Seguridad Alimentaria Brucelosis

Especialización en Seguridad Alimentaria Martinez, 15 de junio de 2012

Brucelosis un problema presente para la Salud Publica

Prof. MV Bact. Cecilia Di Lorenzo . Catedra de Inmunología I parte. Carrera de Microbiología Clínica e Industrial .

Genero Taxonomía Genoma Características metabólicas Relación MO-huésped Relación MO-ambiente

Un solo mundo de medicina veterinaria, OIE

Un mundo una salud (OIE,OMS,FAO)

Conceptos para recordar:

Enfoque interdisciplinario no multidisciplinario

Notas para recordar… La brucelosis, también llamada fiebre malta o fiebre ondulante, es una

enfermedad bacteriana (infecciosa) que afecta a varias especies de mamíferos dentro de los cuales se encuentra el hombre, causando la brucelosis humana.

El capitán David Bruce fue enviado a Malta y condujo una investigación a partir de 1884. El aisló un agente llamado Micrococcus melitensis de bazos humanos de pacientes hospitalizados que habían consumido leche de cabra cruda.

El profesor L.F. Benhard Bang, patólogo veterinario y bacteriólogo Danés, describió un organismo causante de abortos en ganado en 1895 llamado Bacillus abortus.

En 1914 en Estados Unidos, fue aislada la especie Brucella de un feto de cerdo abortado la cual fue llamada B. suis

-1887, David Bruce aisla una bacteriaa partir del bazo de un soldado inglésmuerto en Malta tras sufrir una enfermedad caracterizada por un cuadro febril ondulante. Bruce denomina a esta bacteria Micrococcus melitensis

1897 Bernhard Bang descubre una bacteriacausante de abortos en vacas a la que denominaBacillus abortus

Laboratorio de Inmunologia. Prof. Cecilia Di Lorenzo

1914 Temistocles Zammit demuestra quela brucelosis se transmite por el consumode leche de cabra

1917 Alice Evans demuestra que la leche de vaca también transmite la brucelosis.Asocia la enfermedad al Bacillus abortus de Bang al que renombra como Brucella abortus

1931 Forrest Huddleson reconoce el microorganismocausante de la brucelosis en cerdos como una especienueva: Brucella suis

1966 Leland Carmichael descubre una nuevaespecie a la que denomina Brucella canis poraislarse de casos de abortos en perros.Esta especie se demuestra capaz de infectar a laspersonas

Laboratorio de Inmunologia. Prof Cecilia Di Lorenzo

Laboratorio de Inmunologia

AISLAMIENTO DE LAS ESPECIES DE Brucella

1886 - Bruce - Br. melitensis del hombre

1897 - Bang - Br. abortus de bovinos

1914 - Traum - Br. suis de porcinos

1953 - Buddle y Boyes - Br. ovis de ovinos

1957 - Stoenner y Lackman - Br. neotomae de ratas

1966 - Carmichael - Br. canis de caninos

1994 – Ross et al – Br. cetaceae de delfines

1994 – Ross et al – Br. pinnipediae de focas

2000.- Skol Br. microti

BRUCELOSIS

Laboratorio de Inmunologia. Dra Cecilia Di Lorenzo

Clasificaciones filogenéticas

La información genética de los seres vivos se encuentra codificada en la secuencia de bases del ADN.

La clasificación filogenética se fundamenta en las relaciones genéticas generales que tienen las bacterias sobre la base de antepasados comunes

El estudio del genoma demuestra que la

composición de bases es constante y característica para cada microorganismo.

Para su realización se emplean técnicas de biología molecular con el fin de conocer el ADN (cromosómico o extracromosómico) y el ARN.

Actualmente se utilizan varios parámetros combinados para determinar las relaciones ADN, como son:

tamaño del genoma, contenido de guanina más citosina, estabilidad térmica de las secuencias afines de ADN relaciones del ADN mediante hibridación.

Por otro lado, el ARN ribosómico (ARNr), por su carácter ancestral en la biosíntesis de proteínas, presenta más homología entre microorganismos diferentes que el ADN, y parece ser un buen candidato para la medida de la distancia evolutiva.

A medida que los organismos sufren procesos de mutación, recombinación, o transducción sus genomas cambian de tamaño, composición y secuencia de bases, cumpliéndose la teoría de Darwin de la selección de las especies que mejor se adaptan al medio, es decir, la evolución.

División BXII. Proteobacteria

Clase I Alphaproteobacteria

Orden I Rhodospirillales

Familia II AcetobacteraceaeGénero I Acetobacter Género IX Gluconobacter

Orden II Rickettsiales

FamiliaI Rickettsiaceae Género I Rickettsia

Orden VI Rhizobiales

Familia I RhizobiaceaeGénero I RhizobiumGénero II Agrobacterium

Family III BrucellaceaeGénero I Brucella


Pertenecen al grupo de las alfa-proteobacterias y mas específicamente a la clase Rhizobiales.

Br.maris

B suis

Cepa B. ovis

B.suis

B.suisB.canis

B.suis

Br.maris

B.suis

B.suis

B.canisB.suis

B. Brucella melitensis variedad suis (porcinos, liebres,ciervos, bisontes,etc ) Brucella melitensis variedad abortus (bovinos)

Brucella melitensis variedad neotomae (roedores: meriones )

Brucella melitensis variedad ovis (ovejas)

Brucella melitensis variedad canis (caninos) Brucella melitensis variedad maris (delfines, marsopas, ballenas,

focas),

Brucella melitensis variedad microti (zorros rojos, roedores de campo), Brucella melitensis variedad inopinata, recientemente descrita (2009), aislada de una infección en implante mamario de una paciente de 71 años.

Hoy se plantea el genero como mono especie: Brucella melitensis El resto se las considera biovariedades y se las denomina

Brucella melitensis variedad melitensis

Genero Brucelosis

Gram negativos

Características Microscópicas

InmóvilesNo Poseen cápsula No poseen plasmidos

Son bacilos pequeños de 0.6-1.5 micras de longitud y 0.5-0.7 de diámetro


Coloración de Gram


Vida endocelular

Principales características del Generococobacilo, aeróbico

Gram negativo

No poseen capsulas

Son inmóviles

No son esporulados

Parásitos intracelulares facultativos

Particular perfil metabólico

Producen una infección de por vida en los animales


Colonias regulares, brillantes, traslucidas, pequeñas, convexas. “ gotas de rocío” Crecimiento lento

Características Macroscópicas

Repique de 72hs. B abortus

Relación con el Huésped Genero fuertemente adaptado al huésped Crece y se reproduce dentro de una gran variedad

de células.

Los cultivos lisos de Brucella (S) presentan tendencia a sufrir variaciones durante el crecimiento, especialmente con subcultivos, y aparecen formas rugosas (R).

Las colonias son entonces mucho menos transparentes, presentan una superficie mate más granular y el color varía de blanco mate a marrón con luz reflejada o trasmitida.


La comprobación de esta transición se realiza fácilmente por tinción con cristal violeta: las colonias rugosas aparecen rojas y las lisas de color amarillo pálido.

Por lo general, los cambios de morfología colonial se asocian con cambios en la virulencia, en las propiedades serológicas y/o en la sensibilidad a los fagos.

La aglutinación positiva con un antisuero anti-Brucella es una identificación preliminar de que el aislado corresponde a Brucella.

La identificación posterior completa se realiza mejor en un laboratorio de referencia.


Si las colonias son lisas deben probarse con antisuero contra B. abortus lisa, o preferiblemente con antisueros monoespecíficos contra los antígenos de superficie A y M.

En el caso de colonias rugosas, las colonias deben probarse con antisuero contra el antígeno R de Brucella.


La mayoría de las especies son Catalasa positivas y Oxidasa positivo , solo son negativos a la oxidasa: B. ovis

B. neotomae

Son aerobios estrictos a excepción B. ovis y B. abortus, son microaerobias (5-10% de CO2)


Requerimientos de Cultivo Necesita medios enriquecidos complejos, por requerir de

ciertos animoácidos , tiamina, biotina, nicotinamida, pantotenato de calcio y trazas de magnesio.

Se usan medios con suero

Medio enriquecido Albimi

Medio Selectivo Farrel ( ac nalidixico)


Cultivos de 72 hs


Brucella canis

Lab de Inmunologia. FCV. UNLP



Genero BrucellaLaboratorio de Inmunologia. Dra Cecilia Di Lorenzo


Tbilisi

BRUCELÓFAGOS

6 grupos de fagos :

Tipo 1:: Tbilisi B.abortus en fase S SI o I Tipo 2: cepa Firenze75/13 . B.abortus S SI I y B.suis(4)Tipo 3:: cepa Weybridge B.abortus S SI I y B.suis

Tipo 4: Berkeley BK0 BK1 Y BK2 Formas S abortus,neotomae,suisTipo 5: R/O ,R/C Formas R de Brucella Tipo 6: Tzatnagar Iz Cultivos S,SI,I de abortus,melitensis,neotomae y suis.

El patrón de sensibilidad a los fagos muestra una gran

vinculación con la actividad de oxidación metabólica, definen : especie


B abortus inhibida por Thionina B suis inhibida por Fucsina Laboratorio de Inmunologia. Dra Cecilia Di Lorenzo

Aglutinación con sueros monoespecíficos.-

Procedimiento : Una ansada del cultivo en 0,5 ml de suero en poratojetos

Se emplean el suero monovalente A y en monovalente M.

El R se utiliza solo cuando se sospecha de B. canis o de otra especie rugosa natural.


Genoma de Brucella: 2 replicones


Chr I Chr II2,1 mega bases 1,1, megabases Típico bacteriano Típico plasmido

Funcionalmente absolutamente complemetarios 98% de correspondencia entre especies



Genero Brucella Especie : Brucella melitensis Biovares:

melitensisabortus

suiscanisovis

neotomaemaris



RESERVORIOS COMUNES DE LA ESPECIE DE BRUCELLA

ESPECIE BIOVAR. HOSPEDERO PATOGENICIDADEN HUMANOS

Br. melitensis Todas Caprinos/ovinos +

Br. abortus Todas Bovinos +

Br. suis 1, 3 Porcinos +

2 Porcinos, liebres -

4 Caribus, renos +

Br. canis Caninos +

Br. ovis Ovinos -

Br. neotomae Ratas de campo -

Br. maris Ballenas, delfines, bufeos +

Focas, leones marinos



Constitución del Lipopolisacarido

Brucella : aminoglycose y acidos grasos

Glucose,mannose and quinovosamina

Homopolymer 100 residues of 4 -dideoxymannose



B.abortus B.melitensis B.suis

Brucella lisas Laboratorio de Inmunologia. Dra Cecilia Di Lorenzo

Brucella ovis y Brucella canis


Son cepas naturalmente RUGOSAS



LPS : Brucella



Cepas Lisas o S Cepas RugosasLaboratorio de Inmunologia. Dra Cecilia Di Lorenzo

LPS Rugoso


Cadena O de tipo R


Método para identificación de fase


•Método de Henry : iluminación a 45 °

Método para identificación de fase

Método de Wilson (Coloración con Cristal Violeta)


CV

Cultivo de 48 hs + Sol de Cristal Violeta por 30 “

Se vuelca el colorante y se observa en Lupa


Cambios en la morfología de las colonias son generalmente asociados con cambios en la virulencia.


Diagnostico Directo

Aislamiento: sangre - hemocultivo fetos placenta semen

Poner en evidencia el agente: Técnicas de biología molecular

Coloraciones especificas: Coloración de Stamp

PCR

Coloraciones especificas : Coloración de Stamp

Coloración de Stamp

15¨mVolcar Y Lavar con agua corriente

1/10

0,5%

20-30”Volcar Y Lavar con agua corriente

Volcar Y Lavar con agua corriente10”


Puntillado o cadenas cortas rojas sobre fondo azul

HEMOCULTIVOPunción venosa (2-5 ml ) Colocar en medio para hemocultivo y homogeneizar

Mantener a Temp ambiente

hasta llevar al Laboratorio

Marcha Bacteriológica

Stamp +

Siembra ATS con 10% de suero estéril

24 – 48 - 72 hs 37ºC

Gram - Colonias pequeñas como gotas de rocío

Aisalmiento en Leche y derivados Leche: centrifugar a 10000 rpm

15 minutos Sembrar en medios selectivos

por separado grasa y sedimento Por 15 días

Queso: porciones de 1 grs en medio liquido selectivo, durante 15 días .

Repicar a medios solidos selectivos.

PCR en leche y queso

Con y sin 10 % CO2

•T1: Hidrogeno Sulfurado•T2: Movilidad (agar semisolido)•T3: Ureasa ( Medio Bauer)• Oxidasa• Catalasa

T1

Negativo

T2 T3

Enviamos a Laboratorio de Referencia para confirmación por fagolisotipiaOxidación metabólica , biología molecular y determinación de especie

Negativo Positivo

Bacterias compatibles con el genero Brucella

Coloración de Stamp Positiva

Oxidasa Positiva, Positva débil

Catalasa Positiva

Urea Positiva, indicar tiempo

Hidrógeno Sulfurado Negativo durante 4 dias

Movilidad Inmóvil

Ureasa


• Área Urea de Christensen(Rojo de Fenol)

• Buenos Aires ModificadoIndicador de Andrade y Azul de Timol

Pos Neg

Cronometrar tiempo de reacción



Urea Rápida


Prueba de Catalasa positiva

Prueba de Oxidasa positiva / positiva débil(Parafenilendiamina)

(Ansada en H2O2 )


Movilidad


Agar semisólido


Hidrogeno sulfurado


ATS en pico de flauta Con papel con acetato de

plomo por 4 días ( cambio diario)



•T1: Hidrogeno Sulfurado•T2: Movilidad (agar semisolido)•T3: Ureasa• Oxidasa• Catalasa

T1

Negativo

T2 T3

Enviamos a Laboratorio de Referencia para confirmación por fagolisotipiaOxidación metabólica , biología molecular y determinación de especie

Negativo Positivo

Bacterias compatibles con el genero Brucella


Positiva

Oxidasa Positiva, Positva débil

Catalasa Positiva

Urea Positiva, indicar tiempo

Hidrógeno Sulfurado

Negativo durante 4 dias

Movilidad Inmóvil



Diagnostico Indirecto


MUESTRAS


• VIA DE EXTRACCIÓN - VOLUMEN (4 -5 ml.) - INSTRUMENTAL A UTILIZAR

• CALIDAD : - HEMOLISIS - CONTAMINACIÓN • TIPO : - SANGRE ENTERA : refrigerada - SUERO: frizado

• EMBALAJE

• IDENTIFICACIÓN


Tbilisi

BRUCELÓFAGOS

6 grupos de fagos :

Tipo 1:: Tbilisi B.abortus en fase S SI o I Tipo 2: cepa Firenze75/13 . B.abortus S SI I y B.suis(4)Tipo 3:: cepa Weybridge B.abortus S SI I y B.suis

Tipo 4: Berkeley BK0 BK1 Y BK2 Formas S B.abortus,B.neotomae,B.suisTipo 5: R/O ,R/C Formas R de Brucella Tipo 6: Tzatnagar Iz Cultivos S,SI,I de B.abortus,B.melitensis,B.neotomae y B.suis.

El patrón de sensibilidad a los fagos muestra una gran vinculación con la actividad de oxidación metabólica, definen :

ESPECIE

Genero Brucella

B.abortus B.melitensis B.suis

• Brucella ovis•Brucella canis•Brucellla maris

RUGOSAS

Brucella lisas

Genoma de Brucella: 2 replicones

Chr I Chr II2,1 mega bases 1,1, megabases Típico bacteriano Típico plasmido

Funcionalmente absolutamente complemetarios 98% de correspondencia entre especies

Estudio de genoma de Brucella

No posee plasmidos como factor de virulencia Vías metabólicas oxidativasIdentificado vías metabólicas básicas faltantes

Relación huésped Imposibilidad de ciclo libre 98% de correspondencia entre especies

Pruebas Moleculares: PCR

B. can

is

B. ab

ortu

s S19

B. A

bo

rtus cam

po

B. ab

ortu

s RB

51

B. su

is

M -

152

272

450

1682

794 587

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