degradación de la lactosa y

se conoce que la Salmonella solo degrada la glucosa.

Se puede concluir que no hay presencia de Salmonella, por lo que la harina de pescado

analizada no presenta contaminación de este enterobacteria.

RECOMENDACIONES

Para este análisis sería recomendable que se realizaron más pruebas para así tener

precisión en la identificación como por ejemplo la pruebas de producción de indol.

Para el análisis microbiológico y bioquímico de la de harina de pescado es recomendable

tener una muestra representativa de esta, para lo cual se recomienda usar el método del

cuarteo, el cual fue usado en la realización de este laboratorio.

BIBLIOGRAFÍA

MCKERSON, JOHN; SINKEY, ANTHONY. “Microbiología de los Alimentos y sus procesos de elaboración”. Editorial Acribia. 1972. Zaragoza (España).

PELCZAR, MICHAEL J. PELCZAR. “Elementos de microbiología”. Editorial McGraw-Hill, 1981.

María del Rosario Pascual Anderson, Vicente Calderón y Pascual Microbiología alimentaria: Metodología analítica para alimentos y bebidas; Segunda edición; Publicado por Ediciones Díaz de Santos, 1999; 464 páginas.

http://www.ispch.cl/lab_amb/serv_lab/salmonella.html(19/6/9 hora4:14pm)

Características de la Salmonella Disponible en: http://www.analizacalidad.com/casalmo.htm