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Revista Latinoamericana el Ambiente y las Ciencias 8(18): 11-25 2017 11 1 Transmisión vertical de brucelosis (ganado-humano-vida silvestre) en dos comunidades endémicas de Puebla, México. Vertical transmission of brucellosis (livestock-human-life wild) in two endemic communities of Puebla, Mexico. 1,2 Juan Ricardo Cruz Aviña, 1 Sonia Emilia Silva Gómez, 1 Eduardo Torres Ramirez, 1,2 Elsa Iracena Castañeda Roldán. 1 Posgrado en Ciencias Ambientales ICUAP-BUAP, Ciudad Universitaria, Av. San Claudio s/n, Col San Manuel, CP.72592, Puebla, Puebla, México. 2 Centro de Investigación en Ciencias Microbiológicas ICUAP-BUAP, Ciudad Universitaria, Av. San Claudio s/n, Col San Manuel, CP.72592, Puebla, Puebla, México. Tel 2295500 ext. 2538. correo: [email protected] RESUMEN. La brucelosis es una zoonosis importante que puede infectar al hombre, al ganado y a la fauna silvestre. Actualmente se reconocen 12 especies de Brucella con hospederos diversos, tales como ballenas, armadillos, mandriles, ranas, etc. En el presente estudio se realizó el aislamiento positivo de bacterias de Brucella en fauna silvestre de los géneros: Poblana (peces), Ambystoma (anfibios), Sceloporus (lagartijas) y Peromyscus (ratones silvestres), en un área endémica para brucelosis humana (con incidencias de hasta 30%) y de ganado caprino (con incidencia de hasta 50 %) situadas en el municipio de Guadalupe Victoria, Puebla, México. Los primoaislamientos en placa-agar fueron obtenidos de muestras de tejido blando (hígado, riñón y saco vitelino), en hembras adultas de los cuatro grupos taxonómicos e identificados mediante pruebas de rutina. Se amplificó mediante PCR el gen bp26, que es específico del género Brucella con 1029pb y se les comparó con cepas vacunales de referencia. Los perfiles de los aislamientos, resultaron idénticos comparativamente a nivel de género con cepas de Brucella vacunales. Este es el primer reporte de aislamiento para esta bacteria zoonóotica en fauna endémica de México. Estos resultados apoyan la hipótesis de la transmisión vertical (ganado-humanos-fauna silvestre) de la brucelosis en zonas endémicas de la enfermedad, así como la variada adaptación, etiología y patogenia de Brucella hacia otros anfitriones emergentes. Estos datos podrían ser una herramienta útil, para mejorar la comprensión sobre la virulencia del Recibido: Agosto, 2017. Aprobado: Octubre, 2017

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1 Transmisión vertical de brucelosis (ganado-humano-vida silvestre) en dos

comunidades endémicas de Puebla, México.

Vertical transmission of brucellosis (livestock-human-life wild) in two endemic

communities of Puebla, Mexico.

1,2Juan Ricardo Cruz Aviña, 1Sonia Emilia Silva Gómez, 1Eduardo Torres Ramirez, 1,2Elsa

Iracena Castañeda Roldán.

1Posgrado en Ciencias Ambientales ICUAP-BUAP, Ciudad Universitaria, Av. San Claudio s/n, Col

San Manuel, CP.72592, Puebla, Puebla, México.

2Centro de Investigación en Ciencias Microbiológicas ICUAP-BUAP, Ciudad Universitaria, Av.

San Claudio s/n, Col San Manuel, CP.72592, Puebla, Puebla, México. Tel 2295500 ext. 2538.

correo: [email protected]

RESUMEN. La brucelosis es una zoonosis importante que puede infectar al hombre, al

ganado y a la fauna silvestre. Actualmente se reconocen 12 especies de Brucella con

hospederos diversos, tales como ballenas, armadillos, mandriles, ranas, etc. En el presente

estudio se realizó el aislamiento positivo de bacterias de Brucella en fauna silvestre de los

géneros: Poblana (peces), Ambystoma (anfibios), Sceloporus (lagartijas) y Peromyscus

(ratones silvestres), en un área endémica para brucelosis humana (con incidencias de hasta

30%) y de ganado caprino (con incidencia de hasta 50 %) situadas en el municipio de

Guadalupe Victoria, Puebla, México. Los primoaislamientos en placa-agar fueron

obtenidos de muestras de tejido blando (hígado, riñón y saco vitelino), en hembras adultas

de los cuatro grupos taxonómicos e identificados mediante pruebas de rutina. Se amplificó

mediante PCR el gen bp26, que es específico del género Brucella con 1029pb y se les

comparó con cepas vacunales de referencia. Los perfiles de los aislamientos, resultaron

idénticos comparativamente a nivel de género con cepas de Brucella vacunales. Este es el

primer reporte de aislamiento para esta bacteria zoonóotica en fauna endémica de México.

Estos resultados apoyan la hipótesis de la transmisión vertical (ganado-humanos-fauna

silvestre) de la brucelosis en zonas endémicas de la enfermedad, así como la variada

adaptación, etiología y patogenia de Brucella hacia otros anfitriones emergentes. Estos

datos podrían ser una herramienta útil, para mejorar la comprensión sobre la virulencia del

Recibido: Agosto, 2017.

Aprobado: Octubre, 2017

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género Brucella en el medio natural y su efecto potencialmente deletéreo en la fauna nativa,

como nuevos reservorios de la enfermedad.

ABSTRACT. Brucellosis is an important zoonosis that can infect man, cattle and wildlife.

There are currently 12 species of Brucella with various hosts, such as whales, armadillos,

baboons, frogs, etc. In the present study, it has been made positive isolation of Brucella

bacteria in the genus Poblana (fish), Ambystoma (amphibians), Sceloporus (lizards) and

Peromyscus (wild mice), were carried out in an area endemic for human brucellosis

incidences of up to 30%) and of goats (with incidence up to 50%) located in the

municipality of Guadalupe Victoria, Puebla, Mexico. The Plate-agar isolations were

obtained from soft tissue samples (liver, kidney and yolk sac) in adult females of the four

taxonomic groups and identified by routine testing. The bp26 gene, which is specific for the

Brucella genus with 1029bp, was amplified by PCR and compared with reference vaccine

strains (BM16 and BS19). The profiles of the isolates were found to be identical at the

genus level with Brucella vaccine strains. This is the first report of isolation for this

zoonotic bacterium in endemic Mexican fauna. These results support the hypothesis of

vertical transmission of brucellosis in endemic areas of the disease, as well as the varied

adaptation, etiology and pathogenesis of Brucella towards other emergent hosts. These data

could be a useful tool to improve understanding of the virulence of Brucella genus in the

natural environment and its potential effect negative on native fauna as new reservoirs of

the disease.

Palabras claves: Axalapascos, Brucella, fauna silvestre, transmisión vertical, zoonosis.

Keywords: Axalapazcos, Brucella, vertical transmission, wildlife, zoonosis.

INTRODUCCIÓN

Nuevos patógenos emergen, generando problemas en la salud humana, derivados

principalmente de la fauna silvestre y de las malas prácticas del manejo de animales

domésticos (AVMA, 2007; WHO, 2014), pero la dinámica de este tipo de zoonosis sigue

siendo poco conocida (Rhyan, 2000; Cleaveland y col., 2001; Woolhouse y col., 2005). Los

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patógenos de animales silvestres, contribuyen al incremento de las enfermedades

infecciosas emergentes (EIE) y re-emergentes (EIR), como una amenaza para la salud

pública y también para la salud animal (Chomel y col., 2007). La emergencia de estas

enfermedades zoonóticas, ocurren cuando los gérmenes de los anfitriones pueden pasar de

compartimiento taxonómico y mutar en los humanos (Monsalve y col., 2009). Los

patógenos pueden seguir transfiriéndose entre las diferentes especies animales, y continuar

siendo reservorios, convirtiéndose así en enfermedades epizoóticas (Morse, 1993; WHO,

2015). Existen también factores de riesgo asociados, que incrementan la potencialidad de

las (EIE) y (EIR). v. gr. los cambios repentinos en el medio ambiente o en las

características de los hospederos o de los agentes pueden alterar el estado de equilibrio

(Daszak y col., 2000; Daszak y col., 2001; Pappas, 2010; Cruz et al, 2015).

El género Brucella cuenta actualmente con 12 especies (Whatmore, 2009; Whatmore y col.,

2014, Scholz y col.,2016), se le considera una (EIE y EIR), con capacidad de infectar al

hombre y a un número importante de especies de animales, como roedores, ungulados,

cánidos, pinnípedos y cetáceos (Paulsen y col., 2002; Franco y col., 2007, Guerra, 2007). en

los últimos años se ha incrementado la información sobre la variedad de anfitriones

emergentes y de nuevos reservorios, en donde destaca el grupo de los anfibios (Godfroid y

col., 2005; Scholz y col., 2010; Tiller y col., 2010; Eisenberg y col., 2012; Hernández y

col., 2013; Whatmore y col., 2014, Foster y col., 2015). Las infecciones por este tipo de

bacterias presentan un efecto negativo sobre la fauna nativa, debido a que alteran

significativamente sus tasas de crecimiento y reproducción (Cabello y Cabello, 2008, O´

Callaghan y Whatmore, 2011). Lo cual vulnera la biodiversidad, por el aumento de la tasa

de mortalidad y su potencial riesgo de extinción (Cabello y Cabello, 2008). Un buen

ejemplo de la complejidad de este problema, es el caso de la interacción entre la fauna

silvestre y el ganado introducido en el siglo XIX en el Parque Nacional de Yellowstone en

Estados Unidos de América, en donde a pesar de los billones de dólares que se han

invertido para erradicar este problema, a la fecha aún no ha sido resuelto (O´Brien y col.,

2017).

En México existe un notable incremento en el impacto de las (EIE y EIR) en poblaciones

humanas, mismas que pueden afectar también a la vida silvestre y de la cual existe una gran

laguna de desconocimiento, además de la subnotificación, por lo que actualmente se

desconocen cifras reales sobre todo en la fauna nativa (Jones y col., 2008; Bulman y

Lamberti, 2011; WHO, 2014).

Área de Estudio

Localización geográfica. La Cuenca Oriental (N19°20'-19°23' y W97°24'-97°26' a 2350 m

s.n.m.), está ubicada en la zona limítrofe de los estados de Puebla, Tlaxcala y Veracruz en

el Centro-Oriente de México. (Geréz, 1983; Alcocer y col., 2004). En ella existe una

marcada escasez de agua, debido a las condiciones de áridas de la zona, y al suelo

altamente permeable (Gasca, 1981). La deforestación es notable, así como también el abuso

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en la extracción del agua subterránea (Can y col., 2011). Cuenca Oriental, es también una

de las zonas etnoculturales más importantes del país (v. gr. Cantona) y está considerada

como por la Comisión Nacional para el conocimiento y uso de la Biodiversidad (México)

como Región Hidrológica Prioritaria (RHP No. 71) por el caudal de su agua subterránea y

como Región Prioritaria Terrestre (RPT No. 122) por su marcada biodiversidad y

microendemismos (CONABIO, 2013; INAH 2014), donde algunos de sus rasgos

geomorfológicos más destacables son sus los lagos cráter o Axalapascos: Alchichica,

Atexcac, La Preciosa o las Minas y Quechulac, con un clima semiárido y templado

(desierto-frio), barrido por fuertes vientos (Arredondo y col.,1983; Alcocer y Hammer,

1998; Alcocer y col.,1998; Arredondo, 2002), (Figura 1).

Figura 1. Zona de estudio, Cuenca Oriental, en límites de los estados de Puebla Tlaxcala y

Veracruz, México. Localización geográfica de los lagos cráter o Axalapascos en la Cuenca Oriental

(N19°20'-19°23' y W97°24'-97°26' a 2350 m s.n.m.): Alchichica (ALCHI) (Municipio de

Tepeyahualco, Puebla), Atexcac (ATx), La Preciosa (LPr) y Quechulac (QUE). (Municipio de

Guadalupe Victoria, Puebla), las estrellas amarillas representan comunidades aledañas rurales a los

lagos cráter de Puebla, en donde se obtuvieron los datos de prevalencia de brucelosis humana (BrH)

y de ganado animal (BrA), las estrellas verdes representan a las comunidades rurales aledañas a los

lagos cráter pertenecientes al Municipio de Perote en el estado de Veracruz, por último los círculos

representan los lugares de colecta de los animales nativos, por grupos en orden taxonómico:

Poblana (Charal). Ambystoma (Ajolote), Sceloporus (Lagartija) y Peromyscus (Ratón silvestre)

Tomado de: Google Earth, 2017 y modificado por el autor.

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METODOLOGÍA

Obtención de los datos epidemiológicos. Se obtuvieron los datos de prevalencia de

brucelosis humana (BrH) de los últimos 15 años, de las comunidades rurales de la región de

estudio a través de la Secretaria de Salud del Estado de Puebla (SSEP), de la Jurisdicción

Sanitaria 4 San Salvador “El Seco”, la Delegación Estatal IMSS Puebla, y de algunas tesis

realizadas con esta temática en la zona. Para la obtención de los datos epidemiológicos de

brucelosis en ganado (BrA) se obtuvieron los 10 últimos años, a través de la Delegación

Estatal de la SAGARPA en Puebla y del Comité de Fomento y Salud Animal del Estado de

Puebla (CFSAEP), así como del Comité Estatal de Salud Acuícola del Estado de Puebla

(CESAPUE), de la Secretaria de Desarrollo Agropecuario, Rural y Pesca (SEDERPA) del

Estado de Veracruz, y de la participación de los autores en conjunto con productores

ganaderos en algunos foros, cursos y talleres de brucelosis en ganado en las comunidades

de la zona de estudio.

Trabajo de Campo. Entre febrero del 2013 y abril del 2016, se colectaron ejemplares de los

géneros: Poblana (De Buen 1945), Ambystoma (Tschdi, 1838), Sceloporus (Wiegmann,

1828) y Peromyscus (Gloger, 1841) en el agua y en la ribera de los lagos cráter Alchichica,

Atexcac, La Preciosa y Quechulac. Los organismos colectados fueron puestos en hielo para

su transporte y trasladados en un tiempo menor a cuatro horas, para su análisis respectivo al

Laboratorio de Patogenicidad Bacteriana del Centro de Investigación en Ciencias

Microbiológicas (CICM) de la Benemérita Universidad Autónoma de Puebla (BUAP) en la

ciudad de Puebla, México (Dolensek, 1971; Martínez y Ramis, 2012). Los ejemplares

estudiados se donaron institucionalmente, están a disposición y se encuentran actualmente

depositados en las Colecciones Nacionales correspondientes.

Análisis bacteriológico. De los ejemplares colectados se obtuvieron muestras serológicas y

se practicaron las pruebas de rutina 2ME, rosa de Bengala y Aglutinación en Placa (Alton y

col., 1988); posteriormente se tomaron muestras de tejido y de órganos internos por

separado (hígado, riñón, bazo y placenta) para cada organismo (Dolensek, 1971; Jacobson,

2007). Estos se maceraron con solución salina y se sembraron en placas con medio

selectivo de agar con medio BRUCELLABUAP® (BUAP, 2015, México) adicionados con

antibióticos y cristal violeta (Eisenberg y col., 2012). Las muestras se incubaron a 37°C

durante 48 h con CO2 al 5 % para el primoaislamiento. Se resembraron y se separaron

durante las siguientes 8-24 h, posteriormente se realizaron pruebas de tinción de Gram y de

actividad metabólica (TSI, LIA, URE, CIT, MIO, OXI, CAT, RM-VP, H2S, HEMOL) y

curva de crecimiento (Alton y col., 1988). Finalmente se realizó extracción del ADN

bacteriano.

Análisis molecular. Se realizó PCR con el ADN bacteriano (Kit Fermentas) buscando la

amplificación del gen bp26/ IS711 que es específico del género Brucella (Cloeckaert y col.,

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2000). El gen bp26 codifica la proteína BP26 (Omp28) que es un antígeno

inmunodominante en la infección de Brucella en la fauna silvestre y humanos. Los

oligonuclétidos utilizados conforme a (Cloeckaert, 2010) fueron (Oligo 1:

5’GCCCCTGACATAACCCGCTT3’, Oligo 2: 5’GAGCGTGACATTTGCCGATA3’). Se

utilizaron las cepas de referencia: B. melitensis M16 (ATCC 23456), B. abortus S19 (ATCC

Vacunal) como controles positivos y E. coli como control negativo (Cloeckaert, 2010). Se

utilizó un termociclador MultiGene Optimax con ciclos: (95°C) 07´, (95°C) 35´´, (64°C) 15

´´, (72°C) 03´ Rep 3-35 ciclos, (07°C) 06´, (04°C) indefinido. Los productos del PCR se

corrieron en un gel de agarosa al 1% (p/v) y se tiñeron con bromuro de etidio (0.5 g/mL)

15´´. Se observaron las bandas de amplificación del gen bp26 en un transiluminador de

rayos UV marca Sprectoline y las fotografías de los geles se tomaron con un equipo marca

Kodak Edas.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Este es el primer reporte de una importante zoonosis como es la brucelosis, a nivel vertical,

de tipo taxonómico y evolutivo, en donde los géneros de peces, anfibios, reptiles y

mamíferos pequeños, podrían tener un rol preponderante, como vectores o como

potenciales especies emergentes de la enfermedad, misma que ya se conocía en humanos y

ganado y ahora se sabe puede trasladarse al medio físico y fauna nativa.

En las pruebas de laboratorio se detectaron anticuerpos de Brucella en 31 de las 45

muestras de los tejidos estudiados de Poblana, Ambystoma, Sceloporus y Peromyscus es

decir un (68 % de efectividad con un intervalo de confianza del 95%) mismas muestras que

adicionalmente fueron positivas a las pruebas de rutina de Rosa de Bengala, SAT y 2ME.

Primoaislamiento: De los ejemplares con sospecha, se obtuvo el primoaislamiento positivo

derivado de tejidos y órganos internos (hígado riñón bazo y placenta) es decir una tasa

infectiva y confirmatoria del 100 % de las muestras de Poblana, Ambystoma, Sceloporus y

Peromyscus con concentraciones de Unidades Formadoras de Colonias (UFC) de 1x10 6

hasta 10 10 en todos los casos de los grupos taxonómicos del estudio.

Análisis bacteriológico: Las poblaciones bacterianas obtenidas del primoaislamiento de

cada grupo taxonómico fueron resembradas y resultaron positivas a las pruebas

bioquímicas, de tinción de Gram y de actividad metabólica, obteniéndose así su curva de

crecimiento.

Detección por PCR: Se obtuvo la ampliación del gen bp26/IS711 con 1029pb de las

muestras del ADN bacteriano purificado de Poblana, Ambystoma, Sceloporus y

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Peromyscus, y se les comparo con los controles positivos B. melitensis M16 (ATCC 23456),

B. abortus S19 (ATCC Vacunal) y ADN de E. coli como control negativo (Figura 2).

Análisis molecular de las muestras de ADN de los aislados bacterianos derivados de la fauna nativa

de la región de la Cuenca Oriental en Puebla, México, para los géneros: Poblana (Charal),

Ambystoma, (Ajolote) Sceloporus (Lagartija) y Peromyscus (Ratón de campo).

Figura 2. Resumen de los resultados obtenidos por PCR de los aislado obtenidos, purificados con

ADN bacteriano de: A (Charales del genero Poblana), B (Ajolotes del genero Ambystoma), C

(Lagartijas del genero Sceloporus), D (Ratones de campo del genero Peromyscus), El Primer carril

es el Marcador molecular (1029pb), Carril 2 Control positivo de ADN de Brucella abortus S19

(Vacunal), Carril 3 control positivo de Brucella melitensis M16 ( Vacunal), Carril 3 Control

negativo con ADN de E. coli , Carril 4 resultado positivo para el género Brucella de la muestra

problema.

Diversos estudios apuntan que el deterioro ambiental, la deforestación, el estrés hídrico, la

contaminación, las enfermedades emergentes, entre otros factores son actualmente los

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causantes de la pérdida de biodiversidad en el mundo, con énfasis especial en

Latinoamérica (Sánchez y col., 2005)

Las nuevas infecciones por Brucella se han documentado en todo el mundo en una amplia

variedad de mamíferos terrestres de vida silvestre (Godfroid, 2002). Recientemente, se han

reportado también casos de brucelosis en mamíferos marinos (Foster y col., 2007), además

de peces no nativos de agua dulce (Wael y col., 2010). En el periodo de 2012-2015 ya se

consideró a algunas ranas como reservorios u hospederos naturales de esta bacteria

zoonótica (Eisenberg y col., 2012; Fischer y col., 2012; Watmore y col., 2014) y

potencialmente en otros anfibios (Bosch, 2003). Hasta la fecha no se tenía el registro en el

mundo de casos para los reptiles, aunque al extenderse el rango del genero Brucella hacia

otros grupos taxonómicos diferentes a los mamíferos se abría esa posibilidad (Pappas;

2010; Eisenberg y col., 2012). En un estudio paraecido pero de manera parcial, Eisenberg y

col., en (2012) reportan el crecimiento de sus aislados bacterianos para la rana toro,

cultivada a través de acuacultura, Pyxicephalus edulis en placa de agar (Agar Gassner,

Oxoid, Alemania y Agar Brucella, Merck, Alemania) en un ambiente atmosférico aérobico

con y sin cristal violeta; en contraste para esta investigación, los aislados bacterianos de

Brucella en placa de agar con medio BRUCELLABUAP® (BUAP, México) crecieron

mejor en un ambiente con 5% de CO2 y cristal violeta más antibióticos. Conforme a las

pruebas de rutina y Alton et al. (1988), los resultados de Eisenberg et al. (2012) demuestran

un comportamiento diferente de sus cepas de resiembra de Brucella a las brúcelas clásicas o

tradicionales. Para este estudio los resultados de las pruebas de rutina y metabólicos son

más cercanos a Brucella melitensis, sin embargo, faltaran más estudios de manera

sostenida. Lo anterior concuerda con lo reportado anteriormente por Castañeda et al. (2005)

para suelo y por Cruz et al. (2015) para el agua de lagos cráter La Preciosa, Atexcac y

alrededores. Las pruebas serológicas realizadas en el test de este estudio demostraron una

incidencia importante de la enfermedad hembras adultas de los organismos estudiados

(68%). Vale la pena enfatizar que los jjuveniles de los cuatro grupos taxonómicos

colectados durante el estudio, fueron serológicamente negativos al test (anticuerpos) de

Brucella, lo que indica la probabilidad de que los organismos que se infectaron con

Brucella ocurrió en una edad posterior a la juvenil, tal vez durante y posterior al primer año

de vida, debido a que las hembras positivas a las pruebas de Brucella en algunos casos

estaban preñadas lo que pudiera estar ligado a eventos de placentación, como en otros

grupos (Godfroid y col., 2013). Esto ha sido reportado en otras hembras de fauna silvestre,

como el caso de los armadillos de Argentina (Kin y col., 2014), o los zorros rojos en

Austria (Hofer y col., 2012) y las ranas toro de Tanzania (Eisenberg y col., 2012). Por su

parte, Castañeda et al. (2005) demostró contaminación en suelo en un área cercana a estos

lagos por lo que la infección de los organismos, por el contacto con el suelo es factible. Del

mismo modo, en correspondencia, los datos de la prueba de 2-ME que detecta las IgG1 y la

IgG2 demuestran que estas inmunoglobulinas se encuentran a posteriori a la infección y

pueden persistir durante un largo período de tiempo (Godfroid y col., 2011). En esta fase

existe una excreción elevada del agente en el ambiente que puede durar hasta 18 semanas

(Bathke, 1981). Además, la trasmisión de la brucelosis en los animales rumiantes ocurre a

través de la excreción de materiales contaminados del aparato genital femenino (placenta,

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mortinatos, fluidos, etc.), constituyendo la principal forma de trasmisión infectiva a otros

animales y al hombre en concentraciones incluso del orden de los UFC 1x10 12 (WHO,

2008; Godfroid y col., 2013). Desde luego no existe información en reptiles y tampoco para

peces nativos, ni anfibios nativos. Cabe mencionar que Poblana, Ambystoma, Sceloporus,

Peromyscus podría tener un rol como vector o portador asintomático de la enfermedad, en

el caso de las hembras vivíparas de las lagartijas y de los ratones, ya que forman placenta a

diferencia de los peces y ajolotes que son ovíparos (Méndez de la Cruz y Manríquez, 2014;

González y Álvarez, 2005). Los orígenes de las fuentes contaminantes adquieren una gran

importancia epidemiológica, debido a la gran resistencia ambiental de B. melitensis

(Moreno, 2002) ya reportada en la zona para pastos, suelo, establos, medios de trasporte y

agua (Axalapascos) (Castañeda y col., 2005; Cruz, 2013; Cruz y col., 2015). Con base en lo

anterior, es viable que el suelo como sustrato sea una fuente importante de contaminación

para esta zona en particular. Por su parte, el diagnóstico de la detección de Brucella spp.

PCR como herramienta confirmatoria presenta muchas ventajas, por poseer mayor

sensibilidad y mayor especificidad que otras pruebas. Esta amplificación ha sido

considerada como una técnica de detección específica y sensible, una alternativa para

confirmación de aislamientos o como técnica de diagnóstico directo en muestras clínicas.

Ella sería un importante apoyo para los programas de prevención, control y erradicación de

la brucelosis implementados en el país, en especial en áreas de alta prevalencia, como es el

caso de la Región de estudio, en las cuales las pruebas serológicas de uso rutinario del

programa, muestran frecuentes controversias y problemas. No obstante, el aislamiento y

resiembra del patógeno sigue siendo la prueba irrefutable en el estudio de la brucelosis

(Godfroid, 2002; Godfroid y col., 2005). La falta de polimorfismo genético de las especies

de Brucella dificulta su identificación, ya sea por electroforesis en gel o por amplificación

aleatoria de ADN polimórfico o por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) iniciada al

azar (AP-PCR). A diferencia de lo que sucede con otras bacterias patógenas, la

identificación de las distintas especies de Brucella no se logra mediante la secuenciación

del ARNr 16S, ni con la amplificación de la región del ADN ribosómico situada entre el

16S y el 23S. Una de las técnicas más eficientes para la diferenciación entre las distintas

especies de Brucella o hacer una identificación a nivel de genero entre especies consiste en

aprovechar la variabilidad en una secuencia de inserción en el cromosoma, IS711 a través

del PCR, generándose diferentes tamaños de ampliación según la especie, diferenciando de

esta forma B. abortus (biotipos 1, 2, 4), B. melitensis, B. ovis, y B. suis (biotipo 1) entre

otros. Por lo que para los alcances, objetivos y presupuesto de este estudio se estableció

desde su diseño inicial, llegar a nivel de género ampliando el gen bp26 que es característico

Brucella. Por su parte Eisenberg et al. 2012, en sus estudios en rana toro, utilizó PCR

Bruce-ladder buscando ampliar el gen bscp31 (IS711) comparándolo con cepas de

referencia de Brucella

En contraste, para este estudio se utilizó PCR en tiempo real, buscando la amplificación del

gen bp26/ IS711 que es específico del género Brucella, (Cloeckaert y col.,2000). El gen

bp26 codifica la proteína BP26 (Omp28) que es un antígeno inmunodominante en la

infección de Brucella en fauna silvestre y humanos.

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Por otra parte, las cepas vacunales de referencia de B. abortus S19 y B. melitensis M16 son

parte importante en los programas gubernamentales de control y erradicación de la

brucelosis en el ganado en esta Región (SAGARPA, 2016), de ahí su importancia para el

estudio, además de que, recientemente se ha reportado su potencial efecto deletéreo en la

fauna nativa y como contaminante ambiental en suelo (Godfroid y col., 2011; Godfroid y

col., 2013). Actualmente no hay vacuna disponible para la vida silvestre, ni tampoco

vacuna para la brucelosis humana (Yang y col., 2013). La prevención de la infección por

brucelosis vertical y horizontal depende del control de la enfermedad en el ganado en lo

general (Azpiri y col., 2000; WHO, 2008). Nuevas especies de Brucella pueden emerger y

coexistir con las especies tradicionales debido a su capacidad de adaptación a cambios

sociales, culturales, viajes y prácticas agropecuarias; es decir a cambios medio-ambientales

(Godfroid, 2002; Godfroid y col., 2005; Pappas, 2010). Después de casi 100 años de la

llegada de esta bacteria a la zona de la Cuenca Oriental con la primera importación de

cabras murcianas infectadas, y después de 25 años de los primeros reportes en fauna

silvestre en otras partes endémicas de la enfermedad en el mundo con sendas emergencias

epizoóticas, en México ha existido poco esfuerzo para establecer políticas que permitan

reducir este riesgo.

CONCLUSIONES

Los resultados de este estudio apoyan la hipótesis de la transmisión vertical de la brucelosis

(ganado-humanos-fauna silvestre) en zonas endémicas de la enfermedad, así como la

variada adaptación, etiología y patogenia de Brucella hacia otros anfitriones emergentes

como es el caso de peces, anfibios y reptiles nativos. Así como la reemergencia de la

brucelosis para los roedores del género Peromyscus, el cual se reafirma a nivel de género

para estas localidades del oriente de Puebla.

Se confirma la región de los Axalapascos dentro de la Cuenca Oriental en Puebla, como

una zona importante de zoonosis, en donde la brucelosis humana, la brucelosis en ganado y

ahora en fauna silvestre interactúan de manera importante, como un problema ambiental

preponderante.

Estos datos podrían ser una herramienta útil, para mejorar la comprensión sobre la

virulencia del género Brucella en el medio natural y su efecto potencial en la fauna nativa,

como nuevos reservorios de la enfermedad a nivel evolutivo Peces-Anfibios-Reptiles-

Mamíferos, pequeños dentro del mismo ecosistema, mismos que se suman al sistema ya

conocido (Humanos-Ganado-Medio Físico)

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